WO2019172030A1 - 腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法 - Google Patents

腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法 Download PDF

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平井清華
大槻誠
三木大輔
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    • C12Q2600/158—Expression markers

Definitions

  • the present invention relates to a method for collecting and detecting tumor markers and tumor cells contained in a sample.
  • the present invention relates to a method for recovering and detecting the tumor cells separately from the contaminating cells contained in the sample by using a protein or gene expressed by the tumor cells contained in the sample.
  • CTC Complementary Tumor cell
  • the CTC detection / analysis is performed from among a large number of cells.
  • a technique for collecting and detecting a small number of cells separately is required.
  • CTC CTC cytokeratin
  • EpCAM Epihelial Cell Adhesion Molecule
  • cytokeratin has a problem of cross (non-specific detection) with contaminating cells contained in blood
  • EpCAM has a problem that only a part of epithelial CTCs can be recovered and detected.
  • An object of the present invention is to provide a method for recovering and detecting a tumor marker and tumor cells contained in a sample separately from contaminating cells contained in the sample.
  • the present inventors conducted a comparative expression analysis using a next-generation sequencer of 10 types of cancer cell lines and white blood cells, which are healthy samples, and as a result, the tumor cells contained in the samples were analyzed.
  • the present inventors have found a tumor marker that can be recovered and detected separately from the contaminating cells contained in the sample, and have reached the present invention.
  • the present invention can be exemplified as follows.
  • polypeptides selected from the group consisting of the following (i) to (iii) present in a sample are detected, and tumor cells contained in the sample are detected separately from contaminating cells Method.
  • a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6
  • a method for detecting tumor cells contained in a sample by distinguishing them from contaminating cells comprising detecting a gene encoding any of the following polypeptides (i) to (iii) present in the sample: (I) a polypeptide comprising at least the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 (iii) a splicing variant of the amino acid sequence of any of SEQ ID NOs: 1 to 6 Or a polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a method for recovering tumor cells wherein tumor cells contained in a sample are detected separately from contaminating cells, and the detected tumor cells are recovered using a recovery means, The recovery method, wherein the tumor cell is detected by detecting one or more polypeptides selected from the group consisting of the following (i) to (iii) present in the sample.
  • polypeptide comprising at least the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • Polypeptide comprising at least an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6
  • Splicing of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 A polypeptide comprising at least a variant, or a polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a tumor marker comprising a polypeptide of any of the following (i) to (iii), wherein tumor cells contained in a sample can be detected separately from leukocytes contained in the sample.
  • a polypeptide comprising at least the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • Polypeptide comprising at least an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6
  • iii) Splicing of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 A polypeptide comprising at least a variant, or a polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a tumor marker comprising a gene encoding any one of the following polypeptides (i) to (iii) and capable of detecting tumor cells contained in a sample by distinguishing them from leukocytes contained in the sample.
  • a polypeptide comprising at least the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • Polypeptide comprising at least an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6
  • iii) Splicing of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 A polypeptide comprising at least a variant, or a polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • a tumor marker comprising a polypeptide according to any one of (i) to (iii) below, which can be recovered by distinguishing tumor cells contained in a sample from leukocytes contained in the sample.
  • a polypeptide comprising at least the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6,
  • Polypeptide comprising at least an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6
  • iii) Splicing of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 A polypeptide comprising at least a variant, or a polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the sample is not limited to tissue or whole blood collected from a patient or the like, ascites, and the like, a sample obtained by diluting the tissue, whole blood, ascites and the like with an appropriate buffer, serum, plasma, Also included are suspensions of umbilical cord blood, components derived from whole blood such as component blood collection, and a piece of tissue containing blood such as liver, lungs, spleen, kidneys, tumors, lymph nodes, etc., suspended in an appropriate buffer. . Furthermore, a fraction containing tumor cells obtained by separating and collecting these samples and suspensions by centrifugation or the like is also included in the samples in the present invention.
  • the contaminating cells contained in the sample in the present invention refer to cells other than tumor cells, and the sample is whole blood, whole blood dilution, whole blood-derived component, tissue suspension containing blood, and In the case of blood samples such as fractions containing tumor cells obtained from these samples and suspensions, red blood cells, white blood cells, platelets and the like are listed.
  • the tumor cell detection method of the present invention is an excellent method for distinguishing from white blood cells contained in a blood sample, which is highly likely to be determined as a false positive in the conventional tumor cell detection method.
  • the method for collecting tumor cells of the present invention is a method for collecting tumor cells negative for EpCAM (Epithelial Cell Adhesion Molecule) contained in a blood sample, which was highly likely to be judged as false negative in the conventional method for collecting tumor cells. It is an excellent method.
  • EpCAM Epidermal Cell Adhesion Molecule
  • tumor cells contained in a sample are obtained by any of the polypeptides (i) to (iii) derived from the cells existing in the cells or the genes encoding the polypeptides.
  • the polypeptide of any one of (i) to (iii) derived from the cells secreted from the tumor cells contained in the sample, or the like Tumor cells may be indirectly detected by detecting a gene encoding the polypeptide.
  • the present invention detects the tumor cell based on the expression level of the polypeptide of any one of (i) to (iii) derived from a tumor cell or a gene encoding the polypeptide. That is, it may be performed based on the presence or absence of tumor cells, or may be performed quantitatively, that is, based on the number of tumor cells or the detection intensity. Also, the detection criteria are not particularly limited. For example, if there is even a small detection signal, it may be determined as a tumor cell, and if there is a detection signal that exceeds a certain threshold, it may be determined as a tumor cell.
  • cells having a signal of 2SD or more, 3SD or more, or 4SD or more of the average value of the signal It may be determined as a tumor cell.
  • the collection of tumor cells in the present invention is performed by detecting tumor cells contained in a sample by detecting any of the polypeptides (i) to (iii) derived from the cells present in the cells. After distinguishing and detecting, the detected cells may be recovered using a recovery means. Any one of the polypeptides (i) to (iii) is a transmembrane polypeptide.
  • the present invention uses the polypeptide of any one of (i) to (iii), which is one of the proteins expressed by the tumor cells, for detection and / or recovery of the tumor cells contained in the sample.
  • the polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 1 is a protein called TM4SF1 (Transmembrane 4 L six family member 1), L6, M3S1, TAAL6, or H-L6, and the amino acid sequence thereof is GenBank No.1. It is shown in NP_055035.1.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 2 is a protein called TNFRSF12A (TNF receptor superfamily member 12A), FN14, TWEAKR, or CD266, and the amino acid sequence thereof is GenBank No. It is shown in NP_057723.1.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 3 is a protein called SDC1 (Syndecan 1), SDC, SYND1, syndecan, or CD138, and the amino acid sequence thereof is GenBank No. It is shown in NP_002988.3.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 4 is a protein called F3 (Coagulation factor III, tissue factor), TF, TFA, or CD142, and the amino acid sequence thereof is GenBank No. NP_001984.1.
  • the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 5 is a protein called EPHA2 (EPH receptor A2), CTPA, CTPP1, CTRCT6, ECK, or ARCC2, and the amino acid sequence thereof is GenBank No. It is shown in NP_004422.2.
  • a polypeptide having the amino acid sequence set forth in SEQ ID NO: 6 is a protein called ITGA2 (Integrin subunit alpha 2), CD49B, GPIA, HPA-5, VLA-2, VLAA2, or BR, and the amino acid sequence thereof is GenBank No. . It is shown in NP_002194.2.
  • TM4SF1 SEQ ID NO: 1
  • TNFRSF12A SEQ ID NO: 2
  • lung adenocarcinoma cells breast cancer cells, breast cancer cells, prostate cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells, cancer
  • EpCAM which is a tumor marker used in conventional detection
  • the tumor cells contained in the sample can be detected in a wide range.
  • TM4SF1 (SEQ ID NO: 1) and TNFRSF12A (SEQ ID NO: 2) are transmembrane proteins, so that they contain a wider range of tumor cells contained in the sample compared to EpCAM, which is a tumor marker used in conventional recovery. Can be recovered.
  • ITGA2 SEQ ID NO: 6
  • ITGA2 SEQ ID NO: 6
  • ITGA2 SEQ ID NO: 6
  • ITGA2 is a transmembrane protein
  • one to several amino acid residues of the amino acid sequence described in any of SEQ ID NOs: 1 to 6 May be substituted or deleted with other amino acid residues, or is an embodiment in which 1 to several amino acid residues are inserted into the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6. Also good.
  • “several” means 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3 or 2.
  • Means an integer. 1 to several amino acid residues are preferably 1 to 10 amino acid residues, more preferably 1 to 5 amino acids, still more preferably 1 to 3 amino acids, and particularly preferably 2 or less. It is.
  • the marker used in the method of the present invention has the same activity as the protein consisting of the amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, with respect to the entire amino acid sequence described in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6.
  • the protein may have a homology of 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more, and still more preferably 95% or more.
  • RNA precursor when expressing a protein from a gene encoding the protein, an intron in the gene (RNA) precursor is removed, and a reaction (splicing) occurs that recombines the exons before and after, but the remaining exons Since there is diversity and various mature mRNAs are produced, proteins with different activities (splicing variants) may be expressed.
  • splicing a reaction that recombines the exons before and after, but the remaining exons Since there is diversity and various mature mRNAs are produced, proteins with different activities (splicing variants) may be expressed.
  • Polypeptides that can be used for detection in the present invention include: A polypeptide comprising at least a splicing variant of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, A polypeptide comprising at least a splicing variant in which one to several amino acid residues of the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 to 6 are substituted or deleted with other amino acid residues, A polypeptide comprising at least a splicing variant of one to several amino acid residues inserted into the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6, A polypeptide comprising at least a splicing variant of a polypeptide having 70% or more homology with the amino acid sequence of any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 is also included.
  • a dye that can specifically label any of the polypeptides described in (i) to (iii) above for example, a chemiluminescent dye or a fluorescent dye
  • Detection may be based on a stained image or staining intensity (for example, luminescence intensity or fluorescence intensity), but from the viewpoint of versatility, an antibody against the above-described polypeptide (hereinafter also simply referred to as anti-polypeptide antibody) or aptamer is used.
  • anti-polypeptide antibody an antibody against the above-described polypeptide
  • aptamer aptamer
  • polypeptides described in (i) to (iii) above are transmembrane proteins, they can be tumor markers that can be recovered by distinguishing tumor cells contained in the sample from leukocytes contained in the sample. .
  • the labeling substance may be appropriately selected from substances usually used in the field of measurement using antigen-antibody reaction, and examples thereof include fluorescent substances such as fluorescein, enzymes such as alkaline phosphatase, and radioactive substances.
  • the binding mode between the antibody and the labeling substance is not limited, and the antibody may be directly bound to the labeling substance by chemical bonding or the like, and the antibody is an antibody against the antibody to which the labeling substance is bound (label). It may be an embodiment indirectly bound by a secondary antibody).
  • the detection format of tumor cells contained in a sample using an anti-polypeptide antibody there is no particular limitation on the detection format of tumor cells contained in a sample using an anti-polypeptide antibody, and it may be detected by ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) method, Western blot method, etc., depending on the method used, AIA-900 Or an enzyme immunoassay device such as AIA-CL2400 (both manufactured by Tosoh Corporation).
  • polypeptides described in the above (i) to (iii) can serve as tumor markers that can be detected by distinguishing tumor cells contained in a sample from leukocytes contained in the sample.
  • the tumor cells are detected separately from contaminated cells using the polypeptide according to any one of (i) to (iii), and then the detection is performed.
  • the collected tumor cells may be recovered using a recovery means.
  • the collecting means there is a means provided with a substrate provided with a holding part capable of holding tumor cells and a collecting part for collecting the tumor cells by suction and discharge with a nozzle, and a specific example is JP-A No. 2016-142616. And a recovery device disclosed in the above.
  • the gene encoding any of the polypeptides (i) to (iii) described above is converted using any one of the polypeptides described in (i) to (iii) above using a codon.
  • the polynucleotide is not particularly limited as long as it is a polynucleotide that can be obtained, and a polynucleotide converted using a human codon is particularly preferable.
  • genes encoding a polypeptide comprising at least the polypeptide consisting of the amino acid sequence set forth in any one of SEQ ID NOs: 1 to 6 include the following sequences.
  • a polynucleotide comprising the nucleotides 235 to 840 of the sequence represented by SEQ ID NO: 7 (GenBank No. NM_01420.2) obtained by converting the polypeptide comprising the sequence represented by SEQ ID NO: 1;
  • a polynucleotide consisting of nucleotides from the 87th to the 473rd of the sequence shown in SEQ ID NO: 8 (GenBank No.
  • NM — 016639.2 obtained by converting the polypeptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 2;
  • a polynucleotide consisting of nucleotides 222 to 1106 of the sequence shown in SEQ ID NO: 10 (GenBank No.
  • NM_001993.4 obtained by converting a polypeptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 4;
  • a polynucleotide consisting of nucleotides 156 to 3083 of the sequence shown in SEQ ID NO: 11 obtained by converting a polypeptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 5;
  • a polynucleotide consisting of nucleotides 144 to 3686 obtained by converting the polypeptide consisting of the sequence shown in SEQ ID NO: 12.
  • the gene detection method described above is not particularly limited.
  • a probe may be designed at an appropriate position in the polynucleotide and then detected by a hybridization method, and a primer may be detected at an appropriate position in the polynucleotide.
  • the PCR method, the RT-PCR method, the TRC (Transcribation Reverse transaction Concatenated) method, the NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification) method, the TMA (Transcribion-Mandation Amplification-polynucleotide method, etc.) May be amplified and detected, or a sample containing the polynucleotide may be directly subjected to a sequencer for detection.
  • the gene encoding the polypeptide described in (i) to (iii) above can be a tumor marker that can be detected by distinguishing tumor cells contained in a sample from leukocytes contained in the sample. It is.
  • detection of tumor cells contained in a sample is performed by any one of six types of amino acid sequences including (i) TM4SF1 (GenBank No. NP_055035.1) and TNFRSF12A (GenBank No. NP_05773.1). (Ii) a polypeptide comprising an amino acid sequence having 70% or more homology with the amino acid sequence of (i), (iii) a splicing variant of the amino acid sequence of (i) or (ii) It can be carried out by detecting a polypeptide according to any one of the polypeptides comprising at least, or a gene encoding these polypeptides. By the detection method, tumor cells that are only slightly contained in the sample can be detected separately from the contaminating cells contained in the sample.
  • recovery of tumor cells contained in the sample is detected using the polypeptide according to any one of (i) to (iii) above, and the detected tumor cells are recovered using a recovery means. This can be done.
  • tumor cells that are only slightly contained in the sample can be collected separately from the contaminating cells contained in the sample.
  • TM4SF1 gene expression analysis result of a healthy subject's leukocyte and various cancer cells It is a figure which shows the TNFRSF12A gene expression analysis result of a healthy subject's leukocyte and various cancer cells. It is a figure which shows the result of having immunostained the blood sample which spiked the lung adenocarcinoma cell (PC14) with (a) anti- TM4SF1 antibody and (b) anti-CD45 antibody. It is a figure which shows the result of having immunostained the blood sample which spiked the pancreatic cancer cell (PANC1) with (a) anti- TM4SF1 antibody and (b) anti-CD45 antibody.
  • PC14 lung adenocarcinoma cell
  • PANC1 pancreatic cancer cell
  • the present invention will be described in more detail using an example in which the sample is a blood sample, but the present invention is not limited to the example.
  • Example 1 Gene Expression Analysis of Healthy Leukocytes and Various Cancer Cells
  • human lung adenocarcinoma cells PC9 and PC14
  • human breast cancer cells MDAMB231
  • human breast cancer cells SKBR3
  • human prostate cancer cells 22 Rv1 and PC3
  • human hepatoma cells HepG2 and HuH-7
  • 10 human pancreatic cancer cells PANC1 and AsPC-1
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Ham's F-12 medium AsPC-1 with 10% (v / v)
  • FBS fetal bovine serum
  • MDAMB231 Leibovitz's L-15 Medium with L-Glutamine medium with 10% (v / v)
  • FBS SKBR3 McCoy's with 10% (v / v) FBS 5a medium
  • HepG2 and HuH-7 DMEM / high glucose medium 22Rv containing 10% (v / v) FBS: RPMI0211-1640 medium containing 10% (v / v) FBS PC3: 10% (v / v) to FBS Kanamycin Streptomyces Ham's F-12K medium containing.
  • nucleotide sequence (sequence data) decoded in (3) above was mapped to a human genome sequence using TopHat2 (JOHNS HOKKINS University) and Bowtie2 (JOHNS HOKKINS University).
  • the human genome sequence and human gene information used was BUILD GRCh38 published by NCBI (National Center for Biological Information).
  • the mapped nucleotide sequence was determined by Cufflinks (Washington University) based on the read number of each gene, and the expression value for each gene in units of FPKM (Fragments Per Kilobase of exon per million reads mapped).
  • the average expression value (FPKM value) in cancer cell lines (10 types, 48 samples) is 10.00 times or more the average expression value (FPKM values) in healthy white blood cells (3 samples, 15 samples), and transmembrane Table 1 shows the genes encoding the type proteins.
  • the analysis results for each sample are shown in FIG. 1 and FIG. 2 for the genes encoding TM4SF1 (SEQ ID NO: 1) and TNFRSF12A (SEQ ID NO: 2), respectively.
  • PC9 and PC14 are human lung adenocarcinoma cells
  • MDAMB231 is a human breast cancer cell
  • SKBR3 is a human breast cancer cell
  • HepG2 and HuH-7 are human hepatoma cells
  • AsPC-1 and PANC1 are human pancreatic cancer cells 22Rv1 and PC3 are the results of human prostate cancer cells
  • Leuco1 to Leuco3 are the results of healthy white blood cells
  • 10 ng is the RNA in multiple cells (10 ng min) )
  • the TM4SF1 gene (SEQ ID NO: 7) has an average expression value (FPKM value) in cancer cell lines (48 samples of 10 types) of 300 times or more of the average FPKM value of leukocytes (3 samples 15 samples), and the TM4SF1 gene Is specifically expressed in cancer cells (tumor cells) and is highly expressed (Table 1).
  • the TM4SF1 gene is highly expressed regardless of the cancer type, such as lung adenocarcinoma cells, breast adenocarcinoma cells, breast cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells and prostate cancer cells (FIG. 1).
  • the number 1) and the gene can detect a wide range of tumor cells contained in the sample as compared with EpCAM, which is a tumor marker used in conventional detection.
  • EpCAM which is a tumor marker used in conventional detection.
  • the TM4SF1 protein SEQ ID NO: 1 is a transmembrane protein, it can be seen that tumor cells contained in the sample can be recovered over a wide range compared to EpCAM, which is a tumor marker used in conventional recovery.
  • the average expression value (FPKM value) in cancer cell lines (10 types and 48 samples) is 50 times or more than the average FPKM value in white blood cells (3 samples 15 samples), It can be seen that the TNFRSF12A gene is specifically and highly expressed in cancer cells (tumor cells) (Table 1). In addition, the TNFRSF12A gene is highly expressed regardless of the cancer type, such as lung adenocarcinoma cells, breast adenocarcinoma cells, breast cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells, and prostate cancer cells (FIG. 2).
  • the number 2) and the gene can detect a wide range of tumor cells contained in the sample as compared with EpCAM, which is a tumor marker used in conventional detection.
  • EpCAM which is a tumor marker used in conventional detection.
  • the TNFRSF12A protein (SEQ ID NO: 2) is a transmembrane protein, it can be seen that tumor cells contained in the sample can be recovered over a wide range compared to EpCAM, which is a tumor marker used in conventional recovery.
  • the average of the expression values (FPKM values) in the lung adenocarcinoma cell lines (2 types and 10 samples) is 10.00 times or more the average of the expression values (FPKM values) in the healthy white blood cells (3 samples 15 samples), and Table 2 shows genes encoding transmembrane proteins.
  • the average expression value (FPKM value) in breast cancer or breast cancer cell lines (two types of 10 samples) is 10.00 times or more the average expression value (FPKM values) in healthy white blood cells (3 samples 15 samples), Table 3 shows genes encoding transmembrane proteins.
  • the average expression value (FPKM value) in prostate cancer cell lines (2 types and 8 samples) is not less than 10.00 times the average expression value (FPKM value) in healthy white blood cells (3 samples and 15 samples), and the membrane Table 4 shows the genes encoding penetrating proteins.
  • the average expression value (FPKM value) in the hepatoma cell lines (10 samples from 2 types) is 10.00 times or more the average expression value (FPKM value) in white blood cells (15 samples from 3 subjects), and transmembrane Table 5 shows the genes encoding the type proteins.
  • the average expression value (FPKM value) in pancreatic cancer cell lines (10 samples of 2 types) is 10.00 times or more of the average expression value (FPKM value) in white blood cells (3 samples 15 samples), and the membrane Table 6 shows the genes encoding penetrating proteins.
  • the average expression value (FPKM value) in cancer cell lines (10 types and 48 samples) shown in Table 1 is 10.00 times or more the average expression value (FPKM value) in healthy white blood cells (3 samples 15 samples).
  • Table 7 shows the genes that were 0.000 times or more.
  • the proteins and genes shown in this table can detect a wide range of tumor cells contained in a sample as compared with EpCAM, which is a tumor marker used in conventional detection.
  • EpCAM which is a tumor marker used in conventional detection.
  • the proteins shown in this table are transmembrane proteins, as described above, it is suggested that the tumor cells contained in the sample can be recovered in a wide range compared to EpCAM, which is a tumor marker used in conventional recovery.
  • the average expression value (FPKM value) in pancreatic cancer cell lines (two types and 10 samples) shown in Table 6 is 10.00 times or more the average expression value (FPKM value) in healthy white blood cells (15 samples from 3 samples).
  • the average expression values (FPKM values) in cell lines other than pancreatic cancer lung adenocarcinoma, breast adenocarcinoma or breast cancer, prostate cancer, liver cancer
  • Table 8 shows genes that are less than 10.00 times the average of the values (FPKM values). It is suggested that the proteins and genes shown in this table can specifically detect pancreatic cancer cells.
  • the protein shown in this table is a transmembrane protein, it is suggested that pancreatic cancer cells can be specifically recovered.
  • Example 2 Staining of cancer cells and leukocytes using anti-TM4SF1 antibody Since TM4SF1 gene was found to be highly expressed in cancer cells compared to leukocytes in healthy subjects in Example 1, TM4SF1 was expressed in blood samples. It was examined whether it could be used for specific detection of contained tumor cells.
  • a sample obtained by removing red blood cells from the blood of a healthy person using a specific gravity separation method is used as a blood sample to be used in this example, and human lung adenocarcinoma cells (PC14) or human pancreatic cancer cells (PANC1) are added to the sample. Each spiked.
  • FIG. 3 shows the staining results of human lung adenocarcinoma cells (PC14), and FIG. 4 shows the staining results of human pancreatic cancer cells (PANC1).
  • the cells indicated by arrows are spiked cancer cells.
  • cells stained with an antibody against TM4SF1 (anti-TM4SF1 antibody) (cells indicated by arrows in FIGS. 3A and 4A) are not stained with an antibody against CD45.
  • FIG. 3B and FIG. 4B shows that TM4SF1 (SEQ ID NO: 1) can be used as a tumor marker for detecting tumor cells contained in a blood sample separately from leukocytes contained in the sample.
  • Example 3 Staining of cancer cells and leukocytes using an anti-TNFRSF12A antibody
  • TNFRSF12A gene was highly expressed in cancer cells compared to leukocytes in healthy subjects, and therefore TNFRSF12A was present in blood samples. It was examined whether it could be used for specific detection of contained tumor cells.
  • a sample obtained by removing erythrocytes from the blood of a healthy person using a specific gravity difference separation method is used as a blood sample used in this example, and human lung adenocarcinoma cells (PC9) or human breast adenocarcinoma cells (MDAMB231) are used as the sample. Each spiked.
  • FIG. 5 The staining result of human lung adenocarcinoma cells (PC9) is shown in FIG. 5, and the staining result of human breast adenocarcinoma cells (MDAMB231) is shown in FIG.
  • the cells indicated by arrows are spiked cancer cells.
  • cells stained with an antibody against TNFRSF12A (anti-TNFRSF12A antibody) (cells indicated by arrows in FIGS. 5A and 6A) are not stained with an antibody against CD45.
  • FIG. 5B and FIG. 6B From this, it can be seen that TNFRSF12A (SEQ ID NO: 2) can be used as a tumor marker for detecting tumor cells contained in a blood sample separately from leukocytes contained in the sample.
  • Example 4 Staining of cancer cells and leukocytes using anti-F3 antibody Since it was found in Example 1 that the F3 gene is highly expressed in cancer cells compared to leukocytes in healthy subjects, F3 is present in blood samples. It was examined whether it could be used for specific detection of contained tumor cells.
  • a sample obtained by removing erythrocytes from the blood of a healthy person using a specific gravity difference separation method is used as a blood sample used in this example, and human lung adenocarcinoma cells (PC9) or human breast adenocarcinoma cells (MDAMB231) are used as the sample. Each spiked.
  • FIG. 7 shows the staining result of human lung adenocarcinoma cells (PC9)
  • FIG. 8 shows the staining result of human breast adenocarcinoma cells (MDAMB231).
  • the cells indicated by arrows are spiked cancer cells.
  • cells stained with an antibody against F3 (anti-F3 antibody)
  • FIGS. 7A and 8A are not stained with an antibody against CD45.
  • F3 SEQ ID NO: 4
  • F3 SEQ ID NO: 4
  • Example 5 Staining of cancer cells and leukocytes using anti-EPHA2 antibody Since it was found in Example 1 that the EPHA2 gene was highly expressed in prostate cancer cells as compared with leukocytes in healthy subjects, EPHA2 was present in blood samples. It was examined whether it can be used for specific detection of prostate cancer cells contained in the above.
  • a sample obtained by removing erythrocytes from the blood of a healthy person using a specific gravity difference separation method was used as a blood sample to be used in this example, and human prostate cancer cells (PC3) were spiked into the sample.
  • FIG. 9 The results of staining human prostate cancer cells (PC3) are shown in FIG. In the figure, the cells indicated by arrows are spiked prostate cancer cells.
  • cells stained with an antibody against EPHA2 (anti-EPHA2 antibody) (cells indicated by arrows in FIG. 9A) were not stained with an antibody against CD45 (FIG. 9B). From this, it can be seen that EPHA2 (SEQ ID NO: 5) can be used as a tumor marker for detecting prostate cancer cells contained in a blood sample separately from leukocytes contained in the sample.
  • Example 6 Staining of cancer cells and leukocytes using anti-ITGA2 antibody Since it was found in Example 1 that the ITGA2 gene was highly expressed in pancreatic cancer cells compared to leukocytes in healthy subjects, ITGA2 was present in blood samples. It was investigated whether it could be used for specific detection of pancreatic cancer cells contained in the above.
  • a sample obtained by removing erythrocytes from the blood of a healthy person using a specific gravity separation method was used as a blood sample to be used in this example, and human pancreatic cancer cells (PANC1 or AsPC-1) were spiked on the sample.
  • PANC1 or AsPC-1 human pancreatic cancer cells
  • HBSS Human's Balanced Salt Solution
  • FIG. 10 shows the staining result of human pancreatic cancer cell PANC1
  • FIG. 11 shows the staining result of human pancreatic cancer cell AsPC-1.
  • the cells indicated by arrows are pancreatic cancer cells spiked.
  • cells stained with an antibody against ITGA2 (anti-ITGA2 antibody)
  • FIGS. 10A and 11A are not stained with an antibody against CD45.
  • FIG. 10 (b) and FIG. 11 (b) shows that ITGA2 (SEQ ID NO: 6) can be used as a tumor marker for detecting pancreatic cancer cells contained in a blood sample separately from leukocytes contained in the sample.
  • Example 7 Staining of cancer cells using anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody and anti-EpCAM antibody
  • TM4SF1 gene and TNFRSF12A gene are highly expressed in cancer cells compared to leukocytes in healthy subjects. Therefore, it was investigated whether TM4SF1 protein and TNFRSF12A protein can be used for detection of cancer cells using antibodies that recognize TM4SF1, TNFRSF12A and the existing tumor marker EpCAM.
  • the cancer cell lines (10 strains) used in Example 1 were used as cancer cells.
  • HBSS Human's Balanced Salt Solution
  • Table 9 shows the results of staining cancer cells using anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody and anti-EpCAM antibody.
  • the staining results are shown by the intensity of the fluorescent signal caused by each fluorescently labeled antibody (from 5 levels from + to +++++). The higher the intensity of the signal (the greater the number of +), the higher the intensity. It is expressed (signal intensity (expression amount): + ⁇ ++ ⁇ ++++ ⁇ ++++++ ⁇ ++++++).
  • TM4SF1 protein (SEQ ID NO: 1) and TNFRSF12A protein (SEQ ID NO: 2) are expressed regardless of the cancer type, such as lung adenocarcinoma cells, breast cancer cells, breast cancer cells, prostate cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells. It can be seen that tumor cells contained in the sample can be detected in a wide range. In addition, this result suggests that TM4SF1 protein and TNFRSF12A protein can recover tumor cells contained in the sample in a wide range regardless of cancer type (lung cancer, breast cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, pancreatic cancer). .
  • TM4SF1 and / or TNFRSF12A is highly expressed (+ is also expressed in cell lines (PC-14, MDAMB231, PC-3, PANC1) that are low in expression (only one +) in EpCAM, which is an existing tumor marker. 4 or more), it is suggested that the combination of TM4SF1 and / or TNFRSF12A and EpCAM can detect and collect tumor cells contained in the sample with high accuracy.
  • Example 8 Recovery of cancer cells using anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody and anti-EpCAM antibody
  • TM4SF1 protein (SEQ ID NO: 1) and TNFRSF12A protein (SEQ ID NO: 2) are existing tumor markers EpCAM protein was found to be highly expressed even in low-expressing cell lines (PC-14, MDAMB231, PC-3, PANC1), so that TM4SF1 protein, TNFRSF12A protein and EpCAM protein which is an existing tumor marker were It was investigated whether the cancer cells contained in the sample could be recovered using the antibodies that recognize each.
  • the human pancreatic cancer cell line PANC1 with low expression of EpCAM protein was used as the cancer cell.
  • the “buffer” used in the following procedure is D-PBS ( ⁇ ) containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Mg 2+ and Ca 2+ free). .
  • FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec) was added to 100 ⁇ L of the cell suspension, followed by blocking treatment at room temperature for 10 minutes.
  • Table 10 shows the recovery results of cancer cells when any or all of the anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody and anti-EpCAM antibody were used.
  • the ratio of the number of recovered cells to the number of spiked cells is shown as the cell recovery rate [%].
  • the TM4SF1 protein and the TNFRSF12A protein can recover cancer cells with a low recovery rate from the blood sample with high efficiency in the existing marker EpCAM protein. Moreover, it turns out that cancer cells with a low recovery rate of EpCAM protein can be recovered more efficiently by combining TM4SF1 protein and TNFRSF12A protein and EpCAM protein.
  • Example 9 Staining of cancer cells using anti-SDC1 antibody Since it was found in Example 1 that the SDC1 gene was highly expressed in cancer cells compared to leukocytes of healthy subjects, an antibody that recognizes SDC1 was used. Then, it was examined whether SDC1 can be used for detection of cancer cells. In this example, the cancer cell lines (10 strains) used in Example 1 were used as cancer cells.
  • FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec) was added to 100 ⁇ L of each cancer cell line suspension (1 ⁇ 10 4 cells / 100 ⁇ L), followed by blocking treatment at room temperature for 10 minutes.
  • anti-SDC1 antibody PE-anti-human SDC1 Antibody, Miltenyi Biotec
  • HBSS Human's Balanced Salt Solution
  • SDC1 protein SEQ ID NO: 3 is expressed regardless of the cancer type, including lung adenocarcinoma cells, breast adenocarcinoma cells, breast cancer cells, prostate cancer cells, liver cancer cells, pancreatic cancer cells, and is included in the sample.
  • tumor cells can be detected in a wide range.
  • SDC1 protein can recover a wide range of tumor cells contained in a sample regardless of cancer types (lung cancer, breast cancer, breast cancer, prostate cancer, liver cancer, pancreatic cancer).
  • SDC1 is also highly expressed (4+) in cell lines (PC-14, MDAMB231, PC-3) of low expression (only one +, see Table 9) in the existing tumor marker EpCAM. From the above, it is suggested that tumor cells contained in a sample can be detected and collected with high accuracy by combining SDC1 and EpCAM.
  • Example 10 Staining of cancer cells and leukocytes using anti-SDC1 antibody
  • SDC1 gene was highly expressed in breast cancer or breast cancer cells and pancreatic cancer cells as compared with leukocytes in healthy subjects.
  • SDC1 can be used for specific detection of breast cancer cells and pancreatic cancer cells contained in blood samples.
  • a sample obtained by removing red blood cells from the blood of a healthy person using a specific gravity difference separation method is used as a blood sample used in this example, and human breast cancer cells (SKBR3) or human pancreatic cancer cells (AsPC-1) are used as the samples. Each spiked.
  • HBSS Human's Balanced Salt Solution
  • FIG. 12 The result of staining human breast cancer cell SKBR3 is shown in FIG. 12, and the result of staining human pancreatic cancer cell AsPC-1 is shown in FIG.
  • the cells indicated by the arrows are spiked breast cancer cells and pancreatic cancer cells.
  • FIGS. 12 and 13 cells stained with an antibody against SDC1 (anti-SDC1 antibody) (cells indicated by arrows in FIGS. 12A and 13A) are not stained with an antibody against CD45.
  • SDC1 SEQ ID NO: 3
  • SDC1 SEQ ID NO: 3
  • Example 11 Recovery of cancer cells using anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody, anti-SDC1 antibody and anti-EpCAM antibody
  • TM4SF1 protein SEQ ID NO: 1
  • TNFRSF12A protein SEQ ID NO: 2
  • SDC1 protein SEQ ID NO: 3
  • EpCAM protein which is an existing tumor marker
  • human prostate cancer cell line PC-3 with low expression of EpCAM protein was used as the cancer cell.
  • the “buffer” used in the following procedure is D-PBS ( ⁇ ) containing 0.5% BSA and 2 mM EDTA (Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, Mg 2+ and Ca 2+ free). .
  • PC-3 Human prostate cancer cell line 100 ⁇ L (100 cells) was spiked into 1 mL of healthy human blood.
  • FcR Blocking Reagent (Miltenyi Biotec) was added to 100 ⁇ L of the cell suspension, followed by blocking treatment at room temperature for 10 minutes.
  • anti-TM4SF1 antibody PE-anti-human TM4SF1 Antibody, R & D systems
  • 2.5 ⁇ L of anti-TNFRSF12A antibody PE-anti-human TNFRSF12A Antibody, ⁇ LugenPE, anti-BioLPE5 antibody
  • anti-EpCAM antibody 10 ⁇ L PE-anti-human EpCAM Antibody, Miltenyi Biotec
  • Table 12 shows the recovery results of cancer cells when using any of anti-TM4SF1 antibody, anti-TNFRSF12A antibody, anti-SDC1 antibody and anti-EpCAM antibody, and all three or four types excluding anti-EpCAM antibody.
  • the ratio of the number of recovered cells to the number of spiked cells is shown as the cell recovery rate [%].
  • the TM4SF1 protein, the TNFRSF12A protein, and the SDC1 protein can recover cancer cells, which have a low recovery rate with the existing marker EpCAM protein, from a blood sample with high efficiency.
  • recovery rate by EpCAM protein can be collect

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Abstract

試料中に含まれる腫瘍細胞を、夾雑細胞と区別して回収および検出する方法を提供する。　試料中に存在する、（ｉ）ＴＭ４ＳＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５５０３５．１）、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５７７２３．１）等の６種のいずれかのアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、（ｉｉ）前記アミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、（ｉｉｉ）前記アミノ酸配列（前述した（ｉ）（ｉｉ）のアミノ酸配列）のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、のいずれかのポリペプチド、又はこれらポリペプチドをコードする遺伝子を検出することにより、試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する。

Description

腫瘍マーカーならびに腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収および検出する方法
　本発明は、腫瘍マーカーならびに試料中に含まれる腫瘍細胞の回収および検出法に関する。特に本発明は、試料中に含まれる腫瘍細胞が発現するタンパク質または遺伝子を用いて、前記腫瘍細胞を前記試料中に含まれる夾雑細胞と区別して回収および検出する方法に関する。
　腫瘍細胞が原発巣から離脱すると、血管内またはリンパ管内へと浸透し、血液中またはリンパ液中を循環した後、最終的に他臓器や組織に侵入することで、転移巣を形成する。ここで血液中を循環する腫瘍細胞はＣＴＣ（Ｃｉｒｃｕｌａｔｉｎｇ　Ｔｕｍｏｒ　ｃｅｌｌ）とも呼ばれ、多くの臨床試験や研究がなされている。例えば、患者から採取した血液中に含まれるＣＴＣの数を測定したり（特許文献１）、前記ＣＴＣにおけるタンパク質の発現や遺伝子の突然変異もしくは転座を調べることで、前記患者の予後予測や癌再発予測に関する情報を提供する。しかしながら、血液中に含まれるＣＴＣの数は非常に少なく、かつ血液中には赤血球や白血球など多種多様な夾雑細胞が含まれているため、ＣＴＣ検出／解析の際は、大量の細胞の中から僅かな細胞を区別して回収および検出する技術が必要となる。
　従来、ＣＴＣの検出にはサイトケラチンやＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）（特許文献１）などＣＴＣで発現するタンパク質（腫瘍マーカー）を用いて行なっている。しかしながら、サイトケラチンは血液中に含まれる夾雑細胞とのクロス（非特異検出）の問題があり、ＥｐＣＡＭには上皮性由来の一部のＣＴＣしか回収および検出できない問題があった。
日本国特表２００８－５３３４８７号公報
　本発明の課題は、腫瘍マーカーならびに試料中に含まれる腫瘍細胞を、当該試料中に含まれる夾雑細胞と区別して回収および検出する方法を提供することにある。
　上記課題を解決するために、本発明者らは１０種類の癌細胞株と健常者試料である白血球との次世代シークエンサーを用いた比較発現解析を行なった結果、試料中に含まれる腫瘍細胞を、当該試料中に含まれる夾雑細胞と区別して回収および検出可能な腫瘍マーカーを見出し、本発明に到達した。
　すなわち本発明は以下の通り例示できる。
　［１］
　試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを検出することを特徴とする、試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出する方法。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　［２］
　（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを特異的に認識する抗体またはアプタマーを用いて検出する、［１］に記載の方法。
　［３］
　試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を検出することを特徴とする、試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出する方法。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　［４］
　試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出し、当該検出した腫瘍細胞を回収手段を用いて回収する、腫瘍細胞の回収方法であって、
腫瘍細胞の検出を試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを検出することで行なう、前記回収方法。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　［５］
　腫瘍細胞の検出を（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを特異的に認識する抗体またはアプタマーを用いて行なう、［４］に記載の方法。
　［６］
　試料が血液であり、試料中に含まれる夾雑細胞が白血球である、［１］から［５］のいずれかに記載の方法。
　［７］
　以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドからなる、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカー。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　［８］
　以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子からなる、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカー。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　［９］
　以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドからなる、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して回収可能な腫瘍マーカー。
（ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
（ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
（ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド。
　以下、本発明を詳細に説明する。
　本発明において試料とは、患者などから採取される組織や全血、腹水等に限定されるものではなく、当該組織や全血、腹水等を適切な緩衝液で希釈した試料、血清、血漿、臍帯血、成分採血液などの全血由来の成分、肝臓、肺、脾臓、腎臓、腫瘍、リンパ節などの血液を含む組織の一片を適切な緩衝液で懸濁させた懸濁液も含まれる。さらにこれらの試料や懸濁液を遠心分離などにより分離回収して得られた、腫瘍細胞を含む画分も、本発明における試料に含まれる。
　本発明において試料中に含まれる夾雑細胞とは、腫瘍細胞以外の細胞のことをいい、試料が、全血、全血希釈液、全血由来の成分、血液を含む組織の懸濁液、ならびにこれらの試料や懸濁液から得られた腫瘍細胞を含む画分といった血液試料の場合は、赤血球、白血球、血小板などがあげられる。中でも本発明の腫瘍細胞の検出方法は、従来の腫瘍細胞の検出方法では偽陽性と判断される可能性の高かった、血液試料中に含まれる白血球との識別に優れた方法である。また本発明の腫瘍細胞の回収方法は、従来の腫瘍細胞の回収方法では偽陰性と判断される可能性の高かった、血液試料中に含まれるＥｐＣＡＭ（Ｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ　Ｃｅｌｌ　Ａｄｈｅｓｉｏｎ　Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）陰性の腫瘍細胞の回収に優れた方法である。
　本発明における腫瘍細胞の検出は、試料中に含まれる腫瘍細胞を、当該細胞中に存在する当該細胞由来の前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードする遺伝子に基づき、染色やプローブハイブリダイゼーション法などにより直接検出してもよく、また試料中に含まれる腫瘍細胞から分泌される当該細胞由来の前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードする遺伝子を検出することで、腫瘍細胞を間接的に検出してもよい。
　本発明は、腫瘍細胞由来の前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドまたは当該ポリペプチドをコードする遺伝子の発現量に基づき前記腫瘍細胞を検出するが、当該検出は定性的に、すなわち腫瘍細胞の有無に基づき行なってもよいし、定量的に、すなわち腫瘍細胞数や検出強度に基づき行なってもよい。また検出の判断基準も特に限定はなく、例えば、検出シグナルが少しでもあれば腫瘍細胞と判断してもよく、一定の閾値以上の検出シグナルがあれば腫瘍細胞と判断してもよく、試料中に含まれる夾雑細胞（例えば血液試料の場合は、赤血球や白血球など）が有するシグナルに対し、一定の値以上または当該シグナルの平均値の２ＳＤ以上、３ＳＤ以上もしくは４ＳＤ以上のシグナルを有した細胞を腫瘍細胞と判断してもよい。
　本発明における腫瘍細胞の回収は、試料中に含まれる腫瘍細胞を、当該細胞中に存在する当該細胞由来の前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドを検出することで夾雑細胞と区別して検出した後、当該検出した細胞を回収手段を用いて回収して行なえばよい。なお前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドは、いずれも膜貫通型のポリペプチドである。
　本発明は、試料中に含まれる腫瘍細胞の検出および／または回収に、当該腫瘍細胞が発現するタンパク質の一つである、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドを用いることを特徴とする。
　配列番号１に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＴＭ４ＳＦ１（Ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　４　Ｌ　ｓｉｘ　ｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　１）、Ｌ６、Ｍ３Ｓ１、ＴＡＡＬ６、またはＨ－Ｌ６と呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５５０３５．１に示される。
配列番号２に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＴＮＦ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ　ｍｅｍｂｅｒ　１２Ａ）、ＦＮ１４、ＴＷＥＡＫＲ、またはＣＤ２６６と呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５７７２３．１に示される。
配列番号３に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＳＤＣ１（Ｓｙｎｄｅｃａｎ　１）、ＳＤＣ、ＳＹＮＤ１、ｓｙｎｄｅｃａｎ、またはＣＤ１３８と呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２９８８．３に示される。
配列番号４に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、Ｆ３（Ｃｏａｇｕｌａｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒ　ＩＩＩ，　ｔｉｓｓｕｅ　ｆａｃｔｏｒ）、ＴＦ、ＴＦＡ、またはＣＤ１４２と呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿００１９８４．１に示される。
配列番号５に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＥＰＨＡ２（ＥＰＨ　ｒｅｃｅｐｔｏｒ　Ａ２）、ＣＴＰＡ、ＣＴＰＰ１、ＣＴＲＣＴ６、ＥＣＫ、またはＡＲＣＣ２と呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿００４４２２．２に示される。
配列番号６に記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドは、ＩＴＧＡ２（Ｉｎｔｅｇｒｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔ　ａｌｐｈａ　２）、ＣＤ４９Ｂ、ＧＰＩａ、ＨＰＡ－５、ＶＬＡ－２、ＶＬＡＡ２、またはＢＲと呼ばれるタンパク質であり、そのアミノ酸配列はＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿００２１９４．２に示される。
　中でも、ＴＭ４ＳＦ１（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（配列番号２）は、後述の実施例に示す通り、肺腺癌細胞、乳腺癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞と、癌種を問わず高発現しており、従来の検出で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できる。また、ＴＭ４ＳＦ１（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（配列番号２）は、膜貫通型タンパク質であることから、従来の回収で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に回収できる。
　また膵臓癌細胞を特異的に検出したい場合は、後述の実施例に示す遺伝子発現解析の結果から、ＩＴＧＡ２（配列番号６）を用いると好ましいことが示唆される。なお、ＩＴＧＡ２（配列番号６）は膜貫通型タンパク質であることから、膵臓癌細胞を特異的に回収したい場合は、当該タンパク質を用いると好ましいことが示唆される。
　なお本発明では、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ活性を有する限り、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列の１から数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換または欠失した態様であってもよく、また配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列に１から数個のアミノ酸残基が挿入された態様であってもよい。ここで本明細書において「数個」とは、２０、１９、１８、１７、１６、１５、１４、１３、１２、１１、１０、９、８、７、６、５、４、３または２個の整数を意味する。１から数個のアミノ酸残基とは、好ましくはアミノ酸残基が１個以上１０個以下、より好ましくは１個以上５個以下、更に好ましくは１個以上３個以下、特に好ましくは２個以下である。
　また同様にタンパク質としての機能を有している限り、これらポリペプチドのＮ末端および／またはＣ末端に一残基以上アミノ酸残基を付加した態様であってもよい。また本発明の方法で用いられるマーカーは、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるタンパク質と同じ活性を有する限り、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列全体に対して、７０％以上の相同性を有するタンパク質であってもよく、好ましくは８０％以上、より好ましくは９０％以上、さらにより好ましくは９５％以上の相同性を有するタンパク質である。
　さらに真核細胞では、タンパク質をコードする遺伝子から当該タンパク質を発現させる際、遺伝子（ＲＮＡ）前駆体中のイントロンを除去し、前後のエキソンを再結合する反応（スプライシング）が生じるが、残るエキソンには多様性があり、さまざまな成熟ｍＲＮＡが生産されるため、活性の異なるタンパク質（スプライシングバリアント）が発現することもある。本発明で検出に使用可能なポリペプチドには、
配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチドや、
配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列の１から数個のアミノ酸残基が他のアミノ酸残基に置換もしくは欠失したもののスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチドや、
配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列に１から数個のアミノ酸残基が挿入されたもののスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチドや、
配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチドも含まれる。
　本発明の検出を行なう場合、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のいずれかのポリペプチドを特異的に標識可能な色素（例えば化学発光色素や蛍光色素など）を添加して染色し、その染色像または染色強度（例えば発光強度や蛍光強度）に基づき、検出してもよいが、汎用性の点から前述したポリペプチドに対する抗体（以下、単に抗ポリペプチド抗体とも表記する）またはアプタマーを用いて検出する方法が一般的であり、かつ直接検出／間接的検出の両方に適用可能な点で好ましい態様といえる。
　また、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のポリペプチドは膜貫通型タンパク質であるため、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して回収可能な腫瘍マーカーともなりうる。
　抗ポリペプチド抗体を用いて試料中に含まれる腫瘍細胞を検出する際は、前記抗体に何らかの方法で標識物質を修飾し、当該標識物質の有無または量に基づき検出することが好ましい。標識物質は、抗原抗体反応を利用した測定の分野で通常用いられる物質の中から適宜選択すればよく、一例として、フルオレセイン等の蛍光物質や、アルカリホスファターゼ等の酵素、放射性物質があげられる。前記抗体と標識物質との結合態様に限定はなく、前記抗体が標識物質と化学結合などにより直接結合された態様であってもよく、前記抗体が標識物質が結合された前記抗体に対する抗体（標識二次抗体）によって間接的に結合された態様であってもよい。抗ポリペプチド抗体を用いた試料中に含まれる腫瘍細胞の検出フォーマットに特に限定はなく、用手法でＥＬＩＳＡ（Ｅｎｚｙｍｅ－Ｌｉｎｋｅｄ　ＩｍｍｕｎｏＳｏｒｂｅｎｔ　Ａｓｓａｙ）法やウェスタンブロット法などにより検出してもよく、ＡＩＡ－９００やＡＩＡ－ＣＬ２４００（いずれも東ソー（株）製）などのエンザイムイムノアッセイ装置を用いて自動的に検出してもよい。
　このように前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のポリペプチドは、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカーとなりうるものである。
　本発明により腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して回収するには、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチドを用いて当該腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出した後、当該検出した腫瘍細胞を回収手段を用いて回収すればよい。回収手段の一例として、腫瘍細胞を保持可能な保持部を設けた基板とノズルによる吸引吐出により当該腫瘍細胞を回収する回収部とを備えた手段があげられ、具体例として特開２０１６－１４２６１６号に開示の回収装置があげられる。
　一方、本発明において、前述の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子とは、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のいずれかのポリペプチドをコドンを用いて変換し得られるポリヌクレオチドであれば特に限定はなく、特にヒト型コドンを用いて変換したものが好ましい。
　配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列からなるポリペプチドを少なくとも含むポリペプチドをコードする遺伝子の一例として、以下の配列があげられる。
配列番号１に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号７に記載の配列のうち２３５番目から８４０番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１４２２０．２）、
配列番号２に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号８に記載の配列のうち８７番目から４７３番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿０１６６３９．２）、
配列番号３に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号９に記載の配列のうち３９２番目から１３２１番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１００６９４６．１）、
配列番号４に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号１０に記載の配列のうち２２２番目から１１０６番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿００１９９３．４）、
配列番号５に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号１１に記載の配列のうち１５６番目から３０８３番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿００４４３１．３）、
配列番号６に記載の配列からなるポリペプチドを変換した、配列番号１２に記載の配列のうち１４４番目から３６８６番目までのヌクレオチドからなるポリヌクレオチド（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＭ＿００２２０３．３）。
　前述した遺伝子の検出法に特に限定はなく、例えば、前記ポリヌクレオチド中の適切な位置にプローブを設計した上で、ハイブリダイゼーション法により検出してもよく、前記ポリヌクレオチド中の適切な位置にプライマーセットを設計した上で、ＰＣＲ法、ＲＴ－ＰＣＲ法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ　Ｓｅｑｕｅｎｃｅ－Ｂａｓｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法などを用いて前記ポリヌクレオチドを増幅し検出してもよく、前記ポリヌクレオチドを含む試料を直接シーケンサーに供して検出してもよい。
　このように、前述の（ｉ）から（ｉｉｉ）に記載のポリペプチドをコードする遺伝子は、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカーとなりうるものである。
　本発明によれば、試料中に含まれる腫瘍細胞の検出を、（ｉ）ＴＭ４ＳＦ１（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５５０３５．１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＧｅｎＢａｎｋ　Ｎｏ．ＮＰ＿０５７７２３．１）を含む６種のアミノ酸配列のうちいずれかを少なくとも含むポリペプチド、（ｉｉ）前記（ｉ）のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド、（ｉｉｉ）前記（ｉ）または（ｉｉ）のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、のいずれかに記載のポリペプチド、またはこれらポリペプチドをコードする遺伝子を検出することにより実施できる。前記検出方法により、試料中に僅かしか含まれない腫瘍細胞を、当該試料中に含まれる夾雑細胞と区別して検出できる。
　また、試料中に含まれる腫瘍細胞の回収を、前記（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかに記載のポリペプチドを用いて腫瘍細胞を検出し、当該検出した腫瘍細胞を回収手段を用いて回収することで実施できる。前記回収方法により、試料中に僅かしか含まれない腫瘍細胞を、当該試料中に含まれる夾雑細胞と区別して回収できる。
健常者白血球および各種癌細胞のＴＭ４ＳＦ１遺伝子発現解析結果を示す図である。 健常者白血球および各種癌細胞のＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子発現解析結果を示す図である。 肺腺癌細胞（ＰＣ１４）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＴＭ４ＳＦ１抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＴＭ４ＳＦ１抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 肺腺癌細胞（ＰＣ９）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＣＤ２６６）抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（ＣＤ２６６）抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 肺腺癌細胞（ＰＣ９）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＣＤ１４２（Ｆ３）抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＣＤ１４２（Ｆ３）抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 前立腺癌細胞（ＰＣ３）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＥＰＨＡ２抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＩＴＧＡ２抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 膵臓癌細胞（ＡｓＰＣ－１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＩＴＧＡ２抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＳＤＣ１抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。 膵臓癌細胞（ＡｓＰＣ－１）をスパイクした血液試料を、（ａ）抗ＳＤＣ１抗体および（ｂ）抗ＣＤ４５抗体で免疫染色した結果を示す図である。
　以下、試料が血液試料である場合の実施例を用いて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は当該例に限定されるものではない。
　実施例１　健常者白血球および各種癌細胞の遺伝子発現解析
　癌細胞株として、ヒト肺腺癌細胞（ＰＣ９およびＰＣ１４）、ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）、ヒト乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）、ヒト前立腺癌細胞（２２Ｒｖ１およびＰＣ３）、ヒト肝癌細胞（ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７）、ヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１およびＡｓＰＣ－１）の１０株を選択し、これら癌細胞株と健常者白血球との遺伝子発現量の違いを、次世代シーケンサーを用いて、以下の方法で解析した。
　（１）癌細胞株をそれぞれ以下に示す培地を用いて、５％ＣＯ２環境下３７℃で培養後、０．２５％トリプシン／１ｍＭ　ＥＤＴＡを用いて培地から細胞を剥離することで、癌細胞を一細胞単位で回収し（ｎ＝４）、当該一細胞のＲＮＡからＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ　ｖ４　Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｉｎｐｕｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるｃＤＮＡ合成・増幅を行なった。また、健常者３人の血液から回収した白血球でも同様に一細胞単位（ｎ＝４）でＲＮＡからのｃＤＮＡ合成・増幅を行なった。
　ＰＣ９、ＰＣ１４およびＰＡＮＣ１：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳ（ウシ胎児血清）を含むＤＭＥＭ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅ　Ｍｅｄｉｕｍ）／Ｈａｍ’ｓ　Ｆ－１２培地
ＡｓＰＣ－１：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳと１ｍＭピルビン酸とを含むＲＰＭＩ－１６４０培地
ＭＤＡＭＢ２３１：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＬｅｉｂｏｖｉｔｚ’ｓ　Ｌ－１５　Ｍｅｄｉｕｍ　ｗｉｔｈ　Ｌ－Ｇｌｕｔａｍｉｎｅ培地
ＳＫＢＲ３：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＭｃＣｏｙ’ｓ　５ａ培地
ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＤＭＥＭ／ｈｉｇｈ　ｇｌｕｃｏｓｅ培地
２２Ｒｖ１：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳを含むＲＰＭＩ０２１１－１６４０培地
ＰＣ３：１０％（ｖ／ｖ）ＦＢＳにカナマイシン・ストレプトマイシンを含むＨａｍ’ｓ　Ｆ－１２Ｋ培地。
　（２）前記（１）で得られた細胞を複数集め、ＲＮｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてｔｏｔａｌ　ＲＮＡを回収した後、１０ｎｇのＲＮＡからＳＭＡＲＴ－Ｓｅｑ　ｖ４　Ｕｌｔｒａ　Ｌｏｗ　Ｉｎｐｕｔ　ＲＮＡ　Ｋｉｔ　ｆｏｒ　Ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ）によるｃＤＮＡ合成・増幅を行なった。また、健常者３人の血液から回収した白血球でも同様に複数細胞からＲＮＡを回収し、１０ｎｇ分のＲＮＡからｃＤＮＡ合成・増幅を行なった。
　（３）前記（１）および（２）で得られたｃＤＮＡ　１ｎｇ分を使用して、Ｎｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ＤＮＡ　Ｌｉｂｒａｒｙ　Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ　Ｋｉｔ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）およびＮｅｘｔｅｒａ　ＸＴ　ｖ２　Ｉｎｄｅｘ　Ｋｉｔ　Ｓｅｔ　Ａ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ）によるライブラリー調製を行ない、Ｎｅｘｔ－ｓｅｑ５００（ｉｌｌｕｍｉｎａ）を用いてリード長７５ｂｐ、ｓｉｎｇｌｅ　ｅｎｄ　ｒｅａｄの条件でシークエンス解析を行なうことで、一試料あたり１０００万リード以上の配列を解読した。
　（４）前記（３）で解読したヌクレオチド配列（シーケンスデータ）をＴｏｐＨａｔ２（ＪＯＨＮＳ　ＨＯＰＫＩＮＳ大学）およびＢｏｗｔｉｅ２（ＪＯＨＮＳ　ＨＯＰＫＩＮＳ大学）を用いて、ヒトゲノム配列にマップした。なおヒトゲノム配列およびヒト遺伝子情報はＮＣＢＩ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｃｅｎｔｅｒ　ｆｏｒ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）より公開されているＢＵＩＬＤ　ＧＲＣｈ３８を使用した。マップしたヌクレオチド配列は、Ｃｕｆｆｌｉｎｋｓ（Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ大学）により、解読した各遺伝子のリード数から、ＦＰＫＭ（Ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　Ｐｅｒ　Ｋｉｌｏｂａｓｅ　ｏｆ　ｅｘｏｎ　ｐｅｒ　Ｍｉｌｌｉｏｎ　ｒｅａｄｓ　ｍａｐｐｅｄ）を単位とする遺伝子ごとの発現値を求めた。
　（５）健常者白血球３検体１５サンプルと癌細胞株１０種類４８サンプルについて発現比較を行なった。
　癌細胞株（１０種類４８サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表１に示す。また前記遺伝子のうち、ＴＭ４ＳＦ１（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（配列番号２）をコードする遺伝子について、各サンプル毎の解析結果をそれぞれ図１および図２に示す。図中、ＰＣ９およびＰＣ１４はヒト肺腺癌細胞の、ＭＤＡＭＢ２３１はヒト乳腺癌細胞の、ＳＫＢＲ３はヒト乳癌細胞の、ＨｅｐＧ２およびＨｕＨ－７はヒト肝癌細胞の、ＡｓＰＣ－１およびＰＡＮＣ１はヒト膵臓癌細胞の、２２Ｒｖ１およびＰＣ３はヒト前立腺癌細胞の、Ｌｅｕｃｏ１からＬｅｕｃｏ３は健常者白血球の、それぞれ結果であり、ｓｉｎｇｌｅは一細胞（ｎ＝４）中のＲＮＡの、１０ｎｇは複数細胞中のＲＮＡ（１０ｎｇ分）の、それぞれ結果である。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　ＴＭ４ＳＦ１遺伝子（配列番号７）は、癌細胞株（１０種類４８サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、白血球（３検体１５サンプル）のＦＰＫＭ値の平均の３００倍以上であり、ＴＭ４ＳＦ１遺伝子が癌細胞（腫瘍細胞）特異的かつ高発現していることがわかる（表１）。またＴＭ４ＳＦ１遺伝子は、肺腺癌細胞、乳腺癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞と、癌種を問わず高発現している（図１）ことから、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質（配列番号１）および遺伝子（配列番号７）は、従来の検出で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できることがわかる。また、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質（配列番号１）は膜貫通型タンパク質であることから、従来の回収で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に回収できることがわかる。
　同様にＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子（配列番号８）は、癌細胞株（１０種類４８サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、白血球（３検体１５サンプル）のＦＰＫＭ値の平均の５０倍以上であり、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子が癌細胞（腫瘍細胞）特異的かつ高発現していることがわかる（表１）。またＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子は、肺腺癌細胞、乳腺癌細胞、乳癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞、前立腺癌細胞と、癌種を問わず高発現している（図２）ことから、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質（配列番号２）および遺伝子（配列番号８）は、従来の検出で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できることがわかる。また、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質（配列番号２）は膜貫通型タンパク質であることから、従来の回収で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に回収できることがわかる。
　肺腺癌細胞株（２種類１０サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　乳腺癌又は乳癌細胞株（２種類１０サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表３に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　前立腺癌細胞株（２種類８サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　肝癌細胞株（２種類１０サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　膵臓癌細胞株（２種類１０サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上であり、かつ膜貫通型タンパク質をコードする遺伝子を表６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
　表１に示す、癌細胞株（１０種類４８サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上である遺伝子のうち、全ての癌種（肺腺癌、乳腺癌又は乳癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌）の細胞で健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上となった遺伝子を表７に示す。この表に示すタンパク質および遺伝子は、前述の通り、従来の検出で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できることが示唆される。また、この表に示すタンパク質は膜貫通型タンパク質であるため、前述の通り、従来の回収で用いられる腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭと比較し、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に回収できることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　表６に示す、膵臓癌細胞株（２種類１０サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍以上である遺伝子のうち、膵臓癌以外（肺腺癌、乳腺癌又は乳癌、前立腺癌、肝癌）の細胞株における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均が、全て健常者白血球（３検体１５サンプル）における発現値（ＦＰＫＭ値）の平均の１０．００倍未満である遺伝子を表８に示す。この表に示すタンパク質および遺伝子は、膵臓癌細胞を特異的に検出できることが示唆される。また、この表に示すタンパク質は膜貫通型タンパク質であるため、膵臓癌細胞を特異的に回収できることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例２　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＴＭ４ＳＦ１遺伝子が、健常者白血球に比べて癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＴＭ４ＳＦ１が血液試料中に含まれる腫瘍細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト肺腺癌細胞（ＰＣ１４）またはヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）をそれぞれスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、ＴＭ４ＳＦ１に対する抗体（Ｈｕｍａｎ　ＴＭ４ＳＦ１　Ｐｈｙｃｏｅｒｙｔｈｒｉｎ　ＭＡｂ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）溶液１０μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ，ベックマン・コールター）溶液１０μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を３回洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ　Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラス上に封入し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト肺腺癌細胞（ＰＣ１４）の染色結果を図３に、ヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）の染色結果を図４に、それぞれ示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした癌細胞である。図３および図４の結果とも、ＴＭ４ＳＦ１に対する抗体（抗ＴＭ４ＳＦ１抗体）で染色した細胞（図３（ａ）および図４（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図３（ｂ）および図４（ｂ））。このことから、ＴＭ４ＳＦ１（配列番号１）が、血液試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例３　抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子が、健常者白血球に比べて癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａが血液試料中に含まれる腫瘍細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト肺腺癌細胞（ＰＣ９）またはヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）をそれぞれスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａに対する抗体（ＰＥ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＣＤ２６６（Ｆｎ１４、ＴＷＥＡＫ　Ｒ）　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）溶液２．５μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ，ベックマン・コールター）溶液１０μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を３回洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ　Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラス上に封入し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト肺腺癌細胞（ＰＣ９）の染色結果を図５に、ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）の染色結果を図６に、それぞれ示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした癌細胞である。図５および図６の結果とも、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａに対する抗体（抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体）で染色した細胞（図５（ａ）および図６（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図５（ｂ）および図６（ｂ））。このことから、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ（配列番号２）が、血液試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例４　抗Ｆ３抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＦ３遺伝子が、健常者白血球に比べて癌細胞で高発現していることが判明したことから、Ｆ３が血液試料中に含まれる腫瘍細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト肺腺癌細胞（ＰＣ９）またはヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）をそれぞれスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、Ｆ３に対する抗体（ＣＤ１４２－ＦＩＴＣ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）溶液１０μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＰＥ，ベックマン・コールター）溶液７μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を３回洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ　Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラス上に封入し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト肺腺癌細胞（ＰＣ９）の染色結果を図７に、ヒト乳腺癌細胞（ＭＤＡＭＢ２３１）の染色結果を図８に、それぞれ示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした癌細胞である。図７および図８の結果とも、Ｆ３に対する抗体（抗Ｆ３抗体）で染色した細胞（図７（ａ）および図８（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図７（ｂ）および図８（ｂ））。このことから、Ｆ３（配列番号４）が、血液試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例５　抗ＥＰＨＡ２抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＥＰＨＡ２遺伝子が、健常者白血球に比べて前立腺癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＥＰＨＡ２が血液試料中に含まれる前立腺癌細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト前立腺癌細胞（ＰＣ３）をスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、ＥＰＨＡ２に対する抗体（ＰＥ　ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＥｐｈＡ２、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）溶液５μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、ベックマン・コールター）溶液１０μＬ加え、室温で３０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を３回洗浄し、Ｐｅｒｍｏｕｎｔ　Ｆｉｓｈｅｒ（Ｆｉｓｈｅｒ　Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を用いてスライドガラス上に封入し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト前立腺癌細胞（ＰＣ３）の染色結果を図９に示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした前立腺癌細胞である。図９の結果では、ＥＰＨＡ２に対する抗体（抗ＥＰＨＡ２抗体）で染色した細胞（図９（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図９（ｂ））。このことから、ＥＰＨＡ２（配列番号５）が、血液試料中に含まれる前立腺癌細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例６　抗ＩＴＧＡ２抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＩＴＧＡ２遺伝子が、健常者白血球に比べて膵臓癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＩＴＧＡ２が血液試料中に含まれる膵臓癌細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１またはＡｓＰＣ－１）をそれぞれスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、ＩＴＧＡ２に対する抗体（ＦＩＴＣ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＩＴＧＡ２　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）溶液５μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＰＥ、ベックマン・コールター）溶液２０μＬ加え、室温で４０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡと６μｇ／ｍＬ　Ｔｉｒｏｆｉｂａｎを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を２回洗浄し、スライドガラス上に播種し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト膵臓癌細胞ＰＡＮＣ１の染色結果を図１０に、ヒト膵臓癌細胞ＡｓＰＣ－１の染色結果を図１１に、それぞれ示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした膵臓癌細胞である。図１０および図１１の結果とも、ＩＴＧＡ２に対する抗体（抗ＩＴＧＡ２抗体）で染色した細胞（図１０（ａ）および図１１（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図１０（ｂ）および図１１（ｂ））。このことから、ＩＴＧＡ２（配列番号６）が、血液試料中に含まれる膵臓癌細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例７　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた癌細胞の染色
　実施例１でＴＭ４ＳＦ１遺伝子およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａ遺伝子が、健常者白血球に比べて癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＴＭ４ＳＦ１、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａおよび既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭを認識する抗体を用いて、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質が癌細胞の検出に使用可能か検討した。なお本実施例では癌細胞として、実施例１で用いた癌細胞株（１０株）を用いた。
　（１）癌細胞株懸濁液２．５×１０３個／１００μＬ（ＰＣ－９もしくはＰＣ－１４）又は１×１０４個／１００μＬ（ＭＤＡＭＢ２３１、ＳＫＢＲ３、ＰＣ－３、２２Ｒｖ１、ＨｅｐＧ２、ＨｕＨ－７、ＰＡＮＣ－１もしくはＡｓＰＣ－１）１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（２）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体１０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＭ４ＳＦ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体２．５μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）または抗ＥｐＣＡＭ抗体３μＬ（Ａｌｅｘａ　Ｆｌｕｏｒｏ　４８８－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＥｐＣＡＭ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）を加え、室温で６０分間インキュベートした。
　（３）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡと６μｇ／ｍＬ　Ｔｉｒｏｆｉｂａｎを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を２回洗浄し、スライドガラス上に播種し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた癌細胞の染色結果を表９に示す。なお前記表では、染色結果を各蛍光標識抗体に起因する蛍光シグナルの強さ（＋から＋＋＋＋＋の５段階）で示しており、当該シグナルの強さが大きいほど（＋の数が多いほど）高発現していることを示している（シグナル強度（発現量）：＋＜＋＋＜＋＋＋＜＋＋＋＋＜＋＋＋＋＋）。結果、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質（配列番号２）は、肺腺癌細胞、乳腺癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞と、癌種を問わず発現しており、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できることがわかる。また、この結果から、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質は、試料中に含まれる腫瘍細胞を癌種（肺癌、乳腺癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌）を問わず広範囲に回収できることが示唆される。さらにＴＭ４ＳＦ１および／またはＴＮＦＲＳＦ１２Ａは、既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭでは低発現（＋が１つのみ）の細胞株（ＰＣ－１４、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＣ－３、ＰＡＮＣ１）に対しても高発現（＋が４つ以上）していることから、ＴＭ４ＳＦ１および／またはＴＮＦＲＳＦ１２ＡとＥｐＣＡＭとを組み合わせることで、試料中に含まれる腫瘍細胞を精度高く検出および回収できることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例８　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた癌細胞の回収
　実施例７でＴＭ４ＳＦ１タンパク質（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質（配列番号２）が、既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質が低発現の細胞株（ＰＣ－１４、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＣ－３、ＰＡＮＣ１）に対しても高発現していることが判明したことから、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質および既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質をそれぞれ認識する抗体を用いて、試料中に含まれる癌細胞の回収が可能か検討した。なお本実施例では癌細胞として、ＥｐＣＡＭタンパク質が低発現のヒト膵臓癌細胞株ＰＡＮＣ１を用いた。また、以下の手順にて用いている「バッファ」は、０．５％ＢＳＡと２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＤ－ＰＢＳ（－）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、Ｍｇ２＋とＣａ２＋不含）である。
　（１）健常者血液１ｍＬにヒト膵臓癌細胞（ＰＡＮＣ１）１００μＬ（１００細胞）をスパイクした。
　（２）（１）のスパイクサンプルに１×ＢＤ　Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ（ＢＤ）１０ｍＬを加え、室温で１０分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（３）細胞懸濁液１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）５０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（４）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体５０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＭ４ＳＦ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体２．５μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＥｐＣＡＭ抗体１０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＥｐＣＡＭ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）のうち、いずれか１種または３種全てを加え、冷蔵で１０分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（５）細胞懸濁液８０μＬに、Ａｎｔｉ－ＰＥ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ　ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）２０μＬを加え、冷蔵で１５分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（６）ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を、ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）に設置してバッファで洗浄した。
　（７）細胞懸濁液５００μＬを（６）のカラムに添加し、バッファ５００μＬでカラムを３回洗浄した。
　（８）洗浄後のカラムをＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒから外した後、バッファ１ｍＬをカラムに添加し、カラムにプランジャーを押し入れることで細胞を回収した。
　（９）回収した細胞をスライドガラス上に播種し、顕微鏡下で細胞数の計測を行なった。
　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体のいずれかまたは全て用いたときの癌細胞の回収結果を表１０に示す。なお前記表では、スパイクした細胞数に対する回収細胞数の割合を細胞回収率［％］として示している。結果、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体または抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体を単独で用いた場合では、抗ＥｐＣＡＭ抗体を単独で用いた場合と比較して高い細胞回収率を示した。さらに、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体を３種同時に用いた場合、それぞれ単独で用いた場合と比較してより高い細胞回収率を示した。この結果から、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質は、既存マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質では回収率が低い癌細胞を、血液試料中から高効率に回収できることがわかる。また、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質とＥｐＣＡＭタンパク質とを組み合わせることで、ＥｐＣＡＭタンパク質で回収率が低い癌細胞をより高効率に回収できることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000010
　実施例９　抗ＳＤＣ１抗体を用いた癌細胞の染色
　実施例１でＳＤＣ１遺伝子が、健常者白血球に比べて癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＳＤＣ１を認識する抗体を用いて、ＳＤＣ１が癌細胞の検出に使用可能か検討した。なお本実施例では癌細胞として、実施例１で用いた癌細胞株（１０株）を用いた。
　（１）各癌細胞株懸濁液（１×１０４個／１００μＬ）１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（２）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、抗ＳＤＣ１抗体１０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＳＤＣ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を加え、室温で６０分間インキュベートした。
　（３）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡと６μｇ／ｍＬ　Ｔｉｒｏｆｉｂａｎを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を２回洗浄し、スライドガラス上に播種し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　抗ＳＤＣ１抗体を用いた癌細胞の染色結果を表１１に示す。なお前記表では、染色結果を各蛍光標識抗体に起因する蛍光シグナルの強さ（＋から＋＋＋＋＋の５段階）で示しており、当該シグナルの強さが大きいほど（＋の数が多いほど）高発現していることを示している（シグナル強度（発現量）：＋＜＋＋＜＋＋＋＜＋＋＋＋＜＋＋＋＋＋）。結果、ＳＤＣ１タンパク質（配列番号３）は、肺腺癌細胞、乳腺癌細胞、乳癌細胞、前立腺癌細胞、肝癌細胞、膵臓癌細胞と、癌種を問わず発現しており、試料中に含まれる腫瘍細胞を広範囲に検出できることがわかる。また、この結果から、ＳＤＣ１タンパク質は、試料中に含まれる腫瘍細胞を癌種（肺癌、乳腺癌、乳癌、前立腺癌、肝癌、膵臓癌）を問わず広範囲に回収できることが示唆される。さらにＳＤＣ１は、既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭでは低発現（＋が１つのみ、表９参照）の細胞株（ＰＣ－１４、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＣ－３）に対しても高発現（＋が４つ以上）していることから、ＳＤＣ１とＥｐＣＡＭとを組み合わせることで、試料中に含まれる腫瘍細胞を精度高く検出および回収できることが示唆される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000011
　実施例１０　抗ＳＤＣ１抗体を用いた癌細胞と白血球の染色
　実施例１でＳＤＣ１遺伝子が、健常者白血球に比べて乳癌又は乳腺癌細胞、および膵臓癌細胞で高発現していることが判明したことから、ＳＤＣ１が血液試料中に含まれる乳癌細胞および膵臓癌細胞の特異的検出に使用可能か、検討した。
　（１）健常者血液から比重差分離法を用いて赤血球を除去した試料を本実施例で使用する血液試料とし、当該試料にヒト乳癌細胞（ＳＫＢＲ３）またはヒト膵臓癌細胞（ＡｓＰＣ－１）をそれぞれスパイクした。
　（２）癌細胞株をスパイクした血液試料１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）１０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（３）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、ＳＤＣ１に対する抗体（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＳＤＣ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）溶液１０μＬおよび白血球を検出するためのＣＤ４５に対する抗体（ＣＤ４５－ＦＩＴＣ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）溶液１０μＬ加え、室温で４０分間インキュベートした。
　（４）インキュベート後、１％ＢＳＡと５ｍＭ　ＥＤＴＡと６μｇ／ｍＬ　Ｔｉｒｏｆｉｂａｎを含むＨＢＳＳ（Ｈａｎｋ’ｓ　Ｂａｌａｎｃｅｄ　Ｓａｌｔ　Ｓｏｌｕｔｉｏｎ）で細胞を２回洗浄し、スライドガラス上に播種し、蛍光顕微鏡観察を行なった。
　ヒト乳癌細胞ＳＫＢＲ３の染色結果を図１２に、ヒト膵臓癌細胞ＡｓＰＣ－１の染色結果を図１３に、それぞれ示す。図中、矢印で示した細胞がスパイクした乳癌細胞および膵臓癌細胞である。図１２および図１３の結果とも、ＳＤＣ１に対する抗体（抗ＳＤＣ１抗体）で染色した細胞（図１２（ａ）および図１３（ａ）中、矢印で示した細胞）は、ＣＤ４５に対する抗体では染色されなかった（図１２（ｂ）および図１３（ｂ））。このことから、ＳＤＣ１（配列番号３）が、血液試料中に含まれる乳癌細胞および膵臓癌細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出する腫瘍マーカーとして使用できることがわかる。
　実施例１１　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体、抗ＳＤＣ１抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体を用いた癌細胞の回収
　実施例７でＴＭ４ＳＦ１タンパク質（配列番号１）およびＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質（配列番号２）が、実施例９でＳＤＣ１タンパク質（配列番号３）が、それぞれ既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質が低発現の細胞株（ＰＣ－１４、ＭＤＡＭＢ２３１、ＰＣ－３）に対しても高発現していることが判明したことから、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質、ＳＤＣ１タンパク質および既存の腫瘍マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質をそれぞれ認識する抗体を用いて、試料中に含まれる癌細胞の回収が可能か検討した。なお本実施例では癌細胞として、ＥｐＣＡＭタンパク質が低発現のヒト前立腺癌細胞株ＰＣ－３を用いた。また、以下の手順にて用いている「バッファ」は、０．５％ＢＳＡと２ｍＭ　ＥＤＴＡを含むＤ－ＰＢＳ（－）（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｐｈｏｓｐｈａｔｅ－Ｂｕｆｆｅｒｅｄ　Ｓａｌｉｎｅ、Ｍｇ２＋とＣａ２＋不含）である。
　（１）健常者血液１ｍＬにヒト前立腺癌細胞株（ＰＣ－３）１００μＬ（１００細胞）をスパイクした。
　（２）（１）のスパイクサンプルに１×ＢＤ　Ｐｈａｒｍ　Ｌｙｓｅ（ＢＤ）１０ｍＬを加え、室温で１０分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（３）細胞懸濁液１００μＬにＦｃＲ　Ｂｌｏｃｋｉｎｇ　Ｒｅａｇｅｎｔ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）５０μＬを加え、室温で１０分間ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理した。
　（４）Ｂｌｏｃｋｉｎｇ処理後、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体５０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＭ４ＳＦ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｒ＆Ｄ　ｓｙｓｔｅｍｓ）、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体２．５μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）、抗ＳＤＣ１抗体５μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＳＤＣ１　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ）および抗ＥｐＣＡＭ抗体１０μＬ（ＰＥ－ａｎｔｉ－ｈｕｍａｎ　ＥｐＣＡＭ　Ａｎｔｉｂｏｄｙ、Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）のうち、いずれか１種または抗ＥｐＣＡＭ抗体を除く３種または４種全てを加え、冷蔵で１０分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（５）細胞懸濁液８０μＬに、Ａｎｔｉ－ＰＥ　Ｍｉｃｒｏｂｅａｄｓ　ＵｌｔｒａＰｕｒｅ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）２０μＬを加え、冷蔵で１５分間インキュベート後、バッファで細胞を洗浄し、懸濁させた。
　（６）ＭＳカラム（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）を、ＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ　Ｂｉｏｔｅｃ）に設置してバッファで洗浄した。
　（７）細胞懸濁液５００μＬを（６）のカラムに添加し、バッファ５００μＬでカラムを３回洗浄した。
　（８）洗浄後のカラムをＭＡＣＳ　Ｓｅｐａｒａｔｏｒから外した後、バッファ１ｍＬをカラムに添加し、カラムにプランジャーを押し入れることで細胞を回収した。
　（９）回収した細胞をスライドガラス上に播種し、顕微鏡下で細胞数の計測を行なった。
　抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体、抗ＳＤＣ１抗体および抗ＥｐＣＡＭ抗体のいずれか、ならびに抗ＥｐＣＡＭ抗体を除く３種または４種全て用いたときの癌細胞の回収結果を表１２に示す。なお前記表では、スパイクした細胞数に対する回収細胞数の割合を細胞回収率［％］として示している。結果、抗ＴＭ４ＳＦ１抗体、抗ＴＮＦＲＳＦ１２Ａ抗体または抗ＳＤＣ１抗体を単独で用いた場合では、抗ＥｐＣＡＭ抗体を単独で用いた場合と比較して高い細胞回収率を示した。また抗ＥｐＣＡＭ抗体を除く３種または４種全て用いた場合、それぞれ単独で用いた場合と比較してより高い細胞回収率を示した。さらに４種全て用いた場合、抗ＥｐＣＡＭ抗体を除く３種を用いた場合と比較してより高い細胞回収率を示した。この結果から、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質およびＳＤＣ１タンパク質は、既存マーカーであるＥｐＣＡＭタンパク質では回収率が低い癌細胞を、血液試料中から高効率に回収できることがわかる。また、ＴＭ４ＳＦ１タンパク質、ＴＮＦＲＳＦ１２Ａタンパク質およびＳＤＣ１タンパク質とＥｐＣＡＭタンパク質とを組み合わせることで、ＥｐＣＡＭタンパク質で回収率が低い癌細胞をより高効率に回収できることがわかる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000012
　本発明を詳細に、また特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の本質と範囲を逸脱することなく様々な変更や修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
　なお、２０１８年３月９日に出願された日本特許出願２０１８－０４２７１０号、２０１８年６月１日に出願された日本特許出願２０１８－１０５９６６号、及び２０１８年１０月１２日に出願された日本特許出願２０１８－１９３２７３号の明細書、配列表、特許請求の範囲、図面及び要約書の全内容をここに引用し、本発明の明細書の開示として、取り入れるものである。

Claims (9)

  1. 試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを検出することを特徴とする、試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出する方法。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
  2. （ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを特異的に認識する抗体またはアプタマーを用いて検出する、請求項１に記載の方法。
  3. 試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子を検出することを特徴とする、試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出する方法。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
  4. 試料中に含まれる腫瘍細胞を夾雑細胞と区別して検出し、当該検出した腫瘍細胞を回収手段を用いて回収する、腫瘍細胞の回収方法であって、
    腫瘍細胞の検出を試料中に存在する以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを検出することで行なう、前記回収方法。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
  5. 腫瘍細胞の検出を（ｉ）から（ｉｉｉ）からなる群から選択される１以上のポリペプチドを特異的に認識する抗体またはアプタマーを用いて行なう、請求項４に記載の方法。
  6. 試料が血液であり、試料中に含まれる夾雑細胞が白血球である、請求項１から５のいずれかに記載の方法。
  7. 以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドからなる、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカー。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
  8. 以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドをコードする遺伝子からなる、試
    料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して検出可能な腫瘍マーカー。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
  9. 以下の（ｉ）から（ｉｉｉ）のいずれかのポリペプチドからなる、試料中に含まれる腫瘍細胞を当該試料中に含まれる白血球と区別して回収可能な腫瘍マーカー。
    （ｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド、
    （ｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するアミノ酸配列を少なくとも含むポリペプチド
    （ｉｉｉ）配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列のスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド、または、配列番号１から６のいずれかに記載のアミノ酸配列と７０％以上の相同性を有するポリペプチドのスプライシングバリアントを少なくとも含むポリペプチド
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