CN111565750B

CN111565750B - 抗tm4sf1抗体及其使用方法

Info

Publication number: CN111565750B
Application number: CN201880070504.7A
Authority: CN
Inventors: 保罗·A·贾米内; 史守卿; 哈罗德·F·德沃夏克; 伦纳德·G·普雷斯塔
Original assignee: Anjike Co
Current assignee: Anjike Co
Priority date: 2017-08-28
Filing date: 2018-08-28
Publication date: 2023-11-03
Anticipated expiration: 2038-08-28
Also published as: AU2018323470A1; CA3074111A1; US20220267461A1; MX2020002241A; US11208495B2; US20200270360A1; WO2019046338A1; JP2023071888A; JP2020534351A; EP3675906A4; CN111565750A; JP7241080B2; EP3675906A1; US20220153860A1

Abstract

描述了结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。还描述了使用所述抗体和片段的方法，包括使用所述抗体和片段来抑制转移的方法。

Description

抗TM4SF1抗体及其使用方法

交叉引用

本申请要求2017年8月28日提交的美国临时申请号62/550,994的权益，所述美国临时申请以引用的方式整体并入本文。

背景技术

可阻断肿瘤细胞附着于内皮细胞和/或阻止肿瘤细胞跨越内皮单层进行迁移(也被称为跨内皮迁移)的疗法可抑制或预防肿瘤转移。本领域中对于癌症治疗剂，并且特别是可预防转移的治疗剂仍有需要。

发明内容

在一个实施方案中，本文提供了一种抗TM4SF1结合蛋白，所述抗TM4SF1结合蛋白包含

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80、96、118、119、120或121具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85或109或128具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126或127具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含：重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含：含有与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112或114具有至少75％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101或122具有至少75％同一性的氨基酸序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含：含有如以SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112或114阐述的序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101或122阐述的序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位，并且其中所述蛋白是IgG抗体。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包括IgG抗体，其中所述抗体是人源化的。在一些实施方案中，蛋白结合人TM4SF1，并且与食蟹猴TM4SF1交叉反应。在一些实施方案中，蛋白与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化。在一些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，结合蛋白是包括人IgG1、IgG2或IgG4同种型的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有至少一个使结合蛋白的ADCC或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有至少一个使抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的ADCC和CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、A330S、P331A和P331S。在一些实施方案中，结合蛋白是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。在一些实施方案中，结合蛋白是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G和N297Q。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包括抗TM4SF1抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv或scFv。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ IDNO:8具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:7具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:6具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:14具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:13具有至少75％同一性的氨基酸的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:12具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQID NO:6阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:14阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:13阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:12阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:9阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:20具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:19具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:18具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:26具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:25具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:24具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，如权利要求所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:20阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:19阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:18阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:26阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:25阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:24阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:15阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:21阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:32具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:31具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:30具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:38具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:37具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:36具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:32阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:31阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:30阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:38阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:37阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:36阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:27阐述的氨基酸序列，并且轻链包含如以SEQ ID NO:33阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:44具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:43具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:42具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:50具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:49具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:48具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:44阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:43阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:42阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:50阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:49阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:48阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:39阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:45阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:56具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:55具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:54具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:62具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:61具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:60具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:56阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:55阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:54阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:62阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:61阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:60阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:51阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:57阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:68具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:67具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:66具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:74具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:73具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:72具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:68阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:67阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:66阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:74阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:73阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:72阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:63阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:69阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:80具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:79具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:78具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:86具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:85具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:84具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:80阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:79阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:78阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:86阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:85阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:84阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:75阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:81阐述的氨基酸序列。在一些实施方案中，轻链可变区包含人IgG框架区，并且重链可变区包含人IgG框架区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含含有以SEQ ID NO:87或88阐述的氨基酸序列的IgG骨架。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段还包含含有以SEQ IDNO:89阐述的氨基酸序列的IgG骨架。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:96具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:95具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:94具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:110具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:109具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:107具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:96阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:95阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:94阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:110阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:109阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:107阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:90阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:97阐述的氨基酸序列。

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:110具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:109具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:108具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:110阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:109阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:108阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:90或92阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:101阐述的氨基酸序列。

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:110阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:109阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:107阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:90或92阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:99阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:118具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:116具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:115具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:129具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:128具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:124具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:118阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:116阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:115阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:129阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:128阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:124阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:112阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:122阐述的氨基酸序列。

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:115具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:129具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:128具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，如权利要求57所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ IDNO:116或SEQ ID NO:117阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:115阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:129阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:128阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，重链可变结构域包含如以SEQ ID NO:112或114阐述的氨基酸序列，并且轻链可变结构域包含如以SEQ ID NO:122阐述的氨基酸序列。

一个实施方案提供了一种以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。一个实施方案提供了一种以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG抗体。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化。在一些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、A330S、P331A和P331S。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G和N297Q。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括其抗原结合片段，其中所述其抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv或scFv。

一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用如权利要求1-20中任一项所述的结合蛋白或如权利要求21-74中任一项所述的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一者或多者。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎症性疾病或癌症。

一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用根据权利要求1-20中任一项所述的结合蛋白或根据权利要求21-74中任一项所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。一个实施方案提供了一种预防受试者中的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用本公开的结合蛋白或本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述受试者处于从癌症的部分或完全缓解中。一个实施方案提供了一种治疗患有与高转移风险相关联的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与所述高转移风险相关联的所述癌症的所述受试者施用本公开的结合蛋白或本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。一个实施方案提供了一种治疗或预防患有癌症的受试者中的转移的方法，所述方法包括向患有所述癌症的所述受试者施用本公开的结合蛋白或本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，受试者正经受可诱导转移的治疗。在一些实施方案中，治疗包括手术、放射治疗和化学疗法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，癌症是癌瘤或肉瘤。在一些实施方案中，癌瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌。在一些实施方案中，肉瘤包括骨肉瘤或软组织肉瘤。在一些实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。

一个实施方案提供了一种治疗或预防人受试者中的淋巴性转移或血行性转移的方法，所述方法包括向所述人受试者施用本公开的结合蛋白或本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本公开的TM4SF1结合蛋白和(ii)药学上可接受的载体。一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了一种用于产生本公开的TM4SF1结合蛋白的方法，所述方法包括在允许表达所述TM4SF1结合蛋白的条件下培养用包含编码本公开的TM4SF1结合蛋白的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从培养物回收和纯化所产生蛋白。

一个实施方案提供了一种用于产生本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的条件下培养用包含编码本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从培养物回收和纯化所产生抗体或其抗原结合片段。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有改进的对TM4SF1的结合亲和力的抗TM4SF1结合蛋白，如通过斯卡查德(Scatchard)分析所确定。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有改进的对TM4SF1的特异性的抗TM4SF1结合蛋白，如通过斯卡查德分析所确定。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有降低的免疫原性的抗TM4SF1结合蛋白，如通过HLA分子结合所确定。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有改进的稳定性的抗TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，TM4SF1结合蛋白具有改进的化学稳定性。在一些实施方案中，TM4SF1结合蛋白具有改进的物理稳定性。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有降低的聚集的抗TM4SF1结合蛋白。一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，具有改进的溶解性的抗TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，蛋白以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，蛋白包含：重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80、96、118、119、120或121具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ IDNO:14、26、38、50、62、74、86、110或129具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85或109或128具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72、84、107、108、124、125、126或127具有至少75％同一性的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含：重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68、80、96、118、119、120或121阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67、79、95、116或117阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66、78、94或115阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74、86、110或129阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73、85、109或128阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84、107、108、124、125、126或127阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有与SEQID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112或114具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101或122具有至少85％同一性的氨基酸序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有如以SEQID NO:3、15、27、39、51、63、75、90、92、112或114阐述的序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69、81、97、99、101或122阐述的序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含在阐述为SEQ ID NO:90的序列中包含至少一个氨基酸取代的重链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含在阐述为SEQ ID NO:97的序列中包含至少一个氨基酸取代的轻链。在一些实施方案中，阐述为SEQ ID NO:90的序列中的至少一个氨基酸取代处于选自SEQ ID NO:90的氨基酸位置1、44和80的氨基酸位置中。在一些实施方案中，阐述为SEQ ID NO:97的序列中的至少一个氨基酸取代处于选自SEQ ID NO:97的氨基酸位置3、26和62的氨基酸位置中。在一些实施方案中，SEQ ID NO:90的位置1从谷氨酰胺被取代成谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:90的位置44从天冬氨酸被取代成谷氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:90的位置80从苯丙氨酸被取代成酪氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:97的位置3从异亮氨酸被取代成缬氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:97的位置26从天冬酰胺被取代成谷氨酰胺，或从天冬酰胺被取代成丝氨酸。在一些实施方案中，SEQ ID NO:97的位置62从甘氨酸被取代成丝氨酸。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有阐述为SEQ ID NO:112的序列的重链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有阐述为SEQ ID NO:99或SEQ ID NO:101的序列的轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是人源化的。

一个实施方案提供了一种用于产生本公开的TM4SF1结合蛋白的方法，所述方法包括在允许表达所述TM4SF1结合蛋白的条件下培养用包含编码本公开的TM4SF1结合蛋白的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从培养物回收和纯化所产生蛋白。一个实施方案提供了一种人源化抗TM4SF1结合蛋白，其中在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。一个实施方案提供了一种人源化抗TM4SF1结合蛋白，其中在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。一个实施方案提供了一种人源化抗TM4SF1结合蛋白，其中在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。一个实施方案提供了一种人源化抗TM4SF1结合蛋白，其中在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。

一个实施方案提供了一种相较于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体，包含至少一种改进的功能特征的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述改进的功能特征包括以下中的至少一者：改进的结合亲和力、改进的特异性、改进的抗原性、增加的与人免疫球蛋白框架区的类似性、改进的可制造性、改进的可开发性、改进的稳定性、改进的溶解性、降低的聚集倾向、表达改进、改进的生产水平。

本公开至少部分地基于对例如可用于治疗癌症的新型抗跨膜-4L6家族成员-1(TMFSF1)结合蛋白的鉴定，所述结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。本公开还至少部分地基于用于抑制肿瘤转移的组合物和方法。因此，本公开的一些实施方案包括用于通过阻止肿瘤细胞附着于血管内皮细胞以及穿过血管内皮细胞或在血管内皮细胞之间进行迁移来阻断肿瘤例如向肺和其他器官的转移的方法和组合物。

在一个实施方案中，本公开的特征在于包含本文公开的抗体的重链可变区和轻链可变区的结合区例如CDR1、CDR2和CDR3结构域的人源化抗体。

在以上方面或实施方案中的任一者的一个实施方案中，轻链可变区包含本文公开的轻链CDR以及人IgG框架区，并且重链可变区包含本文公开的重链CDR以及人IgG框架区。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有以SEQ ID NO:87或88阐述的氨基酸序列的IgG重链恒定区。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含含有以SEQID NO:89阐述的氨基酸序列的轻链恒定区。

在一个实施方案中，提供了一种抗TM4SF1结合蛋白，所述抗TM4SF1结合蛋白包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67或79具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66或78具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74或86具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域；含有与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73或85具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67或79阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66或78阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74或86阐述的氨基酸序列的CDR3结构域；含有如以SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73或85阐述的氨基酸序列的CDR2结构域；和含有如以SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75具有至少85％同一性的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81具有至少85％同一性的氨基酸序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有如以SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75阐述的序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81阐述的序列的可变轻链。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位，并且其中所述蛋白是IgG抗体。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包括IgG抗体，其中所述抗体是人源化的。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白结合人TM4SF1，并且与食蟹猴TM4SF1交叉反应。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化。在一些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1结合蛋白以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1结合蛋白以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1结合蛋白以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包括人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区的抗TM4SF1抗原结合蛋白或其抗原结合片段。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、A330S、P331A和P331S。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G和N297Q。在一些实施方案中，抗TM4SF1结合蛋白包括抗TM4SF1抗体的抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv或scFv。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:8具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:7具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:6具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:14具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:13具有至少85％同一性的氨基酸的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:12具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:8阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:7阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:6阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:14阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:13阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:12阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:3阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:9阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:20具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:19具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:18具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:26具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:25具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:24具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，如权利要求24所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:20阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:19阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:18阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:26阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:25阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:24阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:15阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:21阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:32具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:31具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:30具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:38具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:37具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:36具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:32阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQID NO:31阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:30阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:38阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:37阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:36阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:27阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:33阐述的氨基酸序列的轻链。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:44具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:43具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:42具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:50具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:49具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:48具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:44阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQID NO:43阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:42阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:50阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:49阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:48阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:39阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:45阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:56具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:55具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:54具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:62具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:61具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:60具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，如权利要求33所述的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:56阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:55阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:54阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:62阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:61阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:60阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:51阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:57阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:68具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:67具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:66具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:74具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:73具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:72具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:68阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQID NO:67阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:66阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:74阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:73阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:72阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:63阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:69阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。

一个实施方案提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:80具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:79具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:78具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有与SEQ ID NO:86具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR3结构域、含有与SEQ ID NO:85具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR2结构域和含有与SEQ ID NO:84具有至少85％同一性的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:80阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQID NO:79阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:78阐述的氨基酸序列的CDR1结构域；以及轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含含有如以SEQ ID NO:86阐述的氨基酸序列的CDR3结构域、含有如以SEQ ID NO:85阐述的氨基酸序列的CDR2结构域和含有如以SEQ ID NO:84阐述的氨基酸序列的CDR1结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:75阐述的氨基酸序列的重链可变结构域，以及含有如以SEQ ID NO:81阐述的氨基酸序列的轻链可变结构域。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区和含有人IgG框架区的重链可变区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段还包含含有以SEQ IDNO:87或88阐述的氨基酸序列的IgG骨架。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段还包含含有以SEQ ID NO:89阐述的氨基酸序列的IgG骨架。

一个实施方案提供了一种以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。

一个实施方案提供了一种以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG抗体。

在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化。在一些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、A330S、P331A和P331S。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G和N297Q。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包括其抗原结合片段，其中所述其抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv或scFv。

在一个实施方案中，提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用本公开的结合蛋白或抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一者或多者。在一些实施方案中，疾病或病症包括炎症性疾病或癌症。

一个实施方案提供了一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括施用本公开的结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了一种预防受试者中的转移的方法，所述方法包括施用本公开的结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述受试者处于从癌症的部分或完全缓解中。

一个实施方案提供了一种治疗患有与高转移风险相关联的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与所述高转移风险相关联的所述癌症的所述受试者施用本公开的结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了一种治疗或预防患有癌症的受试者中的转移的方法，所述方法包括向患有所述癌症的所述受试者施用本公开的结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，受试者正经受可诱导转移的治疗。在一些实施方案中，治疗包括手术、放射治疗和化学疗法。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，癌症是癌瘤或肉瘤。在一些实施方案中，癌瘤包括乳腺癌、肺癌、结肠癌或前列腺癌。在一些实施方案中，肉瘤包括骨肉瘤或软组织肉瘤。在一些实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。

一个实施方案提供了一种治疗或预防人受试者中的淋巴性转移或血行性转移的方法，所述方法包括向所述人受试者施用本公开的结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本公开的TM4SF1结合蛋白和(ii)药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含(i)本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段和(ii)药学上可接受的载体。

一个实施方案提供了一种用于产生本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在允许表达所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的条件下培养用包含编码本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的核酸序列的载体转化或转染的宿主，以及从培养物回收和纯化所产生抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化的方式结合人TM4SF1。

在一个实施方案中，在使用HEK293细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一个实施方案中，HEK293细胞被转染来表达食蟹猴TM4SF1。在另一实施方案中，HEK293细胞在约600个mRNA拷贝/10⁶个18S rRNA拷贝下表达食蟹猴TM4SF1。

在另一实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1。

在另一实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-8M至约5x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。

在另一实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。

在某些实施方案中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、IgG2或IgG4同种型。

在其他实施方案中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少一个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少两个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。

在其他实施方案中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、A330S、P331A和P331S。

在其他实施方案中，抗TM4SF1 TM4SF1结合蛋白或抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。

在其他实施方案中，TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G和N297Q。

在一个方面，TM4SF1结合蛋白或其抗TM4SF1抗原结合片段是Fab、Fab’、F(ab’)₂、Fv或scFv。

在一个方面，本公开提供了一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于不合需要的内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，EC-细胞相互作用选自：EC-EC、EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用。

在另一实施方案中，疾病或病症选自炎症性疾病或癌症。

在另一方面，本公开的特征在于一种治疗或预防受试者的炎症的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。

在一个方面，本公开提供了一种预防受试者中的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述受试者处于从癌症的部分或完全缓解中。

在另一方面，本公开提供了一种治疗患有与高转移风险相关联的癌症的受试者的方法，所述方法包括向患有与高转移风险相关联的癌症的所述受试者施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开提供了一种治疗或预防患有癌症的受试者中的转移的方法，所述方法包括施用本文所述的抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开包括一种治疗或预防受试者中的血行性转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开包括一种治疗或预防受试者中的淋巴性转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所述的TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，受试者正经受可诱导转移的治疗。在其他实施方案中，治疗选自手术、放射治疗和化学疗法。

在一个实施方案中，受试者是人。

在另一方面，本公开还提供了一种治疗或预防人受试者中的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述有效量包括1至80mg/kg的量的所述抗体或其抗原结合片段。

在另一方面，本公开提供了一种治疗患有与高转移风险相关联的癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文所述的TM4SF1抗体，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述有效量包括1至80mg/kg的量的所述抗体或其抗原结合片段。

在一个实施方案中，以使得在直至施用下一剂量的整个时期中在受试者中维持约1μg/ml或更大的血清浓度的频率施用TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。

在某些实施方案中，TM4SF1结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的所施用的有效量是足以在一周时实现循环抗体浓度>1μg/ml的量。

在其他实施方案中，TM4SF1结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的所施用的有效量是足以持续约1个月连续维持抗体的血清浓度处于或高于1μg/ml的量。

在另一方面，本公开还提供了一种治疗或预防人受试者中的转移的方法，所述方法包括一周一次向所述受试者施用1mg/kg至80mg/kg的TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的TM4SF1结合蛋白或抗TM4SF1抗体或其片段根据维持给药时程用于治疗或预防转移的方法中。

在一个实施方案中，癌症是癌瘤(例如乳腺癌、肺癌、结肠癌和前列腺癌)或肉瘤(例如骨肉瘤或软组织肉瘤)。

在一个实施方案中，癌症是胶质母细胞瘤。

在一个实施方案中，人受试者患有与高转移风险相关联的癌症。

在另一实施方案中，受试者正经受可诱导转移的治疗。在其他实施方案中，治疗选自手术、放射治疗和化学疗法。

在另一实施方案中，人受试者被关于癌症加以治疗，并且具有显现转移的风险。

援引并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请都以引用的方式并入本文，所述引用的程度就好像已特定地和单独地指出将每个单独的出版物、专利或专利申请以引用的方式并入一样。

附图说明

本公开的新颖特征特定地阐述于随附权利要求中。通过参考阐述其中利用本公开的原理的说明性实施方案的以下具体实施方式以及附图，将获得对本公开的特征和优势的更充分了解，在所述附图中：

图1是显示TM4SF1在用于达成外渗的肿瘤细胞(TC)和内皮细胞(EC)相互作用中的作用的示意图。

图2显示以野生型(+/+)TM4SF1的正常水平的约1/2进行表达的TM4SF1杂合性(+/-)小鼠中TC向肺转移的频率。转移的数目显示为肿瘤结节(数目)。示例性转移用箭号指示。

图3A是显示以10％或90％汇合进行生长的B16F10细胞中的TM4SF1表达的图。如图3A中所示，TM4SF1表达水平随汇合而降低。图3B显示在10％(高TM4SF1)或90％(低TM4SF1)表达性B16F10细胞的情况下的转移数目。如图3B中所示，相比于较低TM4SF1表达者，高TM4SF1表达性B16F10细胞产生更多肺转移。示例性转移用箭号指示。

图4显示荧光活体成像结果。将经GFP标记B16F10细胞层置在经RFP标记HLMEC的坪苔上。来自代表性活细胞成像的连续图像显示与对照(Ctl)抗体相比，抗TM4SF1抗体AGX-01(10μg/ml)干扰用于达成迁移的TC相互作用，从而导致广泛不规则细胞突起，所述细胞突起导致细胞脱离。

图5显示抗体AGX-A03的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:3)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:9)。在图5中，对重链CDR1(SEQ ID NO:6)、CDR2(SEQ ID NO:7)和CDR3(SEQ IDNO:8)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:12)、CDR2(SEQ ID NO:13)和CDR3(SEQID NO:14)序列加下划线。

图6显示抗体AGX-A04的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:15)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:21)。在图6中，对重链CDR1(SEQ ID NO:18)、CDR2(SEQ ID NO:19)和CDR3(SEQID NO:20)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:24)、CDR2(SEQ ID NO:25)和CDR3(SEQ ID NO:26)序列加下划线。

图7显示抗体AGX-A05的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:27)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:33)。在图7中，对重链CDR1(SEQ ID NO:30)、CDR2(SEQ ID NO:31)和CDR3(SEQID NO:32)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:36)、CDR2(SEQ ID NO:37)和CDR3(SEQ ID NO:38)序列加下划线。

图8显示抗体AGX-A07的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:39)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:45)。在图8中，对重链CDR1(SEQ ID NO:42)、CDR2(SEQ ID NO:43)和CDR3(SEQID NO:44)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:48)、CDR2(SEQ ID NO:49)和CDR3(SEQ ID NO:50)序列加下划线。

图9显示抗体AGX-A08的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:51)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:57)。在图9中，对重链CDR1(SEQ ID NO:54)、CDR2(SEQ ID NO:55)和CDR3(SEQID NO:56)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:60)、CDR2(SEQ ID NO:61)和CDR3(SEQ ID NO:62)序列加下划线。

图10显示抗体AGX-A09的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:63)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:69)。在图10中，对重链CDR1(SEQ ID NO:66)、CDR2(SEQ ID NO:67)和CDR3(SEQID NO:68)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:72)、CDR2(SEQ ID NO:73)和CDR3(SEQ ID NO:74)序列加下划线。

图11显示抗体AGX-A11的可变重链(VH)序列(SEQ ID NO:75)、可变轻链(VL)序列(SEQ ID NO:81)。在图11中，对重链CDR1(SEQ ID NO:78)、CDR2(SEQ ID NO:79)和CDR3(SEQID NO:80)序列加下划线，并且对轻链CDR1(SEQ ID NO:84)、CDR2(SEQ ID NO:85)和CDR3(SEQ ID NO:86)序列加下划线。

图12显示本公开的若干抗TM4SF1抗体即h AGX-A07 H2L5、hm AGX-A07 H2L5 V1、hm AGX-A07 H2L5 V2、hm AGX-A07 H2L5V3、hm AGX-A07 V4和h AGX-A01 H1L10的靶标结合。

图13显示在不同抑制剂存在下对HUVEC中的TM4SF1内化的影响。图13(A)显示用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记的HUVEC。图13(B)显示由用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记，并且返回在37℃下培养的HUVEC对AGX-A01的摄取。图13(C)显示由用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记，并且返回在37℃下在网格蛋白(clathrin)抑制剂20μM pitstop-2存在下培养的HUVEC对AGX-A01的摄取。图13(D)显示由用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记，并且返回在37℃下在网格蛋白和窖蛋白(caveolin)介导的胞吞抑制剂10μM氯丙嗪(chloropromazine)存在下培养的HUVEC对AGX-A01的摄取。图13(E)显示由用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记，并且返回在37℃下在自体吞噬抑制剂0.4μM巴佛洛霉素A(bifilomycin A)存在下培养的HUVEC对AGX-A01的摄取。图13(F)显示由用AGX-A01(在1μg/ml的浓度下)在4℃下预标记，并且返回在37℃下在发动蛋白(dynamin)抑制剂20μM代纳索(dynasore)存在下培养的HUVEC对AGX-A01的摄取。

具体实施方式

跨膜-4L6家族成员-1(TM4SF1)是一种在许多人上皮肿瘤细胞上高度表达的具有四跨膜蛋白拓扑结构的小型膜糖蛋白。

在一个实施方案中，本公开提供了新型TM4SF1结合蛋白，诸如抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段。在一些实例中，本公开包括使用TM4SF1结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段治疗或预防癌症的方法。本公开包括但不限于用于抑制血道肿瘤转移的组合物和方法。因此，本公开至少部分地提供了针对人TM4SF1的抗体，所述抗体通过阻止肿瘤细胞(TC)附着于血管内皮细胞(EC)以及跨越血管内皮细胞(EC)进行迁移来阻断肿瘤向肺和其他器官的转移。

I.定义

除非本文另外定义，否则与本公开关联使用的科学和技术术语将具有由本领域普通技术人员通常所理解的含义。术语的含义和范围应是明晰的，然而，在存在任何潜在歧义的情况下，本文提供的定义优先于任何词典或外部定义。此外，除非上下文另外要求，否则单数术语将包括复数，并且复数术语将包括单数。在本申请中，除非另外陈述，否则“或”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及其他形式诸如“includes”和“included”的使用不具有限制性。

通常，与本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、以及蛋白质和核酸化学和杂交关联使用的命名法以及本文所述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学、以及蛋白质和核酸化学和杂交的技术是本领域中熟知以及通常使用的那些。除非另外指示，否则本公开的方法和技术通常根据本领域中熟知以及如本说明书整篇引用和讨论的各种一般性和更特定参考文献中所述的常规方法来进行。酶促反应和纯化技术根据制造商说明书，如本领域中通常所实现或如本文所述来进行。与本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学关联使用的命名法以及本文所述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学的实验室程序和技术是本领域中熟知以及通常使用的那些。标准技术用于化学合成、化学分析、药物制备、配制和递送以及治疗患者。

为使本公开可更易于被理解，以下定义所选术语。如本文所用的术语“跨膜-4L6家族成员-1”或“TM4SF1”是指跨膜4超家族/四跨膜蛋白家族的多肽，所述多肽在肿瘤血管结构内皮细胞(EC)、肿瘤细胞(TC)、发育视网膜血管结构的EC、以及血管生成性血管上高度表达。TM4SF1具有两个由四个跨膜结构域(M1、M2、M3和M4)分隔的细胞外环(ECL1和ECL2)、N末端和C末端、以及细胞内环(ICL)。ECL2含有两个N-糖基化位点。人TM4SF1(hTM4SF1)的氨基酸序列以SEQ ID NO:90描述(也参见NCBI参考序列号NP_055035.1)。

如本文所用的术语“抗体”意指包含至少一个与特定抗原(例如TM4SF1)特异性结合或相互作用的互补决定区(CDR)的任何抗原结合分子。术语“抗体”包括包含四个多肽链，即通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链的免疫球蛋白分子以及其多聚体(例如IgM)。每个重链包含重链可变区(在本文中缩写为HCVR或VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个结构域CH1、CH2和CH3。每个轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为LCVR或VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域(CL1)。VH区和VL区可被进一步再分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，所述高变区与被称为框架区(FR)的更保守区域交替散布。每个VH和VL由三个CDR和四个FR组成，从氨基末端至羧基末端按以下顺序安置：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。在本公开的不同实施方案中，抗TMS4F1抗体(或其抗原结合部分)的FR可与人种系序列相同，或可被天然地或人工地修饰。可基于对两个或更多个CDR的并行分析来确定氨基酸共有序列。

术语“完整抗体”是指包含四个多肽链，即通过二硫键相互连接的两个重(H)链和两个轻(L)链的抗体。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体是完整抗体。在一个实施方案中，完整抗体是完整人IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、IgG2或IgG4同种型。

如本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”、抗体的“抗原结合片段”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、可以酶法获得的、合成的、或经遗传工程改造的多肽或糖蛋白。抗体的抗原结合片段可例如使用任何适合标准技术从完整抗体分子获得，所述技术诸如蛋白水解消化，或涉及操作和表达编码抗体可变结构域以及任选地编码抗体恒定结构域的DNA的重组遗传工程改造技术。所述DNA是已知的和/或可易于从例如商业来源、DNA文库(包括例如噬菌体-抗体文库)获得，或可被合成。可对DNA测序，并且以化学方式或通过使用分子生物学技术加以操作，例如用以将一个或多个可变结构域和/或恒定结构域安置成适合构型，或用以引入密码子，创建半胱氨酸残基，修饰、添加或缺失氨基酸等。

抗原结合片段的非限制性实例包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab’)2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体的高变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如经分离互补决定区(CDR)，诸如CDR3肽)，或受约束的FR3-CDR3-FR4肽。

如本文所用的术语抗体或其片段的“可变区”或“可变结构域”是指抗体分子的轻链和重链的包括互补决定区(CDR；即CDR-1、CDR-2和CDR-3)和框架区(FR)的氨基酸序列的部分。VH是指重链的可变结构域。VL是指轻链的可变结构域。根据本公开中使用的方法，对CDR和FR指定的氨基酸位置可根据Kabat(Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1987和1991))来确定。抗体或抗原结合片段的氨基酸编号还根据Kabat的编号。

如本文所用的术语“互补决定区”或“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的可变区中的每一者中存在三个CDR，对于可变区中的每一者，所述CDR被指定为CDR1、CDR2和CDR3。如本文所用的术语“CDR集合”是指存在于单一可变区中的能够结合抗原的一组三个CDR。这些CDR的精确边界已根据不同系统以不同方式界定。由Kabat(Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest(National Institutes ofHealth,Bethesda,Md.(1987)和(1991)))描述的系统不仅提供可适用于抗体的任何可变区的明确残基编号系统，而且还提供界定三个CDR的确切残基边界。这些CDR可被称为KabatCDR。Chothia和同事(Chothia等,J.Mol.Biol.196:901-917(1987)以及Chothia等,Nature342:877-883(1989))发现Kabat CDR内的某些子部分尽管在氨基酸序列水平上具有极大多样性，但却采用几乎相同的肽骨架构象。这些子部分被指定为L1、L2和L3或H1、H2和H3，其中“L”和“H”分别表示轻链区域和重链区域。这些区域可被称为Chothia CDR，所述CDR具有与Kabat CDR重叠的边界。与Kabat CDR重叠的界定CDR的其他边界已由Padlan(FASEB J.9:133-139(1995))和MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。其他CDR边界定义可不严格遵循以上系统中的一者，但仍将与Kabat CDR重叠，尽管鉴于特定残基或残基组或甚至整个CDR不显著影响抗原结合的预测或实验研究结果，它们可为缩短的或延长的。本文所用的方法可利用根据这些系统中的任一者所确定的CDR，但优选实施方案使用Kabat或Chothia确定的CDR。

如本文所用的术语“框架区”(在下文中称为FR)是指除CDR残基以外的那些可变结构域残基。每个可变结构域通常具有四个FR，标识为FR1、FR2、FR3和FR4。抗体或其功能性片段的可变区之间的共同结构特征在本领域中是熟知的。编码特定抗体的DNA序列可通常遵循熟知方法来得到，所述方法诸如作为参考文献并入本文的Kabat等1987Sequence ofProteins of Immunological Interest,U.S.Department of Health and HumanServices,Bethesda MD中所述的那些。此外，用于克隆来自抗体的功能性可变区的一般性方法可见于作为参考文献并入本文的Chaudhary,V.K.等,1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA87:1066中。

本文术语“Fc区”用于定义抗体重链的C末端区域，包括例如天然序列Fc区、重组Fc区和变异Fc区。尽管抗体重链的Fc区的边界可能变化，但人IgG重链Fc区常常被定义成从在位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230伸展至重链的羧基末端。Fc区的C末端赖氨酸(根据EU编号系统的残基447)可例如在抗体的产生或纯化期间，或通过重组工程改造编码抗体的重链的核酸被移除。因此，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被移除的抗体群体、无K447残基被移除的抗体群体、以及具有含K447残基的抗体和不含K447残基的抗体的混合物的抗体群体。

如本文所用的术语“人源化抗体”是指免疫特异性结合目标抗原(例如人TM4SF1)，并且包含大致上具有人抗体的氨基酸序列的框架(FR)区和大致上具有非人抗体的氨基酸序列的互补决定区(CDR)的抗体或其变体、衍生物、类似物或片段。非人(例如鼠)抗体的人源化形式是含有源于非人免疫球蛋白的最小序列的嵌合免疫球蛋白。一般来说，人源化抗体将包含大致上全部至少一个，并且通常两个可变结构域，其中全部或大致上全部CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些，并且全部或大致上全部FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体还可包含免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，所述免疫球蛋白恒定区通常是具有人免疫球蛋白共有序列的免疫球蛋白恒定区。抗体人源化的方法在本领域中是已知的。参见例如Riechmann等,1988,Nature332:323-7；属于Queen等人的美国专利号：5,530,101；5,585,089；5,693,761；5,693,762；和6,180,370；EP239400；PCT公布WO 91/09967；美国专利号5,225,539；EP592106；EP519596；Padlan,1991,Mol.Immunol.,28:489-498；Studnicka等,1994,Prot.Eng.7:805-814；Roguska等,1994,Proc.Natl.Acad.Sci.91:969-973；以及美国专利号5,565,332，所述文献和专利全都据此以引用的方式整体并入本文。

如本文所用的术语“单克隆抗体”是指从大致上同质抗体群体获得的抗体，即构成所述群体的单个抗体是相同的，例外之处是可少量存在的可能突变，例如天然存在的突变。因此，修饰语“单克隆”将抗体的特性指示为不是无关联抗体的混合物。在某些实施方案中，这种单克隆抗体通常包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合性多肽序列通过包括从多种多肽序列选择单一靶标结合性多肽序列的方法来获得。举例来说，选择方法可为从诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的汇合物的多种克隆选择独特克隆。不同于通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制剂，单克隆抗体制剂的每个单克隆抗体针对抗原上的单一表位。

如本文所用的术语“嵌合抗体”是指重链和/或轻链的一部分与源于特定物种或属于特定抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源，而一个或多个链的其余部分与源于另一物种或属于另一抗体类别或子类的抗体中的相应序列相同或同源的抗体(免疫球蛋白)，以及所述抗体的片段，只要它们展现所需生物活性即可(美国专利号4,816,567；以及Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA81:6851-6855(1984))。

如本文所用的术语“表位”是指与抗体分子的可变区中的称为互补位的特定抗原结合位点相互作用的抗原决定簇。单一抗原可具有超过一个表位。因此，不同抗体可结合抗原上不同区域，并且可具有不同生物作用。表位可被定义为结构性的或功能性的。功能性表位通常是结构性表位的子组，并且具有直接促进相互作用的亲和力的那些残基。表位还可为构象性的，也就是说由非线性氨基酸组成。在某些实施方案中，表位可包括是分子诸如氨基酸、糖侧链、磷酰基或磺酰基的化学活性表面集合的决定簇，并且在某些实施方案中，可具有特定三维结构特征和/或特定电荷特征。

“结合亲和力”通常是指分子(例如结合蛋白诸如抗体)的单一结合位点与它的结合配偶体(例如抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。结合分子X(例如抗TM4SF1抗体)对它的结合配偶体Y(例如人TM4SF1)的亲和力可通常由解离常数(K_D)表示。亲和力可通过本领域中已知的常用方法测量，所述方法包括本文所述的那些。低亲和力抗体通常缓慢结合抗原并倾向于容易解离，而高亲和力抗体通常更快结合抗原并倾向于更久保持结合。多种测量结合亲和力的方法在本领域中是已知的，其中任一者都可出于本公开的目的加以使用。特定说明性实施方案包括以下。在一个实施方案中，“K_D”或“K_D值”可通过本领域中已知的测定，例如通过结合测定来测量。K_D可在例如用目标抗体的Fab形式和它的抗原进行的RIA中测量(Chen等,1999,J.Mol Biol293:865-81)。K_D还可通过以下方式测量：使用FACS；或使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000通过BIACORE进行表面等离子体共振测定；或通过使用例如OCTET QK384系统进行生物层干涉测量术。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体的K_D使用用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定来测定。“缔合速率”(on-rate/rateof association/association rate)或“k_缔合”和“解离速率(off-rate/rate ofdissociation/dissociation rate)”或“k_解离”也可用以上所述的相同表面等离子体共振或生物层干涉测量术技术，使用例如BIACORE 2000或BIACORE 3000或OCTET QK384系统测定。

如本文所用的术语“k_缔合”意指如本领域中所知，抗体与抗原缔合以形成抗体/抗原复合物的缔合速率常数。

如本文所用的术语“k_解离”意指如本领域中所知，抗体从抗体/抗原复合物解离的解离速率常数。

术语“抑制(inhibition/inhibit)”当在本文中使用时是指部分(诸如1％、2％、5％、10％、20％、25％、50％、75％、90％、95％、99％)或完全(即100％)抑制。

如本文所用的术语“癌症”是指或描述哺乳动物的特征通常在于细胞生长不受调控的生理状况。

如本文所用的术语“与高转移风险相关联的癌症”是指与至少一种已知会使患有癌症的受试者将显现转移性癌症的风险增加的因素相关联的癌症。与增加的转移风险相关联的因素的实例包括但不限于受试者在初始癌症诊断时具有的癌性淋巴结的数目、肿瘤的尺寸、组织学分级、以及在初始诊断时癌症的分期。

如本文所用的术语“血行性转移”是指癌细胞能够穿透血管壁，此后，它们能够通过血流进行循环(循环肿瘤细胞)以到达身体中的其他部位和组织。

如本文所用的术语“淋巴性转移”是指癌细胞能够穿透淋巴管，并且排入血管中。

在本公开的情形下，如本文所用的术语“治疗(treating/treatment)”意指逆转、缓和、抑制所述术语所适用的病症或病状或所述病症或病状的一种或多种症状的进展，或预防所述病症或病状或所述病症或病状的一种或多种症状。就如本文所用的术语“治疗癌症”来说，其意指抑制癌细胞的生长和/或增殖。在一个实施方案中，本文所述的组合物和方法用于治疗患有转移性癌症的受试者中的转移。

术语“预防癌症(preventing cancer/prevention of cancer)”是指延迟、抑制或防止癌症在其中肿瘤生成或肿瘤发生的发作未经证实，但癌症倾向得以确认(无论是通过例如遗传筛选还是以其他方式)的哺乳动物中的发作。所述术语还涵盖治疗患有恶变前病状的哺乳动物以使恶变前病状向恶性肿瘤的进展停止，或导致恶变前病状的消退。恶变前病状的实例包括增生、发育不良和化生。在一些实施方案中，预防癌症关于处于从癌症的缓解中的受试者加以使用。

多种癌症，包括恶性或良性和/或原发性或继发性癌症，可用本公开的方法治疗或预防。所述癌症的实例为本领域技术人员所知，并且列于标准教科书诸如Merck Manual ofDiagnosis and Therapy(由Merck出版)中。

如本文所用的术语“受试者”是指哺乳动物(例如人)。

如本文所用的术语“施用”是指向受试者给与一定剂量的抗体或其片段或组合物(例如药物组合物)的方法。施用方法可视各种因素(例如所施用的结合蛋白或药物组合物以及所治疗的病状、疾病或病症的严重性)而变化。

如本文所用的术语“有效量”是指本文提供的抗体或药物组合物的足以导致所需结果的量。

术语“约”和“近似”意指在给定值或范围的20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小内。

如在本文中可互换使用的术语“同一性”或“同源性”可为两个或更多个核苷酸或氨基酸序列之间的可通过出于最优比较目的将序列进行对准(例如可将空位引入第一序列的序列中)来确定的“同一性”、“同源性”或“同源性百分比”的计算结果。可接着比较在相应位置处的核苷酸，并且两个序列之间的同一性百分比可为由序列共有的相同位置的数目的函数(即同源性％＝相同位置的数目/位置的总数目x100)。举例来说，第一序列中的某一位置与第二序列中的相应位置可由相同核苷酸占据，那么分子在那个位置处是相同的。两个序列之间的同源性百分比可为在考虑需要被引入以达成两个序列的最优比对的空位的数目和每个空位的长度的情况下，由序列共有的相同位置的数目的函数。在一些实施方案中，序列的出于比较目的加以对准的长度可为参考序列的长度的至少约：30％、40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或95％。搜索可确定两个序列之间的同源性。两个序列可为基因、核苷酸序列、蛋白质序列、肽序列、氨基酸序列或它们的片段。两个序列的实际比较可通过熟知方法，例如使用数学算法来实现。这种数学算法的一非限制性实例可描述于Karlin,S.和Altschul,S.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90-5873-5877(1993)中。这种算法可被并入如Altschul,S.等,Nucleic Acids Res.,25:3389-3402(1997)中所述的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)中。当利用BLAST和空位化BLAST程序时，可使用相应程序(例如NBLAST)的任何相关参数。举例来说，用于序列比较的参数可被设置在评分＝100，字长＝12下，或可加以改变(例如W＝5或W＝20)。其他实例包括Myers和Miller,CABIOS(1989)的算法、ADVANCE、ADAM、BLAT和FASTA。在另一实施方案中，两个氨基酸序列之间的同一性百分比可使用例如GCG软件包(Accelrys，Cambridge,UK)中的GAP程序来获得。

如本文所用的术语“可制造性”是指特定蛋白质在那个蛋白质的重组表达和纯化期间的稳定性。可制造性据信归因于分子在表达和纯化条件下的内在性质。改进的可制造性特征的实例包括蛋白质的统一糖基化；在蛋白质的重组产生期间的增加的细胞效价、生长和蛋白质表达；改进的纯化性质；较小的聚集倾向或不聚集；以及改进的稳定性，包括但不限于热稳定性和在低pH下的稳定性。在一些实施方案中，提供了相较于其他TM4SF1抗体，显示可制造性以及体外和体内活性的保留的TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，通过在CDR或框架区中进行氨基酸取代来使亲本TM4SF1结合蛋白人源化可赋予额外可制造性益处。

在一些实施方案中，提供了显示改进的可开发性特征的TM4SF1结合蛋白，所述改进的可开发性特征包括但不限于例如在蛋白A纯化或尺寸排阻色谱法之后的改进的纯化产率、在纯化之后的改进的同质性、改进的热稳定性。在一些情况下，改进是相对于由杂交瘤小鼠细胞系8G4-5-13-13F(PTA-120523)产生的抗TM4SF1抗体来说的，如通过HLA分子结合所确定。

在一些实例中，结合亲和力通过斯卡查德分析来确定，所述分析包括产生斯卡查德图，所述斯卡查德图是结合的配体与未结合的配体的浓度比率相对于结合的配体浓度的图。

II.TM4SF1结合蛋白

本公开的一个实施方案提供了TM4SF1结合蛋白。在一些实施方案中，TM4SF1结合蛋白是可例如用于治疗或预防癌症的抗体及其抗原结合片段。在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体和抗原结合片段可用于预防肿瘤细胞进行转移。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段通过干扰肿瘤细胞与血管内皮细胞之间的相互作用来预防肿瘤细胞转移。

TM4SF1是一种具有四跨膜蛋白拓扑结构而非同源性的小型质膜糖蛋白(NCBI参考序列号NP_055035.1)(Wright等Protein Sci.9:1594-1600,2000)。它在质膜上形成富含TM4SF1的区域(TMED)，在所述区域中，如同真正四跨膜蛋白一样，它充当募集功能相关膜和胞质分子的分子促进子(Shih等Cancer Res.69:3272-3277,2009；Zukauskas等,Angiogenesis.14:345-354,2011)，并且在癌细胞生长(Hellstrom等Cancer Res.46:3917-3923,1986)、运动性(Chang等Int J Cancer.116:243-252,2005)和转移(Richman等Cancer Res.5916s-5920s,1995)中起重要作用。人TM4SF1蛋白的氨基酸序列(NCBI参考序列号NP_055035.1)在以下显示为SEQ ID NO:134。

MCYGKCARCI GHSLVGLALL CIAANILLYF PNGETKYASENHLSRFVWFF SGIVGGGLLMLLPAFVFIGL EQDDCCGCCGHENCGKRCAM LSSVLAALIG IAGSGYCVIVAALGLAEGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFSILLALG GIEFILCLIQVINGVLGGIC GFCCSHQQQYDC(SEQID NO:91)

本公开的抗TM4SF1抗体及其抗原结合片段对TM4SF1的ECL2结构域具有特异性。人TM4SF1 ECL2结构域的氨基酸序列是EGPLCLDSLGQWNYTFASTEGQYLLDTSTWSECTEPKHIVEWNVSLFS(SEQ ID NO:92)。

如下表2中所述，本公开中包括对TM4SF1具有特异性的新型抗体。表2中所述的抗体是单克隆鼠抗体AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11，所述抗体中的每一者在实施例中所述的筛选中鉴定，并且结合TM4SF1的ECL2区。下表2中还提供人源化抗体h AGX-A07和h AGX-A01。

在一些实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含IgG重链恒定区，所述IgG重链恒定区包含以SEQ ID NO:87或88阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:73或74至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链恒定区，所述轻链恒定区包含以SEQ ID NO:89阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:89至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:3、15、27、39、51、63或75至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以SEQ ID NO:90或92阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:90或92至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链可变结构域，所述重链可变结构域包含以SEQ ID NO:112或114阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:112或114至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:9、21、33、45、57、69或81至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以SEQ ID NO:97、99、101、103或105阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:97、99、101、103或105至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以SEQ ID NO:97、99或101阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:97、99或101至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在另一实施方案中，抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含以SEQ ID NO:122阐述的氨基酸序列，或与SEQ ID NO:122至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％同一或100％同一的序列。

在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR1，所述重链CDR1包含与SEQ ID NO:6、18、30、42、54、66或78至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR2，所述重链CDR2包含与SEQ ID NO:7、19、31、43、55、67或79至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含重链CDR3，所述重链CDR3包含与SEQ ID NO:8、20、32、44、56、68或80至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR1，所述轻链CDR1包含与SEQ ID NO:12、24、36、48、60、72或84至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR2，所述轻链CDR2包含与SEQ ID NO:13、25、37、49、61、73或85至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含轻链CDR3，所述轻链CDR3包含与SEQ ID NO:14、26、38、50、62、74或86至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR1，所述重链CDR1包含与SEQ ID NO:94或SEQ ID NO:115至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR2，所述重链CDR2包含与SEQ ID NO:95、SEQ ID NO:116或SEQ ID NO:117至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含重链CDR3，所述重链CDR3包含与SEQ ID NO:96、SEQ ID NO:118、SEQ ID NO:119、SEQ ID NO:120或SEQ ID NO:121至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。

在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR1，所述轻链CDR1包含与SEQ ID NO:107、SEQ ID NO:108、SEQ ID NO:124、SEQ ID NO:125、SEQ ID NO:126或SEQ ID NO:127至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，包含轻链CDR2，所述轻链CDR2包含与SEQ ID NO:109或SEQ ID NO:128至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，所述轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110、SEQ ID NO:111或SEQ ID NO:129至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。在一些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的，并且包含轻链CDR3，所述轻链CDR3包含与SEQ ID NO:110或SEQ ID NO:129至少约80％至至少约85％、至少约85％至至少约90％、至少约90％至至少约91％、至少约91％至至少约92％、至少约92％至至少约93％、至少约93％至至少约94％、至少约94％至至少约95％、至少约95％至至少约96％、至少约96％至至少约97％、至少约97％至至少约98％、至少约98％至至少约99％、或至少约99％至100％同一的氨基酸序列。

鼠单克隆抗体AGX-A03的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:6、7和8(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:12、13和14(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:6、7和8的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:12、13和14的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A03的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A03的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:3和9描述。

鼠单克隆抗体AGX-A04的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:18、19和20(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:24、25和26(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:18、19和20的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:24、25和26的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A04的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A04的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:15和21描述。

鼠单克隆抗体AGX-A05的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:30、31和32(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:36、37和38(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:30、31和32的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:36、37和38的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A05的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A05的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:27和33描述。

鼠单克隆抗体AGX-A07的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:42、43和44(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:48、49和50(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:42、43和44的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:48、49和50的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A07的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A07的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:39和45描述。

在一个实施方案中，提供了一种人源化AGX-A07(h AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，所述人源化AGX-A07(h AGX-A07)抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90的氨基酸序列阐述的重链序列。在一些实施方案中，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A07(hm AGX-A07)抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07(hm AGX-A07)抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:90的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的重链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:90阐述的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2。在一些实施方案中，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:90的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的重链序列，其中所述一个或多个取代处于SEQ ID NO:90的氨基酸位置1、44和80中。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含E1Q(在SEQ ID NO:90的重链的位置1处谷氨酸被取代成谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含D44G(在SEQ IDNO:90的重链的位置44处天冬氨酸被取代成甘氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含F80Y(在SEQ ID NO:90的重链的位置80处苯丙氨酸被取代成酪氨酸)。在一些实施方案中，提供了一种人源化突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07抗体或抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:92的氨基酸序列阐述的重链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:92阐述的重链序列在本文中也称为AGX-A07 H2v1。在一些实施方案中，提供了人源化AGX-A07抗体或抗原结合片段，所述人源化AGX-A07抗体或抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:97的氨基酸序列阐述的轻链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:97阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5。在一些实施方案中，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:97的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链序列。在一些实施方案中，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:97的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链序列，其中所述一个或多个取代处于SEQ ID NO:97的氨基酸位置3、26、62和90中。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含I3V(在SEQ ID NO:97的轻链的位置3处异亮氨酸被取代成缬氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26Q(在SEQID NO:97的轻链的位置26处天冬酰胺被取代成谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含N26S(在SEQ ID NO:97的轻链的位置26处天冬酰胺被取代成丝氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含G62S(在SEQ IDNO:97的轻链的位置62处甘氨酸被取代成丝氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含W90Y(在SEQ ID NO:97的轻链的位置90处色氨酸被取代成酪氨酸)。在一些实施方案中，提供了人源化突变AGX-A07抗体或抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A07抗体或抗原结合片段包含如以选自SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103和SEQ ID NO:105的氨基酸序列阐述的轻链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:99阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v1，以SEQ ID NO:101阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v2，以SEQ ID NO:103阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v3，并且以SEQ ID NO:105阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A07 L5v4。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO:91提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的重链的示例性编码序列以SEQ ID NO:93提供。人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:98(AGX-A07 L5)提供。人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段的轻链的示例性编码序列以SEQ ID NO:100(AGX-A07L5v1)、SEQID NO:102(AGX-A07 L5v2)、SEQ ID NO:104(AGX-A07L5v3)和SEQ ID NO:106(AGX-A07L5v4)提供。

在一些情况下，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的重链CDR序列，或在如以SEQ ID No:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的重链CDR序列，或在如以SEQ ID No:94、95和96(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。

在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:94阐述的重链CDR1序列，或在如以SEQ ID NO:94阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:95阐述的重链CDR2序列，或在如以SEQ ID NO:95阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:96阐述的重链CDR3序列，或在如以SEQ ID NO:96阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR3序列。

在一些情况下，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ ID No:107、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ ID No:107、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ IDNo:108、109和110(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ ID No:108、109和111(CDR1、CDR2和CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。

在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:107或108阐述的轻链CDR1序列，或在如以SEQ ID No:107或108阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:109阐述的轻链CDR2序列，或在如以SEQ ID NO:109阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:110或111阐述的轻链CDR3序列，或在如以SEQ ID No:110或111阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A07抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:110阐述的轻链CDR3序列，或在如以SEQ ID No:110阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR1序列。

在一些实施方案中，人源化突变AGX-A07包含在SEQ ID NO:132(在本文中也称为AGX-A07 H2)中包含以下氨基酸取代的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133(在本文中也称为AGX-A07 L5)中包含以下氨基酸取代的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S。在一些实施方案中，人源化突变AGX-A07包含在SEQ IDNO:132中包含以下氨基酸取代的重链可变区：Q1E、D44G、F80Y，以及在SEQ ID NO:133中包含以下氨基酸取代的轻链可变区：I3V、N26Q、G62S，其中重链包含CDR1(SEQ ID NO:94)、CDR2(SEQ ID NO:95)和CDR3(SEQ ID NO:96)，并且轻链包含CDR1(SEQ ID NO:108)、CDR2(SEQ ID NO:109)和CDR3(SEQ ID NO:110)。在一些实施方案中，人源化突变AGX-A07是AGX-A07 H2v1L5v2，并且包含含有如以SEQ IDNO:130阐述的氨基酸序列的重链(在本文中也称为AGX-A07 H2v1)，以及含有如以SEQ IDNO:131阐述的氨基酸序列的轻链(在本文中也称为AGX-A07 L5v2)。在一些实施方案中，人源化突变AGX-A07包含含有如以SEQ ID NO:92阐述的氨基酸序列的重链，以及含有如以SEQID NO:101阐述的氨基酸序列的轻链。

鼠单克隆抗体AGX-A08的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:54、55和56(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:60、61和62(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:54、55和56的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:60、61和62的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A08的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A08的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:51和57描述。

鼠单克隆抗体AGX-A09的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:66、67和68(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:72、73和74(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:66、67和68的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:72、73和74的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A09的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A09的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:63和69描述。

鼠单克隆抗体AGX-A11的氨基酸序列描述于表2中。具体来说，重链CDR序列以SEQID No:78、79和80(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:84、85和86(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。本公开中包括抗TM4SF1抗体或抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或抗原结合片段包含含有如以SEQ ID No:78、79和80的氨基酸序列阐述的CDR的重链可变区，和/或含有如以SEQ ID No:84、85和86的氨基酸序列阐述的CDR的轻链可变区。本公开中包括包含AGX-A11的CDR的人源化抗体或抗原结合片段。此外，AGX-A11的重链可变氨基酸序列和轻链可变氨基酸序列分别以SEQ ID NO:75和81描述。

人源化抗体AGX-A01(h AGX-A01)的氨基酸序列描述于表2中。如表2中所示，以SEQID NO:112阐述的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1。具体来说，重链CDR序列以SEQ IDNo:115、116和118(CDR1、CDR2和CDR3)阐述，并且轻链CDR氨基酸序列以SEQ ID No:124、128和129(CDR1、CDR2和CDR3)阐述。此外，人源化AGX-A01的示例性重链氨基酸序列和轻链氨基酸序列分别以SEQ ID No:112和122描述。人源化AGX-A01的重链和轻链的示例性编码序列分别以SEQ ID No:113和123描述。

在一些实施方案中，人源化AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A01(hm AGX-A01)抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A01(hm AGX-A01)抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:112的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的重链序列。在一些实施方案中，人源化AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:112的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的重链序列，其中所述一个或多个取代处于SEQ ID NO:112的氨基酸位置63和106中。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含G63S(在SEQ ID NO:112的重链的位置63处甘氨酸被取代成丝氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106E(在SEQID NO:112的重链的位置106处天冬氨酸被取代成谷氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D106S(在SEQ ID NO:112的重链的位置106处天冬氨酸被取代成丝氨酸)。在一些实施方案中，提供了一种人源化突变AGX-A01抗体或抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A01抗体或抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:114的氨基酸序列阐述的重链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:114阐述的重链序列在本文中也称为AGX-A01 H1v1。

在一些实施方案中，提供了人源化AGX-A01抗体或抗原结合片段，所述人源化AGX-A01抗体或抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:122的氨基酸序列阐述的轻链序列。如表2中所示，以SEQ ID NO:122阐述的轻链序列在本文中也称为AGX-A01 L10。在一些实施方案中，人源化AGX-A01抗体或其抗原结合片段是人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，所述人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含在如以SEQ ID NO:122的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链序列。在一些实施方案中，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是包含在如以SEQ ID NO:122的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链序列的人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个取代处于一个或多个选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51、86和90的氨基酸位置中。在一些实施方案中，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段是包含在如以SEQ ID NO:122的氨基酸序列阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链序列的人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段，其中所述一个或多个取代处于一个或多个选自SEQ ID NO:122的氨基酸位置1、33、42、51和86的氨基酸位置中。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含A1E(在SEQ ID NO:122的轻链的位置1处丙氨酸被取代成谷氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含N33S(在SEQ ID NO:122的轻链的位置33处天冬酰胺被取代成丝氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含M42Q(在SEQ ID NO:122的轻链的位置42处甲硫氨酸被取代成谷氨酰胺)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含V51L(在SEQ ID NO:122的轻链的位置51处缬氨酸被取代成亮氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含D86E(在SEQ ID NO:122的轻链的位置86处天冬氨酸被取代成谷氨酸)。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含I90V(在SEQ ID NO:122的轻链的位置90处异亮氨酸被取代成缬氨酸)。

在一些情况下，人源化AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)阐述的重链CDR序列，或在如以SEQ ID No:115(CDR1)；116(CDR2)；和118(CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)阐述的重链CDR序列，或在如以SEQ ID No:115(CDR1)；116或117(CDR2)；和118、119、120或121(CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。

在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:115阐述的重链CDR1序列，或在如以SEQ ID NO:115阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR1序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ IDNO:116阐述的重链CDR2序列，或在如以SEQ ID NO:116阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQID NO:117阐述的重链CDR2序列，或在如以SEQ ID NO:117阐述的序列中包含一个或多个取代的重链CDR2序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以选自SEQ ID No:118、119、120和121的序列阐述的重链CDR3序列，或在选自SEQ ID No:118、119、120和121的序列中包含一个或多个取代的重链CDR3序列。

在一些情况下，人源化AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ ID No:124(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)阐述的轻链CDR序列，或在如以SEQ ID No:124、125、126或127(CDR1)；128(CDR2)；和129(CDR3)阐述的序列中包含一个或多个取代的CDR序列。

在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:125、126、127或128阐述的轻链CDR1序列，或在如以SEQ ID No:125、126、127或128阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR1序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:129阐述的轻链CDR2序列，或在如以SEQ ID NO:129阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR2序列。在一些情况下，人源化突变AGX-A01抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID No:130阐述的轻链CDR3序列，或在如以SEQ ID No:130阐述的序列中包含一个或多个取代的轻链CDR1序列。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:3阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:9阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:15阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:21阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:27阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:33阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:39阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:45阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:51阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:57阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:63阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:69阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:75阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:81阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:97阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:99阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:101阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:103阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:90阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:105阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:92阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:97阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:92阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:99阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:92阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ IDNO:101阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQID NO:92阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:103阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含如以SEQ ID NO:92阐述的由某一核酸序列编码的重链可变结构域，以及如以SEQ ID NO:105阐述的由某一核酸序列编码的轻链可变结构域。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有与选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQID NO:112或SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一、或100％同一的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ IDNO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ IDNO:81、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:101、SEQ ID NO:103、SEQ ID NO:105或SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一、或100％同一的轻链可变结构域序列。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有与选自SEQID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:63、SEQID NO:75、SEQ ID NO:90、SEQ ID NO:92、SEQ ID NO:112或SEQ ID NO:114的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一、或100％同一的重链可变结构域序列；并且具有与选自SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ IDNO:45、SEQ ID NO:57、SEQ ID NO:69、SEQ ID NO:81、SEQ ID NO:97、SEQ ID NO:99、SEQ IDNO:101或SEQ ID NO:122的氨基酸序列至少95％同一、至少96％同一、至少97％同一、至少98％同一、至少99％同一、或100％同一的轻链可变结构域序列。

在一个实施方案中，本公开包括一种抗TM4SF1抗体，所述抗TM4SF1抗体是IgG，并且包含四个多肽链，所述四个多肽链包括两个各自包含重链可变结构域和重链恒定区CH1、CH2和CH3的重链，以及两个各自包含轻链可变结构域和轻链恒定区(CL)的轻链。在某些实施方案中，抗体是人IgG1、IgG2或IgG4。在某些实施方案中，抗体是人IgG1。在其他实施方案中，抗体是IgG2。重链可变结构域序列和轻链可变结构域序列可含有如表2中阐述的CDR。

互补决定区(CDR)被称为轻链可变结构域与重链可变结构域两者中的高变区。可变结构域的更高度保守部分被称为框架(FR)。给定抗体的CDR和框架区(FR)可使用由Kabat等人(上文)；Lefranc等人(上文)和/或Honegger和Pluckthun(上文)描述的系统鉴定。还为本领域中的人士所熟悉的是Kabat等(1991,NIH出版物91-3242,National TechnicalInformation Service,Springfield,Va.)中所述的编号系统。就此而言，Kabat等人定义了一种用于可变结构域序列，包括用于鉴定CDR的编号系统，所述编号系统可适用于任何抗体。

一个或多个CDR可共价地或非共价地并入分子中以使得它成为抗原结合蛋白。

抗原结合蛋白可并有一个或多个CDR作为较大多肽链的一部分，可使一个或多个CDR共价连接于另一多肽链，或可非共价地并有一个或多个CDR。CDR容许抗原结合蛋白特异性结合特定目标抗原。特定来说，已知CDR3会在抗体或抗体片段的抗原结合中起重要作用。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:68或SEQ ID NO:80中的任一者阐述的CDR3结构域，并且含有包含与如以SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的可变结构域的重链。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:74或SEQ ID NO:86中的任一者阐述的CDR3结构域，并且具有包含与如以SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的轻链。因此，在某些实施方案中，CDR3结构域保持恒定，而可将可变性引入重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中，同时抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特征，例如结合亲和力，或相较于亲本，具有改进的功能特征，例如结合亲和力。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:31、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:55、SEQ ID NO:67或SEQ ID NO:79中的任一者阐述的CDR2结构域，并且含有包含与如以SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQID NO:51、SEQ ID NO:63或SEQ ID NO:75中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的可变结构域的重链。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:73或SEQ ID NO:85中的任一者阐述的CDR2结构域，并且具有包含与如以SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的轻链。因此，在某些实施方案中，CDR2结构域保持恒定，而可将可变性引入重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中，同时抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特征，例如结合亲和力，或相较于亲本，具有改进的功能特征，例如结合亲和力。

在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:42、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:66或SEQ ID NO:78中的任一者阐述的CDR1结构域，并且含有包含与如以SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:39、SEQID NO:45、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的可变结构域的重链。在一个实施方案中，本公开提供了一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有如以SEQ ID NO:12,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:36,SEQ ID NO:48,SEQ ID NO:60,SEQ ID NO:72或SEQ ID NO:84中的任一者阐述的CDR1结构域，并且具有包含与如以SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:45、SEQID NO:57、SEQ ID NO:69或SEQ ID NO:81中的任一者阐述的序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％或100％同一性的氨基酸序列的轻链可变结构域的轻链。因此，在某些实施方案中，CDR1结构域保持恒定，而可将可变性引入重链和/或轻链的其余CDR和/或框架区中，同时抗体或其抗原结合片段保留结合TM4SF1的能力，并且保留亲本的功能特征，例如结合亲和力。

也可使表2中所述的抗TM4SF1抗体和片段人源化。用于使非人抗体人源化的各种方法在本领域中是已知的。举例来说，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源向它之中引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常被称为“输入”残基，所述残基通常取自“输入”可变结构域。可例如遵循Jones等,1986,Nature 321:522-25；Riechmann等,1988,Nature 332:323-27；以及Verhoeyen等,1988,Science 239:1534-36的方法，通过用高变区序列取代人抗体的相应序列来进行人源化。

在一些情况下，通过CDR移植来构建人源化抗体，其中将亲本非人抗体(例如啮齿动物)的六个CDR的氨基酸序列移植于人抗体框架上。举例来说，Padlan等人确定CDR中仅约三分之一的残基实际上接触抗原，并且将这些残基称为“特异性决定残基”或SDR(Padlan等,1995,FASEB J.9:133-39)。在SDR移植技术中，仅将SDR残基移植于人抗体框架上(参见例如Kashmiri等,2005,Methods 36:25-34)。

对将用于制备人源化抗体的人轻链可变结构域与重链可变结构域两者的选择对于降低抗原性可为重要的。举例来说，根据所谓“最适匹配”方法，相对于已知人可变结构域序列的整个文库来筛选非人(例如啮齿动物)抗体的可变结构域的序列。可将与啮齿动物的序列最接近的人序列选作人源化抗体的人框架(Sims等,1993,J.Immunol.151:2296-308；以及Chothia等,1987,J.Mol.Biol.196:901-17)。另一方法使用源于具有特定子组的轻链或重链的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同框架可用于若干不同人源化抗体(Carter等,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA89:4285-89；以及Presta等,1993,J.Immunol.151:2623-32)。在一些情况下，框架源于最充足的人子类VL6子组I(VL6I)和VH子组III(VHIII)的共有序列。在另一方法中，人种系基因用作框架区的来源。

还通常合乎需要的是使抗体在保留它们对抗原的亲和力和其他有利生物性质的情况下人源化。为实现这个目标，根据一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型对亲本序列和各种概念性人源化产物进行分析的过程来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型通常是可用的，并且为本领域技术人员所熟悉。说明和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序是可用的。这些程序包括例如WAM(Whitelegg和Rees,2000,Protein Eng.13:819-24)、Modeller(Sali和Blundell,1993,J.Mol.Biol.234:779-815)和Swiss PDB Viewer(Guex和Peitsch,1997,Electrophoresis 18:2714-23)。对这些显示物的检查容许分析残基在候选免疫球蛋白序列的功能发挥中的可能作用，例如分析影响候选免疫球蛋白结合它的抗原的能力的残基。以这个方式，可选择和组合来自接受序列和输入序列的FR残基以便实现所需抗体特征诸如对一种或多种靶标抗原的亲和力增加。一般来说，高变区残基直接以及最实质上涉及影响抗原结合。

可用于人源化的人框架区包括但不限于：使用“最适匹配”方法选择的框架区(参见例如Sims等,J.Immunol.151(1993)2296)；源于具有特定子组的轻链可变区或重链可变区的人抗体的共有序列的框架区(参见例如Carter等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89(1992)4285；以及Presta等,J.Immunol.,151(1993)2623)；人成熟(体细胞突变)框架区或人种系框架区(参见例如Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633)；以及由筛选FR文库获得的框架区(参见例如Baca等,J.Biol.Chem.272(1997)10678-10684以及Rosok等,J.Biol.Chem.271(1996)22611-22618)。

人源化抗体和制备它们的方法例如综述于Almagro和Fransson,Front.Biosci.13(2008)1619-1633中，并且还例如描述于Riechmann等,Nature 332(1988)323-329；Queen等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA86(1989)10029-10033；美国专利号5,821,337、7,527,791、6,982,321和7,087,409；Kashmiri等,Methods 36(2005)25-34(描述SDR(a-CDR)移植)；Padlan,Mol.Immunol.28(1991)489-498(描述“表面重塑”)；Dall’Acqua等,Methods 36(2005)43-60(描述“FR改组”)；以及Osbourn等,Methods 36(2005)61-68和Klimka等,Br.J.Cancer,83(2000)252-260(描述用以进行FR改组的“导向选择”方法)中。

在一些实施方案中，TM4SF1结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是裸露的，未缀合的，和/或未修饰的。在一些实施方案中，结合蛋白还包括药剂。在一些实施方案中，药剂是治疗剂或诊断剂。在一些实施方案中，治疗剂是生物活性部分。在一些实施方案中，生物活性部分包括细胞毒性剂、化学治疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和抗激素剂。在一些实施方案中，细胞毒性剂包括核糖体失活蛋白、组蛋白脱乙酰基酶(HDAC)抑制剂、微管蛋白抑制剂、烷基化剂、抗生素、抗赘生剂、抗增生剂、抗代谢剂、拓扑异构酶I或II抑制剂、激素激动剂或拮抗剂、免疫调节剂、DNA小沟结合剂和放射性药剂。在某些实施方案中，核糖体失活蛋白是皂素(saporin)。在一些实施方案中，诊断剂是标记。在一些实施方案中，标记是荧光标记、发色标记或放射性标记。在一些实施方案中，药剂直接缀合于TM4SF1结合蛋白。在其他实施方案中，药剂任选地通过接头间接缀合于TM4SF1结合蛋白。

在一些实施方案中，本公开的TM4SF1结合蛋白是一种缀合物(即缀合结合蛋白)，所述缀合物还包括一种或多种药剂(例如1、2、3或4种或更多种药剂)诸如治疗剂，所述药剂在治疗与病理性血管生成相关的病症诸如癌症中以累加方式或以与TM4SF1结合蛋白协同方式起例如杀灭或抑制肿瘤细胞(TC)和/或肿瘤血管结构内皮细胞(EC)的作用。治疗剂例如可为生物活性部分，诸如细胞毒性剂、化学治疗剂、蛋白质、肽、抗体、生长抑制剂和/或抗激素剂。

可直接或间接缀合于本公开的TM4SF1结合蛋白的微管蛋白抑制剂的实例包括不限于聚合抑制剂(例如长春花碱(vinblastine)、长春新碱(vincristine)、长春瑞滨(vinorelbine)、长春氟宁(vinflunine)、念珠藻素52(cryptophycin 52)、大田软海绵素(hallchondrin)、多拉司他汀(dolastatin)、可结合微管蛋白的长春结构域的哈米特林(hemiasterlin)；秋水仙碱(colchine)、考布他汀(combretastatin)、2-甲氧基-雌二醇、可结合微管蛋白的秋水仙碱结构域的E7010；解聚抑制剂，诸如太平洋紫杉醇(paclitaxel)、多西他赛(docetaxel)、埃博霉素(epothilon)、可结合紫杉烷(taxane)位点的盘皮海绵内酯(discodermolide))。

示例性化学治疗剂包括但不限于甲氨蝶呤(methotrexate)、阿德力霉素(adriamicin)、长春花生物碱(长春新碱、长春花碱、依托泊苷(etoposide))、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其他嵌入剂；酶及其片段诸如核苷酸分解酶、抗生素、以及毒素诸如细菌、真菌、植物或动物来源的小分子毒素或酶活性毒素，包括它们的片段和/或变体。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉(diphtheria)A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素(exotoxin)A链(来自绿脓假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa))、篦麻毒素(ricin)A链、相思子毒素(abrin)A链、蒴莲根毒素(modeccin)A链、α-帚曲菌素(alpha-sarcin)、油桐(Aleurites fordii)蛋白、石竹素(dianthin)蛋白、美商陆(Phytolaca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(momordica charantia)抑制剂、泻果素(curcin)、巴豆毒素(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒素(gelonin)、有丝分裂素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、伊诺霉素(enomycin)和新月毒素(tricothecene)。

此外，多种放射性核素可用于缀合于本公开的TM4SF1结合蛋白。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²，以及Lu的放射性同位素。或者，本公开的TM4SF1结合蛋白可缀合于一种或多种较小分子毒素，诸如卡奇霉素(calicheamicin)、类美登素(maytansinoid)、多拉司他汀(dolastatin)、澳瑞他汀(aurostatin)、新月毒素和CC1065，并且本文还涵盖这些毒素的具有毒素活性的衍生物。在各种实例中，可缀合于本公开的TM4SF1结合蛋白的其他治疗剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱和5-氟尿嘧啶等。

在一些实施方案中，用于缀合的诊断剂是标记，诸如荧光标记、发色标记或放射性标记。因此，标记可出于检测目的加以使用，并且可为荧光化合物、酶、辅基、发光物质、生物发光物质或放射性物质。放射性标记例如可包括用于闪烁照相研究的放射性原子，例如Tc^99m或I¹²³，或用于核磁共振(NMR)成像(也被称为磁共振成像MRI)的自旋标记，诸如再次包括的碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

一种或多种药剂(例如治疗剂和/或诊断剂)可直接缀合于本公开的TM4SF1结合蛋白(例如通过直接共价或非共价相互作用的方式)，以使药剂无间隔地缀合于蛋白。药剂可例如通过直接肽键来直接缀合于本公开的结合蛋白。在其他情况下，直接缀合通过直接非共价相互作用，诸如本公开的TM4SF1结合蛋白与特异性结合TM4SF1结合蛋白的药剂(例如抗体药剂)之间的相互作用的方式来进行。

一种或多种药剂(例如治疗剂和/或诊断剂)可间接缀合于本公开的TM4SF1结合蛋白(例如通过伴有直接共价或非共价相互作用的接头的方式)。接头可为可从许多商业来源获得的化学连接剂，诸如同双官能性和异双官能性交联剂。可用于交联的区域可见于本公开的结合蛋白(例如抗TM4SF1抗体)上。接头可包含柔性臂，例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个碳原子。示例性接头包括BS3([双(磺基丁二酰亚胺基)辛二酸酯；BS3是一种靶向可及的伯胺的同双官能性N-羟基丁二酰亚胺酯)、NHS/EDC(N-羟基丁二酰亚胺和N-乙基-(二甲基氨基丙基)碳二亚胺；NHS/EDC允许达成伯胺基团与羧基的缀合)、磺基-EMCS([N-e-顺丁烯二酰亚胺基己酸]酰肼；磺基-EMCS是对硫氢基和氨基具有反应性的异双官能性反应性基团(顺丁烯二酰亚胺和NHS酯))、酰肼(大多数蛋白质含有暴露的碳水化合物，并且酰肼是一种可用于使羧基连接于伯胺的试剂)、以及SATA(N-丁二酰亚胺基-S-乙酰基硫代乙酸酯；SATA对胺具有反应性，并且添加经保护的硫氢基)。为形成共价键，可使用具有广泛多种活性羧基(例如酯)的化学反应性基团，其中羟基部分在为对肽进行修饰所需的水平上是生理上可接受的。特定试剂包括N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、N-羟基-磺基丁二酰亚胺(磺基-NHS)、顺丁烯二酰亚胺-苯甲酰基-丁二酰亚胺(MBS)、γ-顺丁烯二酰亚胺基-丁酰氧基丁二酰亚胺酯(GMBS)、顺丁烯二酰亚胺基丙酸(MPA)、顺丁烯二酰亚胺基己酸(MHA)和顺丁烯二酰亚胺基十一烷酸(MUA)。伯胺是NHS酯的主要靶标。存在于蛋白质的N末端上的可及的a-氨基和赖氨酸的ε-胺与NHS酯反应。当NHS酯缀合反应物与伯胺反应时形成酰胺键，从而释放N-羟基丁二酰亚胺。这些含有丁二酰亚胺的反应性基团在本文中被称为丁二酰亚胺基。在本公开的某些实施方案中，蛋白质上的官能团将是硫醇基团，并且化学反应性基团将是含有顺丁烯二酰亚胺基的基团诸如γ-顺丁烯二酰亚胺-丁酰胺(GMBA或MPA)。所述含有顺丁烯二酰亚胺的基团在本文中被称为顺丁烯二酰亚胺基。当反应混合物的pH是6.5-7.4时，顺丁烯二酰亚胺基对肽上的硫氢基最具选择性。在pH 7.0时，相比于与胺的反应速率，顺丁烯二酰亚胺基与硫氢基(例如蛋白质诸如血清白蛋白或IgG上的硫醇基团)的反应速率是1000倍更快的。因此，可形成顺丁烯二酰亚胺基与硫氢基之间的稳定硫醚键联。

在其他实施方案中，接头包括至少一个氨基酸(例如具有至少2、3、4、5、6、7、10、15、20、25、40或50个氨基酸的肽)。在某些实施方案中，接头是单一氨基酸(例如任何天然存在的氨基酸诸如Cys)。在其他实施方案中，可使用肽，诸如富含甘氨酸的肽。在一些情况下，接头可为单一氨基酸(例如任何氨基酸，诸如Gly或Cys)。适合接头的实例是丁二酸、Lys、Glu和Asp，或二肽诸如Gly-Lys。当接头是丁二酸时，所述丁二酸的一个羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，并且所述丁二酸的另一羧基可例如与肽或取代基的氨基形成酰胺键。当接头是Lys、Glu或Asp时，所述Lys、Glu或Asp的羧基可与氨基酸残基的氨基形成酰胺键，并且所述Lys、Glu或Asp的氨基可例如与取代基的羧基形成酰胺键。当Lys用作接头时，另一接头可插入在Lys的ε-氨基与取代基之间。在一个特定实施方案中，另一接头是丁二酸，所述丁二酸例如与Lys的ε-氨基以及与存在于取代基中的氨基形成酰胺键。在一个实施方案中，另一接头是Glu或Asp(例如所述Glu或Asp与Lys的ε-氨基形成酰胺键，并且与存在于取代基中的羧基形成另一酰胺键)，也就是说取代基是NE酰化赖氨酸残基。

在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-6M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。

在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位，如在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中所测定。

在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1。

在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-3M至约1x 10^-4M、约1x 10^-4M至约1x 10^-5M、约1x 10^-5M至约1x 10^-6M、约1x 10^-6至约1x 10^-7M、约1x10^-7至约1x 10^-8M、约1x 10^-8M至约1x 10^-9M、约1x 10^-9M至约1x 10^-10M、约1x10^-10M至约1x10^-11M、约1x 10^-11M至约1x 10^-12M、约2x 10^-3M至约2x 10^-4M、约2x 10^-4M至约2x 10^-5M、约2x10^-5M至约2x 10^-6M、约2x 10^-6至约2x 10^-7M、约2x 10^-7至约2x 10^-8M、约2x 10^-8M至约2x 10^-9M、约2x 10^-9M至约2x 10^-10M、约2x 10^-10M至约2x 10^-11M、约2x 10^-11M至约2x 10^-12M、约3x10^-3M至约3x 10^-4M、约3x 10^-4M至约3x 10^-5M、约3x 10^-5M至约3x 10^-6M、约3x 10^-6至约3x10^-7M、约3x 10^-7至约3x 10^-8M、约3x 10^-8M至约3x 10^-9M、约3x 10^-9M至约3x 10^-10M、约3x10^-10M至约3x 10^-11M、约3x 10^-11M至约3x 10^-12M、约4x 10^-3M至约4x 10^-4M、约4x 10^-4M至约4x 10^-5M、约4x 10^-5M至约4x 10^-6M、约4x 10^-6至约4x 10^-7M、约4x 10^-7至约4x 10^-8M、约4x10^-8M至约4x 10^-9M、约4x 10^-9M至约4x 10^-10M、约4x 10^-10M至约4x 10^-11M、约4x 10^-11M至约4x 10^-12M、约5x 10^-3M至约5x 10^-4M、约5x 10^-4M至约5x 10^-5M、约5x 10^-5M至约5x 10^-6M、约5x 10^-6至约5x 10^-7M、约5x 10^-7至约5x 10^-8M、约5x 10^-8M至约5x 10^-9M、约5x 10^-9M至约5x10^-10M、约5x 10^-10M至约5x 10^-11M、约5x 10^-11M至约5x 10^-12M、约5x 10^-7M至约5x 10^-11M、约5x10^-7M、约1x 10^-7M、约5x 10^-8M、约1x 10^-8M、约5x 10^-9M、约1x 10^-9M、约5x 10^-10M、约1x10^-10M、约5x 10^-11M或约1x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，K_D在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中加以测定。

在某些实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。

在某些实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-6M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一个实施方案中，HEK293细胞被转染来表达食蟹猴TM4SF1。在另一实施方案中，HEK293细胞在约600个mRNA拷贝/10⁶个18S rRNA拷贝下表达食蟹猴TM4SF1。

测定抗体或抗体片段的K_D的方法在本领域中是已知的。举例来说，表面等离子体共振可用于测定抗体关于抗原的K_D(例如在25℃下使用BIACORE 2000或BIACORE 3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,N.J.)，其中抗原或Fc受体在约10个响应单位(RU)下固定在CM5芯片上)。在某些实施方案中，FACS或流式细胞计量术用于测定K_D，借此，根据标准方法，表达TM4SF1的细胞诸如HEK293细胞或HUVEC细胞用于结合抗体或片段，并且测量K_D。使用流式细胞计量术测定抗体的亲和力例如描述于Geuijen等(2005)J Immunol Methods.302(1-2):68-77中。在某些实施方案中，FACS用于测定抗体的亲和力。

在一个实施方案中，本公开的特征在于一种抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段具有含有保守性氨基酸取代的本文所述的CDR氨基酸序列，以致所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含CDR的与表2中阐述的CDR氨基酸序列至少95％同一(或至少96％同一、或至少97％同一、或至少98％同一、或至少99％同一)的氨基酸序列。“保守性氨基酸取代”是其中某一氨基酸残基被具有化学性质(例如电荷或疏水性)类似的侧链(R基团)的另一氨基酸残基取代的取代。一般来说，保守性氨基酸取代将不实质上改变蛋白质的功能性质。在其中两个或更多个氨基酸序列因保守性取代而不同于彼此的情况下，序列同一性百分比或类似性程度可向上调整以修正取代的保守性性质。用于进行这个调整的手段为本领域技术人员所熟知。参见例如Pearson(1994)MethodsMol.Biol.24:307-331，所述文献以引用的方式并入本文。具有化学性质类似的侧链的氨基酸的群组的实例包括(1)脂族侧链：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；(2)脂族-羟基侧链：丝氨酸和苏氨酸；(3)含有酰胺的侧链：天冬酰胺和谷氨酰胺；(4)芳族侧链：苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；(5)碱性侧链：赖氨酸、精氨酸和组氨酸；(6)酸性侧链：天冬氨酸和谷氨酸，以及(7)含硫侧链是半胱氨酸和甲硫氨酸。

在一个方面，本公开的特征还在于一种如在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中所测定，以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有人IgG框架区的轻链可变区，并且包含含有人IgG框架区的重链可变区。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人源化的。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段与食蟹猴TM4SF1交叉反应。

在本公开的另一方面，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是如在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中所测定，以约5x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1的ECL2环上的表位的人源化抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段。在一个实施方案中，在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x10^-6M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1。在一个实施方案中，在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约1x 10^-8M或更小的K_D结合人TM4SF1。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以1x10^-3M至约1x 10^-4M、约1x10^-4M至约1x 10^-5M、约1x 10^-5M至约1x 10^-6M、约1x 10^-6至约1x 10^-7M、约1x 10^-7至约1x 10^-8M、约1x10^-8M至约1x 10^-9M、约1x 10^-9M至约1x 10^-10M、约1x 10^-10M至约1x 10^-11M、约1x 10^-11M至约1x 10^-12M、约2x 10^-3M至约2x 10^-4M、约2x 10^-4M至约2x 10^-5M、约2x 10^-5M至约2x10^-6M、约2x 10^-6至约2x 10^-7M、约2x 10^-7至约2x 10^-8M、约2x 10^-8M至约2x 10^-9M、约2x 10^- ⁹M至约2x 10^-10M、约2x 10^-10M至约2x 10^-11M、约2x 10^-11M至约2x 10^-12M、约3x 10^-3M至约3x10^-4M、约3x 10^-4M至约3x10^-5M、约3x 10^-5M至约3x 10^-6M、约3x 10^-6至约3x 10^-7M、约3x10^-7至约3x 10^-8M、约3x 10^-8M至约3x 10^-9M、约3x 10^-9M至约3x10^-10M、约3x 10^-10M至约3x 10^- ¹¹M、约3x 10^-11M至约3x 10^-12M、约4x 10^-3M至约4x 10^-4M、约4x 10^-4M至约4x 10^-5M、约4x 10^-5M至约4x 10^-6M、约4x 10^-6至约4x 10^-7M、约4x 10^-7至约4x 10^-8M、约4x 10^-8M至约4x 10^- ⁹M、约4x 10^-9M至约4x 10^-10M、约4x 10^-10M至约4x 10^-11M、约4x 10^-11M至约4x 10^-12M、约5x10^-3M至约5x 10^-4M、约5x 10^-4M至约5x 10^-5M、约5x 10^-5M至约5x 10^-6M、约5x 10^-6至约5x10^-7M、约5x 10^-7至约5x 10^-8M、约5x 10^-8M至约5x 10^-9M、约5x 10^-9M至约5x 10^-10M、约5x10^-10M至约5x 10^-11M、约5x 10^-11M至约5x 10^-12M、约5x 10^-7M至约5x 10^-11M、约5x 10^-7M、约1x 10^-7M、约5x 10^-8M、约1x 10^-8M、约5x 10^-9M、约1x 10^-9M、约5x 10^-10M、约1x 10^-10M、约5x10^-11M或约1x 10^-11M的K_D结合人TM4SF1。在一些实施方案中，K_D在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中加以测定。在一个实施方案中，在使用TM4SF1表达性HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段以约5x 10^-10M或更小的K_D结合人TM4SF1。

在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或抗原结合片段与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化，即抗体的结合不依赖于TM4SF1的在ECL2环内的糖基化(SEQ ID NO:77)。

本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段可为任何同种型(例如但不限于IgG、IgM和IgE)中的任一者。在某些实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段是IgG同种型。在一特定实施方案中，本公开的抗体或其抗原结合片段具有IgG1、IgG2或IgG4同种型。在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是人IgG1、人IgG2或人IgG4同种型。

在ADCC和/或CDC活性方面，IgG2是天然最低的(An等,MAbs.2009年11月-12月；1(6):572–579)。因此，在某些实施方案中，IgG2被有利地使用。然而，IgG2具有两个额外半胱氨酸(导致4个铰链间二硫键)，此使得它倾向于通过形成抗体间二硫键而聚集。在一相关实施方案中，对IgG2半胱氨酸进行突变以使聚集降低。

本公开提供了结合TM4SF1的抗体片段。在某些情况下，使用抗体片段而非完全抗体存在优势。片段的较小尺寸允许快速清除，并且可导致向细胞、组织或器官的到达得以改进。对于某些抗体片段的综述，参见Hudson等,2003,Nature Med.9:129-34。

已开发用于产生抗体片段的各种技术。在传统上，这些片段通过蛋白水解消化完整抗体获得(参见例如Morimoto等,1992,J.Biochem.Biophys.Methods 24:107-17；以及Brennan等,1985,Science 229:81-83)。然而，这些片段现时可直接由重组宿主细胞产生。Fab、Fv和scFv抗体片段全都可在大肠杆菌或酵母细胞中表达并从大肠杆菌或酵母细胞分泌，由此允许轻易产生大量这些片段。可从以上讨论的抗体噬菌体文库分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段，并且化学偶联以形成F(ab’)2片段(Carter等,1992,Bio/Technology 10:163-67)。根据另一方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)2片段。包含补救受体结合表位残基，具有增加的体内半衰期的Fab和F(ab’)2片段描述于例如美国专利号5,869,046中。用于产生抗体片段的其他技术将为熟练从业者显而易知。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)(参见例如WO 93/16185；美国专利号5,571,894和5,587,458)。Fv和scFv具有缺乏恒定区的完整结合位点；因此，它们可适于在体内使用期间达成非特异性结合降低。可构建scFv融合蛋白以产生效应蛋白在scFv的氨基或羧基末端的融合(参见例如Borrebaeck编(上文))。抗体片段还可为“线性抗体”，例如如以上引用的参考文献中所述。所述线性抗体可为单特异性的或多特异性的，诸如双特异性的。

在某些实施方案中，抗原结合片段选自Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv和scFv。

例如对人TM4SF1具有高亲和力的抗TM4SF1抗体(和片段)可使用本领域中已知的筛选技术鉴定。举例来说，单克隆抗体可使用首先由Kohler等,1975,Nature 256:495-97描述的杂交瘤方法制备，或可通过重组DNA方法制备(参见例如美国专利号4,816,567)。

在杂交瘤方法中，使用例如人TM4SF1的ECL2环或表达TM4SF1(借此，ECL2环在细胞表面上表达)的细胞使小鼠或其他适当宿主动物诸如仓鼠免疫，以引发产生或能够产生将特异性结合用于免疫的蛋白质的抗体的淋巴细胞。或者，可在体外使淋巴细胞免疫。在免疫之后，分离淋巴细胞，接着使用适合融合剂诸如聚乙二醇使淋巴细胞与骨髓瘤细胞系融合以形成杂交瘤细胞(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice 59-103(1986))。

将由此制备的杂交瘤细胞接种，并且使其在适合培养基中生长，在某些实施方案中，所述培养基含有一种或多种抑制未融合亲本骨髓瘤细胞(也被称为融合配偶体)的生长或存活的物质。举例来说，如果亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的选择性培养基通常将包括次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸苷(HAT培养基)，此会阻止HGPRT缺陷性细胞的生长。

示例性融合配偶体骨髓瘤细胞是高效融合，支持由所选抗体产生性细胞稳定高水平产生抗体，并且对针对未融合亲本细胞进行选择的选择性培养基敏感的那些。示例性骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤株系，诸如SP-2和衍生物，例如可从美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，Manassas,Va.)获得的X63-Ag8-653细胞，以及可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego,Calif.)获得的源于MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤的那些。还已描述用于产生人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系(Kozbor,1984,Immunol.133:3001-05；以及Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications 51-63(1987))。

测定杂交瘤细胞在其中生长的培养基中针对抗原的单克隆抗体的产生。通过免疫沉淀或通过体外结合测定诸如RIA或ELISA来测定由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性。单克隆抗体的结合亲和力可例如通过Munson等,1980,Anal.Biochem.107:220-39中所述的斯卡查德分析来测定。

一旦鉴定产生具有所需特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞，即可通过有限稀释程序来对克隆进行亚克隆，并且通过标准方法使其生长(Goding(上文))。适于这个目的的培养基包括例如DMEM或RPMI-1640培养基。此外，可例如通过将细胞在腹膜内注射至小鼠中来使杂交瘤细胞在体内以腹水肿瘤形式在动物中生长。

通过常规抗体纯化程序诸如像亲和色谱法(例如使用蛋白A或蛋白G-琼脂糖)或离子交换色谱法、羟磷灰石色谱法、凝胶电泳、透析等来使由亚克隆分泌的单克隆抗体适合地从培养基、腹水液或血清分离。

使用常规程序(例如通过使用能够特异性结合编码鼠抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)，易于分离和测序编码单克隆抗体的DNA。杂交瘤细胞可充当所述DNA的来源。一旦分离，即可将DNA放置至表达载体中，接着将所述表达载体转染至宿主细胞诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或不另外产生抗体蛋白质的骨髓瘤细胞中，以获得在重组宿主细胞中合成单克隆抗体。关于在细菌中重组表达编码抗体的DNA的综述文章包括Skerra等,1993,Curr.Opinion in Immunol.5:256-62以及Pluckthun,1992,Immunol.Revs.130:151-88。

在另一实施方案中，单克隆抗体或抗体片段可从使用例如Antibody PhageDisplay:Methods and Protocols(O’Brien和Aitken编,2002)中所述的技术产生的抗体噬菌体文库分离。在原则上，通过筛选含有展示融合于噬菌体外壳蛋白的抗体可变区(Fv)的各种片段的噬菌体的噬菌体文库来选择合成抗体克隆。针对所需抗原筛选所述噬菌体文库。使表达能够结合所需抗原的Fv片段的克隆吸附于抗原，因此与文库中的非结合克隆分离。接着将结合克隆从抗原洗脱，并且可通过额外抗原吸附/洗脱循环来进一步富集。

可使可变结构域功能性地在噬菌体上展示为单链Fv(scFv)片段，其中VH和VL通过短柔性肽共价连接，或展示为Fab片段，其中VH和VL各自融合于恒定结构域并且非共价地相互作用，如例如于Winter等,1994,Ann.Rev.Immunol.12:433-55中所述。

VH和VL基因的谱系可通过PCR来单独克隆，并且在噬菌体文库中随机重组，可接着搜索所述噬菌体文库中的抗原结合克隆，如Winter等(上文)中所述。来自经免疫来源的文库提供对免疫原具有高亲和力的抗体而无需构建杂交瘤。或者，可克隆天然谱系以提供单一来源的针对广泛范围的非自身抗原以及自身抗原的人抗体而不进行任何免疫，如由Griffiths等,1993,EMBO J 12:725-34所述。最后，天然文库还可通过以下方式合成制备：从干细胞克隆未重排V基因区段，以及使用含有随机序列的PCR引物来编码高变CDR3区域以及实现体外重排，如例如由Hoogenboom和Winter,1992,J.Mol.Biol.227:381-88所述。

对文库的筛选可通过本领域中已知的各种技术实现。举例来说，TM4SF1(例如ECL2环的可溶性形式或表达所述环的细胞)可用于包被吸附板的各孔，在固定于吸附板或用于细胞分选中的宿主细胞上表达，缀合于生物素以用链霉亲和素包被的珠粒捕集，或用于对展示文库进行淘选的任何其他方法中。对具有缓慢解离动力学(例如良好结合亲和力)的抗体的选择可通过使用长久洗涤和单价噬菌体展示(如Bass等,1990,Proteins 8:309-14以及WO 92/09690中所述)，以及通过使用低包被密度的抗原(如Marks等,1992,Biotechnol.10:779-83中所述)来促进。

抗TM4SF1抗体可通过以下方式获得：设计适于选择目标噬菌体克隆的抗原筛选程序，随后使用来自目标噬菌体克隆的VH和/或VL序列(例如Fv序列)或来自VH和VL序列的各种CDR序列以及Kabat等(上文)中所述的适合恒定区(例如Fc)序列来构建全长抗TM4SF1抗体克隆。

可使用本领域中已知以及本文所述的结合测定对抗TM4SF1抗体进行筛选以确定抗体是否对TM4SF1的ECL2环具有治疗性亲和力。抗体抑制或降低转移性细胞活性的能力可使用本领域中的标准测定以及本文所述的那些测定来测量。临床前测定需要使用通常属于以下三种类型中的一种的动物转移模型：(i)通常通过用以产生肺转移的尾部静脉注射，通过用以产生肝转移的门静脉或脾内注射，或通过用以产生骨转移和其他转移的左室心脏注射，将转移性小鼠肿瘤细胞诸如B16F10黑素瘤TC注射至小鼠中；(ii)将转移性肿瘤细胞或完整肿瘤片段同位移植至小鼠中，所述方法常常需要稍后手术切除原发性肿瘤以预防与原发性肿瘤生长相关的致病性；和(iii)经遗传工程改造小鼠自发性转移模型，其中最常见的是MMTV-Pyt(小鼠乳腺肿瘤病毒-多瘤病毒中T抗原)小鼠乳腺癌模型，所述模型提供人癌症转移的一种高度真实的小鼠模型；大于85％的半合性MMTV-PyMT雌性自发地显现可触知的乳腺肿瘤，所述肿瘤在8-16周龄时转移至肺。通过活体动物成像或直接计数处死动物的肺中的随TM4SF1免疫阻断程度而变化的转移性结节来定量肺中的转移性负荷以及实现例如肺转移降低至少50％的治疗水平将指示例如某一治疗性抗体可用于本公开方法中。此外，跨物种反应性测定在本领域中是已知的。可使用的测定的实例例如描述于Khanna和Hunter(Carcinogenesis.2005年3月；26(3):513-23)以及Saxena和Christofori(Mol Oncol.2013年4月；7(2):283-96)中，所述文献以引用的方式整体并入本文。

在本公开的一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段含有一个或多个使抗体或片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变。

如本文所用的术语“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)”是指由细胞毒性效应细胞通过非吞噬过程杀灭抗体包被的靶标细胞，所述非吞噬过程的特征在于释放细胞毒性颗粒的内含物或表达细胞死亡诱导性分子。ADCC通过靶标结合的抗体(属于IgG或IgA或IgE类别)与某些Fc受体(FcR)的相互作用触发，所述Fc受体是存在于效应细胞表面上的结合免疫球蛋白(Ig)的Fc区的糖蛋白。介导ADCC的效应细胞包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、巨噬细胞、嗜中性白细胞、嗜酸性粒细胞和树突细胞。ADCC是一种快速效应机制，其功效依赖于许多参数(靶标细胞的表面上的抗原的密度和稳定性；抗体亲和力和FcR结合亲和力)。基于PBMC的ADCC测定和基于天然杀伤细胞的ADCC测定可用于检测ADCC。这些测定中的读出数据是终点驱动的(靶标细胞溶解)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指在补体存在下使靶标细胞溶解。经典补体路径的活化由补体系统的第一组分(C1q)结合抗体(具有适当子类)引发，所述抗体结合于它们的同源抗原。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,1996,J.Immunol.Methods 202:163)。已描述具有改变的Fc区氨基酸序列(多肽具有变异Fc区)以及增加或降低的C1q结合能力的多肽变体(参见例如美国专利号6,194,551；WO 1999/51642；Idusogie等,2000,J.Immunol.164:4178-84)。具有少许或不具有CDC活性的抗体(或片段)可被选择来进行使用。

如本文所用的术语“效应功能”是指由IgG的一个或多个Fc效应结构域(例如免疫球蛋白的Fc区)所促成的功能。所述功能可通过例如一个或多个Fc效应结构域与具有吞噬或溶解活性的免疫细胞上的Fc受体结合，或通过一个或多个Fc效应结构域与补体系统的组分结合来实现。抗体效应功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬(ADCP)；下调细胞表面受体(例如B细胞受体)；以及B细胞活化。

如本文所用的术语“降低”或“消除”是指能够导致优选是20％或更大，更优选是50％或更大，并且最优选是75％、85％、90％、95％或更大的总体减低。降低或消除可涉及所治疗的病症(例如癌症)的症状，转移的存在性或尺寸，或原发性肿瘤的尺寸。

如本文所用的术语“降低的ADCC/CDC功能”是指相较于对照(例如具有不包括一个或多个突变的Fc区的抗体)，特定效应功能例如ADCC和/或CDC降低至少约5％、至少约10％、至少约15％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％或更大。

因此，在某些实施方案中，相较于与本公开的抗体具有相同氨基酸序列，但不包含对Fc区进行的至少一个氨基酸残基的添加、取代或缺失的抗体(在本文中也称为“未修饰抗体”)，本公开的突变抗体具有降低的或消除的对负责促进效应功能的Fc配体的亲和力。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少两个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段包含含有至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个、至少九个、至少十个或更多个使抗体或其抗原结合片段的ADCC和/或CDC效应功能降低或消除的突变的Fc区。

在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：E233P、L234V、L234A、L235A、G236Δ(缺失)、G237A、V263L、N297A、N297D、N297G、N297Q、K322A、A327G、P329A、P329G、P329R、A330S、P331A和P331S。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A/L235A突变，具有或不具有G237A突变的Fc区。在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A、L235A和G237A突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有A327G/A330S/P331S突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有E233P/L234V/L235A/ΔG236(缺失)突变的Fc区，所述突变提供降低的与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA的结合，以及降低的ADCC和CDC效应功能，如例如于以引用的方式整体并入本文的An Z等Mabs 2009年11月-12月；1(6):572-9中所述。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有处于K322A、P329A和P331A中的一者或多者中的突变的Fc区，所述突变提供降低的与C1q的结合，如例如于以引用的方式整体并入本文的Canfield和Morrison.J Exp Med(1991)173(6):1483–91.10.1084中所述。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有V263L突变的Fc区，所述突变提供增强的与FcγRIIB的结合以及增强的ADCC，如例如以引用的方式整体并入本文的Hezareh等J Virol.2001年12月；75(24):12161-8中所述。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234A/L235A、G237A或L235E突变的Fc区。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG1同种型，并且包含含有L234F、L235E或P331S突变的Fc区。

在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：V234A、G237A、P238S、H268A或H268Q、V309L、A330S和P331S。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有A330S/P331S突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG2同种型，并且包含含有A330S/P331S、V234A/G237A/P238S/H268A/V309L/A330S/P331S、或H268Q/V309L/A330S/P331S突变的Fc区。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有一个或多个选自下组的突变的Fc区：S228P、E233P、F234A、F234V、L235E、L235A、G236Δ(缺失)、N297A、N297D、N297G、N297Q、P329G、P329R。

在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P突变的Fc区，所述突变提供降低的Fab臂交换以及降低的聚集，如例如于以引用的方式整体并入本文的Chappel等Proc Natl Acad Sci U S A(1991)88(20):9036–40中所述。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/L235E突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/E233P/F234V/L235A/ΔG236(缺失)突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有N297x突变的Fc区，其中x＝A、D、G、Q。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/F234A/L235A突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E突变的Fc区，所述突变提供降低的与FcγRI、FcγRIIA、FcγRIIIA的结合以及降低的ADCC和CDC效应活性，如例如以引用的方式整体并入本文的Saxena等FrontImmunol.2016年12月12；7:580中所述。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有S228P/F234A/L235A或E233P/L235A/G236Δ突变的Fc区。

在一个实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有至少S228P突变的Fc区。Angal等人(Mol Immunol.1993年1月；30(1):105-8)描述对人IgG4重链的铰链序列的分析以将在残基241(根据EU编号系统，并且现时对应于在Kabat编号的情况下的残基228)处存在丝氨酸确定为在一定比例的分泌型人IgG4中的铰链区中存在重链间二硫桥异质性的原因。Silva等人(J Biol Chem.2015年2月27日；290(9):5462-9)描述人IgG4中的阻止体内和体外IgG4Fab臂交换的S228P突变。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4同种型，并且包含含有L235E或S228P突变的Fc区。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有N297A、N297D或N297G突变的Fc区。

在其他实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段是IgG4或IgG1同种型，并且包含含有P329G、P329R突变的Fc区。

在一个示例性实施方案中，任何IgG同种型的突变Fc区包含一个或多个在位置234、235、236、237、297、318、320、322处的突变(如以引用的方式整体并入本文的WO1988007089中所述)。Fc区中的包括取代、缺失和添加的其他可能突变还描述于例如以引用的方式整体并入本文的US20140170140、WO2009100309、US20090136494和US8969526中。

可进行体外和/或体内细胞毒性测定以确认CDC和/或ADCC活性的降低或消除。举例来说，可进行Fc受体(FcR)结合测定以确保抗体缺乏FcγR结合性(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn结合能力。用于介导ADCC的主要细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。用以评估目标分子的ADCC活性的体外测定的非限制性实例描述于美国专利号5,500,362(参见例如Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83(1986)7059-7063)和Hellstrom,I.等,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82(1985)1499-1502；美国专利号5,821,337(参见Bruggemann,M.等,J.Exp.Med.166(1987)1351-1361)中。或者，可采用非放射性测定方法，参见例如用于流式细胞计量术的ACTI.TM.非放射性细胞毒性测定(CellTechnology,Inc.Mountain View,Calif.)；以及CytoTox 96.RTM.非放射性细胞毒性测定(Promega,Madison,Wis.)。适用于所述测定的效应细胞包括外周血液单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可在体内，例如在诸如Clynes等,Proc.Nat’lAcad.Sci.USA 95(1998)652-656中公开的动物模型中评估目标分子的ADCC活性。还可进行C1q结合测定以确认抗体不能结合C1q，因此缺乏CDC活性。参见例如WO 2006/029879和WO2005/100402中的C1q和C3c结合ELISA。为评估补体活化，可进行CDC测定(参见例如Gazzano-Santoro等,J.Immunol.Methods 202(1996)163；Cragg,M.S.等,Blood 101(2003)1045-1052；以及Cragg,M.S.和Glennie,M.J.,Blood 103(2004)2738-2743)。还可使用本领域中已知的方法进行FcRn结合和体内清除率/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.等,Int’l.Immunol.18(12)(2006)1759-1769)。

在一个实施方案中，相较于未修饰抗体，本公开的抗体或其抗原结合片段展现降低的或消除的ADCC效应功能。在另一实施方案中，相比于未修饰抗体的ADCC效应功能，本公开的抗体或其抗原结合片段展现至少减小至1/2或至少减小至1/3或至少减小至1/5或至少减小至1/10或至少减小至1/50或至少减小至1/100的降低的ADCC效应功能。在另一实施方案中，相对于未修饰抗体，本公开的抗体展现降低至少10％或至少20％或至少30％或至少40％或至少50％或至少60％或至少70％或至少80％或至少90％或至少100％的ADCC效应功能。在本公开的另一方面，由本公开的抗体或其抗原结合片段诱导的ADCC效应功能降低或下调是降低至对于由未修饰抗体达成的ADCC诱导所观察到的数值的0％、2.5％、5％、10％、20％、50％或75％。在某些实施方案中，ADCC活性的降低和/或消除可归因于本公开的抗体或其抗原结合片段对Fc配体和/或受体的亲和力降低。

III.多核苷酸

在一些实施方案中，还提供了编码如本文所述的TM4SF1结合蛋白诸如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的多核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸分子以DNA构建体形式提供。在其他实施方案中，多核苷酸分子以信使RNA转录物形式提供。

在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如以SEQ ID NO:4、16、28、40、52、64或76中的任一者阐述的核酸序列编码的重链可变结构域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如以SEQ ID NO:10、22、34、46、58、70或82中的任一者阐述的核酸序列编码的轻链可变结构域。

在一些实施方案中，提供了针对在宿主细胞例如细菌(诸如大肠杆菌)或真核细胞(诸如CHO细胞)中表达加以密码子优化的核酸序列。在一些实例中，核酸序列针对在CHO细胞中表达加以密码子优化。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如以SEQ ID NO:5、17、29、41、53、65或77中的任一者阐述的密码子优化的核酸序列编码的重链可变结构域。在一些实例中，本公开的抗TM4SF1抗体包含由如以SEQ ID NO:11、23、35、47、59、71或83中的任一者阐述的密码子优化的核酸序列编码的轻链可变结构域。在某些情况下，SEQ IDNO:5、17、29、41、53、65或77中的任一者的核酸序列是针对在CHO细胞中表达加以密码子优化的核酸序列。在某些情况下，SEQ ID NO:11、23、35、47、59、71或83中的任一者的核酸序列是针对在CHO细胞中表达加以密码子优化的核酸序列。

多核苷酸分子通过已知方法构建，诸如通过将编码结合蛋白的基因合并成连接于适合启动子以及任选地连接于适合转录终止子的遗传构建体，以及在细菌或其他适当表达系统诸如像CHO细胞中表达所述遗传构建体。视所利用的载体系统和宿主而定，可使用许多适合转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子。选择启动子以使它驱动多核苷酸在相应宿主细胞中的表达。

在一些实施方案中，将如本文所述的多核苷酸插入优选是表达载体的载体中，此代表另一实施方案。这个重组载体可根据已知方法构建。受到特别关注的载体包括质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒等)和粘粒。

多种表达载体/宿主系统可用于含有和表达编码所描述TM4SF1结合蛋白的多肽的多核苷酸。表达载体的实例对于在大肠杆菌中表达来说是pSKK(Le Gall等,J ImmunolMethods.(2004)285(1):111-27)，或对于在哺乳动物细胞中表达来说是pcDNA5(Invitrogen)。

因此，在一些实施方案中，如本文所述的TM4SF1结合蛋白通过以下方式产生：将编码如上所述的蛋白的载体引入宿主细胞中，以及在各种条件下培养所述宿主细胞，借此，蛋白结构域得以表达，可被分离，以及任选地被进一步纯化。

IV.治疗方法

本公开还提供了一种用于抑制内皮细胞(EC)特异性的细胞-细胞相互作用的方法，所述相互作用例如但不限于EC-EC、EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用。在某些实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体和片段可用于治疗具有特征在于异常EC-细胞相互作用的病理学的任何人疾病或病症。在某些实施方案中，EC-细胞相互作用是EC-白细胞相互作用，其中抑制EC-白细胞相互作用用于预防炎症。

在其他实施方案中，本公开的特征在于一种治疗或预防受试者的疾病或病症的方法，其中所述疾病或病症的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，所述方法包括施用如本文所述的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方案中，EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一者或多者。在示例性实施方案中，疾病是炎症性疾病或病症，并且本公开的抗体和片段用于抑制EC-白细胞相互作用。在另一示例性实施方案中，疾病或病症选自炎症性疾病或癌症。白细胞粘附于血管内皮是炎症性过程的标志。因此，在一个实施方案中，本公开的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段用于治疗其中抑制白细胞附着于内皮细胞或抑制白细胞跨越内皮进行迁移有助于治疗的炎症性疾病(参见例如Rychly等,CurrPharm Des.2006；12(29):3799-806，所述文献以引用的方式整体并入本文)。实例包括但不限于败血症、炎症性肠病、牛皮癣或多发性硬化症。

每年，单在美国就有约50万患者死于癌症。肿瘤转移导致这些死亡中的约90％。没有阻断转移的疗法是已知的。本公开提供了可基于对由新颖靶标TM4SF1介导的肿瘤细胞(TC)-内皮细胞(EC)相互作用的免疫阻断来治疗癌症，并且抑制转移性细胞的抗体及其抗原结合片段。

如上所述，TM4SF1是一种小型四跨膜蛋白样细胞表面糖蛋白，最初作为在TC侵袭和转移中具有作用的TC抗原被发现。TM4SF1由TC和EC选择性表达。在小鼠与人两者中，TM4SF1均在低水平下在对正常组织进行供给的血管EC上表达。已显示TM4SF1在约10-20倍高的水平下在内衬于对许多人癌症进行供给的血管的血管EC上表达，并且在等同高水平下在培养的EC上表达。图1提供说明TM4SF1在用于达成外渗的TC和EC相互作用中的推定作用的示意图。富含TM4SF1的微区域(TMED)募集细胞表面蛋白如整合素(integrin)以协助形成纳米足(nanopodia)，即从细胞表面延伸，并且介导细胞-细胞相互作用的薄膜通道。因此，在某些情况下，本文所述的抗TM4SF1抗体和片段干扰纳米足介导的相互作用，并且抑制TC与EC的为TC外渗所必需的相互作用。

本文所述的TM4SF1结合蛋白或药物组合物中的任一者都可被配制以治疗患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症，诸如乳腺癌、卵巢癌、肾癌、结肠直肠癌、肝癌、胃癌和肺癌；肥胖症；黄斑变性；糖尿病性视网膜病变；牛皮癣；类风湿性关节炎；细胞免疫性；和红斑痤疮)的受试者(例如人)。

TM4SF1在大多数上皮TC的表面上高度表达，并且还在内衬于肿瘤血管的EC上以及在培养的EC上高度表达。它在正常血管EC的表面上在约1/10-1/20低的水平下表达。在小鼠模型中，肿瘤向肺的转移与EC和TC两者上的TM4SF1表达相关。转移需要TC初始附着于血管EC，以及它们随后跨越EC进行迁移以进入肺或其他转移部位。以下实施例显示，在一些情况下，本公开的抗TM4SF1抗体在培养情况下干扰TC-EC相互作用，并且还可在体内抑制肿瘤转移。

因此，本公开的抗体和片段可用于阻断转移中的最早步骤中的一者或两者(参见图1)，即，TC附着于血管EC和/或TC跨越EC进行迁移，并且由此预防处于风险下的癌症患者中的转移或实质上降低转移的数目。

本公开还提供了一种用于预防转移的方法。人肿瘤通常在生长的早期阶段使TC脱落进入血液和淋巴管中；因此，对原发性肿瘤的早期治疗不能提供转移尚未发生的保证。因此，免疫阻断TM4SF1可用于治疗或预防血行性转移或治疗或预防淋巴性转移。

在一些实施方案中，本公开的方法涉及抑制受试者中的转移性细胞。在一个实施方案中，受试者患有癌症，例如与转移相关的癌症或已转移的癌症。在其他实施方案中，受试者已针对癌症加以治疗，并且处于缓解或部分缓解中，其中施用本文所述的抗TM4SF1抗体或片段的益处是它们起预防转移以及维持缓解或部分缓解的作用。

在某些实施方案中，本公开提供了一种治疗具有显现转移的较大风险的人士的方法，其中施用本文所述的抗TM4SF1抗体和片段可用于抑制转移或延迟转移的发作。

本公开中包括一种通过向有需要的受试者施用抗TM4SF1抗体来阻断肿瘤转移特别是向肺的转移的方法。在一些实例中，抗TM4SF1抗体是人抗TM4SF1抗体，在本文中也称为抗hTM4SF1抗体。在某些实施方案中，方法包括向有需要的受试者施用有效量的抗hTM4SF1抗体，其中所述有效量的所述抗体阻止肿瘤细胞(TC)附着于血管内皮细胞(EC)以及跨越血管内皮细胞(EC)进行迁移。

在某些实施方案中，向患有癌症或处于具有转移的风险下的受试者施用抗TM4SF1抗体，以使剂量和频率维持长期TM4SF1免疫阻断。给药方案将通过以足以使在受试者的正常血管EC上表达的TM4SF1饱和的量向受试者施用抗TM4SF1抗体来最大程度抑制TM4SF1介导的转移。

在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的所施用的有效量是足以在一周时实现循环抗体浓度>1μg/ml的量。

在某些实施方案中，抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段的所施用的有效量是足以持续约1个月连续维持抗体的血清浓度处于或高于1μg/ml的量。

在一个实施方案中，本公开提供了一种治疗或预防人受试者中的转移的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段，其中所述抗体或其抗原结合片段的所述有效量包括1至80mg/kg的量的所述抗体或其抗原结合片段。

用于治疗性使用本公开的抗体的施用模式可为将抗体递送至宿主的任何适合途径，诸如胃肠外施用，例如真皮内、肌肉内、腹膜内、静脉内或皮下、经肺；经粘膜(口服、鼻内、阴道内、经直肠)；使用呈片剂、胶囊、溶液、粉剂、凝胶剂、粒子形式的制剂；以及含于注射器、植入装置、渗透泵、药筒、微型泵中；或为熟练技术人员所了解以及本领域中已知的其他手段。部位特异性施用可通过例如关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、大肠内、子宫颈管内、胃内、肝内、心脏内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、血管内、膀胱内、病变内、经阴道、经直肠、经颊、舌下、鼻内或经皮递送来实现。

在一些实施方案中，本公开的抗体可通过任何适合途径向受试者施用，例如通过静脉内(i.v.)输注或团式注射以胃肠外方式、以肌肉内方式或以皮下方式或以腹膜内方式。静脉内输注可历经例如15、30、60、90、120、180或240分钟，或1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12小时来给与。在一些实施方案中，对受试者给与的剂量是约0.005mg至约100mg/kg，例如约0.05mg至约30mg/kg或约5mg至约25mg/kg、或约4mg/kg、约8mg/kg、约16mg/kg或约24mg/kg、或例如约0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mg/kg。在某些实施方案中，对受试者给与的剂量是例如约15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、40、50、60、70、80、90或100mg/kg。在一些情况下，本公开的抗体的对受试者给与的剂量可为通过静脉内施用的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约0.1mg/kg至10mg/kg。在一些情况下，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过静脉内施用的约0.1mg/kg。在一些情况下，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约0.1mg/kg。在一些实施方案中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过静脉内施用的约0.3mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约0.3mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过静脉内施用的约1.0mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约1.0mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过静脉内施用的约3.0mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约3.0mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量可为通过静脉内施用的约10.0mg/kg。在一些实例中，本公开的抗体的对受试者给与的剂量是通过皮下施用的约10.0mg/kg。

在某些实施方案中，给与本公开的抗体的固定单位剂量，例如50、100、200、500或1000mg，或剂量可基于患者的表面积，例如500、400、300、250、200或100mg/m²。在一些情况下，施用1次与8次之间的剂量(例如1、2、3、4、5、6、7或8次)以治疗患者，但可给与9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20次或更多次剂量。

在一些实施方案中，在一天、两天、三天、四天、五天、六天、一周、两周、三周、一个月、五周、六周、七周、两个月、三个月、四个月、五个月、六个月或更久之后，重复施用本文所述的本公开的抗体。如同长期施用一样，重复治疗过程也是可能的。重复施用在相同剂量下或在不同剂量下进行。在一些实例中，本文所述的本公开的抗体通过静脉内输注在8mg/kg下或在16mg/kg下在每周间隔下施用8周，随后在8mg/kg下或在16mg/kg下每两周进行施用，再持续16周，继之以在8mg/kg下或在16mg/kg下每四周进行施用。或者，在一些实施方案中，本文所述的本公开的抗体在0.1mg/kg至约10mg/kg之间下在每周间隔下施用17周。举例来说，在一些情况下，在启动治疗之后，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40天中的至少一天，或替代地，在第1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20周中的至少一周，或以它们的任何组合方式；使用每24、12、8、6、4或2小时一次的单次剂量或分次剂量，或以它们的任何组合方式；以每天约0.1-100mg/kg，诸如0.5、0.9、1.0、1.1、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、45、50、60、70、80、90或100mg/kg的量以每日剂量形式提供本公开的抗体。在一些实施方案中，防治性施用本文所述的本公开的抗体以降低显现炎症性疾病诸如RA、牛皮癣性关节炎或牛皮癣的风险，延迟炎症性疾病诸如RA、牛皮癣性关节炎或牛皮癣的进展中的事件的发生。在一些实例中，本公开的抗体被冻干以进行储存，并且在使用之前在适合载体中复原。在一些情况下，本公开的抗体以无菌冷冻液体形式提供于具有塞子和伴有翻转型盖子的铝密封件的玻璃小瓶中。在一些实例中，每个小瓶含有3.3mL 50mg/mL的抗体于10mM组氨酸、8.5％(w/v)蔗糖和0.04％(w/v)聚山梨醇酯80的制剂(pH 5.8)中的溶液(包括10％过量灌装)。在一些实例中，小瓶不含有防腐剂，并且用于单次使用。可将小瓶冷冻储存，并且避光。为制备用于静脉内施用的抗体，在一些实例中，抗体制剂在于无菌稀释剂中稀释之前用0.22微米过滤器过滤。在一些实例中，使用管线内0.22微米过滤器，历经至少30分钟的时期，通过静脉内输注来施用在多达约100mL的体积下的稀释抗体。或者，在一些实施方案中，以1或2次皮下注射处于约3.3mL的50mg/mL抗体的方式施用抗体。皮下注射部位可例如在腹部区域内。

V.药物组合物

本公开的TM4SF1结合蛋白(例如抗TM4SF1抗体或其抗原结合片段)或编码本公开的TM4SF1结合蛋白的多核苷酸中的任一者都可被包括在组合物(例如药物组合物)中。本公开的药物组合物可还包括药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。

如本文所用的术语“药物组合物”是指含有与药学上可接受的载体一起配制的本文所述的TM4SF1结合蛋白，并且在由政府监管机构核准作为用于治疗哺乳动物的疾病的治疗方案的一部分的情况下加以制造或销售的组合物。药物组合物可被配制，例如以用于以单位剂型(例如片剂、胶囊、囊片、凝胶胶囊或糖浆)进行口服施用；用于经表面施用(例如以乳膏剂、凝胶剂、洗剂或软膏剂形式)；用于静脉内施用(例如以不含颗粒栓塞物以及于适于静脉内使用的溶剂系统中的无菌溶液形式)；或以本文所述的任何其他制剂形式配制。

如本文所用的术语“药学上可接受的载体”是指在生理上可为所治疗哺乳动物(例如人)接受，同时维持它与其一起施用的蛋白质的治疗性质的载体。一种示例性药学上可接受的载体是生理盐水。其他生理上可接受的载体和它们的制剂为本领域技术人员所知，并且例如描述于以引用的方式并入本文的Remington’s Pharmaceutical Sciences(第18版,A.Gennaro,1990,Mack Publishing Company,Easton,PA)中。

在一些实施方案中，含有如上所述的TM4SF1结合蛋白的药物组合物被制备成溶液；于甘油、液体聚乙二醇以及它们在油中的任何组合中的分散液；固体剂型；可吸入剂型；鼻内剂型；脂质体制剂；包含纳米粒子的剂型；包含微粒的剂型；聚合剂型；或它们的任何组合。

在一些实例中，药学上可接受的赋形剂是Handbook of PharmaceuticalExcipients,American Pharmaceutical Association(1986)中所述的赋形剂。适合赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘合剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。

在一些实施方案中，赋形剂是缓冲剂。适合缓冲剂的非限制性实例包括柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。作为缓冲剂，在一些实施方案中，碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、聚磷酸钠、聚磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其他钙盐或它们的组合用于本公开的药物组合物中。

在一些实施方案中，赋形剂包括防腐剂。适合防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，诸如α-生育酚和抗坏血酸；以及抗微生物剂，诸如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实例中，抗氧化剂还包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、甲硫氨酸、乙醇和N-乙酰基半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂包括有效霉素A(validamycin A)、TL-3、原钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶(aprotinin)、苯基甲基磺酰氟、氟磷酸二异丙酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、卡斯帕酶(caspase)抑制剂、粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷基化剂、抗微生物剂、氧化酶抑制剂或其他抑制剂。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含粘合剂作为赋形剂。适合粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、寡糖以及它们的组合。在一些实例中，用于药物制剂中的粘合剂选自淀粉诸如马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖诸如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糖糊精；天然和合成胶；明胶；纤维素衍生物诸如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇诸如山梨糖醇、木糖醇、甘露糖醇以及水或它们的任何组合。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含润滑剂作为赋形剂。适合润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、sterotex、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁和轻质矿物油。在一些实施方案中，用于药物制剂中的润滑剂选自金属硬脂酸盐(诸如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(诸如硬脂基反丁烯二酸钠)、脂肪酸(诸如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属月桂基硫酸盐(诸如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石或它们的组合。

在一些实施方案中，药物制剂包含分散增强剂作为赋形剂。在一些实例中，适合分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶(guar gum)、高岭土、膨润土、纯化木纤维素、淀粉乙醇酸钠、同形硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。

在一些实施方案中，如本文所述的药物组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施方案中，崩解剂是非泡腾性崩解剂。适合非泡腾性崩解剂的非限制性实例包括淀粉诸如玉米淀粉、马铃薯淀粉、它们的预凝胶化和改性淀粉，甜味剂、粘土诸如膨润土、微晶纤维素、海藻酸盐、淀粉乙醇酸钠、胶诸如琼脂、瓜尔胶、刺槐豆胶、刺梧桐胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施方案中，崩解剂是泡腾性崩解剂。适合泡腾性崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸组合、以及碳酸氢钠与酒石酸组合。

在一些实施方案中，赋形剂包括调味剂。在一些实例中，并入外层中的调味剂选自合成调味油和调味香料；天然油；来自植物、叶、花和果实的提取物；以及它们的组合。在一些实施方案中，调味剂可选自：肉桂油；冬青油；胡椒薄荷油；三叶草油；干草油；茴香油；桉树油；香草油；柑桔油，诸如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；以及水果香精，包括苹果、桃子、梨、草莓、树莓、樱桃、李子、菠萝和杏香精。

在一些实施方案中，赋形剂包括甜味剂。适合甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖以及它们的混合物(当不用作载体时)；糖精和它的各种盐，诸如钠盐；二肽甜味剂，诸如阿斯巴甜(aspartame)；二氢查耳酮(dihydrochalcone)化合物、甘草甜(glycyrrhizin)；甜菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊苷(Stevioside))；蔗糖的氯代衍生物，诸如三氯蔗糖(sucralose)；以及糖醇，诸如山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇等。

在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含着色剂。适合着色剂的非限制性实例包括食物、药物和化妆品着色剂(FD和C)、药物和化妆品着色剂(D和C)、以及外用药物和化妆品着色剂(Ext.D和C)。着色剂可用作染料或它们的相应色淀。

在一些情况下，如本文所述的药物组合物包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂是杀真菌螯合剂。实例包括但不限于：乙二胺-N,N,N’,N’-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠、三钠、四钠、二钾、三钾、二锂和二铵盐；EDTA的钡、钙、钴、铜、镝、铕、铁、铟、镧、镁、锰、镍、钐、锶或锌螯合物；反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N’,N’-四乙酸单水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨基-2-羟基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；1,3-二氨基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；乙二胺-N,N’-二乙酸；乙二胺-N,N’-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N’-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N’,N’-三乙酸；乙二胺-N,N,N’,N’-四(亚甲基膦酸)；O,O’-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N’,N’-四乙酸；N,N-双(2-羟基苯甲基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-己二胺-N,N,N’,N’-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N’,N’-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴酸盐；或三乙四胺-N,N,N’,N”,N’”,N’”-六乙酸。

还涵盖了包括如本文公开的抗TM4SF1抗体和一种或多种其他抗微生物剂或抗真菌剂的组合产品，所述抗微生物剂或抗真菌剂例如多烯诸如两性霉素B(amphotericin B)、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素(nystatin)；唑和三唑诸如伏立康唑(voriconazole)、氟康唑(fluconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、泊沙康唑(pozaconazole)等；葡聚糖合成酶抑制剂诸如卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)(FK463)和V-棘白菌素(V-echinocandin)(LY303366)；灰黄霉素(griseofulvin)；烯丙胺诸如特比萘芬(terbinafine)；氟胞嘧啶(flucytosine)或其他抗真菌剂，包括本文所述的那些。此外，预期肽可与经表面使用的抗真菌剂诸如环吡酮胺(ciclopirox olamine)、卤普罗近(haloprogin)、托萘酯(tolnaftate)、十一碳烯酸盐(undecylenate)、经表面使用的制霉菌素、阿莫罗芬(amorolfine)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬和其他经表面使用的药剂组合。在一些情况下，药物组合物包含额外药剂。在一些情况下，额外药剂以治疗有效量存在于药物组合物中。

在普通储存和使用条件下，如本文所述的药物组合物包含防腐剂以防止微生物生长。在某些实例中，如本文所述的药物组合物不包含防腐剂。适于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散液以及用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉剂。药物组合物包含是溶剂或分散介质的载体，所述溶剂或分散介质含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)和/或植物油或它们的任何组合。适当流动性例如通过使用包覆剂诸如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需粒度，以及通过使用表面活性剂加以维持。防止微生物作用通过各种抗细菌剂和抗真菌剂例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等来达成。在许多情况下，包括等张剂，例如糖或氯化钠。延长可注射组合物的吸收可通过在组合物中使用延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝和明胶来达成。

对于以水溶液进行胃肠外施用，举例来说，如果必要，那么液体剂型以适合方式加以缓冲，并且用足够盐水或葡萄糖致使液体稀释剂等张。液体剂型尤其适于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。就此而论，可采用的无菌水性介质将为本领域技术人员鉴于本公开而得知。举例来说，在某些情况下，将一个剂量溶解于1mL至20mL等张NaCl溶液中，并且添加至100mL至1000mL的流体例如碳酸氢钠缓冲盐水中，或在建议的输注部位处注射。

在某些实施方案中，无菌可注射溶液通过以下方式制备：以所需量将免疫治疗剂与以上列举的如所需要的各种其他成分一起并入适当溶剂中，随后过滤灭菌。通常，分散液通过将各种灭菌活性成分并入含有基本分散介质和来自以上列举的那些成分的所需其他成分的无菌媒介物中来制备。在一些情况下，本文公开的组合物以中性或盐形式配制。药学上可接受的盐包括例如酸加成盐(采用蛋白质的游离氨基加以形成)，并且所述酸加成盐采用无机酸诸如像盐酸或磷酸，或诸如乙酸、草酸、酒石酸、杏仁酸等的有机酸加以形成。在一些情况下，采用游离羧基形成的盐由无机碱诸如像氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁；以及诸如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等的有机碱获得。在一些实施方案中，在配制后，药物组合物以可与剂量配制相容的方式以及以诸如治疗有效的量施用。

在某些实施方案中，本公开的药物组合物包含有效量的如本文公开的抗TM4SF1抗体与药学上可接受的载体组合。如本文所用的“药学上可接受”包括不干扰活性成分的生物活性的有效性和/或不对它向其施用的患者具有毒性的任何载体。适合药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液诸如油/水乳液、各种类型的湿润剂和无菌溶液。药学上可相容的载体的额外非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收的基质材料、含有免疫治疗剂的植入元件、或任何其他适合媒介物、递送或分配装置或材料。所述载体例如通过常规方法加以配制，并且在有效量下向受试者施用。

VI.组合疗法

在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种其他疗法之前、之后或与一种或多种其他疗法组合施用如本文公开的抗TM4SF1抗体。其他疗法的实例可包括但不限于化学疗法、放射、抗癌剂或它们的任何组合。相对于免疫疗法的施用，其他疗法可并行或依序施用。在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与一种或多种抗癌剂或癌症疗法组合施用如本文公开的免疫疗法。抗癌剂包括但不限于化学治疗剂、放射冶疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗周期素依赖性激酶剂。在某些实施方案中，癌症疗法包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或它们的组合。在某些实施方案中，本公开的方法包括在一种或多种其他免疫调节剂之前、之后或与一种或多种其他免疫调节剂组合施用如本文公开的免疫疗法。在一些实例中，免疫调节剂包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫性的任何化合物、分子或物质。其他免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区、抗CD11b抗体或其可变区、COX2抑制剂例如塞来昔布(celecoxib)、细胞因子诸如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和1FNy，以及趋化因子诸如MIP-1、MCP-1和IL-8。

在其中其他疗法是放射的某些实例中，示例性剂量是5,000拉德(Rad)(50Gy)至100,000拉德(1000Gy)、或50,000拉德(500Gy)、或在所叙述范围内的其他适当剂量。或者，放射剂量是约30至60Gy、约40至约50Gy、约40至48Gy、或约44Gy、或在所叙述范围内的其他适当剂量，其中剂量例如借助于如上所述的剂量测定研究加以确定。如本文所用的“Gy”可指等于100拉德的特定吸收放射剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。

在其中其他疗法是化学疗法的某些实例中，示例性化学治疗剂包括不限于烷基化剂(例如氮芥衍生物、亚乙基亚胺、烷基磺酸酯、肼和三嗪、亚硝基脲以及金属盐)、植物生物碱(例如长春花生物碱、紫杉烷、鬼臼毒素(podophyllotoxin)以及喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如蒽环霉素、色霉素等)、抗代谢剂(例如叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂以及腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂以及杂项抗赘生剂(例如核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂以及类视黄醇)。示例性化学治疗剂可包括不限于阿那曲唑(anastrozole)比卡鲁胺(bicalutamide)硫酸博莱霉素(bleomycin sulfate)白消安(busulfan)白消安注射液卡培他滨(capecitabine)N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂(carboplatin)卡莫司汀(carmustine)苯丁酸氮芥(chlorambucil)顺铂(cisplatin)克拉屈滨(cladribine)环磷酰胺(cyclophosphamide)阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosinearabinoside)阿糖胞苷(cytarabine)脂质体注射液达卡巴嗪(dacarbazine)更生霉素(dactinomycin)(放线菌素D(Actinomycin D)、可美净(Cosmegan))、盐酸柔红霉素(daunorubicin hydrochloride)柠檬酸柔红霉素脂质体注射液地塞米松(dexamethasone)、多西他赛(docetaxel)盐酸多柔比星(doxorubicinhydrochloride)依托泊苷磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)5-氟尿嘧啶氟他胺(flutamide)替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(Gemcitabine)(二氟脱氧胞苷)、羟基脲伊达比星(Idarubicin)异环磷酰胺(ifosfamide)伊立替康(irinotecan)L-天冬酰胺酶甲酰四氢叶酸钙(leucovorin calcium)、美法仑6-巯基嘌呤甲氨蝶呤米托蒽醌(mitoxantrone)米洛他(mylotarg)、太平洋紫杉醇(paclitaxel)菲尼克斯(phoenix)(钇90/MX-DTPA)、喷司他汀(pentostatin)、以聚苯丙生20为载体的卡莫司汀植入物(polifeprosan20with carmustine implant)柠檬酸他莫昔芬(tamoxifen citrate)替尼泊苷(teniposide)6-硫鸟嘌呤、噻替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)注射用盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride for injection)长春花碱长春新碱以及长春瑞滨(vinorelbine)依布替尼(Ibrutinib)、艾代拉里斯(idelalisib)和布妥昔单抗维多汀(brentuximab vedotin)。

示例性烷基化剂包括不限于氮芥、亚乙基亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen )、氮芥(chlormethine)环磷酰胺( Revimmune^TM)、异环磷酰胺美法仑()、苯丁酸氮芥哌泊溴烷(pipobroman) 三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine) 三亚乙基硫代磷酸胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺(Temozolomide) 噻替派白消安卡莫司汀洛莫司汀(lomustine)链脲霉素(streptozocin)和达卡巴嗪额外示例性烷基化剂包括不限于奥沙利铂(Oxaliplatin)替莫唑胺(Temozolomide)(和)；更生霉素(也被称为放线菌素-D、)；美法仑(也被称为L-PAM、L-溶肉瘤素(L-sarcolysin)和苯丙氨酸氮芥、)；六甲蜜胺(Altretamine)(也被称为六甲基蜜胺(HMM)、)；卡莫司汀苯达莫司汀(Bendamustine)白消安(和)；卡铂洛莫司汀(也被称为CCNU、)；顺铂(也被称为CDDP、和)；苯丁酸氮芥环磷酰胺(和)；达卡巴嗪(也被称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、)；六甲蜜胺(也被称为六甲基蜜胺(HMM)、)；异环磷酰胺泼尼莫司汀(Prednumustine)；丙卡巴肼二氯甲基二乙胺(也被称为氮芥(nitrogen mustard)、氮芥(mustine)和二氯甲基二乙胺盐酸盐、)；链脲霉素噻替派(也被称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、)；环磷酰胺以及盐酸苯达莫司汀

示例性蒽环霉素可包括不限于例如多柔比星(和)；博莱霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素、)；脂质体柔红霉素(柠檬酸柔红霉素脂质体、)；米托蒽醌(DHAD、)；表柔比星(epirubicin)(Ellence^TM)；伊达比星(idarubicin)(Idamycin)；丝裂霉素C格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；灰暗霉素(ravidomycin)；以及脱乙酰基灰暗霉素(desacetylravidomycin)。

示例性长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨长春新碱以及长春地辛(Vindesine) 长春花碱(也被称为硫酸长春花碱、长春碱(vincaleukoblastine)以及VLB、和)；以及长春瑞滨

示例性蛋白体抑制剂可但不限于硼替佐米(bortezomib)卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007、(S)-4-甲基-N—((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；玛瑞佐米(marizomib)(NPI-0052)；柠檬酸艾沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)；以及O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

如本文所用的“与……组合”意指抗TM4SF1抗体和其他疗法作为治疗方案或计划的一部分向受试者施用。在某些实施方案中，组合使用不要求抗TM4SF1抗体和其他疗法在施用之前加以物理组合，或它们历经相同时间范围加以施用。举例而非以限制方式来说，抗TM4SF1抗体和一种或多种药剂并行向所治疗的受试者施用，或在相同时间或以任何顺序依序或在不同时间点施用。

VII.试剂盒

本公开提供了包括本公开的组合物(例如药物组合物)(例如包括本公开的抗TM4SF1抗体的组合物)的试剂盒。试剂盒包括用以允许临床医师(例如医师或护士)向受试者施用其中含有的组合物以治疗与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的说明书。

在某些实施方案中，试剂盒包括一种或多种含有有效量的本公开的抗体的单次剂量药物组合物的包装。任选地，为施用一种或多种药物组合物所必需的仪器或装置可被包括在试剂盒中。举例来说，本公开的试剂盒可提供一个或多个含有有效量的本公开的疫苗、载体、稳定化三聚体或优化病毒多肽的预填充注射器。此外，试剂盒还可包括额外组成部分，诸如关于患有与病理性血管生成相关的病症(例如癌症)的受试者使用一种或多种含有本公开的TM4SF1结合蛋白或多核苷酸的药物组合物的施用时程的说明书。

将为本领域技术人员显而易知的是，可在不脱离本公开的精神或范围下在本公开的组合物、方法和试剂盒方面进行各种修改和变化。因此，意图本公开涵盖本公开的修改和变化，前提是它们在随附权利要求和它们的等同物的范围内。

实施例

提供以下实施例以说明而非限制当前所要求保护的公开内容。

实施例1.肿瘤细胞(TC)-内皮细胞(EC)相互作用由TM4SF1介导

这个研究的目的在于确定TM4SF1表达涉及于TM4SF1表达与TC转移之间的TC关联中，以及本公开的示例性抗TM4SF1抗体对EC-TC相互作用的影响。相较于野生型小鼠(TM4SF1+/+)，使用TM4SF1杂合性(+/-)小鼠来在体内使TM4SF1水平与转移相关联。TC向肺转移的频率随EC TM4SF1表达而变化。如图2中所示，在尾部静脉注射B16F10 TC之后，以野生型(+/+)TM4SF1的正常水平的约1/2进行表达的TM4SF1杂合性(+/-)小鼠中的肺转移减少至接近1/5。

还研究了B16F10细胞中的TM4SF1表达。图3A和图3B中所示的结果显示B16F10 TC的转移潜力随TM4SF1表达而变化。如图3A中所示，TM4SF1表达水平随汇合而降低。如图3B中所示，相比于较低TM4SF1表达者，高TM4SF1表达性B16F10细胞产生更多肺转移。

进一步实验显示B16F10细胞不良附着于用抗TM4SF1抗体AGX-A01处理的人肺微血管EC(HLMEC)的单层，在所述单层上异常迁移，以及从所述单层频繁脱离(图4；AGX-A01在PCT/US2014/059761中被称为抗体8G4，AGX-A01的可变重链和轻链分别包含以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2阐述的氨基酸序列)。将经GFP标记B16F10细胞层置在经RFP标记HLMEC的坪苔上。图4中所示的来自代表性活细胞成像的连续图像显示与对照(Ctl)抗体相比，抗TM4SF1抗体(10μg/ml)干扰用于达成迁移的TC相互作用，从而导致广泛不规则细胞突起，所述细胞突起导致细胞脱离。

实施例2.抗人TM4SF1抗体可抑制TC-EC相互作用以及阻断TC迁移

产生了针对人TM4SF1(hTM4SF1)的许多示例性单克隆抗体(AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11)。为确定它们的治疗价值，测试示例性抗hTM4SF1抗体中的每一者以确定哪些抗体能够抑制肿瘤细胞(TC)附着于培养的人肺微血管内皮细胞(EC)和/或跨越所述内皮细胞进行迁移。

示例性抗hTM4SF1抗体中的全部七者(AGX-A03、AGX-A04、AGX-A05、AGX-A07、AGX-A08、AGX-A09和AGX-A11)都与人TM4SF1和食蟹猴TM4SF1交叉反应。

相比之下，抗体AGX-A01(在PCT/US2014/059761中被称为抗体8G4)以低于纳体积摩尔浓度亲和力与人TM4SF1而非食蟹猴TM4SF1反应。制备包含七种抗体中的每一者的可变区的嵌合抗体，并且所述嵌合抗体具有ADCC和CDC效应功能被消除的人IgG1同种型。它们与TM4SF1的ECL-2环上的不同表位反应。

除非另外规定，否则在以下以及遍及本文所述的实验中，同种型匹配抗体充当对照。

分别表达高(109±17个mRNA拷贝/细胞)和低(1.5±2.6个mRNA拷贝/细胞)水平的TM4SF1的两种人乳腺腺癌细胞系MDA-MB-468和MCF-7被选择用于这些研究。在120±17个mRNA拷贝/细胞下表达TM4SF1的人肺微血管内皮细胞(HLMEC)源于人肺微血管结构(LonzaBiologics Inc)。10μg/ml AGX-A01已在流式细胞计量术中被显示会使MDA-MB-468与HLMEC两者中的细胞表面TM4SF1结合饱和，并且是阻断图4中所示的B16F10 TC-EC相互作用的剂量。在体外在高达1mg/ml AGX-A01的剂量下历经2天细胞培养，未观察到对HLMEC的毒性。

确定抑制EC-TC相互作用(TC附着于EC和/或跨EC迁移)的抗体浓度

进行研究以确定抑制EC-TC相互作用(TC附着于EC和/或跨EC迁移)的抗体浓度。使HLMEC在4孔载玻片腔室中生长以形成单层。将抗体(7种抗hTM4SF1测试抗体或同种型匹配对照抗体中的每一者)在100、10、1和0μg/ml的连续稀释浓度下添加至每个孔中以允许用HLMEC平衡0.5小时，随后添加10³个经GFP转染TC。1小时和4小时后，在温和冲洗以消除松散结合或脱离的TC之后移除培养基，并且用温热培养基将腔室洗涤一次，接着用37℃预温热多聚甲醛固定。EVOS FL自动细胞成像系统(ThermoFisher)用于采用Z-堆叠功能从单层的顶部至基质底部对整个孔进行扫描。接着通过EVOS将单个图像自动拼接并Z-堆叠在一起，并且对荧光信号计数以获得附着和迁移TC的数目。还使用EVOS成像系统进行活细胞成像以当EC-TC相互作用发生时对它们进行观察。

观察到七种示例性抗hTM4SF1测试抗体中的每一者都抑制TC附着于HLMEC单层。还观察到八种示例性抗hTM4SF1抗体中的每一者都抑制跨越HLMEC单层进行迁移。

实施例3.抗TM4SF1抗体给药方案

进行以下实验以确定本公开的示例性抗TM4SF1抗体的在C57Bl/6小鼠中建立和维持长期TM4SF1免疫阻断的给药方案。给药方案将通过注射足以使在C57Bl/6小鼠的正常血管EC上表达的TM4SF1饱和的量的示例性抗TM4SF1抗体来最大程度抑制TM4SF1介导的转移。

如此处在实施例3中定义的“饱和剂量”是所注射示例性抗TM4SF1抗体的数目等于在体内在小鼠中可用结合位点的数目所处的剂量。在各种剂量的示例性抗TM4SF1抗体下进行的药物代谢动力学(PK)测定将鉴定饱和剂量，因为一旦所注射剂量超过饱和剂量，血清抗TM4SF1抗体浓度即快速升高。以下显示的表1概述具有约0.5nM的亲和力Kd的示例性抗TM4SF1抗体的所注射剂量、血清浓度和免疫阻断水平之间的预期关系。

表1.示例性抗TM4SF1抗体的所注射剂量、血清浓度和免疫阻断之间的示例性关系

在某些情况下，观察到在3mg/kg下施用示例性抗TM4SF1测试抗体在12小时内达到约0.07μg/ml的血清浓度，略微高于预期平衡血清浓度。相比之下，不与任何小鼠蛋白相互作用的抗hTM4SF1抗体(AGX-A01)在相同剂量下持续超过十二天维持血清水平>5μg/ml，并且不诱导抗体应答。

3.1确定示例性抗TM4SF1测试抗体的为在1周时实现高水平免疫阻断所需的初始剂量

进行研究，借此，示例性抗TM4SF1测试抗体在30mg/kg下以单次剂量向小鼠施用。在腹膜内施用抗TM4SF1抗体之后二十四小时，将B16F10转移性TC注射至小鼠中。观察到相对于用肿瘤细胞注射但未用示例性抗TM4SF1测试抗体治疗的对照小鼠，接受抗mTM4SF1抗体的小鼠显示肺转移降低，例如降低约83％。

在另一实验中，通过一系列PK测定鉴定示例性抗TM4SF1测试抗体的饱和剂量，所述PK测定由用于具有五只八周龄雌性C57Bl/6小鼠的各组的单一较高(40mg/kg)剂量以及两种较低(20和10mg/kg)剂量的示例性抗mTM4SF1测试抗体组成。

通过流式细胞计量术测定存在于血清中的示例性抗TM4SF1测试抗体的水平。简要来说，收集血液(约30μl)，并且根据需要在PBS中稀释血清以用于与表达高水平的小鼠TM4SF1(215±27个TM4SF1mRNA拷贝/细胞)的MS1小鼠EC一起在4℃下孵育30分钟。接着将细胞于PBS中洗涤以移除未结合抗体，并且与经AlexaFlour-488标记抗人二级抗体一起在4℃下孵育30分钟。存在的示例性抗TM4SF1测试抗体的量根据使用10倍连续稀释浓度的抗TM4SF1抗体产生的标准曲线确定。这个测定通常具有0.001μg/ml的灵敏性。在某些情况下，发现免疫阻断在1μg/ml的血清水平下是约93％，并且在约5μg/ml的血清水平下是约98.5％。

这些实验的目标在于鉴定在一周时实现循环抗体浓度>1μg/ml例如在约5μg/ml下的初始剂量。

3.2确定为维持长期高水平免疫阻断所需的每周维持剂量的大小

这个实验的目标在于鉴定示例性抗TM4SF1测试抗体的维持对血管TM4SF1的高水平免疫阻断的每周维持剂量，所述高水平免疫阻断由循环中的抗mTM4SF1抗体的水平始终高于1μg/ml指示。

持续至少七天直至注射下一维持剂量，所需每周维持剂量维持示例性抗TM4SF1测试抗体的血清浓度高于1μg/ml，并且理想的是接近于5μg/ml。为确定维持剂量，以上在3.1中确定的初始剂量用作起始剂量，接着在约第7天时，测试等于初始剂量的100％、50％、25％和0％的维持剂量。视示例性抗TM4SF1测试抗体的第14天血清浓度而定，调整每个小鼠群组中的第14天维持剂量以致使注射后7天的血清浓度在所需1-5μg/ml范围内。重复这个循环直至所有组都汇合于相同维持剂量。连同对照抗体组一起，这些实验使用120只八周龄雌性C57Bl/6小鼠(2种抗体x4组x5只小鼠/组x重复3次)。

3.3.监测毒性和抗mTM4SF1抗体免疫原性

进行实验以确定在被施用每周维持剂量的示例性抗TM4SF1测试抗体的小鼠中的毒性。在实施例3.2中确定的每周维持剂量持续至少3个月的时期，并且监测小鼠的毒性和抗TM4SF1测试抗体免疫原性的征象。

为确保维持免疫阻断以及为考查小鼠是否已产生针对抗mTM4SF抗体的抗体，每周抽取血液，并且评估以下参数：(a)抗TM4SF1测试抗体的血清浓度；和(b)已产生的任何抗TM4SF1测试抗体抗体的可能存在性，所述可能存在性通过使用用所测定的抗TM4SF1测试抗体包被的板以及抗小鼠IgG二级抗体进行的ELISA测定来评估。这些实验包括30只小鼠(2种抗体x5只小鼠/组x重复3次)。

实施例4.示例性抗TM4SF1测试抗体在两种小鼠肺转移模型中的抗转移潜力

在B10F10黑素瘤肿瘤细胞的情况下以及在MMTV Pyt(小鼠乳腺肿瘤多瘤病毒中T抗原)的情况下测试三种免疫阻断水平的功效。给药是如此以致达成以上在实施例3中鉴定的给药时程的100％、50％和25％，并且对在肺中所引起的转移性负荷进行定量。

在两种模型中，对随免疫阻断水平而变化的转移数目进行定量，其中目标是实现肺转移降低至少50％。

4.1.对在静脉内(尾部静脉)注射B16F10 TC之后的肺转移的定量

通过尾部静脉注射的TC(2x10⁵个细胞于100μl PBS中)在最初穿过之后由肺从循环清除；可见的肺转移到14天时显现。转移通过标准方法(例如如Overwijk WW,RestifoNP.B16 as a mouse model for human melanoma.Curr Protoc Immunol 2001；第20章:第20 1单元；Brown LM,Welch DR,Rannels SR.B16F10 melanoma cell colonization ofmouse lung is enhanced by partial pneumonectomy.Clin Exp Metastasis2002；19:369-76.35；Khanna C,Hunter K.Modeling metastasis in vivo.Carcinogenesis 2005；26:513-23中所述)来评估，对可见的肿瘤结节的总数以及大(>1mm直径)肿瘤结节的数目相对于小肿瘤结节(<1mm直径)的数目进行计数。

4.1.1.用示例性抗TM4SF1测试抗体治疗小鼠。

进行研究以确定肺中的转移性负荷是否以及在什么程度上随TM4SF1免疫阻断程度而变。基于实施例3.1的结果测试三种水平的抗TM4SF1测试抗体免疫阻断：单次注射实现100％阻断(例如血清中1-5μg/ml抗TM4SF1测试抗体)的示例性抗TM4SF1测试抗体剂量以及代表那个剂量的50％和25％的剂量。在抗体注射之后第4天进行B16F10细胞注射，所述时间通常大约是免疫阻断开始接近100％免疫阻断所处的时间。在B16F10细胞注射之后14天即在初始注射之后18天将小鼠处死。在第-0、-4(在细胞注射之前)、+7(在细胞注射后)、+14和+18天获取血液样品以评估抗TM4SF1测试抗体的血清浓度。包括对照抗体组，90只八周龄雌性C57Bl/6小鼠(2种抗体x3种剂量/抗体x5只小鼠/组x重复3次)用于研究中。

4.1.2.在注射至小鼠中之前用抗mTM4SF1抗体处理TC

B16F10细胞表达高水平的TM4SF1(在过夜培养之后在10％汇合下，约130个TM4SF1mRNA拷贝/细胞；如图3A中所示)。在这个研究中考查选择性免疫阻断TC TM4SF1对肺转移的影响。这些实验遵循实施例4.1.1中阐述的方案，例外之处是在注射至小鼠中之前，使TC与10μg/ml示例性抗TM4SF1抗体一起在4℃下孵育1小时以使TM4SF1结合位点饱和，接着洗涤以移除未结合抗TM4SF1测试抗体。对于示例性抗TM4SF1测试抗体和对照抗体，30只小鼠(2种抗体x1种剂量/抗体x5只小鼠/组x重复3次)用于研究中。

如上所述加以处理的TC随后通过尾部静脉来注射，并且发现所述TC在最初穿过肺之后被从循环清除，由此证明免疫阻断TC TM4SF1促进在体内在小鼠中的转移抑制。

4.2.MMTV-Pyt模型中的自发性肺转移

MMTV-Pyt小鼠乳腺肿瘤转移模型重演人癌症从增生进展至恶化前状态，接着到8-12周龄时进展至具有转移潜力的明显侵袭性导管癌。在8周龄之后，TC不断脱落，从而重现在人中的其中连续免疫阻断将为预防转移所必需的临床情形。可见的肺转移在约第13周时开始出现。

为测试示例性抗TM4SF1测试抗体的功效，在8周龄雌性MMTV-Pyt小鼠中开始施用抗体治疗，因为这是原发性恶性肿瘤最初在乳腺中出现所处的龄期。此处使用实施例3中制定的抗TM4SF1测试抗体给药时程。在16周时将小鼠处死。评估肺转移的数目和团块，如实施例4.1中所述对转移进行计数。连同对照抗体一起，90只七周龄雌性Pyt小鼠(2种抗体x3种剂量/抗体x5只小鼠/组x重复3次)用于研究。

有可能的是，因为TC与肿瘤血管中的血管生成性EC两者均活跃地代谢以及分裂不断产生新表面TM4SF1的细胞，所以肿瘤(乳腺中的原发性肿瘤与肺转移两者)的存在可能使抗TM4SF1测试抗体的为维持免疫阻断所需的剂量增加。因此，在某些情况下，对在实施例3中在无肿瘤小鼠的情况下制定的给药时程进行调整以在实施例4.2的携带肿瘤的小鼠中维持等同免疫阻断。定期对循环抗TM4SF1测试抗体水平进行PK评估以验证血清抗体水平保持高于1μg/ml；如果它们并非如此，那么注射额外抗体以维持所需免疫阻断。

尽管有可能的是，抗TM4SF1抗体抗体(针对人IgG骨架)可在8周实验时期期间产生，但截至12天，未发现已产生所述抗体。如果产生抗TM4SF1抗体抗体，那么用包括小鼠IgG骨架而非人IgG骨架的示例性抗TM4SF1抗体重复进行研究。

在本文所述的两种模型中，目标在于定量肺中的随TM4SF1免疫阻断程度而变化的转移性负荷，并且实现肺转移降低至少50％。

实施例5.人源化突变TM4SF1抗体可结合原代内皮细胞中的TM4SF1

在4℃下用各种测试抗体(1μg/ml)预标记人脐静脉内皮细胞(HUVEC)，并且返回在37℃下培养。

用于这个研究中的测试抗体是：人源化AGX-A07 H2L5(包含如以SEQ ID NO:97阐述的轻链氨基酸序列(AGX-A07 L5)和如以SEQ ID NO:90阐述的重链氨基酸序列(AGX-A07H2))；人源化突变(hm)AGX-A07 H2L5 V1(包含如以SEQ ID NO:99阐述的轻链氨基酸序列(AGX-A07 L5v1)和如以SEQ ID NO:92阐述的重链氨基酸序列(AGX-A07 H2v1))；hm AGX-A07 H2L5 V2(包含如以SEQ ID NO:101阐述的轻链氨基酸序列(AGX-A07 L5v2)和如以SEQID NO:92阐述的重链氨基酸序列(AGX-A07 H2v1))；hm AGX-A07 H2L5 V3(包含如以SEQ IDNO:103阐述的轻链氨基酸序列(AGX-A07 L5v3)和如以SEQ ID NO:92阐述的重链氨基酸序列(AGX-A07 H2v1))；hm AGX-A07 H2L5 V4(包含如以SEQ ID NO:105阐述的轻链氨基酸序列(AGX-A07 L5v4)和如以SEQ ID NO:92阐述的重链氨基酸序列(AGX-A07 H2v1))；以及人源化AGX-A01。

如图12的平均荧光强度(MFI)图中所示，相较于包含在位置90处具有色氨酸至酪氨酸取代(W90Y)的轻链序列的测试抗体hm AGX-A07 H2L5 V3和hm AGX-A07 H2L5 V4(如由hm AGX-A07 H2L5V3和hm AGX-A07 H2L5 V4的较低MFI值；hm AGX-A07 H2L5 V3的EC₅₀＝4.19nM；hm AGX-A07 H2L5 V4的EC₅₀＝46.06nM所证明)，包含在位置90处具有色氨酸残基的轻链序列的测试抗体hAGX-A07 H2L5、hm AGX-A07 H2L5 V1和hm AGX-A07 H2L5 V2在结合HUVEC细胞方面是优越的(如由h AGX-A07 H2L5、hm AGX-A07 H2L5 V1、hm AGX-A07 H2L5V2的高MFI值；以及hAGX-A07 H2L5的EC₅₀＝1.53nM；hm AGX-A07 H2L5 V1的EC₅₀＝1.58nM，hm AGX-A07 H2L5 V2的EC₅₀＝1.64nM所指示)。人源化AGX-A01也能够以EC₅₀＝3.03nM进行结合。

实施例6.用抗TM4SF1抗体预标记的原代内皮细胞中的TM4SF1内化

在4℃下用AGX-A01(1μg/ml)预标记人脐静脉内皮细胞(HUVEC)(染色显示于图13(A)中)，并且返回在37℃下在无以下抑制剂下培养(如图13(B)中所示)或在以下抑制剂存在下培养：20μM pitstop-2(网格蛋白抑制剂)(如图13(C)中所示)；10μM氯丙嗪(网格蛋白和窖蛋白介导的胞吞抑制剂)(如图13(D)中所示)；0.4μM巴佛洛霉素A(自体吞噬抑制剂)(如图13(E)中所示)；或20μM代纳索(发动蛋白抑制剂)(如图13(F)中所示)。在4小时之后，将细胞在4％多聚甲醛中固定，并且用经Alexa-488标记驴抗人抗体、鬼笔环肽(phallodin)(用以对肌动蛋白纤维进行染色)和DAPI(用以对核进行染色)染色。免疫细胞化学分析证明在无添加的抑制剂下(图13(A))或在pitstop-2(图13(C))、氯丙嗪(图13(D))或巴佛洛霉素A(图13(E))存在下，在4小时时达成实质性以及等同的AGX-A01摄取。然而，当与代纳索一起培养时，AGX-A01大部分保持在细胞表面上(图13(F))。

表2.序列描述

尽管本文已显示和描述本公开的优选实施方案，但将对本领域技术人员明显的是所述实施方案仅通过举例方式来提供。在不脱离本公开的情况下，众多改变、变化和替代现将为本领域技术人员所想到。应了解本文所述的本公开的实施方案的各种替代方案可用于实施本公开。意图以下权利要求限定本公开的范围，并且在这些权利要求的范围内的方法和结构以及它们的等同物由所述权利要求涵盖。

Claims

1.一种抗TM4SF1结合蛋白，所述抗TM4SF1结合蛋白包含：

重链可变结构域，所述重链可变结构域包含由SEQ ID NO:96的氨基酸序列组成的CDR3结构域；由SEQ ID NO:95的氨基酸序列组成的CDR2结构域；和由SEQ ID NO:94的氨基酸序列组成的CDR1结构域；以及

轻链可变结构域，所述轻链可变结构域包含由选自SEQ ID NO:110或111的氨基酸序列组成的CDR3结构域；由SEQ ID NO:109的氨基酸序列组成的CDR2结构域；和由选自SEQ IDNO:107或108的氨基酸序列组成的CDR1。

2.如权利要求1所述的抗TM4SF1结合蛋白，其包含

重链，所述重链包含选自SEQ ID NO:90、92、130和132的氨基酸序列；以及

轻链，所述轻链包含选自SEQ ID NO:97、99、101、103、105、131和133的氨基酸序列。

3.如权利要求1所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述结合蛋白是IgG1同种型，并包含含有以下位置中的至少一个中的突变的Fc区：L234、L235、G237、和N297。

4.如权利要求1所述的抗TM4SF1结合蛋白，其包括其抗原结合片段，其中所述其抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab')₂、Fv或scFv。

5.如权利要求1所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中所述蛋白与人TM4SF1的结合不依赖于人TM4SF1的ECL2环的糖基化。

6.如权利要求1所述的抗TM4SF1结合蛋白，其中在使用HEK293过度表达细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以1x 10^-8M或更小的K_D结合食蟹猴TM4SF1，或在使用HUVEC细胞进行的标准流式细胞计量术测定中，所述蛋白以1x 10^-9M或更小的K_D结合人TM4SF1。

7.根据权利要求1-6任一项所述的抗TM4SF1结合蛋白在制备药物中的用途，所述药物在治疗癌瘤的方法中使用。

8.根据权利要求7的用途，其中所述癌瘤的特征在于异常内皮细胞(EC)-细胞相互作用，且其中所述EC-细胞相互作用包括EC-间充质干细胞、EC-纤维母细胞、EC-平滑肌细胞、EC-肿瘤细胞、EC-白细胞、EC-脂肪细胞和EC-神经元细胞相互作用中的一者或多者。

9.一种抗体药物缀合物，其包含：

i)含有权利要求1-8任一项所述的抗TM4SF1结合蛋白的抗原结合蛋白；和

ii)治疗分子。

10.根据权利要求9的抗体药物缀合物，其中所述治疗分子选自下组：细胞毒性剂、化学治疗剂、蛋白质、肽、生长抑制剂、抗激素剂或其组合。