CN102590531A - 卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法 - Google Patents
卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法,该试剂盒主要包括分别包被6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM的八种荧光微球;6种基因工程卵巢癌相关抗原为TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189,它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列。本发明采用液相芯片技术,实现了同时检测血清中这六种抗原的IgG、IgM型自身抗体的含量,解决了高效快速地检测多种卵巢癌相关抗原自身抗体的问题。该试剂盒适用于人群中卵巢癌高发性评估诊断以及预后效果评价观察,可以直接用于早期诊断卵巢癌、判断患者预后状况等方面。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物技术领域的液相芯片检测试剂盒,尤其是一种卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
卵巢癌是目前国内外常见的妇科恶性肿瘤,其死亡率已排全部妇女恶性肿瘤的第四位,在女性生殖道恶性肿瘤中居首位,并有上升趋势。卵巢癌发病隐匿,早期缺乏典型的临床症状。由于卵巢特殊的解剖学位置,常规体格检查和盆腔双合诊很难在早期发现卵巢癌。到目前为止,在病变I期被确诊病人仅有25%,而且当病变发展到晚期(III、IV)时,即使得到恰当的治疗其5年存活率也由I期的95%下降到20-25%。因此,加强卵巢癌的二级预防,及早发现、诊断、治疗是提高卵巢癌治疗效果的关键。故筛选和鉴定有高度敏感性及特异性、能用于早期卵巢癌诊断的血清标志,对于改善临床预后和提高存活率有重要意义。
CA125是目前临床上应用最广泛的卵巢癌血清标志物,它在50%的I期、90%的晚期(III期、IV期)卵巢癌中升高,同时在妇科的良性病变、非妇科恶性肿瘤病人中也可升高。即便如此,CA125与超声联合检测时对卵巢癌的阳性预测值也只有20%左右。正是因为其特异性及阳性预测值较低,限制了它在卵巢癌早期诊断中的应用。为此,有研究者将CA125与其它血清标志物联合应用,以提高对卵巢癌的诊断效能。
越来越多的研究证实,在肿瘤形成过程中,肿瘤可刺激机体产生针对肿瘤相关抗原的免疫反应,其中最明显的特征就是抗体的产生,这种由广泛表达于肿瘤细胞的异常蛋白诱导产生的自身抗体,一般称之为肿瘤自身抗体。研究发现,检测抗原自身抗体的敏感度与特异度均高于传统检测抗原的方法,且自身抗体在许多恶性肿瘤患者术前的血清中升高,术后明显下降;而炎症反应等良性病变引起的短暂性抗原升高并不能刺激机体产生自身抗体;另外,检测抗原自身抗体还可以很好地避免假阳性。可见,血清中肿瘤自身抗体可能是肿瘤发生的报告分子,检测肿瘤自身抗体用于恶性肿瘤的诊断是一个很有前景的方法,并可用于病情预测。
然而,肿瘤患者由肿瘤抗原诱导产生的自身抗体阳性率过低,平均为15%~20%,很少超过50%,这限制了单个自身抗体作为肿瘤发生报告分子的可能性。分析单个肿瘤相关抗原自身抗体在诊断卵巢恶性肿瘤时均不理想,这说明卵巢恶性肿瘤的发生是一个多阶段、多步骤、多基因参与的过程,每个阶段都有其特异性开放表达的抗原,因此,通过寻找卵巢恶性肿瘤各个阶段的肿瘤相关抗原的自身抗体,组成自身抗体谱就可能为卵巢恶性肿瘤的分期、诊断及筛查等提供更全面的血清学标志物,联合多个标志物则可弥补其不足。
SEREX方法由Sahin等创立,即用肿瘤患者自体血清中的高滴度IgG抗体筛选肿瘤cDNA文库,获得肿瘤抗原的方法。运用该方法筛选得到的大量肿瘤抗原构成了一个刺激机体对肿瘤产生体液免疫应答的抗原库,而肿瘤患者体内针对这些抗原的相应自身抗体,则构成了一个既可用于筛选肿瘤特异性或相关性抗原,又可作为肿瘤诊断标志物的抗体谱。用SEREX方法可在多种肿瘤患者血液中检测到与肿瘤细胞胞内成分反应的自身抗体,获得了大量的由胞内抗原诱导产生的自身抗体,这也是以往方法所无法做到的。SSH(SuppressionSubtractive Hybridization,抑制性消减杂交技术)是抑制性PCR与消减杂交技术相结合的更简单、更快速分离差异表达基因的方法,它不仅提高了特异性,降低了假阳性率,而且灵敏性高,保证了低丰度片段的检测成功。
免疫学检测最常用的技术有免疫斑点、免疫印迹、ELISA等,其中,ELISA方法最受重视,它简单、快速、敏感且易于自动化,适于大规模筛选样本。然而,ELISA每次一般只能对一种抗原/抗体进行分析,如果要对多种抗原抗体同时进行分析,其工作量就要大幅度增加,操控难度也相应增加。
液相芯片(Suspension Array,Liquid Chip,也称微球体悬浮芯片)是基于xMAP(flexible Multi-Analyte Profiling)技术的新型生物芯片技术平台,它是在不同荧光编码的微球上进行抗原/抗体、酶/底物、配体/受体的结合反应及核酸杂交反应,通过红、绿两束激光分别检测微球编码和报告荧光来达到定性和定量的目的,一个反应孔内可以完成多达100种不同的生物学反应,是继基因芯片、蛋白芯片之后的新一代高通量分子检测技术平台。该技术将流式检测与芯片技术有机地结合在一起,在保持高通量检测的同时,将反应体系由液相-固相反应改变为接近生物系统内部环境的完全液相反应体系,对于确保建立在正确的高级结构之上的真实的蛋白质相互作用尤为关键。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法,以克服现有血清学检测方法上的不足,实现准确快速检测卵巢癌相关抗原自身抗体。
为解决上述技术问题,本发明采用如下技术方案:卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒,主要包括分别包被6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM的八种荧光微球;6种基因工程卵巢癌相关抗原为TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189,它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列。
荧光微球为耦联羟基微球。
上述卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒的制备方法:取八种聚苯乙烯荧光微球分别包被具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列的6种基因工程卵巢癌相关抗原TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。
该方法包括以下步骤:取八种聚苯乙烯荧光微球,6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各对应一种聚苯乙烯荧光微球;每种聚苯乙烯荧光微球各取2.5×106个,经超声雾化和旋涡振荡充分重悬后,以0.1mol/L pH 6.2的NaH2PO4溶液作为活化缓冲液,洗涤2次后置于1.5ml Eppendorf管中,管中反应体系包括80μl NaH2PO4活化缓冲液、新鲜配制的浓度均为50g/L的表面活化剂Sulfo-NHS和EDC各10μl,室温下孵育20分钟进行微球表面的碳氧化学修饰以利于耦联;漂洗后的活化微球加入500μl含125μg相应抗原蛋白的0.05mol/L pH 5.0MES耦联缓冲液,振荡孵育后继而以200μl封闭/保存缓冲液PBS-TBN封闭微球表面的未结合位点,即得包被微球溶液。
分别取八种上述包被微球溶液,以分析缓冲溶液按1∶5稀释后,在血球记数仪下计算微球浓度并调整其终浓度至1×106/ml,4℃避光保存备用;分析缓冲溶液为含浓度0.1%BSA、0.01mol/L叠氮钠的0.01mol/L pH 7.4的PBS。
封闭/保存缓冲液PBS-TBN是含浓度0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%NaN3pH 7.4的PBS。
发明人将改良的SEREX技术与SSH技术相结合从卵巢恶性肿瘤腹水肿瘤细胞中筛选出了6个卵巢癌相关抗原(TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189),免疫斑点检测显示这6个卵巢癌相关抗原的IgG、IgM型自身抗体组成的自身抗体谱可用于卵巢癌的早期诊断。研究中发现单个卵巢癌相关抗原的自身抗体在检测中有局限性,而联合多处自身抗体组成自身抗体谱进行分析时就能弥补此缺陷。然而,常规免疫检测手段无法实现同时分析多种抗原抗体。此前,国内外亦尚无能高效用于卵巢癌早期诊断的液相芯片试剂盒商品。由此,发明人采用液相芯片技术,将上述6种基因工程抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM包被不同的荧光微球,建立了卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒,应用其进行血清学检测,可同时检测血清中这六种抗原的IgG、IgM型自身抗体的含量,解决了高效快速地检测多种卵巢癌相关抗原自身抗体的问题。该试剂盒适用于人群中卵巢癌高发性评估诊断以及预后效果评价观察,可以直接用于早期诊断卵巢癌、判断患者预后状况等方面,具有快速性、客观性和准确性等优点。本发明其与现有技术相比具有如下有益效果:
<1>通量大可以同时检测同一样本中的6个抗原的自身抗体;
<2>所需样品量少只需要1μl血清样品即可完成多种抗原自身抗体的检测;
<3>简单快捷应用本发明检测不到2小时即可完成;
<4>操作容易适合一般分子生物学检验人员使用,无需丰富的专业知识,实验结果由相应的分析仪自动读取,排除了主观性;
<5>无毒无害不涉及有毒、有害的试剂。
具体实施方式
卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒及其制备方法研究
一、实验材料
研究所使用的六种基因工程抗原,均由发明者自行在大肠杆菌中表达、纯化获得。
人免疫球蛋白IgG、IgM购自北京赛驰生物科技有限公司。
八种聚苯乙烯荧光微球为耦联羟基微球,均购自美国Luminex公司(编号为101、102、103、104、105、106、107、108),每种各自带有其独特的荧光光谱。
微球表面活化剂Sulfo-NHS、EDC购自Pierec公司。
藻红蛋白藕联的羊抗人IgG~Fc和羊抗人IgM μ链购自Santa-Cruz公司。
二、试剂盒的制备
制备荧光微球液相芯片
取八种聚苯乙烯荧光微球分别包被具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列的6种基因工程卵巢癌相关抗原TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。具体步骤如下:
取八种聚苯乙烯荧光微球(编号为101、102、103、104、105、106、107、108),6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各对应一种聚苯乙烯荧光微球;每种聚苯乙烯荧光微球各取2.5×106个,经超声雾化和旋涡振荡充分重悬后,以活化缓冲液(0.1mol/L NaH2PO4溶液pH 6.2)洗涤2次后置于1.5ml Eppendorf管中,管中反应体系包括80μl NaH2PO4活化缓冲液、表面活化剂Sulfo-NHS和EDC(均为50g/L,新鲜配制)各10μl,室温下孵育20分钟进行微球表面的碳氧化学修饰以利于耦联;漂洗后的活化微球加入500μl耦联缓冲液(0.05mol/L MES pH 5.0,其中含125μg相应抗原蛋白),振荡孵育后继而以200μl封闭/保存缓冲液PBS-TBN(PBS中含浓度0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%NaN3 pH 7.4)封闭微球表面的未结合位点,即得包被微球溶液。分别取八种上述包被微球溶液,以分析缓冲溶液(0.1%BSA,0.01mol/L叠氮钠,0.01mol/L PBS,pH 7.4)按1∶5稀释后,在血球记数仪下计算微球浓度并调整其终浓度至1×106/ml,4℃避光保存备用。
将制备好的八种包被微球溶液各自包装,然后组装成检测试剂盒,备用。
三、试剂盒的应用
应用本试剂盒检测血清中抗原自身抗体步骤如下:
6种卵巢癌相关抗原血清中自身抗体含量的检测:所有反应均在1.5ml Eppendorf管中完成,总反应体系为100μl,加入各卵巢癌相关抗原蛋白包被的微球(5000个/种),加入稀释的检测血清,孵育30分钟并经PBS-1%BSA漂洗2次后,加入人IgG、IgM蛋白包被的微球(5000个/种),加入藻红蛋白藕联的羊抗人IgG~Fc和羊抗人IgM μ链,孵育30分钟并经PBS-1%BSA漂洗2次后,以Luminex100系统检测读取数据。每个样本测两次,取平均值。
参照品的构建:所有反应均在1.5ml Eppendorf管中完成,总反应体系为100μl,其中以合适稀释浓度梯度的人IgG、IgM蛋白包被的微球混合液(5000个/种),加入藻红蛋白藕联的羊抗人IgG~Fc和羊抗人IgM μ链,孵育30分钟并经PBS-1%BSA漂洗2次后,以Luminex100系统检测。Luminex100包括一束分类激光(635nm)以判定微球的荧光色谱决定被测物的性质和一束报告激光(532nm)分别计数50个微球获得其MFI以定量。绘制参照品曲线,得出曲线方程。将自身抗体含量检测中得到的数据代入曲线方程可得出相应抗原自身抗体的相对含量。
将检测所得的自身抗体的相对含量绘制ROC曲线进行分析,ROC曲线下面积在0.5-0.7间说明诊断效果较差,0.7-0.9间诊断效果中等,大于0.9则诊断效果较好,本研究选取ROC曲线下面积在0.7以上、灵敏度和特异度均可以达到70%的作为检测指标,进而对其灵敏度和特异度进行评价,找出最佳交叉点作为其临界值(见表1)。
表1各抗原蛋白相应自身抗体IgG、IgM cut off值及在还同血清中的阳性率
注:*各抗原自身抗体在癌与非癌血清中阳性率的比较。
用二分类Logistic(Binary logistic)回归分析法分析这联合6个抗原血清中相应IgG、IgM型自身抗体在卵巢癌诊断中的价值。分析结果显示:当TM4SF1、C1D、FXR1抗原IgG型自身抗体及TM4SF1、TIZ抗原IgM型自身抗体组成肿瘤相关抗原自身抗体谱时,该抗体谱单独检测与CA125单独检测比较,其诊断卵巢恶性肿瘤的敏感度明显增高(P<0.05)、特异度明显降低(P<0.05)、准确率相当(P>0.05)。自身抗体谱与CA125联合检测与抗体谱单独检测比较,其诊断卵巢恶性肿瘤的敏感度、特异度、准确率均明显升(P<0.05),阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值也明显升高(P<0.05),阴性似然明显下降(P<0.05);而与CA125单独检测比较,其敏感度、准确率明显升高(P<0.05),特异度稍升高(P>0.05),阳性预测值、阳性似然比、阴性预测值明显提高(P<0.05),阴性似然比明显降低(P<0.05),结果见表2。
表2不同检测方法在卵巢恶性肿瘤诊断中的价值
不同临床病理特征的卵巢恶性肿瘤患者间不同检测方法的结果比较
抗体谱与CA125联合检测诊断上皮性癌的阳性率高于抗体谱及CA125单独检测(P<0.05),抗体谱与CA125联合检测和抗体谱单独检测诊断非上皮性癌的敏感度均显著高于CA125单独检测(P<0.05);抗体谱与CA125联合检测和抗体谱单独检测诊断I~II期癌的敏感度均显著高于CA125单独检测(P<0.05),抗体谱与CA125联合检测诊断III~IV期癌的敏感度显著高于单独CA125检测(P<0.05),结果见表3。
表3不同临床病理特征的卵巢恶性肿瘤患者间不同检测方法的结果比较
注:“a”表示因非上皮性癌无病理分化程度,故总例数少了18例;“b”表示例数少于20,不计算百分率;“c”表示与同一指标内单独CA125检测比较,“d”表示与同一指标内抗体谱与CA125联合检测比较,P<0.05。
抗体谱在卵巢恶性肿瘤病情监测中的价值
24例卵巢恶性肿瘤患者治疗前、后抗体谱单独检测的阳性率分别为71%(17/24)和38%(9/24),两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);CA125单独检测的阳性率分别为67%(16/24)和21%(5/24),两者比较,差异有统计学意义(P<0.01);抗体谱及CA125联合检测的阳性率分别为88%(21/24)和42%(10/24),两者比较,差异有统计学意义(P<0.05)。
本研究利用液相芯片技术的高通量特点,检测了6个卵巢癌相关抗原IgG、IgM型自身抗体在卵巢癌与非癌人群中的相对含量,并经统计学方法从中选出了能用于卵巢癌诊断的多个抗体组合(自身抗体谱),该抗体谱还仅能用于卵巢癌(特别是早期卵巢癌)的诊断及病情的监测。
Claims (6)
1.一种卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒,其特征在于主要包括分别包被6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM的八种荧光微球;所述6种基因工程卵巢癌相关抗原为TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189,它们分别具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒,其特征在于:所述荧光微球为耦联羟基微球。
3.根据权利要求1所述卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒的制备方法,其特征在于:取八种聚苯乙烯荧光微球分别包被具有序列表中SEQ.ID.No.1至SEQ.ID.No.6的氨基酸序列的6种基因工程卵巢癌相关抗原TM4SF1、C1D、TIZ、OV-142、FXR1、OV-189和人免疫球蛋白IgG、IgM。
4.根据权利要求3所述卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒的制备方法,其特征在于该方法包括以下步骤:取八种聚苯乙烯荧光微球,6种基因工程卵巢癌相关抗原和人免疫球蛋白IgG、IgM各对应一种聚苯乙烯荧光微球;每种聚苯乙烯荧光微球各取2.5×106个,经超声雾化和旋涡振荡充分重悬后,以0.1mol/L pH 6.2的NaH2PO4溶液作为活化缓冲液,洗涤2次后置于1.5ml Eppendorf管中,管中反应体系包括80μlNaH2PO4活化缓冲液、新鲜配制的浓度均为50g/L的表面活化剂Sulfo-NHS和EDC各10μl,室温下孵育20分钟进行微球表面的碳氧化学修饰以利于耦联;漂洗后的活化微球加入500μl含125μg相应抗原蛋白的0.05mol/L pH 5.0MES耦联缓冲液,振荡孵育后继而以200μl封闭/保存缓冲液PBS-TBN封闭微球表面的未结合位点,即得包被微球溶液。
5.根据权利要求4所述卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒的制备方法,其特征在于:分别取八种所述包被微球溶液,以分析缓冲溶液按1∶5稀释后,在血球记数仪下计算微球浓度并调整其终浓度至1×106/ml,4℃避光保存备用;所述分析缓冲溶液为含浓度0.1%BSA、0.01mol/L叠氮钠的0.01mol/L pH 7.4的PBS。
6.根据权利要求5所述卵巢癌相关抗原自身抗体谱液相芯片检测试剂盒的制备方法,其特征在于:所述封闭/保存缓冲液PBS-TBN是含浓度0.1%BSA、0.02%Tween-20、0.05%NaN3 pH 7.4的PBS。
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