CN111837039B - 肿瘤标志物、以及将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来回收及检测的方法 - Google Patents

肿瘤标志物、以及将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来回收及检测的方法 Download PDF

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Abstract

提供将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分、并回收及检测试样中包含的肿瘤细胞的方法。通过检测试样中存在的下述任一多肽或编码这些多肽的基因，从而将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分、并回收及检测试样中包含的肿瘤细胞，所述多肽为：(i)至少包含TM4SF1(GenBank No.NP＿055035.1)、TNFRSF12A(GenBank No.NP＿057723.1)等6种中的任一氨基酸序列的多肽、(ii)至少包含与上述氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、(iii)至少包含上述氨基酸序列(上述的(i)(ii)的氨基酸序列)的剪接变体的多肽。

Description

肿瘤标志物、以及将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来回收及检 测的方法
技术领域
本发明涉及肿瘤标志物以及试样中包含的肿瘤细胞的回收及检测方法。特别地，本发明涉及使用试样中包含的肿瘤细胞所表达的蛋白质或基因将上述肿瘤细胞与上述试样中包含的夹杂细胞相区分、并回收及检测上述肿瘤细胞的方法。
背景技术
肿瘤细胞一旦离开原发灶，则渗透到血管内或淋巴管内，在血液中或淋巴液中进行循环后最终入侵其它脏器、组织，从而形成转移灶。这里，在血液中进行循环的肿瘤细胞也被称为CTC(Circulating Tumor cell，循环肿瘤细胞)，进行了大量的临床试验、研究。例如，测定了从患者采集的血液中所含的CTC的数量(专利文献1)；或者，通过调查上述CTC中的蛋白质表达、基因突变或易位来提供与上述患者的预后预测、癌症复发预测有关的信息。但是，血液中所含的CTC的数量非常少且血液中包含红细胞、白细胞等多种多样的夹杂细胞，因此在CTC检测/分析时需要从大量的细胞中仅区分并回收及检测少量的细胞的技术。
以往，在CTC的检测中，使用细胞角蛋白、EpCAM(Epithelial Cell AdhesionMolecule，上皮细胞粘附分子)(专利文献1)等在CTC中表达的蛋白质(肿瘤标志物)来进行。但是，细胞角蛋白存在与血液所含的夹杂细胞的交叉(非特异检测)问题，EpCAM存在仅能回收及检测上皮性来源的部分CTC的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1:日本特表2008-533487号公报
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于，提供肿瘤标志物、以及将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的夹杂细胞相区分、并回收及检测试样中包含的肿瘤细胞的方法。
用于解决问题的方案
为了解决上述课题，本发明人们进行了10种癌细胞株与作为健康人试样的白细胞的、使用下一代测序仪的比较表达分析，结果发现了能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的夹杂细胞相区分、并回收及检测试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物，从而完成了本发明。
即，本发明可以例示如下。
[1]
一种将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测的方法，其特征在于，检测试样中存在的选自由以下的(i)至(iii)组成的组中的1种以上多肽。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
[2]
根据[1]所述的方法，其中，使用特异性地识别选自由(i)至(iii)组成的组中的1种以上多肽的抗体或适配体进行检测。
[3]
一种将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测的方法，其特征在于，检测试样中存在的编码以下的(i)至(iii)的任一多肽的基因。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
[4]
一种肿瘤细胞的回收方法，其中，将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测，并使用回收单元回收该检测出的肿瘤细胞，
通过检测试样中存在的选自由以下的(i)至(iii)组成的组中的1种以上多肽来进行肿瘤细胞的检测。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
[5]
根据[4]所述的方法，其中，使用特异性地识别选自由(i)至(iii)组成的组中的1种以上多肽的抗体或适配体进行肿瘤细胞的检测。
[6]
根据[1]至[5]中任一项所述的方法，其中，试样为血液，试样中包含的夹杂细胞为白细胞。
[7]
一种肿瘤标志物，其能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分来检测，所述肿瘤标志物由以下的(i)至(iii)的任一多肽构成。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
[8]
一种肿瘤标志物，其能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分来检测，所述肿瘤标志物由编码以下的(i)至(iii)的任一多肽的基因构成。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
[9]
一种肿瘤标志物，其能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分来回收，所述肿瘤标志物由以下的(i)至(iii)的任一多肽构成。
(i)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的多肽；
(ii)至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽；
(iii)至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、或至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
以下详细说明本发明。
本发明中，试样不限于从患者等采集的组织、全血、腹水等，也包括：将该组织、全血、腹水等用合适的缓冲液稀释而得的试样；血清、血浆、脐带血、成分采血液等来自全血的成分；将一片肝脏、肺、脾脏、肾脏、肿瘤、淋巴节等包含血液的组织用合适的缓冲液悬浮而成的悬浮液。进一步地，本发明中的试样还包括通过离心分离等对这些试样、悬浮液进行分离回收而得到的、包含肿瘤细胞的级分。
本发明中，试样中包含的夹杂细胞是指肿瘤细胞以外的细胞，在试样为全血、全血稀释液、源自全血的成分、包含血液的组织的悬浮液、以及由这些试样或悬浮液得到的包含肿瘤细胞的级分之类的血液试样的情况下，可列举红细胞、白细胞、血小板等。其中，本发明的肿瘤细胞的检测方法为与通过以往的肿瘤细胞的检测方法极有可能被判断为假阳性的、血液试样中包含的白细胞的分辨性优异的方法。另外，本发明的肿瘤细胞的回收方法为在通过以往的肿瘤细胞的回收方法极有可能被判断为假阴性的、血液试样中包含的EpCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule，上皮细胞粘附分子)阴性的肿瘤细胞的回收方面优异的方法。
本发明中的肿瘤细胞的检测中，可以基于该细胞中存在的源自该细胞的上述(i)至(iii)的任一多肽或编码该多肽的基因利用染色、探针杂交法等直接检测试样中包含的肿瘤细胞，另外，也可以通过检测试样中包含的肿瘤细胞所分泌的源自该细胞的上述(i)至(iii)的任一多肽或编码该多肽的基因间接地检测肿瘤细胞。
本发明基于源自肿瘤细胞的上述(i)至(iii)的任一多肽或编码该多肽的基因的表达量来检测上述肿瘤细胞，可以定性地、即基于肿瘤细胞的有无来进行该检测，也可以定量地、即基于肿瘤细胞数、检测强度来进行该检测。另外，检测的判断基准也没有特别限定，例如，可以是只要检测信号存在、则即使少也判断为肿瘤细胞，也可以是若存在一定阈值以上的检测信号则判断为肿瘤细胞，还可以是将相对于试样中包含的夹杂细胞(例如在血液试样的情况下为红细胞、白细胞等)所具有的信号具有一定值以上或该信号的平均值的2SD以上、3SD以上或4SD以上的信号的细胞判断为肿瘤细胞。
本发明中的肿瘤细胞的回收可以如下进行：在通过检测该细胞中存在的来自该细胞的上述(i)至(iii)的任一多肽而将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分并检测试样中包含的肿瘤细胞后，使用回收单元回收该检测出的细胞。需要说明的是，上述(i)至(iii)的任一多肽均为跨膜型的多肽。
本发明的特征在于，在试样中包含的肿瘤细胞的检测和/或回收中，使用作为该肿瘤细胞所表达的蛋白质之一的上述(i)至(iii)的任一多肽。
由序列号1记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为TM4SF1(Transmembrane 4Lsix family member 1，四次跨膜蛋白L6超家族成员1)、L6、M3S1、TAAL6、或H-L6的蛋白质，其氨基酸序列如GenBank No.NP＿055035.1所示。
由序列号2记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为TNFRSF12A(TNF receptorsuperfamily member 12A，TNF受体超家族成员12A)、FN14、TWEAKR、或CD266的蛋白质，其氨基酸序列如GenBank No.NP＿057723.1所示。
由序列号3记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为SDC1(Syndecan 1，黏结蛋白聚糖1)、SDC、SYND1、黏结蛋白聚糖、或CD138的蛋白质，其氨基酸序列如GenBank No.NP＿002988.3所示。
由序列号4记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为F3(凝血因子III(Coagulationfactor III)，组织因子(tissue factor))、TF、TFA、或CD142的蛋白质，其氨基酸序列如GenBank No.NP＿001984.1所示。
由序列号5记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为EPHA2(EPH receptor A2，肝配蛋白A2受体)、CTPA、CTPP1、CTRCT6、ECK、或ARCC2的蛋白质，其氨基酸序列如GenBankNo.NP＿004422.2所示。
由序列号6记载的氨基酸序列构成的多肽是被称为ITGA2(Integrin subunitalpha 2，整合蛋白α2亚基)、CD49B、GPIa、HPA-5、VLA-2、VLAA2、或BR的蛋白质，其氨基酸序列如GenBank No.NP＿002194.2所示。
其中，如后述的实施例所示，TM4SF1(序列号1)及TNFRSF12A(序列号2)在肺腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞中均高表达，不受癌症种类限制，与以往的检测中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外，TM4SF1(序列号1)及TNFRSF12A(序列号2)为跨膜型蛋白，因此与以往的回收中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以大范围地回收试样中包含的肿瘤细胞。
另外，在想要特异性地检测胰腺癌细胞时，后述的实施例所示的基因表达分析的结果表明优选使用ITGA2(序列号6)。需要说明的是，ITGA2(序列号6)为跨膜型蛋白，因此表明在想要特异性地回收胰腺癌细胞时优选使用该蛋白质。
需要说明的是，本发明中，只要与由序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列构成的蛋白质具有相同的活性，则也可以为将序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的1至数个氨基酸残基置换为其他氨基酸残基或使其缺失的形态，另外也可以为在序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列中插入1至数个氨基酸残基而成的形态。这里，本说明书中，“数个”是指20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2个的整数。1至数个氨基酸残基是指：优选氨基酸残基为1个以上且10个以下，更优选为1个以上且5个以下，进一步优选为1个以上且3个以下，特别优选为2个以下。
另外，只要同样具有蛋白质功能，则也可以为在这些多肽的N末端和/或C末端添加有一个以上氨基酸残基的形态。另外，本发明的方法中使用的标志物只要与由序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列构成的蛋白质具有相同的活性，则可以为相对于序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列整体具有70％以上的同源性的蛋白质，优选为具有80％以上、更优选为具有90％以上、进一步更优选为具有95％以上的同源性的蛋白质。
进一步地，在真核细胞中由编码蛋白质的基因表达该蛋白质时，会发生除去基因(RNA)前体中的内含子、将前后的外显子重新结合的反应(剪接)，由于残留的外显子存在多样性而生产出各种成熟mRNA，因此有时会表达出活性不同的蛋白质(剪接变体)。本发明中能够用于检测的多肽还包括：
至少包含序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的剪接变体的多肽、
至少包含将序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列的1至数个氨基酸残基置换为其他氨基酸残基或使其缺失的多肽的剪接变体的多肽、
至少包含在序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列中插入了1至数个氨基酸残基的多肽的剪接变体的多肽、
至少包含与序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列具有70％以上的同源性的多肽的剪接变体的多肽。
在进行本发明的检测时，可以添加能够特异性地标记上述(i)至(iii)记载的任一多肽的色素(例如化学发光色素、荧光色素等)而将其染色，基于其染色图像或染色强度(例如发光强度、荧光强度)进行检测，从通用性的角度出发，使用针对上述多肽的抗体(以下也简单表述为抗多肽抗体)或适配体进行检测的方法为常规方法，并且能够用于直接检测/间接检测两者，因此可以说是优选方式。
另外，上述(i)至(iii)记载的多肽为跨膜型蛋白，因此也能成为将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并回收试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物。
在使用抗多肽抗体检测试样中包含的肿瘤细胞时，优选通过任意方法将标记物修饰到上述抗体上，基于该标记物的有无或量进行检测。标记物可以从利用抗原抗体反应的测定领域通常所使用的物质中适当选择，作为一例，可列举荧光素等荧光物质、碱性磷酸酶等酶、放射性物质。上述抗体与标记物的结合方式没有限定，可以为上述抗体通过化学键等与标记物直接结合的方式，也可以为上述抗体通过针对标记物所结合的上述抗体的抗体(标记二抗)而进行间接结合的方式。使用了抗多肽抗体的、对于试样中所包含的肿瘤细胞的检测格式没有特别限定，可以通过惯用方法利用ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbentAssay，酶联免疫)法、蛋白质印迹法等进行检测，也可以使用AIA-900、AIA-CL2400(均为东曹株式会社制)等酶联免疫分析装置自动进行检测。
这样，上述(i)至(iii)记载的多肽也能成为能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物。
在利用本发明将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分、并回收肿瘤细胞时，在使用上述(i)至(iii)中的任一者记载的多肽将该肿瘤细胞与夹杂细胞相区分并检测该肿瘤细胞后，使用回收单元回收该检测出的肿瘤细胞即可。作为回收单元的一例，可列举具备设置有能够保持肿瘤细胞的保持部的基板、和通过利用喷嘴的抽吸、吐出来回收该肿瘤细胞的回收部的单元，作为具体例，可列举日本特开2016-142616号中公开的回收装置。
另一方面，本发明中，编码上述的(i)至(iii)的任一多肽的基因只要是使用密码子将上述(i)至(iii)记载的任一多肽转换而得到的多核苷酸就没有特别限定，特别优选使用人类密码子转换而成的多核苷酸。
作为编码至少包含由序列号1至6中的任一者记载的氨基酸序列构成的多肽的多肽的基因的一例，可列举以下序列。
对由序列号1记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号7记载的序列中第235位至第840位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_014220.2)、
对由序列号2记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号8记载的序列中第87位至第473位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_016639.2)、
对由序列号3记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号9记载的序列中第392位至第1321位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_001006946.1)、
对由序列号4记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号10记载的序列中第222位至第1106位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_001993.4)、
对由序列号5记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号11记载的序列中第156位至第3083位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_004431.3)、
对由序列号6记载的序列构成的多肽进行转换而成的、由序列号12记载的序列中第144位至第3686位为止的核苷酸构成的多核苷酸(GenBank No.NM_002203.3)。
上述的基因检测方法没有特别限定，例如，可以对上述多核苷酸中的合适位置设计探针、在此基础上通过杂交法进行检测，也可以对上述多核苷酸中的合适位置设计引物组并在此基础上使用PCR法、RT-PCR法、TRC(Transcription Reverse transcriptionConcerted，转录-逆转录协同)法、NASBA(Nucleic Acid Sequence-Based Amplification，基于核酸序列扩增)法、TMA(Transcription-Mediated Amplification，转录介导的扩增)法等扩增、检测上述多核苷酸，还可以将包含上述多核苷酸的试样供于直接测序仪来进行检测。
这样，编码上述的(i)至(iii)记载的多肽的基因可成为能够将试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物。
发明的效果
根据本发明，通过检测下述任一者记载的多肽或编码这些多肽的基因，可以实施试样中包含的肿瘤细胞的检测，所述多肽为：(i)至少包含包括TM4SF1(GenBank No.NP＿055035.1)及TNFRSF12A(GenBank No.NP＿057723.1)在内的6种氨基酸序列中的任一者的多肽、(ii)包含与上述(i)的氨基酸序列具有70％以上的同源性的氨基酸序列的多肽、(iii)至少包含上述(i)或(ii)的氨基酸序列的剪接变体的多肽。通过上述检测方法，可以将试样中仅少量地包含的肿瘤细胞与该试样中包含的夹杂细胞相区分，并检测试样中仅少量地包含的肿瘤细胞。
另外，通过使用上述(i)至(iii)中的任一者记载的多肽检测肿瘤细胞，使用回收单元回收该检测出的肿瘤细胞，从而可以实施试样中包含的肿瘤细胞的回收。通过上述回收方法，可以将试样中仅少量地包含的肿瘤细胞与该试样中包含的夹杂细胞相区分，并回收试样中仅少量地包含的肿瘤细胞。
附图说明
图1为示出健康人白细胞及各种癌细胞的TM4SF1基因表达分析结果的图。
图2为示出健康人白细胞及各种癌细胞的TNFRSF12A基因表达分析结果的图。
图3为示出用(a)抗TM4SF1抗体及(b)抗CD45抗体对掺加(spike)了肺腺癌细胞(PC14)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图4为示出用(a)抗TM4SF1抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了胰腺癌细胞(PANC1)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图5为示出用(a)抗TNFRSF12A(CD266)抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了肺腺癌细胞(PC9)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图6为示出用(a)抗TNFRSF12A(CD266)抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了乳腺癌细胞(MDAMB231)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图7为示出用(a)抗CD142(F3)抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了肺腺癌细胞(PC9)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图8为示出用(a)抗CD142(F3)抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了乳腺癌细胞(MDAMB231)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图9为示出用(a)抗EPHA2抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了前列腺癌细胞(PC3)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图10为示出用(a)抗ITGA2抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了胰腺癌细胞(PANC1)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图11为示出用(a)抗ITGA2抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了胰腺癌细胞(AsPC-1)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图12为示出用(a)抗SDC1抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了乳癌细胞(SKBR3)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
图13为示出用(a)抗SDC1抗体及(b)抗CD45抗体对掺加了胰腺癌细胞(AsPC-1)的血液试样进行免疫染色的结果的图。
具体实施方式
实施例
以下，使用试样为血液试样时的实施例进一步详细说明本发明，但本发明不受该例子限定。
实施例1健康人白细胞及各种癌细胞的基因表达分析
作为癌细胞株，选择人肺腺癌细胞(PC9及PC14)、人乳腺癌细胞(MDAMB231)、人乳癌细胞(SKBR3)、人前列腺癌细胞(22Rv1及PC3)、人肝癌细胞(HepG2及HuH-7)、人胰腺癌细胞(PANC1及AsPC-1)这10种，使用下一代测序仪，用以下的方法分析这些癌细胞株与健康人白细胞的基因表达量的差异。
(1)将癌细胞株分别用以下所示的培养基在5％CO2环境下在37℃下培养后，使用0.25％胰蛋白酶/1mM EDTA从培养基剥离细胞，从而以单细胞单位回收癌细胞(n＝4)，由该单细胞的RNA利用SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing(Clontech)进行cDNA合成和扩增。另外，用从3名健康人的血液回收的白细胞，也同样地以单细胞单位(n＝4)由RNA进行cDNA的合成和扩增。
包含PC9、PC14及PANC1：10％(v/v)FBS(胎牛血清)的DMEM(杜尔贝科改良伊格尔培养基)/Ham’s F-12培养基
AsPC-1：包含10％(v/v)FBS和1mM丙酮酸的RPMI-1640培养基
MDAMB231：包含10％(v/v)FBS的、加入了L-谷氨酰胺的Leibovitz’s L-15培养基的培养基
SKBR3：包含10％(v/v)FBS的McCoy’s 5a培养基
HepG2及HuH-7：包含10％(v/v)FBS的DMEM/高葡萄糖培养基
22Rv1：包含10％(v/v)FBS的RPMI0211-1640培养基
PC3：在10％(v/v)FBS中包含卡那霉素/链霉素的Ham’s F-12K培养基。
(2)将多个上述(1)中得到的细胞集中在一起，用RNeasy Mini Kit(QIAGEN)回收总RNA后，由10ng的RNA利用SMART-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit for Sequencing(Clontech)进行cDNA合成和扩增。另外，对于由3名健康人的血液回收的白细胞，也同样地由多个细胞回收RNA，由10ng分的RNA进行cDNA合成和扩增。
(3)使用上述(1)及(2)中得到的cDNA1ng分，利用Nextera XT DNA LibraryPreparation Kit(Illumina)及Nextera XT v2 Index Kit Set A(Illumina)进行文库制备，使用Next-seq500(illumina)在读长75bp、单端测序的条件下进行测序分析，从而对每一试样解读1000万读取以上的序列。
(4)将上述(3)中解读的核苷酸序列(测序数据)用TopHat2(JOHNS HOPKINS大学)及Bowtie2(JOHNS HOPKINS大学)映射于人基因组序列。需要说明的是，人基因组序列及人基因信息使用了NCBI(National Center for Biological Information)公开的BUILDGRCh38。对于进行了映射的核苷酸序列，通过Cufflinks(Washington大学)由解读而得的各基因的读取数求出以FPKM(Fragments Per Kilobase of exon per Million readsmapped)为单位的每基因的表达值。
(5)对于健康人白细胞的3个被检体的15个样品和10种癌细胞株的48个样品进行表达比较。
癌细胞株(10种、48个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表1。另外，针对上述基因中的编码TM4SF1(序列号1)及TNFRSF12A(序列号2)的基因，将各样品每一个的分析结果分别示于图1及图2。图中，分别地，PC9及PC14为人肺腺癌细胞的结果，MDAMB231为人乳腺癌细胞的结果，SKBR3为人乳癌细胞的结果，HepG2及HuH-7为人肝癌细胞的结果，AsPC-1及PANC1为人胰腺癌细胞的结果，22Rv1及PC3为人前列腺癌细胞的结果，Leuco1至Leuco3为健康人白细胞的结果，single为单细胞(n＝4)中的RNA的结果，10ng为多个细胞中的RNA(10ng分)的结果。
[表1]
TM4SF1基因(序列号7)的、癌细胞株(10种、48个样品)的表达值(FPKM值)的平均为白细胞(3个被检体、15个样品)的FPKM值的平均的300倍以上，可知TM4SF1基因在癌细胞(肿瘤细胞)中特异性表达且高表达(表1)。另外，TM4SF1基因在肺腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞中均高表达，不受癌症种类限制(图1)，因此可知TM4SF1蛋白(序列号1)及基因(序列号7)与以往的检测中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外可知，TM4SF1蛋白(序列号1)为跨膜型蛋白，因此与以往的回收中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地回收试样中包含的肿瘤细胞。
同样地，TNFRSF12A基因(序列号8)的、癌细胞株(10种、48个样品)的表达值(FPKM值)的平均为白细胞(3个被检体、15个样品)的FPKM值的平均的50倍以上，可知TNFRSF12A基因在癌细胞(肿瘤细胞)中特异性表达且高表达(表1)。另外，TNFRSF12A基因在肺腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞、前列腺癌细胞中均高表达，不受癌症种类限制(图2)，因此可知TNFRSF12A蛋白(序列号2)及基因(序列号8)与以往的检测中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外可知，TNFRSF12A蛋白(序列号2)为跨膜型蛋白，因此与以往的回收中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地回收试样中包含的肿瘤细胞。
肺腺癌细胞株(2种、10个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表2。
[表2]
乳腺癌或乳癌细胞株(2种、10个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表3。
[表3]
前列腺癌细胞株(2种、8个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表4。
[表4]
肝癌细胞株(2种、10个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表5。
[表5]
胰腺癌细胞株(2种、10个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上，并且将编码跨膜型蛋白的基因示于表6。
[表6]
将表1所示的、癌细胞株(10种、48个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上的基因中的、在全部癌症种类(肺腺癌、乳腺癌或乳癌、前列腺癌、肝癌、胰癌)的细胞中达到健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上的基因示于表7。如上所述，表明该表所示的蛋白质及基因与以往的检测中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外，由于该表所示的蛋白质为跨膜型蛋白，因此，如上所述还表明与以往的回收中使用的作为肿瘤标志物的EpCAM相比可以广泛地回收试样中包含的肿瘤细胞。
[表7]
将表6所示的、胰腺癌细胞株(2种、10个样品)的表达值(FPKM值)的平均为健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍以上的基因中的、在胰癌以外(肺腺癌、乳腺癌或乳癌、前列腺癌、肝癌)的细胞株中的表达值(FPKM值)的平均低于全部健康人白细胞(3个被检体、15个样品)的表达值(FPKM值)的平均的10.00倍的基因示于表8。表明该表所示的蛋白质及基因可以特异性地检测胰腺癌细胞。另外，该表所示的蛋白质为跨膜型蛋白，因此表明特异性地回收胰腺癌细胞。
[表8]
实施例2使用抗TM4SF1抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，TM4SF1基因在癌细胞中高表达，因此研究了TM4SF1能否用于血液试样中包含的肿瘤细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中分别掺加人肺腺癌细胞(PC14)或人胰腺癌细胞(PANC1)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对TM4SF1的抗体(Human TM4SF1Phycoerythrin MAb、R&Dsystems)溶液10μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-FITC，Beckman Coulter)溶液10μL，在室温下孵育30分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA和5mM EDTA的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞3次，用Permount Fisher(Fisher Scientific)封入载玻片，进行荧光显微镜观察。
分别地，将人肺腺癌细胞(PC14)的染色结果示于图3，将人胰腺癌细胞(PANC1)的染色结果示于图4。图中，箭头所示的细胞为掺加的癌细胞。图3及图4的结果均为：被针对TM4SF1的抗体(抗TM4SF1抗体)染色的细胞(图3的(a)及图4的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图3的(b)及图4的(b))。由该结果可知：TM4SF1(序列号1)可以作为将血液试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物使用。
实施例3使用抗TNFRSF12A抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，TNFRSF12A基因在癌细胞中高表达，因此研究了TNFRSF12A能否用于血液试样中包含的肿瘤细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中分别掺加人肺腺癌细胞(PC9)或人乳腺癌细胞(MDAMB231)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对TNFRSF12A的抗体(PE抗人CD266(Fn14、TWEAK R)抗体、Biolegend)溶液2.5μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-FITC，BeckmanCoulter)溶液10μL，在室温下孵育30分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA和5mM EDTA的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞3次，用Permount Fisher(Fisher Scientific)封入载玻片，进行荧光显微镜观察。
分别地，将人肺腺癌细胞(PC9)的染色结果示于图5，将人乳腺癌细胞(MDAMB231)的染色结果示于图6。图中，箭头所示的细胞为掺加的癌细胞。图5及图6的结果均为：被针对TNFRSF12A的抗体(抗TNFRSF12A抗体)染色的细胞(图5的(a)及图6的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图5的(b)及图6的(b))。由该结果可知：TNFRSF12A(序列号2)可以作为将血液试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物使用。
实施例4使用抗F3抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，F3基因在癌细胞中高表达，因此研究了F3能否用于血液试样中包含的肿瘤细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中分别掺加人肺腺癌细胞(PC9)或人乳腺癌细胞(MDAMB231)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对F3的抗体(CD142-FITC、Miltenyi Biotec)溶液10μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-PE，Beckman Coulter)溶液7μL，在室温下孵育30分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA和5mM EDTA的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞3次，用Permount Fisher(Fisher Scientific)封入载玻片，进行荧光显微镜观察。
将人肺腺癌细胞(PC9)的染色结果示于图7，将人乳腺癌细胞(MDAMB231)的染色结果示于图8。图中，箭头所示的细胞为掺加的癌细胞。图7及图8的结果均为：被针对F3的抗体(抗F3抗体)染色的细胞(图7的(a)及图8的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图7的(b)及图8的(b))。由该结果可知：F3(序列号4)可以作为将血液试样中包含的肿瘤细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的肿瘤细胞的肿瘤标志物使用。
实施例5使用抗EPHA2抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，EPHA2基因在前列腺癌细胞中高表达，因此研究了EPHA2能够用于血液试样中包含的前列腺癌细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中掺加人前列腺癌细胞(PC3)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对EPHA2的抗体(PE抗人EphA2、Biolegend)溶液5μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-FITC、Beckman Coulter)溶液10μL，在室温下孵育30分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA和5mM EDTA的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞3次，用Permount Fisher(Fisher Scientific)封入载玻片，进行荧光显微镜观察。
将人前列腺癌细胞(PC3)的染色结果示于图9。图中，箭头所示的细胞为掺加的前列腺癌细胞。图9的结果为被针对EPHA2的抗体(抗EPHA2抗体)染色的细胞(图9的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图9的(b))。由该结果可知：EPHA2(序列号5)可以作为将血液试样中包含的前列腺癌细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的前列腺癌细胞的肿瘤标志物使用。
实施例6使用抗ITGA2抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，ITGA2基因在胰腺癌细胞中高表达，因此研究了ITGA2能否用于血液试样中包含的胰腺癌细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中分别掺加人胰腺癌细胞(PANC1或AsPC-1)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对ITGA2的抗体(FITC-抗人ITGA2抗体、Biolegend)溶液5μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-PE、Beckman Coulter)溶液20μL，在室温下孵育40分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA、5mM EDTA和6μg/mL替罗非班的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞2次，接种到载玻片上，进行荧光显微镜观察。
分别地，将人胰腺癌细胞PANC1的染色结果示于图10，将人胰腺癌细胞AsPC-1的染色结果示于图11。图中，箭头所示的细胞为掺加的胰腺癌细胞。图10及图11的结果均为：被针对ITGA2的抗体(抗ITGA2抗体)染色的细胞(图10的(a)及图11的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图10的(b)及图11的(b))。由该结果可知：ITGA2(序列号6)可以作为将血液试样中包含的胰腺癌细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的胰腺癌细胞的肿瘤标志物使用。
实施例7使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体及抗EpCAM抗体的癌细胞染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，TM4SF1基因及TNFRSF12A基因在癌细胞中高表达，因此使用识别TM4SF1、TNFRSF12A及作为现有的肿瘤标志物的EpCAM的抗体研究了TM4SF1蛋白及TNFRSF12A蛋白能否用于癌细胞的检测。需要说明的是，在本实施例中，作为癌细胞，使用了实施例1所用的癌细胞株(10株)。
(1)向2.5×103个/100μL(PC-9或PC-14)或1×104个/100μL(MDAMB231、SKBR3、PC-3、22Rv1、HepG2、HuH-7、PANC-1或AsPC-1)的癌细胞株悬浮液100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(2)封闭处理后，加入抗TM4SF1抗体10μL(PE-抗人TM4SF1抗体、R&D systems)、抗TNFRSF12A抗体2.5μL(PE-抗人TNFRSF12A抗体、Biolegend)或抗EpCAM抗体3μL(AlexaFluoro 488-抗人EpCAM抗体、Biolegend)，在室温下孵育60分钟。
(3)孵育后，用包含1％BSA、5mM EDTA和6μg/mL替罗非班的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞2次，接种到载玻片上，进行荧光显微镜观察。
将使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体及抗EpCAM抗体的癌细胞染色结果示于表9。需要说明的是，在上述表中，用源于各荧光标记抗体的荧光信号的强度(+至+++++的5级)表示染色结果，该信号的强度越大(+的数越多)越表示高表达(信号强度(表达量)：+＜++＜+++＜++++＜+++++)。结果是，TM4SF1蛋白(序列号1)及TNFRSF12A蛋白(序列号2)不受癌症种类限制地在肺腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞中表达，可知可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外，该结果表明，TM4SF1蛋白及TNFRSF12A蛋白可以不受癌症种类(肺癌、乳腺癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、胰癌)限制地广泛地回收试样中包含的肿瘤细胞。进一步地，对于现有的肿瘤标志物EpCAM为低表达(+仅为1个)的细胞株(PC-14、MDAMB231、PC-3、PANC1)而言，TM4SF1和/或TNFRSF12A也高表达(+为4个以上)，因此暗示了通过将TM4SF1和/或TNFRSF12A与EpCAM组合可以高精度地检测及回收试样中包含的肿瘤细胞。
[表9]
实施例8使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体及抗EpCAM抗体的癌细胞回收
实施例7中已经明确了：对于现有的肿瘤标志物EpCAM蛋白为低表达的细胞株(PC-14、MDAMB231、PC-3、PANC1)而言，TM4SF1蛋白(序列号1)及TNFRSF12A蛋白(序列号2)也高表达，因此研究了使用分别识别TM4SF1蛋白、TNFRSF12A蛋白及作为现有的肿瘤标志物的EpCAM蛋白的抗体能否回收试样中包含的癌细胞。需要说明的是，在本实施例中，作为癌细胞，使用了低表达EpCAM蛋白的人胰腺癌细胞株PANC1。另外，以下的步骤中使用的“缓冲液”为包含0.5％BSA和2mM EDTA的D-PBS(-)(杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水，不含Mg2+和Ca2+)。
(1)向健康人血液1mL中掺加人胰腺癌细胞(PANC1)100μL(100个细胞)。
(2)向(1)的掺加样品中加入1×BD Pharm Lyse(BD)10mL，在室温下孵育10分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(3)向细胞悬浮液100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)50μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(4)封闭处理后，加入抗TM4SF1抗体50μL(PE-抗人TM4SF1抗体、R&D systems)、抗TNFRSF12A抗体2.5μL(PE-抗人TNFRSF12A抗体、Biolegend)及抗EpCAM抗体10μL(PE-抗人EpCAM抗体、Miltenyi Biotec)中的任意一种或全部3种，在冷藏下孵育10分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(5)向细胞悬浮液80μL中加入Anti-PE Microbeads UltraPure(MiltenyiBiotec)20μL,在冷蔵下孵育15分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(6)将MS色谱柱(Miltenyi Biotec)设置于MACS Separator(Miltenyi Biotec)，用缓冲液洗涤。
(7)将细胞悬浮液500μL添加到(6)的色谱柱中，用缓冲液500μL洗涤色谱柱3次。
(8)将洗涤后的色谱柱从MACS Separator中拆下后，向色谱柱中添加缓冲液1mL，将柱塞压入色谱柱中而回收细胞。
(9)将回收的细胞接种到载玻片上，在显微镜下进行细胞数的测定。
将使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体及抗EpCAM抗体中的任一者或全部时的癌细胞的回收结果示于表10。需要说明的是，上述表中，示出回收细胞数相对于掺加的细胞数的比例来作为细胞回收率[％]。结果为：单独使用抗TM4SF1抗体或抗TNFRSF12A抗体的情况下，显示出高于单独使用抗EpCAM抗体时的细胞回收率。进一步地，在同时使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体及抗EpCAM抗体这3种时，与分别单独使用时相比显示出更高的细胞回收率。由该结果可知，TM4SF1蛋白及TNFRSF12A蛋白可以从血液试样中高效率地回收在用现有标志物EpCAM蛋白的情况下回收率低的癌细胞。另外可知，通过将TM4SF1蛋白及TNFRSF12A蛋白与EpCAM蛋白组合，可以更高效率地回收用EpCAM蛋白时回收率低的癌细胞。
[表10]
实施例9使用抗SDC1抗体的癌细胞染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，SDC1基因在癌细胞中高表达，因此研究了能否使用识别SDC1的抗体将SDC1用于癌细胞的检测。需要说明的是，在本实施例中，作为癌细胞，使用了实施例1所用的癌细胞株(10株)。
(1)向各癌细胞株悬浮液(1×104个/100μL)100μL中加入FcR封闭剂(MiltenyiBiotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(2)封闭处理后，加入抗SDC1抗体10μL(PE-抗人SDC1抗体、Miltenyi Biotec)，在室温下孵育60分钟。
(3)孵育后，用包含1％BSA、5mM EDTA和6μg/mL替罗非班的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞2次，接种到载玻片上，进行荧光显微镜观察。
将使用抗SDC1抗体的癌细胞染色结果示于表11。需要说明的是，在上述表中，用源于各荧光标记抗体的荧光信号的强度(+至+++++的5级)表示染色结果，该信号的强度越大(+的数越多)越表示高表达(信号强度(表达量)：+＜++＜+++＜++++＜+++++)。结果是，SDC1蛋白(序列号3)不受癌症种类限制地在肺腺癌细胞、乳腺癌细胞、乳癌细胞、前列腺癌细胞、肝癌细胞、胰腺癌细胞中表达，可知可以广泛地检测试样中包含的肿瘤细胞。另外，该结果表明，SDC1蛋白可以不受癌症种类(肺癌、乳腺癌、乳癌、前列腺癌、肝癌、胰癌)限制地广泛地回收试样中包含的肿瘤细胞。进一步地，对于现有的肿瘤标志物EpCAM为低表达(+仅为1个，参照表9)的细胞株(PC-14、MDAMB231、PC-3)而言，SDC1也高表达(+为4个以上)，因此暗示了通过将SDC1和EpCAM组合可以高精度地检测及回收试样中包含的肿瘤细胞。
[表11]
实施例10使用抗SDC1抗体的癌细胞和白细胞的染色
实施例1中已经明确了：与健康人白细胞相比，SDC1基因在乳癌或乳腺癌细胞、及胰腺癌细胞中高表达，因此研究了SDC1能否用于血液试样中包含的乳癌细胞及胰腺癌细胞的特异性检测。
(1)将使用比重差分离法从健康人血液中除去红细胞而成的试样作为本实施例中使用的血液试样，向该试样中分别掺加人乳癌细胞(SKBR3)或人胰腺癌细胞(AsPC-1)。
(2)向掺加了癌细胞株的血液试样100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)10μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(3)封闭处理后，加入针对SDC1的抗体(PE-抗人SDC1抗体、Miltenyi Biotec)溶液10μL及用于检测白细胞的针对CD45的抗体(CD45-FITC、Biolegend)溶液10μL，在室温下孵育40分钟。
(4)孵育后，用包含1％BSA、5mM EDTA和6μg/mL替罗非班的HBSS(Hank’s平衡盐溶液)洗涤细胞2次，接种到载玻片上，进行荧光显微镜观察。
分别地，将人乳癌细胞SKBR3的染色结果示于图12，将人胰腺癌细胞AsPC-1的染色结果示于图13。图中，箭头所示的细胞为掺加的乳癌细胞及胰腺癌细胞。图12及图13的结果均为：被针对SDC1的抗体(抗SDC1抗体)染色的细胞(图12的(a)及图13的(a)中箭头所示的细胞)未被针对CD45的抗体染色(图12的(b)及图13的(b))。由该结果可知：SDC1(序列号3)可以作为将血液试样中包含的乳癌细胞及胰腺癌细胞与该试样中包含的白细胞相区分、并检测血液试样中包含的乳癌细胞及胰腺癌细胞的肿瘤标志物使用。
实施例11使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体、抗SDC1抗体及抗EpCAM抗体的癌细胞回收
实施例7中已经明确了：对于低表达现有的肿瘤标志物EpCAM蛋白的细胞株(PC-14、MDAMB231、PC-3)而言，TM4SF1蛋白(序列号1)及TNFRSF12A蛋白(序列号2)高表达，实施例9中已经明确了：对于低表达现有的肿瘤标志物EpCAM蛋白的细胞株(PC-14、MDAMB231、PC-3)而言，SDC1蛋白(序列号3)高表达，因此研究了使用分别识别TM4SF1蛋白、TNFRSF12A蛋白、SDC1蛋白及作为现有的肿瘤标志物的EpCAM蛋白的抗体能否回收试样中包含的癌细胞。需要说明的是，在本实施例中，作为癌细胞，使用了低表达EpCAM蛋白的人前列腺癌细胞株PC-3。另外，以下的步骤中使用的“缓冲液”为包含0.5％BSA和2mM EDTA的D-PBS(-)(杜尔贝科磷酸缓冲生理盐水，不含Mg2+和Ca2+)。
(1)向健康人血液1mL中掺加人前列腺癌细胞株(PC-3)100μL(100细胞)。
(2)向(1)的掺加样品中加入1×BD Pharm Lyse(BD)10mL，在室温下孵育10分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(3)向细胞悬浮液100μL中加入FcR封闭剂(Miltenyi Biotec)50μL，在室温下进行10分钟的封闭处理。
(4)封闭处理后，加入抗TM4SF1抗体50μL(PE-抗人TM4SF1抗体、R&D systems)、抗TNFRSF12A抗体2.5μL(PE-抗人TNFRSF12A抗体、Biolegend)、抗SDC1抗体5μL(PE-抗人SDC1抗体、Biolegend)及抗EpCAM抗体10μL(PE-抗人EpCAM抗体、Miltenyi Biotec)中的任意一种、或除抗EpCAM抗体之外的3种、或全部4种，在冷蔵下孵育10分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(5)向细胞悬浮液80μL中加入Anti-PE Microbeads UltraPure(MiltenyiBiotec)20μL，在冷蔵下孵育15分钟后，用缓冲液洗涤细胞，进行悬浮。
(6)将MS色谱柱(Miltenyi Biotec)设置于MACS Separator(Miltenyi Biotec)，用缓冲液洗涤。
(7)向(6)的色谱柱中添加细胞悬浮液500μL，用缓冲液500μL将色谱柱洗涤3次。
(8)将洗涤后的色谱柱从MACS Separator拆下后，向色谱柱添加缓冲液1mL，将柱塞压入色谱柱而回收细胞。
(9)将回收的细胞接种到载玻片上，在显微镜下进行细胞数的测定。
将使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体、抗SDC1抗体及抗EpCAM抗体中的任一者、以及使用除抗EpCAM抗体以外的3种或使用全部4种时的癌细胞回收结果示于表12。需要说明的是，上述表中，示出回收细胞数相对于掺加的细胞数的比例作为细胞回收率[％]。结果是：单独使用抗TM4SF1抗体、抗TNFRSF12A抗体或抗SDC1抗体时，显示出高于单独使用抗EpCAM抗体时的细胞回收率。另外，使用除抗EpCAM抗体以外的3种或全部4种时，与分别单独使用时相比，显示出更高的细胞回收率。进一步地，使用全部4种时，与使用除抗EpCAM抗体以外的3种时相比，显示出更高的细胞回收率。由该结果可知，TM4SF1蛋白、TNFRSF12A蛋白及SDC1蛋白可以从血液试样中高效率地回收用现有标志物EpCAM蛋白时回收率低的癌细胞。另外可知，通过将TM4SF1蛋白、TNFRSF12A蛋白及SDC1蛋白与EpCAM蛋白组合，可以更高效率地回收用EpCAM蛋白时回收率低的癌细胞。
[表12]
虽然详细地、另外参照特定的实施方式说明了本发明，但是可以在不脱离本发明的本质和范围的条件下加以各种变更、改进，这对于本领域技术人员而言是显而易见的。
需要说明的是，将2018年3月9日提出的日本专利申请2018-042710号、2018年6月1日提出的日本专利申请2018-105966号、及2018年10月12日提出的日本专利申请2018-193273号的说明书、序列表、权利要求书、附图及摘要的全部内容援引于此，并且作为本发明的说明书的公开而引入。
序列表
<110> 东曹株式会社(TOSOH corporation)
<120> 肿瘤标志物、以及将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来回收及检测的方法
<130> 217-0238WO
<150> JP2018-042710
<151> 2018-03-09
<150> JP2018-105966
<151> 2018-06-01
<150> JP2018-193273
<151> 2018-10-12
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 202
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NP_055035.1
<309> 2016-10-07
<313> (1)..(202)
<400> 1
Met Cys Tyr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Ile Gly His Ser Leu Val Gly
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Cys Ile Ala Ala Asn Ile Leu Leu Tyr Phe Pro Asn
20 25 30
Gly Glu Thr Lys Tyr Ala Ser Glu Asn His Leu Ser Arg Phe Val Trp
35 40 45
Phe Phe Ser Gly Ile Val Gly Gly Gly Leu Leu Met Leu Leu Pro Ala
50 55 60
Phe Val Phe Ile Gly Leu Glu Gln Asp Asp Cys Cys Gly Cys Cys Gly
65 70 75 80
His Glu Asn Cys Gly Lys Arg Cys Ala Met Leu Ser Ser Val Leu Ala
85 90 95
Ala Leu Ile Gly Ile Ala Gly Ser Gly Tyr Cys Val Ile Val Ala Ala
100 105 110
Leu Gly Leu Ala Glu Gly Pro Leu Cys Leu Asp Ser Leu Gly Gln Trp
115 120 125
Asn Tyr Thr Phe Ala Ser Thr Glu Gly Gln Tyr Leu Leu Asp Thr Ser
130 135 140
Thr Trp Ser Glu Cys Thr Glu Pro Lys His Ile Val Glu Trp Asn Val
145 150 155 160
Ser Leu Phe Ser Ile Leu Leu Ala Leu Gly Gly Ile Glu Phe Ile Leu
165 170 175
Cys Leu Ile Gln Val Ile Asn Gly Val Leu Gly Gly Ile Cys Gly Phe
180 185 190
Cys Cys Ser His Gln Gln Gln Tyr Asp Cys
195 200
<210> 2
<211> 129
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NP_057723.1
<309> 2016-09-09
<313> (1)..(129)
<400> 2
Met Ala Arg Gly Ser Leu Arg Arg Leu Leu Arg Leu Leu Val Leu Gly
1 5 10 15
Leu Trp Leu Ala Leu Leu Arg Ser Val Ala Gly Glu Gln Ala Pro Gly
20 25 30
Thr Ala Pro Cys Ser Arg Gly Ser Ser Trp Ser Ala Asp Leu Asp Lys
35 40 45
Cys Met Asp Cys Ala Ser Cys Arg Ala Arg Pro His Ser Asp Phe Cys
50 55 60
Leu Gly Cys Ala Ala Ala Pro Pro Ala Pro Phe Arg Leu Leu Trp Pro
65 70 75 80
Ile Leu Gly Gly Ala Leu Ser Leu Thr Phe Val Leu Gly Leu Leu Ser
85 90 95
Gly Phe Leu Val Trp Arg Arg Cys Arg Arg Arg Glu Lys Phe Thr Thr
100 105 110
Pro Ile Glu Glu Thr Gly Gly Glu Gly Cys Pro Ala Val Ala Leu Ile
115 120 125
Gln
<210> 3
<211> 310
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NP_002988.3
<309> 2016-09-09
<313> (1)..(310)
<400> 3
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1 5 10 15
Leu Gln Pro Ala Leu Pro Gln Ile Val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu
20 25 30
Asp Gln Asp Gly Ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe Ser Gly Ser Gly
35 40 45
Ala Gly Ala Leu Gln Asp Ile Thr Leu Ser Gln Gln Thr Pro Ser Thr
50 55 60
Trp Lys Asp Thr Gln Leu Leu Thr Ala Ile Pro Thr Ser Pro Glu Pro
65 70 75 80
Thr Gly Leu Glu Ala Thr Ala Ala Ser Thr Ser Thr Leu Pro Ala Gly
85 90 95
Glu Gly Pro Lys Glu Gly Glu Ala Val Val Leu Pro Glu Val Glu Pro
100 105 110
Gly Leu Thr Ala Arg Glu Gln Glu Ala Thr Pro Arg Pro Arg Glu Thr
115 120 125
Thr Gln Leu Pro Thr Thr His Gln Ala Ser Thr Thr Thr Ala Thr Thr
130 135 140
Ala Gln Glu Pro Ala Thr Ser His Pro His Arg Asp Met Gln Pro Gly
145 150 155 160
His His Glu Thr Ser Thr Pro Ala Gly Pro Ser Gln Ala Asp Leu His
165 170 175
Thr Pro His Thr Glu Asp Gly Gly Pro Ser Ala Thr Glu Arg Ala Ala
180 185 190
Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gln Leu Pro Ala Ala Glu Gly Ser Gly Glu
195 200 205
Gln Asp Phe Thr Phe Glu Thr Ser Gly Glu Asn Thr Ala Val Val Ala
210 215 220
Val Glu Pro Asp Arg Arg Asn Gln Ser Pro Val Asp Gln Gly Ala Thr
225 230 235 240
Gly Ala Ser Gln Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val
245 250 255
Ile Ala Gly Gly Leu Val Gly Leu Ile Phe Ala Val Cys Leu Val Gly
260 265 270
Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu
275 280 285
Glu Glu Pro Lys Gln Ala Asn Gly Gly Ala Tyr Gln Lys Pro Thr Lys
290 295 300
Gln Glu Glu Phe Tyr Ala
305 310
<210> 4
<211> 295
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NP_001984.1
<309> 2016-10-07
<313> (1)..(295)
<400> 4
Met Glu Thr Pro Ala Trp Pro Arg Val Pro Arg Pro Glu Thr Ala Val
1 5 10 15
Ala Arg Thr Leu Leu Leu Gly Trp Val Phe Ala Gln Val Ala Gly Ala
20 25 30
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser
35 40 45
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100 105 110
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115 120 125
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gln Pro Thr
130 135 140
Ile Gln Ser Phe Glu Gln Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu
145 150 155 160
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg
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Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu Ile Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser
180 185 190
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu
195 200 205
Ile Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gln Ala Val
210 215 220
Ile Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu
225 230 235 240
Cys Met Gly Gln Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu Ile Phe Tyr Ile Ile
245 250 255
Gly Ala Val Val Phe Val Val Ile Ile Leu Val Ile Ile Leu Ala Ile
260 265 270
Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gln Ser Trp Lys Glu
275 280 285
Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser
290 295
<210> 5
<211> 976
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NP_004422.2
<309> 2016-10-09
<313> (1)..(976)
<400> 5
Met Glu Leu Gln Ala Ala Arg Ala Cys Phe Ala Leu Leu Trp Gly Cys
1 5 10 15
Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gln Gly Lys Glu Val Val Leu Leu
20 25 30
Asp Phe Ala Ala Ala Gly Gly Glu Leu Gly Trp Leu Thr His Pro Tyr
35 40 45
Gly Lys Gly Trp Asp Leu Met Gln Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile
50 55 60
Tyr Met Tyr Ser Val Cys Asn Val Met Ser Gly Asp Gln Asp Asn Trp
65 70 75 80
Leu Arg Thr Asn Trp Val Tyr Arg Gly Glu Ala Glu Arg Ile Phe Ile
85 90 95
Glu Leu Lys Phe Thr Val Arg Asp Cys Asn Ser Phe Pro Gly Gly Ala
100 105 110
Ser Ser Cys Lys Glu Thr Phe Asn Leu Tyr Tyr Ala Glu Ser Asp Leu
115 120 125
Asp Tyr Gly Thr Asn Phe Gln Lys Arg Leu Phe Thr Lys Ile Asp Thr
130 135 140
Ile Ala Pro Asp Glu Ile Thr Val Ser Ser Asp Phe Glu Ala Arg His
145 150 155 160
Val Lys Leu Asn Val Glu Glu Arg Ser Val Gly Pro Leu Thr Arg Lys
165 170 175
Gly Phe Tyr Leu Ala Phe Gln Asp Ile Gly Ala Cys Val Ala Leu Leu
180 185 190
Ser Val Arg Val Tyr Tyr Lys Lys Cys Pro Glu Leu Leu Gln Gly Leu
195 200 205
Ala His Phe Pro Glu Thr Ile Ala Gly Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala
210 215 220
Thr Val Ala Gly Thr Cys Val Asp His Ala Val Val Pro Pro Gly Gly
225 230 235 240
Glu Glu Pro Arg Met His Cys Ala Val Asp Gly Glu Trp Leu Val Pro
245 250 255
Ile Gly Gln Cys Leu Cys Gln Ala Gly Tyr Glu Lys Val Glu Asp Ala
260 265 270
Cys Gln Ala Cys Ser Pro Gly Phe Phe Lys Phe Glu Ala Ser Glu Ser
275 280 285
Pro Cys Leu Glu Cys Pro Glu His Thr Leu Pro Ser Pro Glu Gly Ala
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485 490 495
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Ser Lys Ser Glu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Thr Tyr Val Asp Pro His
580 585 590
Thr Tyr Glu Asp Pro Asn Gln Ala Val Leu Lys Phe Thr Thr Glu Ile
595 600 605
His Pro Ser Cys Val Thr Arg Gln Lys Val Ile Gly Ala Gly Glu Phe
610 615 620
Gly Glu Val Tyr Lys Gly Met Leu Lys Thr Ser Ser Gly Lys Lys Glu
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Val Pro Val Ala Ile Lys Thr Leu Lys Ala Gly Tyr Thr Glu Lys Gln
645 650 655
Arg Val Asp Phe Leu Gly Glu Ala Gly Ile Met Gly Gln Phe Ser His
660 665 670
His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gly Val Ile Ser Lys Tyr Lys Pro Met
675 680 685
Met Ile Ile Thr Glu Tyr Met Glu Asn Gly Ala Leu Asp Lys Phe Leu
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Arg Glu Lys Asp Gly Glu Phe Ser Val Leu Gln Leu Val Gly Met Leu
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Arg Gly Ile Ala Ala Gly Met Lys Tyr Leu Ala Asn Met Asn Tyr Val
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His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Ile Leu Val Asn Ser Asn Leu Val
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Cys Lys Val Ser Asp Phe Gly Leu Ser Arg Val Leu Glu Asp Asp Pro
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770 775 780
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Trp Ser Phe Gly Ile Val Met Trp Glu Val Met Thr Tyr Gly Glu Arg
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Gly Phe Arg Leu Pro Thr Pro Met Asp Cys Pro Ser Ala Ile Tyr Gln
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Leu Met Met Gln Cys Trp Gln Gln Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lys Phe
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Ala Asp Ile Val Ser Ile Leu Asp Lys Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser
865 870 875 880
Leu Lys Thr Leu Ala Asp Phe Asp Pro Arg Val Ser Ile Arg Leu Pro
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<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
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<309> 2016-02-21
<313> (1)..(1181)
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450 455 460
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Leu Ser Asp Ile Asn Met Asp Gly Phe Asn Asp Val Ile Val Gly Ser
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Pro Leu Glu Asn Gln Asn Ser Gly Ala Val Tyr Ile Tyr Asn Gly His
580 585 590
Gln Gly Thr Ile Arg Thr Lys Tyr Ser Gln Lys Ile Leu Gly Ser Asp
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Gly Ala Phe Arg Ser His Leu Gln Tyr Phe Gly Arg Ser Leu Asp Gly
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Leu Trp Lys Leu Gly Phe Phe Lys Arg Lys Tyr Glu Lys Met Thr Lys
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<211> 1712
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
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<309> 2016-10-07
<313> (1)..(1712)
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aagggcggga cattccccct gcctcttcgc accacagcca gagcctgcca ttaggaccaa 60
tgaaagcaaa gtacctcatc ccctcagtga ctaagaatcg cagtatttaa gaggtagcag 120
gaatgggctg agagtggtgt ttgctttctc caccagaagg gcacactttc atctaatttg 180
gggtatcact gagctgaaga caaagagaag ggggagaaaa cctagcagac caccatgtgc 240
tatgggaagt gtgcacgatg catcggacat tctctggtgg ggctcgccct cctgtgcatc 300
gcggctaata ttttgcttta ctttcccaat ggggaaacaa agtatgcctc cgaaaaccac 360
ctcagccgct tcgtgtggtt cttttctggc atcgtaggag gtggcctgct gatgctcctg 420
ccagcatttg tcttcattgg gctggaacag gatgactgct gtggctgctg tggccatgaa 480
aactgtggca aacgatgtgc gatgctttct tctgtattgg ctgctctcat tggaattgca 540
ggatctggct actgtgtcat tgtggcagcc cttggcttag cagaaggacc actatgtctt 600
gattccctcg gccagtggaa ctacaccttt gccagcactg agggccagta ccttctggat 660
acctccacat ggtccgagtg cactgaaccc aagcacattg tggaatggaa tgtatctctg 720
ttttctatcc tcttggctct tggtggaatt gaattcatct tgtgtcttat tcaagtaata 780
aatggagtgc ttggaggcat atgtggcttt tgctgctctc accaacagca atatgactgc 840
taaaagaacc aacccaggac agagccacaa tcttcctcta tttcattgta atttatatat 900
ttcacttgta ttcatttgta aaactttgta ttagtgtaac atactcccca cagtctactt 960
ttacaaacgc ctgtaaagac tggcatcttc acaggatgtc agtgtttaaa tttagtaaac 1020
ttcttttttg tttgtttatt tgtttttgtt tttttttaag gaatgaggaa acaaaccacc 1080
ctctgggggt aatttacaga ctgagtgaca gtactcagta tatctgagat aaactctata 1140
atgttttgga taaaaataac attccaatca ctattgtata tatgtgcatg tattttttaa 1200
attaaagatg tctagttgct ttttataaga ccaagaagga gaaaatccga caacctggaa 1260
agatttttgt tttcactgct tgtatgatgt ttcccattca tacacctata aatctctaac 1320
aagaggccct ttgaactgcc ttgtgttctg tgagaaacaa atatttactt agagtggaag 1380
gactgattga gaatgttcca atccaaatga atgcatcaca acttacaatg ctgctcattg 1440
ttgtgagtac tatgagattc aaatttttct aacatatgga aagccttttg tcctccaaag 1500
atgagtacta gggatcatgt gtttaaaaaa agaaaggcta cgatgactgg gcaagaagaa 1560
agatgggaaa ctgaataaag cagttgatca gcatcattgg aacatgggga cgagtgacgg 1620
caggaggacc acgaggaaat accctcaaaa ctaacttgtt tacaacaaaa taaagtattc 1680
actaccatgt taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 1712
<210> 8
<211> 1048
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NM_016639.2
<309> 2016-09-09
<313> (1)..(1048)
<400> 8
aaggcggggg cgggggcggg gcggcggccg tgggtccctg ccggccggcg gcgggcgcag 60
acagcggcgg gcgcaggacg tgcactatgg ctcggggctc gctgcgccgg ttgctgcggc 120
tcctcgtgct ggggctctgg ctggcgttgc tgcgctccgt ggccggggag caagcgccag 180
gcaccgcccc ctgctcccgc ggcagctcct ggagcgcgga cctggacaag tgcatggact 240
gcgcgtcttg cagggcgcga ccgcacagcg acttctgcct gggctgcgct gcagcacctc 300
ctgccccctt ccggctgctt tggcccatcc ttgggggcgc tctgagcctg accttcgtgc 360
tggggctgct ttctggcttt ttggtctgga gacgatgccg caggagagag aagttcacca 420
cccccataga ggagaccggc ggagagggct gcccagctgt ggcgctgatc cagtgacaat 480
gtgccccctg ccagccgggg ctcgcccact catcattcat tcatccattc tagagccagt 540
ctctgcctcc cagacgcggc gggagccaag ctcctccaac cacaaggggg gtggggggcg 600
gtgaatcacc tctgaggcct gggcccaggg ttcaggggaa ccttccaagg tgtctggttg 660
ccctgcctct ggctccagaa cagaaaggga gcctcacgct ggctcacaca aaacagctga 720
cactgactaa ggaactgcag catttgcaca ggggaggggg gtgccctcct tcctagaggc 780
cctgggggcc aggctgactt ggggggcaga cttgacacta ggccccactc actcagatgt 840
cctgaaattc caccacgggg gtcaccctgg ggggttaggg acctattttt aacactaggg 900
ggctggccca ctaggagggc tggccctaag atacagaccc ccccaactcc ccaaagcggg 960
gaggagatat ttattttggg gagagtttgg aggggaggga gaatttatta ataaaagaat 1020
ctttaacttt aaaaaaaaaa aaaaaaaa 1048
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<211> 3309
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NM_001006946.1
<309> 2016-09-09
<313> (1)..(3309)
<400> 9
ttcagcccct ctcccgggct gcgcctccgc actccgggcc cgggcagaag ggggtgcgcc 60
tcggccccac cacccaggga gcagccgagc tgaaaggccg ggaaccgcgg cttgcgggga 120
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cggcgggaga ggtgcgggcc gaatccgagc cgagcggaga ggaatccggc agtagagagc 240
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ctgccgctct cccgccgccg gtccgggcag catgaggcgc gcggcgctct ggctctggct 420
gtgcgcgctg gcgctgagcc tgcagccggc cctgccgcaa attgtggcta ctaatttgcc 480
ccctgaagat caagatggct ctggggatga ctctgacaac ttctccggct caggtgcagg 540
tgctttgcaa gatatcacct tgtcacagca gaccccctcc acttggaagg acacgcagct 600
cctgacggct attcccacgt ctccagaacc caccggcctg gaggctacag ctgcctccac 660
ctccaccctg ccggctggag aggggcccaa ggagggagag gctgtagtcc tgccagaagt 720
ggagcctggc ctcaccgccc gggagcagga ggccaccccc cgacccaggg agaccacaca 780
gctcccgacc actcatcagg cctcaacgac cacagccacc acggcccagg agcccgccac 840
ctcccacccc cacagggaca tgcagcctgg ccaccatgag acctcaaccc ctgcaggacc 900
cagccaagct gaccttcaca ctccccacac agaggatgga ggtccttctg ccaccgagag 960
ggctgctgag gatggagcct ccagtcagct cccagcagca gagggctctg gggagcagga 1020
cttcaccttt gaaacctcgg gggagaatac ggctgtagtg gccgtggagc ctgaccgccg 1080
gaaccagtcc ccagtggatc agggggccac gggggcctca cagggcctcc tggacaggaa 1140
agaggtgctg ggaggggtca ttgccggagg cctcgtgggg ctcatctttg ctgtgtgcct 1200
ggtgggtttc atgctgtacc gcatgaagaa gaaggacgaa ggcagctact ccttggagga 1260
gccgaaacaa gccaacggcg gggcctacca gaagcccacc aaacaggagg aattctatgc 1320
ctgacgcggg agccatgcgc cccctccgcc ctgccactca ctaggccccc acttgcctct 1380
tccttgaaga actgcaggcc ctggcctccc ctgccaccag gccacctccc cagcattcca 1440
gcccctctgg tcgctcctgc ccacggagtc gtggggtgtg ctgggagctc cactctgctt 1500
ctctgacttc tgcctggaga cttagggcac caggggtttc tcgcatagga cctttccacc 1560
acagccagca cctggcatcg caccattctg actcggtttc tccaaactga agcagcctct 1620
ccccaggtcc agctctggag gggaggggga tccgactgct ttggacctaa atggcctcat 1680
gtggctggaa gatcctgcgg gtggggcttg gggctcacac acctgtagca cttactggta 1740
ggaccaagca tcttgggggg gtggccgctg agtggcaggg gacaggagtc cactttgttt 1800
cgtggggagg tctaatctag atatcgactt gtttttgcac atgtttcctc tagttctttg 1860
ttcatagccc agtagacctt gttacttctg aggtaagtta agtaagttga ttcggtatcc 1920
ccccatcttg cttccctaat ctatggtcgg gagacagcat cagggttaag aagacttttt 1980
tttttttttt ttaaactagg agaaccaaat ctggaagcca aaatgtaggc ttagtttgtg 2040
tgttgtctct tgagtttgtc gctcatgtgt gcaacagggt atggactatc tgtctggtgg 2100
ccccgtttct ggtggtctgt tggcaggctg gccagtccag gctgccgtgg ggccgccgcc 2160
tctttcaagc agtcgtgcct gtgtccatgc gctcagggcc atgctgaggc ctgggccgct 2220
gccacgttgg agaagcccgt gtgagaagtg aatgctggga ctcagccttc agacagagag 2280
gactgtaggg agggcggcag gggcctggag atcctcctgc agaccacgcc cgtcctgcct 2340
gtggcgccgt ctccaggggc tgcttcctcc tggaaattga cgaggggtgt cttgggcaga 2400
gctggctctg agcgcctcca tccaaggcca ggttctccgt tagctcctgt ggccccaccc 2460
tgggccctgg gctggaatca ggaatatttt ccaaagagtg atagtctttt gcttttggca 2520
aaactctact taatccaatg ggtttttccc tgtacagtag attttccaaa tgtaataaac 2580
tttaatataa agtagtcctg tgaatgccac tgccttcgct tcttgcctct gtgctgtgtg 2640
tgacgtgacc ggacttttct gcaaacacca acatgttggg aaacttggct cgaatctctg 2700
tgccttcgtc tttcccatgg ggagggattc tggttccagg gtccctctgt gtatttgctt 2760
ttttgttttg gctgaaattc tcctggaggt cggtaggttc agccaaggtt ttataaggct 2820
gatgtcaatt tctgtgttgc caagctccaa gccccatctt ctaaatggca aaggaaggtg 2880
gatggcccca gcacagcttg acctgaggct gtggtcacag cggaggtgtg gagccgaggc 2940
ctaccccgca gacaccttgg acatcctcct cccacccggc tgcagaggcc agaggccccc 3000
agcccagggc tcctgcactt acttgcttat ttgacaacgt ttcagcgact ccgttggcca 3060
ctccgagagg tgggccagtc tgtggatcag agatgcacca ccaagccaag ggaacctgtg 3120
tccggtattc gatactgcga ctttctgcct ggagtgtatg actgcacatg actcgggggt 3180
ggggaaaggg gtcggctgac catgctcatc tgctggtccg tgggacggtg cccaagccag 3240
aggctgggtt catttgtgta acgacaataa acggtacttg tcatttcggg caaaaaaaaa 3300
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<210> 10
<211> 2393
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NM_001993.4
<309> 2016-10-07
<313> (1)..(2393)
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ggagtcggga ggagcggcgg gggcgggcgc cgggggcggg cagaggcgcg ggagagcgcg 60
ccgccggccc tttatagcgc gcggggcacc ggctccccaa gactgcgagc tccccgcacc 120
ccctcgcact ccctctggcc ggcccagggc gccttcagcc caacctcccc agccccacgg 180
gcgccacgga acccgctcga tctcgccgcc aactggtaga catggagacc cctgcctggc 240
cccgggtccc gcgccccgag accgccgtcg ctcggacgct cctgctcggc tgggtcttcg 300
cccaggtggc cggcgcttca ggcactacaa atactgtggc agcatataat ttaacttgga 360
aatcaactaa tttcaagaca attttggagt gggaacccaa acccgtcaat caagtctaca 420
ctgttcaaat aagcactaag tcaggagatt ggaaaagcaa atgcttttac acaacagaca 480
cagagtgtga cctcaccgac gagattgtga aggatgtgaa gcagacgtac ttggcacggg 540
tcttctccta cccggcaggg aatgtggaga gcaccggttc tgctggggag cctctgtatg 600
agaactcccc agagttcaca ccttacctgg agacaaacct cggacagcca acaattcaga 660
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gaaggaacaa cactttccta agcctccggg atgtttttgg caaggactta atttatacac 780
tttattattg gaaatcttca agttcaggaa agaaaacagc caaaacaaac actaatgagt 840
ttttgattga tgtggataaa ggagaaaact actgtttcag tgttcaagca gtgattccct 900
cccgaacagt taaccggaag agtacagaca gcccggtaga gtgtatgggc caggagaaag 960
gggaattcag agaaatattc tacatcattg gagctgtggt atttgtggtc atcatccttg 1020
tcatcatcct ggctatatct ctacacaagt gtagaaaggc aggagtgggg cagagctgga 1080
aggagaactc cccactgaat gtttcataaa ggaagcactg ttggagctac tgcaaatgct 1140
atattgcact gtgaccgaga acttttaaga ggatagaata catggaaacg caaatgagta 1200
tttcggagca tgaagaccct ggagttcaaa aaactcttga tatgacctgt tattaccatt 1260
agcattctgg ttttgacatc agcattagtc actttgaaat gtaacgaatg gtactacaac 1320
caattccaag ttttaatttt taacaccatg gcaccttttg cacataacat gctttagatt 1380
atatattccg cactcaagga gtaaccaggt cgtccaagca aaaacaaatg ggaaaatgtc 1440
ttaaaaaatc ctgggtggac ttttgaaaag cttttttttt tttttttttt tttttgagac 1500
ggagtcttgc tctgttgccc aggctggagt gcagtagcac gatctcggct cactgcaccc 1560
tccgtctctc gggttcaagc aattgtctgc ctcagcctcc cgagtagctg ggattacagg 1620
tgcgcactac cacgccaagc taatttttgt attttttagt agagatgggg tttcaccatc 1680
ttggccaggc tggtcttgaa ttcctgacct caggtgatcc acccaccttg gcctcccaaa 1740
gtgctagtat tatgggcgtg aaccaccatg cccagccgaa aagcttttga ggggctgact 1800
tcaatccatg taggaaagta aaatggaagg aaattgggtg catttctagg acttttctaa 1860
catatgtcta taatatagtg tttaggttct tttttttttc aggaatacat ttggaaattc 1920
aaaacaattg gcaaactttg tattaatgtg ttaagtgcag gagacattgg tattctgggc 1980
accttcctaa tatgctttac aatctgcact ttaactgact taagtggcat taaacatttg 2040
agagctaact atatttttat aagactacta tacaaactac agagtttatg atttaaggta 2100
cttaaagctt ctatggttga cattgtatat ataatttttt aaaaaggttt tctatatggg 2160
gattttctat ttatgtaggt aatattgttc tatttgtata tattgagata atttatttaa 2220
tatactttaa ataaaggtga ctgggaattg ttactgttgt acttattcta tcttccattt 2280
attatttatg tacaatttgg tgtttgtatt agctctacta cagtaaatga ctgtaaaatt 2340
gtcagtggct tacaacaacg tatctttttc gcttataata cattttggtg act 2393
<210> 11
<211> 3970
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NM_004431.3
<309> 2015-03-15
<313> (1)..(3970)
<400> 11
ggttctcacc caacttccat taaggactcg gggcaggagg ggcagaagtt gcgcgcaggc 60
cggcgggcgg gagcggacac cgaggccggc gtgcaggcgt gcgggtgtgc gggagccggg 120
ctcgggggga tcggaccgag agcgagaagc gcggcatgga gctccaggca gcccgcgcct 180
gcttcgccct gctgtggggc tgtgcgctgg ccgcggccgc ggcggcgcag ggcaaggaag 240
tggtactgct ggactttgct gcagctggag gggagctcgg ctggctcaca cacccgtatg 300
gcaaagggtg ggacctgatg cagaacatca tgaatgacat gccgatctac atgtactccg 360
tgtgcaacgt gatgtctggc gaccaggaca actggctccg caccaactgg gtgtaccgag 420
gagaggctga gcgtatcttc attgagctca agtttactgt acgtgactgc aacagcttcc 480
ctggtggcgc cagctcctgc aaggagactt tcaacctcta ctatgccgag tcggacctgg 540
actacggcac caacttccag aagcgcctgt tcaccaagat tgacaccatt gcgcccgatg 600
agatcaccgt cagcagcgac ttcgaggcac gccacgtgaa gctgaacgtg gaggagcgct 660
ccgtggggcc gctcacccgc aaaggcttct acctggcctt ccaggatatc ggtgcctgtg 720
tggcgctgct ctccgtccgt gtctactaca agaagtgccc cgagctgctg cagggcctgg 780
cccacttccc tgagaccatc gccggctctg atgcaccttc cctggccact gtggccggca 840
cctgtgtgga ccatgccgtg gtgccaccgg ggggtgaaga gccccgtatg cactgtgcag 900
tggatggcga gtggctggtg cccattgggc agtgcctgtg ccaggcaggc tacgagaagg 960
tggaggatgc ctgccaggcc tgctcgcctg gattttttaa gtttgaggca tctgagagcc 1020
cctgcttgga gtgccctgag cacacgctgc catcccctga gggtgccacc tcctgcgagt 1080
gtgaggaagg cttcttccgg gcacctcagg acccagcgtc gatgccttgc acacgacccc 1140
cctccgcccc acactacctc acagccgtgg gcatgggtgc caaggtggag ctgcgctgga 1200
cgccccctca ggacagcggg ggccgcgagg acattgtcta cagcgtcacc tgcgaacagt 1260
gctggcccga gtctggggaa tgcgggccgt gtgaggccag tgtgcgctac tcggagcctc 1320
ctcacggact gacccgcacc agtgtgacag tgagcgacct ggagccccac atgaactaca 1380
ccttcaccgt ggaggcccgc aatggcgtct caggcctggt aaccagccgc agcttccgta 1440
ctgccagtgt cagcatcaac cagacagagc cccccaaggt gaggctggag ggccgcagca 1500
ccacctcgct tagcgtctcc tggagcatcc ccccgccgca gcagagccga gtgtggaagt 1560
acgaggtcac ttaccgcaag aagggagact ccaacagcta caatgtgcgc cgcaccgagg 1620
gtttctccgt gaccctggac gacctggccc cagacaccac ctacctggtc caggtgcagg 1680
cactgacgca ggagggccag ggggccggca gcaaggtgca cgaattccag acgctgtccc 1740
cggagggatc tggcaacttg gcggtgattg gcggcgtggc tgtcggtgtg gtcctgcttc 1800
tggtgctggc aggagttggc ttctttatcc accgcaggag gaagaaccag cgtgcccgcc 1860
agtccccgga ggacgtttac ttctccaagt cagaacaact gaagcccctg aagacatacg 1920
tggaccccca cacatatgag gaccccaacc aggctgtgtt gaagttcact accgagatcc 1980
atccatcctg tgtcactcgg cagaaggtga tcggagcagg agagtttggg gaggtgtaca 2040
agggcatgct gaagacatcc tcggggaaga aggaggtgcc ggtggccatc aagacgctga 2100
aagccggcta cacagagaag cagcgagtgg acttcctcgg cgaggccggc atcatgggcc 2160
agttcagcca ccacaacatc atccgcctag agggcgtcat ctccaaatac aagcccatga 2220
tgatcatcac tgagtacatg gagaatgggg ccctggacaa gttccttcgg gagaaggatg 2280
gcgagttcag cgtgctgcag ctggtgggca tgctgcgggg catcgcagct ggcatgaagt 2340
acctggccaa catgaactat gtgcaccgtg acctggctgc ccgcaacatc ctcgtcaaca 2400
gcaacctggt ctgcaaggtg tctgactttg gcctgtcccg cgtgctggag gacgaccccg 2460
aggccaccta caccaccagt ggcggcaaga tccccatccg ctggaccgcc ccggaggcca 2520
tttcctaccg gaagttcacc tctgccagcg acgtgtggag ctttggcatt gtcatgtggg 2580
aggtgatgac ctatggcgag cggccctact gggagttgtc caaccacgag gtgatgaaag 2640
ccatcaatga tggcttccgg ctccccacac ccatggactg cccctccgcc atctaccagc 2700
tcatgatgca gtgctggcag caggagcgtg cccgccgccc caagttcgct gacatcgtca 2760
gcatcctgga caagctcatt cgtgcccctg actccctcaa gaccctggct gactttgacc 2820
cccgcgtgtc tatccggctc cccagcacga gcggctcgga gggggtgccc ttccgcacgg 2880
tgtccgagtg gctggagtcc atcaagatgc agcagtatac ggagcacttc atggcggccg 2940
gctacactgc catcgagaag gtggtgcaga tgaccaacga cgacatcaag aggattgggg 3000
tgcggctgcc cggccaccag aagcgcatcg cctacagcct gctgggactc aaggaccagg 3060
tgaacactgt ggggatcccc atctgagcct cgacagggcc tggagcccca tcggccaaga 3120
atacttgaag aaacagagtg gcctccctgc tgtgccatgc tgggccactg gggactttat 3180
ttatttctag ttctttcctc cccctgcaac ttccgctgag gggtctcgga tgacaccctg 3240
gcctgaactg aggagatgac cagggatgct gggctgggcc ctctttccct gcgagacgca 3300
cacagctgag cacttagcag gcaccgccac gtcccagcat ccctggagca ggagccccgc 3360
cacagccttc ggacagacat atgggatatt cccaagccga ccttccctcc gccttctccc 3420
acatgaggcc atctcaggag atggagggct tggcccagcg ccaagtaaac agggtacctc 3480
aagccccatt tcctcacact aagagggcag actgtgaact tgactgggtg agacccaaag 3540
cggtccctgt ccctctagtg ccttctttag accctcgggc cccatcctca tccctgactg 3600
gccaaaccct tgctttcctg ggcctttgca agatgcttgg ttgtgttgag gtttttaaat 3660
atatattttg tactttgtgg agagaatgtg tgtgtgtggc agggggcccc gccagggctg 3720
gggacagagg gtgtcaaaca ttcgtgagct ggggactcag ggaccggtgc tgcaggagtg 3780
tcctgcccat gccccagtcg gccccatctc tcatcctttt ggataagttt ctattctgtc 3840
agtgttaaag attttgtttt gttggacatt tttttcgaat cttaatttat tatttttttt 3900
atatttattg ttagaaaatg acttatttct gctctggaat aaagttgcag atgattcaaa 3960
ccgaaaaaaa 3970
<210> 12
<211> 7878
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<300>
<308> GenBank/NM_002203.3
<309> 2016-02-21
<313> (1)..(7878)
<400> 12
ttttccctgc tctcaccggg cgggggagag aagccctctg gacagcttct agagtgtgca 60
ggttctcgta tccctcggcc aagggtatcc tctgcaaacc tctgcaaacc cagcgcaact 120
acggtccccc ggtcagaccc aggatggggc cagaacggac aggggccgcg ccgctgccgc 180
tgctgctggt gttagcgctc agtcaaggca ttttaaattg ttgtttggcc tacaatgttg 240
gtctcccaga agcaaaaata ttttccggtc cttcaagtga acagtttggc tatgcagtgc 300
agcagtttat aaatccaaaa ggcaactggt tactggttgg ttcaccctgg agtggctttc 360
ctgagaaccg aatgggagat gtgtataaat gtcctgttga cctatccact gccacatgtg 420
aaaaactaaa tttgcaaact tcaacaagca ttccaaatgt tactgagatg aaaaccaaca 480
tgagcctcgg cttgatcctc accaggaaca tgggaactgg aggttttctc acatgtggtc 540
ctctgtgggc acagcaatgt gggaatcagt attacacaac gggtgtgtgt tctgacatca 600
gtcctgattt tcagctctca gccagcttct cacctgcaac tcagccctgc ccttccctca 660
tagatgttgt ggttgtgtgt gatgaatcaa atagtattta tccttgggat gcagtaaaga 720
attttttgga aaaatttgta caaggcctgg atataggccc cacaaagaca caggtggggt 780
taattcagta tgccaataat ccaagagttg tgtttaactt gaacacatat aaaaccaaag 840
aagaaatgat tgtagcaaca tcccagacat cccaatatgg tggggacctc acaaacacat 900
tcggagcaat tcaatatgca agaaaatatg cttattcagc agcttctggt gggcgacgaa 960
gtgctacgaa agtaatggta gttgtaactg acggtgaatc acatgatggt tcaatgttga 1020
aagctgtgat tgatcaatgc aaccatgaca atatactgag gtttggcata gcagttcttg 1080
ggtacttaaa cagaaacgcc cttgatacta aaaatttaat aaaagaaata aaagcaatcg 1140
ctagtattcc aacagaaaga tactttttca atgtgtctga tgaagcagct ctactagaaa 1200
aggctgggac attaggagaa caaattttca gcattgaagg tactgttcaa ggaggagaca 1260
actttcagat ggaaatgtca caagtgggat tcagtgcaga ttactcttct caaaatgata 1320
ttctgatgct gggtgcagtg ggagcttttg gctggagtgg gaccattgtc cagaagacat 1380
ctcatggcca tttgatcttt cctaaacaag cctttgacca aattctgcag gacagaaatc 1440
acagttcata tttaggttac tctgtggctg caatttctac tggagaaagc actcactttg 1500
ttgctggtgc tcctcgggca aattataccg gccagatagt gctatatagt gtgaatgaga 1560
atggcaatat cacggttatt caggctcacc gaggtgacca gattggctcc tattttggta 1620
gtgtgctgtg ttcagttgat gtggataaag acaccattac agacgtgctc ttggtaggtg 1680
caccaatgta catgagtgac ctaaagaaag aggaaggaag agtctacctg tttactatca 1740
aagagggcat tttgggtcag caccaatttc ttgaaggccc cgagggcatt gaaaacactc 1800
gatttggttc agcaattgca gctctttcag acatcaacat ggatggcttt aatgatgtga 1860
ttgttggttc accactagaa aatcagaatt ctggagctgt atacatttac aatggtcatc 1920
agggcactat ccgcacaaag tattcccaga aaatcttggg atccgatgga gcctttagga 1980
gccatctcca gtactttggg aggtccttgg atggctatgg agatttaaat ggggattcca 2040
tcaccgatgt gtctattggt gcctttggac aagtggttca actctggtca caaagtattg 2100
ctgatgtagc tatagaagct tcattcacac cagaaaaaat cactttggtc aacaagaatg 2160
ctcagataat tctcaaactc tgcttcagtg caaagttcag acctactaag caaaacaatc 2220
aagtggccat tgtatataac atcacacttg atgcagatgg attttcatcc agagtaacct 2280
ccagggggtt atttaaagaa aacaatgaaa ggtgcctgca gaagaatatg gtagtaaatc 2340
aagcacagag ttgccccgag cacatcattt atatacagga gccctctgat gttgtcaact 2400
ctttggattt gcgtgtggac atcagtctgg aaaaccctgg cactagccct gcccttgaag 2460
cctattctga gactgccaag gtcttcagta ttcctttcca caaagactgt ggtgaggacg 2520
gactttgcat ttctgatcta gtcctagatg tccgacaaat accagctgct caagaacaac 2580
cctttattgt cagcaaccaa aacaaaaggt taacattttc agtaacgctg aaaaataaaa 2640
gggaaagtgc atacaacact ggaattgttg ttgatttttc agaaaacttg ttttttgcat 2700
cattctccct gccggttgat gggacagaag taacatgcca ggtggctgca tctcagaagt 2760
ctgttgcctg cgatgtaggc taccctgctt taaagagaga acaacaggtg acttttacta 2820
ttaactttga cttcaatctt caaaaccttc agaatcaggc gtctctcagt ttccaagcct 2880
taagtgaaag ccaagaagaa aacaaggctg ataatttggt caacctcaaa attcctctcc 2940
tgtatgatgc tgaaattcac ttaacaagat ctaccaacat aaatttttat gaaatctctt 3000
cggatgggaa tgttccttca atcgtgcaca gttttgaaga tgttggtcca aaattcatct 3060
tctccctgaa ggtaacaaca ggaagtgttc cagtaagcat ggcaactgta atcatccaca 3120
tccctcagta taccaaagaa aagaacccac tgatgtacct aactggggtg caaacagaca 3180
aggctggtga catcagttgt aatgcagata tcaatccact gaaaatagga caaacatctt 3240
cttctgtatc tttcaaaagt gaaaatttca ggcacaccaa agaattgaac tgcagaactg 3300
cttcctgtag taatgttacc tgctggttga aagacgttca catgaaagga gaatactttg 3360
ttaatgtgac taccagaatt tggaacggga ctttcgcatc atcaacgttc cagacagtac 3420
agctaacggc agctgcagaa atcaacacct ataaccctga gatatatgtg attgaagata 3480
acactgttac gattcccctg atgataatga aacctgatga gaaagccgaa gtaccaacag 3540
gagttataat aggaagtata attgctggaa tccttttgct gttagctctg gttgcaattt 3600
tatggaagct cggcttcttc aaaagaaaat atgaaaagat gaccaaaaat ccagatgaga 3660
ttgatgagac cacagagctc agtagctgaa ccagcagacc tacctgcagt gggaaccggc 3720
agcatcccag ccagggtttg ctgtttgcgt gaatggattt ctttttaaat cccatatttt 3780
ttttatcatg tcgtaggtaa actaacctgg tattttaaga gaaaactgca ggtcagtttg 3840
gaatgaagaa attgtggggg gtgggggagg tgcggggggc aggtagggaa ataataggga 3900
aaatacctat tttatatgat gggggaaaaa aagtaatctt taaactggct ggcccagagt 3960
ttacattcta atttgcattg tgtcagaaac atgaaatgct tccaagcatg acaactttta 4020
aagaaaaata tgatactctc agattttaag ggggaaaact gttctcttta aaatatttgt 4080
ctttaaacag caactacaga agtggaagtg cttgatatgt aagtacttcc acttgtgtat 4140
attttaatga atattgatgt taacaagagg ggaaaacaaa acacaggttt tttcaattta 4200
tgctgctcat ccaaagttgc cacagatgat acttccaagt gataatttta tttataaact 4260
aggtaaaatt tgttgttggt tccttttaga ccacggctgc cccttccaca ccccatcttg 4320
ctctaatgat caaaacatgc ttgaataact gagcttagag tatacctcct atatgtccat 4380
ttaagttagg agagggggcg atatagagaa taaggcacaa aattttgttt aaaactcaga 4440
atataacatg taaaatccca tctgctagaa gcccatcctg tgccagagga aggaaaagga 4500
ggaaatttcc tttctctttt aggaggcaca acagttctct tctaggattt gtttggctga 4560
ctggcagtaa cctagtgaat ttctgaaaga tgagtaattt ctttggcaac cttcctcctc 4620
ccttactgaa ccactctccc acctcctggt ggtaccatta ttatagaagc cctctacagc 4680
ctgactttct ctccagcggt ccaaagttat cccctccttt acccctcatc caaagttccc 4740
actccttcag gacagctgct gtgcattaga tattaggggg gaaagtcatc tgtttaattt 4800
acacacttgc atgaattact gtatataaac tccttaactt cagggagcta ttttcattta 4860
gtgctaaaca agtaagaaaa ataagctcga gtgaatttct aaatgttgga atgttatggg 4920
atgtaaacaa tgtaaagtaa gacatctcag gatttcacca gaagttacag atgaggcact 4980
ggaagccacc aaattagcag gtgcaccttc tgtggctgtc ttgtttctga agtacttaaa 5040
cttccacaag agtgaatttg acctaggcaa gtttgttcaa aaggtagatc ctgagatgat 5100
ttggtcagat tgggataagg cccagcaatc tgcattttaa caagcacccc agtcactagg 5160
atgcagatgg accacacttt gagaaacacc acccatttct actttttgca ccttattttc 5220
tctgttcctg agcccccaca ttctctagga gaaacttaga ggaaaagggc acagacacta 5280
catatctaaa gctttggaca agtccttgac ctctataaac ttcagagtcc tcattataaa 5340
atgggaagac tgagctggag ttcagcagtg atgcttttag ttttaaaagt ctatgatctg 5400
gacttcctat aatacaaata cacaatcctc caagaatttg acttggaaaa aaatgtcaaa 5460
ggaaaacagg ttatctgccc atgtgcatat ggacaacctt gactaccctg gcctggcccg 5520
tggtggcagt ccagggctat ctgtactgtt tacagaatta ctttgtagtt gacaacacaa 5580
aacaaacaaa aaaggcataa aatgccagcg gtttatagaa aaaacagcat ggtattctcc 5640
agttaggtat gccagagtcc aattctttta acagctgtga gaatttgctg cttcattcca 5700
acaaaatttt atttaaaaaa aaaaaaaaaa gactggagaa actagtcatt agcttgataa 5760
agaatattta acagctagtg gtgctggtgt gtacctgaag ctccagctac ttgagagact 5820
gagacaggaa gatcgcttga gcccaggagt tcaagtccag cctaagcaac atagcaagac 5880
cctgtctcaa aaaaatgact atttaaaaag acaatgtggc caggcacggt ggctcacacc 5940
tgtaatccca acactttggg aggctgaggc cggtggatca cgaggtcagg agtttgagac 6000
tagcctggcc aacatggtga aaccccatct ctaataatat aaaaattagc tgggcgtagt 6060
agcaggtgcc tgtaatccca gttactcggg aagctgaggc aggagaatca cttgaacccg 6120
ggaggcagag gtttcagtga gccgagatcg cgccactgca ctccagcctg ggtgacaggg 6180
caagactctg tctcaaacaa acaaacaaaa aaaaagttag tactgtatat gtaaatacta 6240
gcttttcaat gtgctataca aacaattata gcacatcctt ccttttactc tgtctcacct 6300
cctttaggtg agtacttcct taaataagtg ctaaacatac atatacggaa cttgaaagct 6360
ttggttagcc ttgccttagg taatcagcct agtttacact gtttccaggg agtagttgaa 6420
ttactataaa ccattagcca cttgtctctg caccatttat cacaccagga cagggtctct 6480
caacctgggc gctactgtca tttggggcca ggtgattctt ccttgcaggg gctgtcctgt 6540
accttgtagg acagcagccc tgtcctagaa ggtatgttta gcagcattcc tggcctctag 6600
ctacccgatg ccagagcatg ctccccccgc agtcatgaca atcaaaaaat gtctccagac 6660
attgtcaaat gcctcctggg gggcagtatt tctcaagcac ttttaagcaa aggtaagtat 6720
tcatacaaga aatttagggg gaaaaaacat tgtttaaata aaagctatgt gttcctattc 6780
aacaatattt ttgctttaaa agtaagtaga gggcataaaa gatgtcatat tcaaatttcc 6840
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ttgtgcatga ctcatttcag cagcaaaata agaactccta actgaacaga aatttttcta 7020
cctagcaatg ttattcttgt aaaatagtta cctattaaaa ctgtgaagag taaaactaaa 7080
gccaatttat tatagtcaca caagtgatta tactaaaaat tattataaag gttataattt 7140
tataatgtat ttacctgtcc tgatatatag ctataaccca atatatgaaa atctcaaaaa 7200
ttaagacatc atcatacaga aggcaggatt ccttaaactg agatccctga tccatcttta 7260
atatttcaat ttgcacacat aaaacaatgc ccttttgtgt acattcaggc atacccattt 7320
taatcaattt gaaaggttaa tttaaacctc tagaggtgaa tgagaaacat gggggaaaag 7380
tatgaaatag gtgaaaatct taactatttc tttgaactct aaagactgaa actgtagcca 7440
ttatgtaaat aaagtttcat atgtacctgt ttattttggc agattaagtc aaaatatgaa 7500
tgtatatatt gcataactat gttagaattg tatatatttt aaagaaattg tcttggatat 7560
tttcctttat acataataga taagtctttt ttcaaatgtg gtgtttgatg tttttgatta 7620
aatgtgtttt gcctctttcc acaaaaactg taaaaataaa tgcatgtttg tacaaaaagt 7680
tgcagaattc atttgattta tgagaaacaa aaattaaatt gtagtcaaca gttagtagtt 7740
tttctcatat ccaagtataa caaacagaaa agtttcatta ttgtaaccca cttttttcat 7800
accacattat tgaatattgt tacaattgtt ttgaaaataa agccattttc tttgggcttt 7860
tataagttaa aaaaaaaa 7878

Claims (6)

1.一种非疾病诊断目的的将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测的方法，其特征在于，检测试样中存在的以下的(i)的多肽，
(i)为序列号1记载的氨基酸序列的多肽；
其中所述肿瘤细胞为EpCAM阴性的肿瘤细胞，所述夹杂细胞为白细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，使用特异性地识别(i)的多肽的抗体或适配体进行检测。
3.一种非疾病诊断目的的将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测的方法，其特征在于，检测试样中存在的编码以下的(i)的多肽的基因，
(i)为序列号1记载的氨基酸序列的多肽；
其中所述肿瘤细胞为EpCAM阴性的肿瘤细胞，所述夹杂细胞为白细胞。
4.一种肿瘤细胞的回收方法，其中，将试样中包含的肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来检测，并使用回收单元回收该检测出的肿瘤细胞，
通过检测试样中存在的以下的(i)的多肽来进行肿瘤细胞的检测，
(i)为序列号1记载的氨基酸序列的多肽；
其中所述肿瘤细胞为EpCAM阴性的肿瘤细胞，所述夹杂细胞为白细胞。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，使用特异性地识别(i)的多肽的抗体或适配体进行肿瘤细胞的检测。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中，试样为血液。
CN201980018046.7A 2018-03-09 2019-02-27 肿瘤标志物、以及将肿瘤细胞与夹杂细胞相区分来回收及检测的方法 Active CN111837039B (zh)

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