JPWO2016093321A1 - 細胞培養方法及び細胞培養装置 - Google Patents
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Abstract
細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。このため、培養皿３の一端に設けられた供給口４と、供給口４との間で培養細胞６を挟むように培養皿３の他端に設けられた排出口５と、培養皿３に供給する培養液を蓄えるリザーバタンク１１と、培養皿から排出された培養液を蓄える廃液タンク２１と、供給口４を介してリザーバタンク１１内の培養液を培養皿３に供給する供給側微小流量ポンプ１２と、排出口５を介して培養皿３から培養液を排出する排出側微小流量ポンプ２２と、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように供給側微小流量ポンプ１２及び排出側微小流量ポンプ２２の流量制御を行う流量制御部３０と、を備える。
Description
本発明は、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置に関する。
近年における幹細胞を利用した再生医療としては、例えば、肝硬変や血液疾患、心筋梗塞の治療、血管の構築、骨や角膜の再生、移植用皮膚の確保、などが考えられている。再生医療では、培養皿内で幹細胞などから目的とする細胞や臓器を増殖させ、人に移植するようにしている。最近では、骨髄由来の幹細胞から血管新生を行い、狭心症、心筋梗塞などの治療に成功している。
ここで、従来の細胞培養装置は、培養皿内の培養液を定期的に入れ替えて培養細胞の増殖を行っていた。この細胞培養装置は、培養液の入れ替えに伴って細胞に大きな刺激が与えられ、また、細胞の代謝活動に伴って培養液中に老廃物が排出されることから、細胞にストレスや傷害を与えてしまうという問題があった。
これに対して、培養液の入れ替えを行わず、培養皿に培養液を送液して細胞培養を行うものがある。例えば、特許文献１には、細胞の増殖速度をモニタリングし、このモニタリングした増殖速度をもとに培養液中の栄養分の減少を予測し、消費された栄養素を培養液に追加する細胞培養装置が記載されている。
また、培養液の入れ替えを行わず、培養液の送液及び排液を行って細胞培養を行うものがある。例えば、特許文献２には、中空繊維からなるフィルタモジュールによって培養液を培養槽に循環させ、培養液中の栄養分の追加と老廃物の除去を行う細胞培養方法が記載されている。
しかしながら、特許文献１に記載された細胞培養装置は、連続的に栄養素を培養槽に送液するが、培養槽に培養液を溜める方式であるため、培養液中の細胞の代謝活動により排出された老廃物の濃度が高まると、任意のタイミングで従来の細胞培養装置と同様に、培養槽内の培養液を一度に交換せざるを得ない。この培養液の全体交換の頻度が１日に１回で行われると、結果的に従来の細胞培養装置と同様に、細胞にストレスや傷害を与えてしまうことになる。
一方、特許文献２では、極微量の培養液を連続的に送液及び排液を行うようにしているが、培養期間が長期間になると、老廃物によってフィルタモジュールが目詰まりしてしまい、長期間培養には適しない。特に、近年の再生医療等で求められる細胞が得られるまでの培養期間は、１か月程度の長期間であるため、長期間培養ができないことは、再生医療等で求められる細胞面積の大きな細胞を培養することができないことを意味する。
本発明は、上記に鑑みてなされたものであって、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができる細胞培養方法及び細胞培養装置を提供することを目的とする。
上述した課題を解決し、目的を達成するために、本発明にかかる細胞培養方法は、培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養方法であって、前記培養細胞を挟むように前記培養皿の一端に前記液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出することを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養方法は、上記の発明において、前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養装置であって、前記培養皿の一端に設けられた前記液体の供給口と、前記供給口との間で前記培養細胞を挟むように前記培養皿の他端に設けられた前記培養皿の排出口と、前記培養皿に供給する前記液体を蓄えるリザーバタンクと、前記培養皿から排出された前記液体を蓄える廃液タンクと、前記供給口を介して前記リザーバタンク内の前記液体を前記培養皿に供給する供給側微小流量ポンプと、前記排出口を介して前記培養皿から前記液体を排出する排出側微小流量ポンプと、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記供給側微小流量ポンプ及び前記排出側微小流量ポンプの流量制御を行う流量制御部と、を備えたことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の側面の表面自由エネルギーは、前記培養皿の底面の表面自由エネルギーに比して小さいことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底面を水平に調整する水平調整機構を備えたことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底面を斜めに調整する傾斜調整機構を備えたことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給口及び前記排出口は、複数であり、それぞれ線状に離散配置されることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、及び、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間は、可撓性チューブで接続され、前記供給側微小流量ポンプと前記供給口との間、及び前記排出側微小流量ポンプと前記排出口との間に、それぞれ前記可撓性チューブの開口を絞る絞り調整機構を設けたことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、及び、前記排出側微小流量ポンプの流出口と前記廃液タンクとの間は、着脱自在に直接接続されることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給口と前記供給側微小流量ポンプの流出口とを結ぶ供給側流路の上部に前記リザーバタンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の供給口側に横置きし、他端から、前記供給側微小流量ポンプの流入口を前記リザーバタンクに着脱自在に接続するとともに前記供給側微小流量ポンプの流出口を前記供給側流路の流入口に着脱自在に接続し、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口とを結ぶ排出側流路の上部に前記廃液タンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の排出口側に横置きし、他端から、前記排出側微小流量ポンプの流出口を前記廃液タンクに着脱自在に接続するとともに前記排出側微小流量ポンプの流入口を前記排出側流路の流出口に着脱自在に接続したことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプとの間の第１の流路、前記供給側微小流量ポンプと前記培養皿との間の第２の流路、前記培養皿と前記排出側微小流量ポンプとの間の第３の流路、前記排出側微小流量ポンプと前記廃液タンクとの間の第４の流路とを内部に埋め込み形成し、前記リザーバタンク、前記培養皿、前記廃液タンクの上部に配置される流路プレートを備え、前記第１の流路と前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第２の流路と前記供給側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続され、前記第３の流路と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第４の流路と前記排出側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続されることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿内の液位を検出する液位検出センサを備え、前記流量制御部は、前記液位検出センサが検出する液位が一定となるように流量制御を行うことを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記供給側微小流量ポンプを駆動する供給側駆動源は前記供給側微小流量ポンプに対して着脱可能であり、前記排出側微小流量ポンプを駆動する排出側駆動源は前記排出側微小流量ポンプに対して着脱可能であることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、少なくとも前記培養皿を配置する基板を備え、前記基板は、前記培養細胞の培養状態を観察する領域に、穴、または前記培養皿が配置される反対側が開口した無色透明の凹部を形成していることを特徴とする。
また、本発明にかかる細胞培養装置は、上記の発明において、前記培養皿の底部に設けられた透明導電膜ヒータと、前記培養皿内の前記液体の温度を検出する温度センサと、前記温度センサの検出結果をもとに前記透明導電膜ヒータを通電して前記培養皿内の前記液体の温度を所定温度範囲内に保つ制御を行う温度制御部と、を備えたことを特徴とする。
本発明によれば、培養細胞を挟むように培養皿の一端に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出するようにしているので、細胞にストレスや傷害を与えずに長期間培養を行うことができるとともに、前記液体の消費を抑えることができる。
以下、添付図面を参照してこの発明を実施するための形態について説明する。
（全体構成）
図１は、本発明の実施の形態である細胞培養装置１の外観構成を示す斜視図である。また、図２は、図１に示した細胞培養装置１の構成を示すブロック図である。図１及び図２に示すように、細胞培養装置１は、基板２の上部中央に培養皿３が設けられ、培養皿３の両端から培養皿３を挟むように、培養液を培養皿３に供給する送液部１０及び培養皿３から培養液を排出する排液部２０が基板２上に設けられる。
図１は、本発明の実施の形態である細胞培養装置１の外観構成を示す斜視図である。また、図２は、図１に示した細胞培養装置１の構成を示すブロック図である。図１及び図２に示すように、細胞培養装置１は、基板２の上部中央に培養皿３が設けられ、培養皿３の両端から培養皿３を挟むように、培養液を培養皿３に供給する送液部１０及び培養皿３から培養液を排出する排液部２０が基板２上に設けられる。
培養皿３には、培養細胞６を挟むように、培養皿３の一端側である供給口側面３ａに培養液の供給口４が設けられるとともに、培養皿３の他端側である排出口側面３ｂに培養液の排出口５が設けられる。供給口４及び排出口５は、それぞれ６つ設けられ、それぞれが供給口側面３ａ及び排出口側面３ｂに沿って線状に離散配置されている。なお、供給口４及び排出口５の開口は、培養皿３内の培養液の深さ未満の位置に配置される。
送液部１０は、リザーバタンク１１、供給側微小流量ポンプ１２、及び絞り調整機構１３を有する。リザーバタンク１１には、培養液が蓄えられる。供給側微小流量ポンプ１２は、リザーバタンク１１内の培養液を培養皿３の供給口４に供給する。絞り調整機構１３は、供給側微小流量ポンプ１２から供給される培養液の流量を再調整する可変絞り機能を有する。
リザーバタンク１１の培養液流出口と供給側微小流量ポンプ１２の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ１１によって接続される。また、供給側微小流量ポンプ１２の培養液流出口と供給口４との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ１２によって接続される。絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２の６本の可撓性チューブのそれぞれに対して可変絞りを行うことができる。
供給側微小流量ポンプ１２は、６つのペリスタルティックポンプからなるポンプ群１２ａと、減速機１２ｂと、モータ１２ｃとを有する。各ペリスタルティックポンプは、回転軸に沿って多段に連結可能である。減速機１２ｂは、モータ１２ｃの回転を多段で減速し、この減速した回転をポンプ群１２ａに伝達する。モータ１２ｃは、減速機１２ｂに対して着脱可能である。送液部１０側の基板２には、基板２上に立設するフランジ２ａが形成されている。フランジ２ａの一端面側にポンプ群１２ａが取り付けられ、フランジ２ａの他端面側に減速機１２ｂが取り付けられ、減速機１２ｂとポンプ群１２ａとが連結される。減速機１２ｂは、フランジ２ａ及びポンプ群１２ａに対して着脱可能に構成されている。
一方、排液部２０は、廃液タンク２１、排出側微小流量ポンプ２２、及び絞り調整機構２３を有する。排出側微小流量ポンプ２２は、培養皿３内の培養液を培養皿３の排出口５から排出する。廃液タンク２１は、排出側微小流量ポンプ２２が排出した培養液を蓄える。絞り調整機構２３は、排出側微小流量ポンプ２２から排出される培養液の流量を再調整する可変絞り機能を有する。
排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ２２によって接続される。また、排出側微小流量ポンプ２２の培養液流出口と廃液タンク２１の培養液流入口との間は、６本の可撓性チューブからなる流路Ｌ２１によって接続される。また、絞り調整機構２３は、流路Ｌ２２の６本の可撓性チューブのそれぞれに対して可変絞りを行うことができる。
排出側微小流量ポンプ２２は、６つのペリスタルティックポンプからなるポンプ群２２ａと、減速機２２ｂと、モータ２２ｃとを有する。各ペリスタルティックポンプは、回転軸に沿って多段に連結可能である。減速機２２ｂは、モータ２２ｃの回転を多段で減速し、この減速した回転をポンプ群２２ａに伝達する。モータ２２ｃは、減速機２２ｂに対して着脱可能である。排液部２０側の基板２には、基板２上に立設するフランジ２ｂが形成されている。フランジ２ｂの一端面側にポンプ群２２ａが取り付けられ、フランジ２ｂの他端面側に減速機２２ｂが取り付けられ、減速機２２ｂとポンプ群２２ａとが連結される。減速機２２ｂは、フランジ２ｂ及びポンプ群２２ａに対して着脱可能に構成されている。
なお、図１に示すように、培養皿３は、押さえ部材１０３ａ，１０３ｂによって基板２に取り付けられる。また、リザーバタンク１１は、押さえ部材１１１ａ，１１１ｂによって基板２に取り付けられる。さらに、廃液タンク２１は、押さえ部材１２１ａ，１２１ｂによって基板２に取り付けられる。
上述したように、モータ１２ｃ，２２ｃ及び減速機１２ｂ，２２ｂは、着脱可能であり、オートクレーブ時に取り外すことができる。なお、培養皿３は、通常、ポリカーボネイトで形成されているため、オートクレーブが行われる毎に交換される。
図２に示すように、モータ１２ｃ及びモータ２２ｃは、流量制御部３０によって駆動される。そして、ポンプ群１２ａ，２２ａは、流量制御部３０によって培養液の流量制御を行う。培養皿３の底部には、透明導電膜ヒータ４１及び温度センサ４２が設けられる。また、リザーバタンク１１には、ペルチェ素子４３及び温度センサ４４が設けられる。温度制御部４０は、温度センサ４２の検出結果をもとに透明導電膜ヒータ４１の通電制御を行って、培養皿３内の培養液が所望温度、例えば３７℃となるように温度制御するとともに、温度センサ４４の検出結果をもとにペルチェ素子４３の通電制御を行って、リザーバタンク１１内の培養液が所望温度、例えば５〜２０℃となるように温度制御を行う。電源５０は、流量制御部３０及び温度制御部４０に対して電力供給を行う。培養皿３内の培養液は、細胞が増殖するのに適した温度に設定する必要があり、リザーバタンク１１内の培養液は、長期保存が可能である温度に設定する必要がある。なお、リザーバタンク１１内の培養液は、培養皿３内の培養液の温度よりも低い温度に設定されるが、リザーバタンク１１から流出した培養液は、培養皿３の供給口に到達するまでの流路Ｌ１１，Ｌ１２を通過することによって常温に近い温度となる。
なお、図３に示すように、基板２には、培養皿３が配置される領域に、例えば円形の穴２ｃが設けられる。この穴２ｃを設けるのは、培養皿３の高さ方向の長さを短くして、細胞培養中の細胞の状態を光学顕微鏡で観察できるようにするためである。したがって、培養皿３が配置される部分の基板２を下方からくり抜いた凹部としてもよい。ただし、この凹部の底部は、無色透明であることが好ましい。
また、図４に示すように、基板２には、リザーバタンク１１が配置される領域に、例えば円形の穴２ｄが設けられる。これは、穴２ｄを介してリザーバタンク１１内の培養液の状態を目視観察できるようにするためである。リザーバタンク１１内の培養液の状態が悪化すると、濁りや変色が生じる。なお、同様にして、廃液タンク２１が配置される領域にも穴を設けるようにすることが好ましい。
図５に示すように、絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２である可撓性チューブを挟むように押圧して、流路開口を狭める絞りを形成することができる。上述したように絞り調整機構１３は、流路Ｌ１２の各可撓性チューブの流量を個別に再調整するものであるが、この絞りを流路Ｌ１２に形成することによって、絞りの上流側の圧力Ｐ１は、下流側の圧力Ｐ２に比して大きくなる。この結果、絞りの上流側に配置されるポンプ群１２ａが吸引及び吐出する際の培養液内に気泡等が発生しにくくなり、流量制御を精度高く行うことができる。
（培養皿内の培養液の流れ）
ここで、本実施の形態では、培養皿３内で、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖが、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように培養液を培養皿３に供給しつつ排出するようにしている。
ここで、本実施の形態では、培養皿３内で、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖが、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように培養液を培養皿３に供給しつつ排出するようにしている。
図６は、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖに対する、培養細胞６内に現れるせん断応力影響細胞の発現率を示す図である。なお、せん断応力影響細胞の発現率は、正常細胞に対する細胞死や細胞変異が生じた細胞の面積率としている。図６に示すように、せん断応力影響細胞の発現率は、最大速度Ｖｍａｘ未満で０となる。したがって、最大速度Ｖｍａｘ未満の移動線速度Ｖで培養液を培養皿３に供給しつつ排出することによって、培養細胞６にせん断応力による影響を与えないようにすることができる。具体的な最大速度Ｖｍａｘは、培養細胞６をマウスのＥＳ細胞とした場合、０．３ｍ／ｍｉｎ程度である。
しかも、本実施の形態では、培養皿３に対して連続的に培養液を供給し、かつ、排出するようにしているので、培養液を長期間にわたって交換する必要がないため、細胞面積が大きく、かつ、適正な細胞を得ることができる。さらに、供給口４及び排出口５の開口は大きく、少なくとも老廃物を通過させて詰まらせない大きさ以上である。したがって、フィルタなどによる根詰まりが生じないので、この観点からも、培養液を長期間にわたって交換する必要がないため、細胞面積が大きく、かつ、適正な細胞を得ることができる。
なお、確実に培養細胞６にせん断応力の影響を与えないようにする場合、培養液の分子運動による拡散速度Ｖ１以下となるように培養液を培養皿３に供給しつつ排出することが好ましい。培養液の分子運動による拡散は、人為的な拡散と異なり、培養液の流れによって培養細胞６にせん断応力を与えない。この結果、細胞が傷つかず、ストレスをもたない適正な細胞を得ることができる。
拡散速度Ｖ１は、最大速度Ｖｍａｘに比べて極めて小さい値であり、培養液の供給及び排出の量を少なくすることができるため、低コストで培養細胞６を増殖することができる。なお、最小の移動線速度は、培養細胞６が細胞死せずに、必要な栄養素を得ることができる速度であり、培養細胞６ごとに異なる。したがって、設定される移動線速度は、拡散速度と同じか同程度にすることが好ましい。なお、一般的な最小の移動線速度は、拡散速度の１／３程度である。
ここで、上述した拡散現象は、時間ｔ［ｓ］内に分子が移動する平均距離ｘ［ｃｍ］とすると、
ｘ＝（４Ｄｔ）＾（１／２）
として表すことができる。ここで、Ｄは、拡散係数であり、室温では、Ｄ＝（１〜２）×１０＾（−５）［ｃｍ＾２／ｓ］程度である。
したがって、培養液の分子が１分間に移動する平均距離ｘは、０．４〜０．７ｍｍとなり、拡散速度Ｖ１は、０．４〜０．７ｍｍ／ｍｉｎ となる。
ｘ＝（４Ｄｔ）＾（１／２）
として表すことができる。ここで、Ｄは、拡散係数であり、室温では、Ｄ＝（１〜２）×１０＾（−５）［ｃｍ＾２／ｓ］程度である。
したがって、培養液の分子が１分間に移動する平均距離ｘは、０．４〜０．７ｍｍとなり、拡散速度Ｖ１は、０．４〜０．７ｍｍ／ｍｉｎ となる。
一方、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度Ｖは、拡散速度Ｖ１以下にすることを考える。培養皿３における供給口４から排出口５に向かう断面積は、培養液の深さを１．５ｍｍ、幅を８６ｍｍとすると、１２９ｍｍ＾２となる。そこで、培養液の流量を４２μＬ／ｍｉｎと設定すると、移動線速度Ｖは、流量を断面積で除算した値となり、０．３７９ｍｍ／ｍｉｎとなる。この場合、移動線速度Ｖは、拡散速度Ｖ１よりも小さくなる。
図７は、上述した培養液の流量に設定した場合での供給口側面３ａから排出口側面３ｂに向かって流れる培養液の状態画像を示す図である。なお、図７では、供給される培養液にメチレンブルーを加えて着色している。図７に示すように、供給された培養液は、６つの供給口４から供給されるため、６つの山が形成されている。これら６つの山の先端領域Ｅ１では、供給された培養液が既存の培養液に拡散していることがわかる。そして、この先端領域Ｅ１が時間の経過とともに、排出口側面３ｂに向かって移動する。また、時間の経過に伴って、供給口側面３ａ側は、供給された培養液が支配的となる。なお、排出口側面３ｂに向かう方向に平行な培養皿３の流れ方向側面３ｃ，３ｄでは、メニスカスによって拡散速度が速くなっている。
供給される培養液は、この拡散状態を超えない流量で供給し、かつ、排出するように流量制御される。すなわち、培養液の供給量は、供給口４から拡散される培養液の流量を補充する流量としている。
図８は、図７に示した直線Ｃ上における、時間経過に伴う相対濃度変化を示している。なお、距離Ｒは、供給口側面３ａの位置を起点としている。図８に示すように、時間経過に伴って、相対濃度Ｄが釣鐘型に傾斜している先端領域Ｅ１が拡散速度Ｖ１で排出口側面３ｂに向かって移動する。一方、先端領域Ｅ１から供給口側面３ａでは、拡散速度Ｖ１以下の移動線速度Ｖで移動し、相対濃度が一定となり、供給された培養液が支配的となっている。
（培養液の流量制御処理）
図９は、流量制御部３０による培養液の流量制御処理手順を示すフローチャートである。図９に示すように、まず、培養細胞６を培養皿３の底部に接着させ、その後、排出側微小流量ポンプ２２を停止したまま、供給側微小流量ポンプ１２を駆動し、培養皿３内に培養液が満ちるように培養液を供給する（ステップＳ１０１）。その後、供給側微小流量ポンプ１２を停止し、排出側微小流量ポンプ２２を駆動して培養液を排出し、培養液の深さが所定深さとなるように設定する（ステップＳ１０２）。その後、この所定深さで、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度が、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように、好ましくは、培養液の拡散速度以下となるように、培養液を一定流量で供給し、かつ、排出するように、供給側微小流量ポンプ１２及び排出側微小流量ポンプ２２の流量制御を行う（ステップＳ１０３）。
図９は、流量制御部３０による培養液の流量制御処理手順を示すフローチャートである。図９に示すように、まず、培養細胞６を培養皿３の底部に接着させ、その後、排出側微小流量ポンプ２２を停止したまま、供給側微小流量ポンプ１２を駆動し、培養皿３内に培養液が満ちるように培養液を供給する（ステップＳ１０１）。その後、供給側微小流量ポンプ１２を停止し、排出側微小流量ポンプ２２を駆動して培養液を排出し、培養液の深さが所定深さとなるように設定する（ステップＳ１０２）。その後、この所定深さで、供給口４から排出口５に向かう培養液の移動線速度が、培養細胞６にせん断応力を与えない最大速度未満となるように、好ましくは、培養液の拡散速度以下となるように、培養液を一定流量で供給し、かつ、排出するように、供給側微小流量ポンプ１２及び排出側微小流量ポンプ２２の流量制御を行う（ステップＳ１０３）。
（実験結果）
上述した細胞培養装置１を用いて、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を培養皿３に播種し、５日間、培養液を拡散速度以下で供給、かつ、排出して培養した。そして、細胞にせん断応力がかかっていたか否かを調べた。せん断応力がかかったか否かは、ＮＯの経路、ＰＫＣの経路でのリン酸化状態を調べることによってわかる。実験結果では、ＮＯの経路には、ｅＮＯＳのリン酸ペプチドが一度も同定されなかった。また、ＰＫＣの経路では、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化ペプチドは同定されず、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化は変化がなかった。これらの結果から、細胞には、せん断応力がかかっていないものと推定できる。
上述した細胞培養装置１を用いて、Ａ５４９細胞（ヒト肺胞基底上皮腺癌細胞）を培養皿３に播種し、５日間、培養液を拡散速度以下で供給、かつ、排出して培養した。そして、細胞にせん断応力がかかっていたか否かを調べた。せん断応力がかかったか否かは、ＮＯの経路、ＰＫＣの経路でのリン酸化状態を調べることによってわかる。実験結果では、ＮＯの経路には、ｅＮＯＳのリン酸ペプチドが一度も同定されなかった。また、ＰＫＣの経路では、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化ペプチドは同定されず、ＫＲＴＳ（Ｓ７３）のリン酸化は変化がなかった。これらの結果から、細胞には、せん断応力がかかっていないものと推定できる。
（供給口及び排出口の配置）
上述した実施の形態では、図１０の上部に示したように、供給口４の開口位置は、供給口側面３ａに対して培養液面内で水平方向に線状で等間隔に配置されていたが、図１０の下部に示すように、供給口４の開口位置を中央側にずらした配置としてもよい。この場合、メニスカスによる影響が軽減され、先端領域Ｅ１を一層、直線状に移動させることができる。なお、排出口５の開口位置も同様である。
上述した実施の形態では、図１０の上部に示したように、供給口４の開口位置は、供給口側面３ａに対して培養液面内で水平方向に線状で等間隔に配置されていたが、図１０の下部に示すように、供給口４の開口位置を中央側にずらした配置としてもよい。この場合、メニスカスによる影響が軽減され、先端領域Ｅ１を一層、直線状に移動させることができる。なお、排出口５の開口位置も同様である。
なお、培養液の深さが深い場合には、図１１に示すように、供給口４の開口位置を、深さ方向にも分散した面的配置としてもよい。なお、排出口５の開口位置も同様である。
（メニスカス発生の抑制）
ところで、図７では、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度がメニスカスによって速くなっていた。そこで、メニスカスの発生を抑制するために、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂに、フッ素系の撥水剤を塗布した。その結果、図１０の上部に示した供給口４の開口配置であっても、図１２に示すように、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度を抑えることができた。すなわち、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂにフッ素系の撥水剤を塗布することによってメニスカスの発生が抑制され、培養液の移動線速度を均一にすることができる。なお、メニスカスの発生を抑制すればよいので、少なくとも流れ方向側面３ｃ，３ｄにフッ素系の撥水剤が塗布されればよい。また、撥水剤はフッ素系に限らず、撥水性を有する材料であればよい。
ところで、図７では、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度がメニスカスによって速くなっていた。そこで、メニスカスの発生を抑制するために、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂに、フッ素系の撥水剤を塗布した。その結果、図１０の上部に示した供給口４の開口配置であっても、図１２に示すように、流れ方向側面３ｃ，３ｄにおける培養液の移動線速度を抑えることができた。すなわち、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂにフッ素系の撥水剤を塗布することによってメニスカスの発生が抑制され、培養液の移動線速度を均一にすることができる。なお、メニスカスの発生を抑制すればよいので、少なくとも流れ方向側面３ｃ，３ｄにフッ素系の撥水剤が塗布されればよい。また、撥水剤はフッ素系に限らず、撥水性を有する材料であればよい。
上述した撥水剤の塗布は、流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂの表面自由エネルギーを培養皿３の底面に比して小さくしたものである。したがって、撥水剤の塗布に限らず、培養皿３の流れ方向側面３ｃ，３ｄ、供給口側面３ａ、排出口側面３ｂの表面材質の表面自由エネルギーが、底面の表面自由エネルギーに比して小さいものであればよい。
（培養皿の水平調整機構）
なお、図１２に示した培養液の流れの先端は、流れ方向に対して斜めになっている。これは、培養皿３が水平に配置されず、幅方向に傾斜して培養液の深さが異なっていたからである。そこで、図１３に示すように、培養皿３が固定される培養皿用基板２ｅを基板２上に設けるとともに、基板２と培養皿用基板２ｅとの間であって、培養皿３の四隅に対応する部分に、４つの水平調整機構５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ）を設ける。さらに、培養皿用基板２ｅの上部に、Ｘ方向とＹ方向との水平性を検知する２つの水準器５２を取り付ける。なお、ＸＹ平面の水平性を検知できるものであれば、１つの水準器であってもよい。
なお、図１２に示した培養液の流れの先端は、流れ方向に対して斜めになっている。これは、培養皿３が水平に配置されず、幅方向に傾斜して培養液の深さが異なっていたからである。そこで、図１３に示すように、培養皿３が固定される培養皿用基板２ｅを基板２上に設けるとともに、基板２と培養皿用基板２ｅとの間であって、培養皿３の四隅に対応する部分に、４つの水平調整機構５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ）を設ける。さらに、培養皿用基板２ｅの上部に、Ｘ方向とＹ方向との水平性を検知する２つの水準器５２を取り付ける。なお、ＸＹ平面の水平性を検知できるものであれば、１つの水準器であってもよい。
図１４は、具体的な水平調整機構５１ｃの構成を示す図である。水平調整機構５１ｃは、調整ダイヤル５３を回動すると、調整ダイヤル５３の先端側に形成されたネジ部５３ａが回動する。このネジ部５３ａに螺合する傾斜部材５４は、ネジ部５３ａの回動に応じてＹ方向に移動する。傾斜部材５４の上部には、昇降部材５５が配置される。傾斜部材５４上部の傾斜部５４ａと昇降部材５５下部の傾斜部５５ａとは、摺動可能に当接している。したがって、傾斜部材５４のＹ方向の移動に応じて昇降部材５５は高さ方向であるＺ方向に移動する。そして、操作者は、水準器５２が示す水平状態を参照して、４つの水平調整機構５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄのＺ方向の位置を調整し、培養皿用基板２ｅを水平に調整することができる。結果的に、培養皿３の底面３ｅを水平に調整することができる。
この水平調整機構５１によって培養皿３の底面３ｅが水平に調整されると、培養皿３に供給及び排出される培養液の深さを一定にすることができる。この結果、培養液の流れ方向（Ｘ方向）の移動線速度を均一にすることができる。
なお、上述した水平調整機構５１は、手動式であるが、自動水平調整機構であることが好ましい。例えば、水準器５２が示す気泡の位置画像を撮像装置によって取得し、この気泡が水平状態の位置に移動するように、モータで駆動する調整ダイヤルを回動制御すればよい。この水平調整の自動化が行われると、培養細胞６の培養中であっても水平状態を常に自動的に維持することができる。
（送液部及び排液部の接続）
図１５に示すように、リザーバタンク１１と供給側微小流量ポンプ１２の流入口との間の接続部６１、供給側微小流量ポンプ１２の流出口と供給口４との間の接続部６２、排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の流入口との間の接続部６３、及び、排出側微小流量ポンプ２２の流出口と廃液タンク２１との間の接続部６４は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるようにしてもよい。
図１５に示すように、リザーバタンク１１と供給側微小流量ポンプ１２の流入口との間の接続部６１、供給側微小流量ポンプ１２の流出口と供給口４との間の接続部６２、排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の流入口との間の接続部６３、及び、排出側微小流量ポンプ２２の流出口と廃液タンク２１との間の接続部６４は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるようにしてもよい。
また、図１６に示すように、供給口４と供給側微小流量ポンプ１２の流出口とを結ぶ供給側流路７５の上部にリザーバタンク１１を設けた多段配置構成の一端を、培養皿３の供給口４側に横置きし、他端から、供給側微小流量ポンプ１２の流入口をリザーバタンク１１に着脱自在に接続するとともに供給側微小流量ポンプ１２の流出口を供給側流路７５の流入口に着脱自在に接続する構成としてもよい。
すなわち、供給側微小流量ポンプ１２の流入口とリザーバタンク１１との接続部７１、及び供給側微小流量ポンプ１２の流出口と供給側流路７５の流入口とを接続する接続部７２は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるように構成されている。
同様にして、排出口５と排出側微小流量ポンプ２２の流入口とを結ぶ排出側流路７６の上部に廃液タンク２１を設けた多段配置構成の一端を、培養皿３の排出口５側に横置きし、他端から、排出側微小流量ポンプ２２の流出口を廃液タンク２１に着脱自在に接続するとともに排出側微小流量ポンプ２２の流入口を排出側流路７６の流出口に着脱自在に接続する構成としてもよい。
すなわち、排出側微小流量ポンプ２２の流出口と廃液タンク２１との接続部７４、及び排出側微小流量ポンプ２２の流出口と排出側流路７６の流出口とを接続する接続部７３は、自動開閉弁内蔵のソケット及びプラグによって直接接続され、かつ、着脱自在でワンタッチ接続できるように構成されている。
（細胞培養装置の運搬形態）
上述した細胞培養装置は、平板状であるため、多段に積み重ねることができる。したがって、例えば、図１７に示すように、保温が可能な運搬箱８０で細胞培養装置１を多段に積み重ねて運搬することができる。各細胞培養装置１の電源コネクタ８１は、バッテリ８３に接続される電源コネクタ８２にそれぞれ接続される。電源コネクタ８２は、バッテリ８３に対して数珠つなぎに接続されている。したがって、例えば、上側から３段目の細胞培養装置１が取り外されても、この取り外された細胞培養装置１の電源コネクタ８１と電源コネクタ８２とを取り外すのみで、他の細胞培養装置１を連続して培養し続けることができる。
上述した細胞培養装置は、平板状であるため、多段に積み重ねることができる。したがって、例えば、図１７に示すように、保温が可能な運搬箱８０で細胞培養装置１を多段に積み重ねて運搬することができる。各細胞培養装置１の電源コネクタ８１は、バッテリ８３に接続される電源コネクタ８２にそれぞれ接続される。電源コネクタ８２は、バッテリ８３に対して数珠つなぎに接続されている。したがって、例えば、上側から３段目の細胞培養装置１が取り外されても、この取り外された細胞培養装置１の電源コネクタ８１と電源コネクタ８２とを取り外すのみで、他の細胞培養装置１を連続して培養し続けることができる。
なお、運搬箱８０などで細胞培養装置１を運搬する場合、培養皿３は蓋で覆われ、培養皿３内の空間を培養液で満たしておくことが好ましい。これによって、培養皿３内の培養細胞に対するせん断応力の影響を軽減することができるとともに、運搬先に到達するまで連続培養することができる。
（閉鎖かん流系流路の適用）
上述した実施の形態では、培養皿３と排出側微小流量ポンプ２２との流路は、可撓性チューブを用い、この可撓性チューブと排出側微小流量ポンプ２２との流出口とはユーザが接続するようにしていた。この実施の形態の変形例では、すべての流路に開放部を設けない閉鎖かん流系流路を形成している。
上述した実施の形態では、培養皿３と排出側微小流量ポンプ２２との流路は、可撓性チューブを用い、この可撓性チューブと排出側微小流量ポンプ２２との流出口とはユーザが接続するようにしていた。この実施の形態の変形例では、すべての流路に開放部を設けない閉鎖かん流系流路を形成している。
図１８は、閉鎖かん流系流路を用いた細胞培養装置２００の構成を示す平面図である。また、図１９は、図１８に示した細胞培養装置２００のＡ−Ａ線断面図である。図１８および図１９に示すように、細胞培養装置２００は、基板２０１上に、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３、および、モータ２１３ａ，２１３ｂが配置される。培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、および、廃液タンク２２３の上部には、流路プレート２２０が配置される。また、モータ２１３ａ，２１３ｂ上には、それぞれ供給側微小流量ポンプ２１２ａ，２１２ｂが配置される。なお、基板２０１には、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３が配置される凹部が形成されている。この凹部の底部には、開口が形成されている。
流路プレート２２０には、流路が埋め込み形成されている。流路プレート２２０は、上部プレート２２１と下部プレート２２２との対向面に流路となる溝を形成し、上部プレート２２１と下部プレート２２２との対向面を接合することによって内部に流路を形成している。流路は、リザーバタンク２１１と供給側微小流量ポンプ２１２ａとの間の第１の流路Ｌ２３１、供給側微小流量ポンプ２１２ａと培養皿２０３ａ，２０３ｂとの間の第２の流路Ｌ２３２、培養皿２０３ａ，２０３ｂと排出側微小流量ポンプ２１２ｂとの間の第３の流路Ｌ２３３、排出側微小流量ポンプ２１２ｂと廃液タンク２２３との間の第４の流路Ｌ２３４を有する。
また、第１の流路Ｌ２３１と供給側微小流量ポンプ２１２ａの流入管Ｌ２４１との間の流入口２５１はピンポート接続され、第２の流路Ｌ２３２と供給側微小流量ポンプ２１２ａの流出管Ｌ２４２との間の流出口２５２はピンポート接続される。また、第３の流路Ｌ２３３と排出側小流量ポンプ２１２ｂの流入管Ｌ２４３との間の流入口２５５はピンポート接続され、第４の流路Ｌ２３４と排出側微小流量ポンプ２１２ｂの流出管Ｌ２４４との間の流出口２５６はピンポート接続される。これにより、リザーバタンク２１１内の培養液は、廃液タンク２２３に回収されるまでの間、閉鎖かん流系流路内を流れる。したがって、細胞培養装置２００の組立時に作業者による培養液へのコンタミネーションを防止することができる。なお、ピンポート接続は、コンタミネーション防止のため、予め接続状態としておくことが好ましい。これによって、作業者は、細胞培養装置２００の組立時に流路形成のための作業がなくなる。
なお、流路プレート２２０の下部には、基板２０１上に配置された培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３の各開口に挿入されて流路プレート２２０を位置決めする下部係合部２５１が形成されている。また、流路プレート２２０の上部には、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３を塞ぐ各蓋２６１の位置ずれを防止する上部係合部２５２が形成されている。また、培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３の各開口に対応する流路プレート２２０の領域には開口３０１が形成されている。また、流路プレート２２０は、ノズルを設けて培養皿２０３ａ，２０３ｂ、リザーバタンク２１１、廃液タンク２２３内への流路を形成している。
また、上述した細胞培養装置２００では、１つの培養皿２０３ａ，２０３ｂにそれぞれ１つの供給口２５３と１つの排出口２５４とを設けるようにしている。これは、培養液を低流量で供給する際、１つの培養皿に、１つの流路から分岐した複数の供給口を設けると各供給口に対する流量の均等分岐が難しくなる場合があるからである。
さらに、この変形例では、流路プレート２２０に培養皿２０３ａ，２０３ｂ内の培養液の液位を検出する液位検出センサＳＤを設けている。図２の流路制御部３０に対応する、図示しない流量制御部は、液位検出センサＳＤが検出する液位が一定となるように流量制御を行う。これによって、培養液の移動速度を一定に保つことができる。
また、この変形例では、図１９に示した基板２０１のＡ部に、培養皿２０３ａ，２０３ｂの底面を斜めに調整する傾斜調整機構が設けられている。この傾斜調整機構は、図１３、図１４に示した水平調整機構５１と同様な構成によって実現できる。この傾斜調整機構による傾斜は、培養皿２０３ａ，２０３ｂの底部における排出口２５４側が低くなるようにする。これによって、培養中に発生した死細胞を排出口２５４から効率よく除去することができる。したがって、排出口２５４の位置と傾斜調整機構の傾き方向とを合致させることが好ましい。なお、供給口２５３は、排出口２５４に対向する位置に設けられる。したがって、傾斜調整機構によって傾いている状態では、供給口２５３は排出口２５４に比して高い位置に設けられる。なお、リザーバタンク２１１の排出口も排出口２５４と同様に、傾斜時に低くなる位置に設けることが好ましい。
なお、ポンプ２１２ａとモータ２１３ａの接続において、ポンプ２１２ａに対してモータ２１３ａの入力軸が回転しながら接続できる機構を持っている。具体的には、モータ２１３ａの入力軸がバネによって上下することができ、ポンプ２１２ａの嵌合穴とモータ２１３ａの入力軸の位置が合わさったときにバネによって押し込まれ接続できるようになっている。ポンプ２１２ｂとモータ２１３ｂとの接続も同様にポンプ２１２ｂに対してモータ２１３ｂの入力軸が回転しながら接続できる機構を持っている。
上述した実施の形態では、供給及び排出される培養液の流量が極めて少ないため、細胞面積の大きな細胞を培養する場合であっても、培養液の消費量を低減することができる。また、近年の再生医療等で求められる細胞が得られるまでの培養期間が１か月程度の長期間であっても、大量の培養液を消費することはなく、細胞培養のコスト低下を図ることができる。
ところで、上述した培養液は、液体培地である。液体培地には、合成培地と天然培地とがある。合成培地は、天然培地と異なり、生理的塩類溶液（塩類溶液）に糖類やビタミン類などの化学物質を混ぜ合わせたものである。そして、合成培地は、特定の哺乳動物、爬虫類、魚類、昆虫、植物などの組織や細胞に、それぞれ、浸透圧、ｐＨ、イオン組成などが至適な塩類溶液の組成であることが要求される。この塩類溶液の組成が最適化された塩類溶液を見い出すために、本実施の形態の細胞培養装置を用いることができる。すなわち、栄養素を含まない塩類溶液を細胞培養装置に供給及び排出して、細胞培養装置内の細胞の生存状態を観察することによって、最適な塩類溶液の組成を見い出すことができる。この場合、本実施の形態の細胞培養装置では、細胞からの老廃物を連続的で長期に排除することができ、かつ、細胞の生存に関するストレスや傷害という他の要因を排除することができるので、最適な塩類溶液の組成を決定することができる。なお、最適な合成培地を見い出す場合、さらに各種栄養素の組成を変えて細胞の生存状態を観察すればよい。
すなわち、本実施の形態の細胞培養装置は、培養細胞の増殖のために必要な栄養素を含む培養液や、培養細胞の短期間の生命維持に必要な、栄養素を含まない塩類溶液などの液体を培養皿３内に供給し、かつ、排出するものである。
１，２００ 細胞培養装置
２，２０１ 基板
２ａ，２ｂ フランジ
２ｃ，２ｄ 穴
２ｅ 培養皿用基板
３，２０３ａ，２０３ｂ 培養皿
３ａ 供給口側面
３ｂ 排出口側面
３ｃ，３ｄ 流れ方向側面
３ｅ 底面
４，２５３ 供給口
５，２５４ 排出口
６ 培養細胞
１０ 送液部
１１，２１１ リザーバタンク
１２，２１２ａ，２１２ｂ 供給側微小流量ポンプ
１２ａ，２２ａ ポンプ群
１２ｂ，２２ｂ 減速機
１２ｃ，２２ｃ，２１３ａ，２１３ｂ モータ
１３，２３ 絞り調整機構
２０ 排液部
２１，２２３ 廃液タンク
２２ 排出側微小流量ポンプ
３０ 流量制御部
４０ 温度制御部
４１ 透明導電膜ヒータ
４２，４４ 温度センサ
４３ ペルチェ素子
５０ 電源
５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ） 水平調整機構
５２ 水準器
５３ 調整ダイヤル
５３ａ ネジ部
５４ 傾斜部材
５４ａ，５５ａ 傾斜部
５５ 昇降部材
６１〜６４，７１〜７４ 接続部
７５ 供給側流路
７６ 排出側流路
８０ 運搬箱
８１，８２ 電源コネクタ
８３ バッテリ
１０３ａ，１０３ｂ，１１１ａ，１１１ｂ，１２１ａ，１２１ｂ 押さえ部材
２２０ 流路プレート
Ｃ 直線
Ｄ 相対濃度
Ｅ１ 先端領域
Ｌ１１，Ｌ１２，Ｌ２１，Ｌ２２ 流路
Ｌ２３１ 第１の流路
Ｌ２３２ 第２の流路
Ｌ２３３ 第３の流路
Ｌ２３４ 第４の流路
Ｐ１，Ｐ２ 圧力
Ｒ 距離
ＳＤ 液位検出センサ
Ｖ 移動線速度
Ｖ１ 拡散速度
Ｖｍａｘ 最大速度
２，２０１ 基板
２ａ，２ｂ フランジ
２ｃ，２ｄ 穴
２ｅ 培養皿用基板
３，２０３ａ，２０３ｂ 培養皿
３ａ 供給口側面
３ｂ 排出口側面
３ｃ，３ｄ 流れ方向側面
３ｅ 底面
４，２５３ 供給口
５，２５４ 排出口
６ 培養細胞
１０ 送液部
１１，２１１ リザーバタンク
１２，２１２ａ，２１２ｂ 供給側微小流量ポンプ
１２ａ，２２ａ ポンプ群
１２ｂ，２２ｂ 減速機
１２ｃ，２２ｃ，２１３ａ，２１３ｂ モータ
１３，２３ 絞り調整機構
２０ 排液部
２１，２２３ 廃液タンク
２２ 排出側微小流量ポンプ
３０ 流量制御部
４０ 温度制御部
４１ 透明導電膜ヒータ
４２，４４ 温度センサ
４３ ペルチェ素子
５０ 電源
５１（５１ａ，５１ｂ，５１ｃ，５１ｄ） 水平調整機構
５２ 水準器
５３ 調整ダイヤル
５３ａ ネジ部
５４ 傾斜部材
５４ａ，５５ａ 傾斜部
５５ 昇降部材
６１〜６４，７１〜７４ 接続部
７５ 供給側流路
７６ 排出側流路
８０ 運搬箱
８１，８２ 電源コネクタ
８３ バッテリ
１０３ａ，１０３ｂ，１１１ａ，１１１ｂ，１２１ａ，１２１ｂ 押さえ部材
２２０ 流路プレート
Ｃ 直線
Ｄ 相対濃度
Ｅ１ 先端領域
Ｌ１１，Ｌ１２，Ｌ２１，Ｌ２２ 流路
Ｌ２３１ 第１の流路
Ｌ２３２ 第２の流路
Ｌ２３３ 第３の流路
Ｌ２３４ 第４の流路
Ｐ１，Ｐ２ 圧力
Ｒ 距離
ＳＤ 液位検出センサ
Ｖ 移動線速度
Ｖ１ 拡散速度
Ｖｍａｘ 最大速度
Claims (16)
- 培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養方法であって、
前記培養細胞を挟むように前記培養皿の一端に前記液体の供給口を設けるとともに前記培養皿の他端に前記液体の排出口を設け、前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記液体を前記培養皿に供給しつつ排出することを特徴とする細胞培養方法。 - 前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする細胞培養方法。
- 培養細胞を培養皿内に配置し、前記培養皿内に前記培養細胞の増殖あるいは維持に必要な液体を供給するとともに前記培養皿内の前記液体を排出して前記培養細胞を連続して培養する細胞培養装置であって、
前記培養皿の一端に設けられた前記液体の供給口と、
前記供給口との間で前記培養細胞を挟むように前記培養皿の他端に設けられた前記培養皿の排出口と、
前記培養皿に供給する前記液体を蓄えるリザーバタンクと、
前記培養皿から排出された前記液体を蓄える廃液タンクと、
前記供給口を介して前記リザーバタンク内の前記液体を前記培養皿に供給する供給側微小流量ポンプと、
前記排出口を介して前記培養皿から前記液体を排出する排出側微小流量ポンプと、
前記供給口から前記排出口に向かう前記液体の移動線速度が、前記培養細胞にせん断応力を与えない最大速度未満となるように前記供給側微小流量ポンプ及び前記排出側微小流量ポンプの流量制御を行う流量制御部と、
を備えたことを特徴とする細胞培養装置。 - 前記液体の移動線速度は、前記液体の分子運動による拡散速度以下であることを特徴とする請求項３に記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の側面の表面自由エネルギーは、前記培養皿の底面の表面自由エネルギーに比して小さいことを特徴とする請求項３または４に記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底面を水平に調整する水平調整機構を備えたことを特徴とする請求項３〜５のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底面を斜めに調整する傾斜調整機構を備えたことを特徴とする請求項３〜６のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記供給口及び前記排出口は、複数であり、それぞれ線状に離散配置されることを特徴とする請求項３〜７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、及び、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間は、可撓性チューブで接続され、
前記供給側微小流量ポンプと前記供給口との間、及び前記排出側微小流量ポンプと前記排出口との間に、それぞれ前記可撓性チューブの開口を絞る絞り調整機構を設けたことを特徴とする請求項３〜７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、前記供給側微小流量ポンプの流出口と前記供給口との間、前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、及び、前記排出側微小流量ポンプの流出口と前記廃液タンクとの間は、着脱自在に直接接続されることを特徴とする請求項３〜７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記供給口と前記供給側微小流量ポンプの流出口とを結ぶ供給側流路の上部に前記リザーバタンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の供給口側に横置きし、他端から、前記供給側微小流量ポンプの流入口を前記リザーバタンクに着脱自在に接続するとともに前記供給側微小流量ポンプの流出口を前記供給側流路の流入口に着脱自在に接続し、
前記排出口と前記排出側微小流量ポンプの流入口とを結ぶ排出側流路の上部に前記廃液タンクを設けた多段配置構成の一端を前記培養皿の排出口側に横置きし、他端から、前記排出側微小流量ポンプの流出口を前記廃液タンクに着脱自在に接続するとともに前記排出側微小流量ポンプの流入口を前記排出側流路の流出口に着脱自在に接続したことを特徴とする請求項１０に記載の細胞培養装置。 - 前記リザーバタンクと前記供給側微小流量ポンプとの間の第１の流路、前記供給側微小流量ポンプと前記培養皿との間の第２の流路、前記培養皿と前記排出側微小流量ポンプとの間の第３の流路、前記排出側微小流量ポンプと前記廃液タンクとの間の第４の流路とを内部に埋め込み形成し、前記リザーバタンク、前記培養皿、前記廃液タンクの上部に配置される流路プレートを備え、
前記第１の流路と前記供給側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第２の流路と前記供給側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続され、前記第３の流路と前記排出側微小流量ポンプの流入口との間、および前記第４の流路と前記排出側微小流量ポンプの流出口との間がピンポート接続されることを特徴とする請求項３〜７のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記培養皿内の液位を検出する液位検出センサを備え、
前記流量制御部は、前記液位検出センサが検出する液位が一定となるように流量制御を行うことを特徴とする請求項３〜１２のいずれか一つに記載の細胞培養装置。 - 前記供給側微小流量ポンプを駆動する供給側駆動源は前記供給側微小流量ポンプに対して着脱可能であり、前記排出側微小流量ポンプを駆動する排出側駆動源は前記排出側微小流量ポンプに対して着脱可能であることを特徴とする請求項３〜１３のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 少なくとも前記培養皿を配置する基板を備え、前記基板は、前記培養細胞の培養状態を観察する領域に、穴、または前記培養皿が配置される反対側が開口した無色透明の凹部を形成していることを特徴とする請求項３〜１４のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
- 前記培養皿の底部に設けられた透明導電膜ヒータと、
前記培養皿内の前記液体の温度を検出する温度センサと、
前記温度センサの検出結果をもとに前記透明導電膜ヒータを通電して前記培養皿内の前記液体の温度を所定温度範囲内に保つ制御を行う温度制御部と、
を備えたことを特徴とする請求項３〜１５のいずれか一つに記載の細胞培養装置。
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|---|---|---|---|
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| PCT/JP2015/084698 WO2016093321A1 (ja) | 2014-12-11 | 2015-12-10 | 細胞培養方法及び細胞培養装置 |
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