JP2005518790A - リンパ球異常増殖疾患の診断方法 - Google Patents

Abstract

本発明は、リンパ球異常増殖疾患を診断および治療するための新規な方法に関する。詳細には、本発明は、第１２染色体中の染色体ブレークポイント（breakpoint）および／または第１２染色体からの染色体構成要素の転座を検出することを利用し、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座（または複数の転座）が原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患と関連している診断および治療するための新規な方法に関する。さらに、本発明は、診断および治療剤としての、第１２染色体中の染色体ブレークポイントおよび／またはその転座に含まれるニューロンナビゲーター３遺伝子（ＮＡＶ３）またはその等価物または機能的フラグメントの使用に関し、ここに該遺伝子および／またはその転座は原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖性疾患と関連している。また、本発明は、療法の開発にも関する。

Description

発明の分野
本発明は、リンパ球異常増殖疾患を診断および治療するための新規な方法に関する。詳細には、本発明は、ヒト第１２染色体中の染色体ブレークポイント（breakpoint）および／または第１２染色体からの染色体構成要素の転座を検出することを利用し、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座（または複数の転座）が原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患と関連している診断および治療するための新規な方法に関する。さらに、本発明は、診断および治療剤としての、第１２染色体中の染色体ブレークポイントおよび／またはその転座に含まれるニューロンナビゲーター３遺伝子（ＮＡＶ３）またはその等価物または機能的フラグメントの使用に関し、ここに該遺伝子および／またはその転座は原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖性疾患と関連している。また、本発明は、療法の開発にも関する。

発明の背景
原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）は、病因および病理学的機構がほとんど理解されていない非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）の異類群を表す［Siegel, R. S.ら, J.Clin. Oncol. 18 (2000) 2908-2925］。ＣＴＣＬについては治癒力のある療法が存在しない。過去数十年の間に、先進国世界においては約２−８％のＣＴＣＬの発生の増加が観察されている［Doll, R.ら (編者), Trends in cancer incidence and mortality, cancer surveys, Vol 19/20, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1994, 423-53; Hjalgrim, H.ら, Br. J. Cancer 73 (1996) 951-54］。原発性胃腸リンパ腫の群の後、ＣＴＣＬは原発性皮膚Ｂ細胞リンパ腫と一緒になって、リンパ節外ＮＨＬの２番目の最も一般的な群を形成している［lsaacson, P. G.およびNorton, A. J., Cutaneous lymphoma, in Extranodal lymphomas, London, Churchill Livingstone, 1994, p.172］。フィンランドにおいては、過去４０年の間に男性において３倍高いＣＴＣＬの発生が見出されているが、女性においては見出されていない［Vaekevae, L.ら, J. Invest. Dermatol. 115 (2000) 62-65］。

ＣＴＣＬ患者の大部分、約８０％が通常は無痛性の疾患経過を示し、治療によって長期の鎮静を達成し得る。しかしながら、約２０％の症例では、皮膚、血液、リンパ節および骨髄のごとき幾つかの組織を腫瘍細胞が侵入するように攻撃性大細胞変異型へのトランスフォーメーションを受け、これが元の悪性細胞クローンであるという幾つかの証拠が存在する［Wolfe, J.ら, J. Clin. Oncol. 13 (1995) 1751-57］。これらの患者の５年生存率は１５％未満である［Willemze, R.ら, Blood 90 (1997) 354-371; Siegel, R. S.ら, 前掲］。このトランスフォーメーションはいずれの現在の手段をもってしても予想し得ない。

ＣＴＣＬの最も一般的な形態は、菌状息肉腫（ＭＦ）である。最初の皮膚障害は徐々に進行する。それは湿疹または軽症乾癬に似ており、局面性類乾癬（Ｐｐｓ）とも呼ばれる。初期フェーズにおいて、ポリ−またはオリゴ−クローナルなＣＤ−４陽性リンパ球が皮膚の表皮に浸潤する。悪性トランスフォーメーションの時期およびコンパートメントは知られていない［Veelken, H.ら, J. Invest. Dermatol. 104 (1995) 889］。悪性リンパ球は後に血液およびリンパ節においても見出されている。しかしながら、最近のデータは、悪性細胞が以前に考えられていたよりもより早期に分散するようであることを示唆している［Karenko, L. ら, J. Invest. Dermatol. 108 (1997) 22-29; Karenko, L.ら, J. Invest. Dermatol. 112 (1999) 329-95; Karenko L.ら, J. Invest. Dermatol. 16 (2001) 188-193］。

ＣＴＣＬのより攻撃的な形態は、ＭＦから発達し得るかまたは紅皮性皮膚症状と直接的に開始し得る白血病セザリー症候群（ＳＳ）である。

ＣＴＣＬの治療においては、早期の診断が極めて重要である。この疾患は後のステージでぶり返す傾向があるからである。しかしながら、現在、ＣＴＣＬの明確な診断に利用可能な手段は存在しない。とりわけ、ＭＦは、それが湿疹または軽症乾癬に似ていることに起因してその初期の発現において診断することは困難であり、したがって、残念ながらその時点において検出されないままとなり得る。ＣＴＣＬの診断においては、罹患した皮膚領域から皮膚バイオプシー試料が得られて組織病理学的分析が行われる。組織病理学的診断は、表皮侵入性の（epidermotropic）、形態的に悪性のリンパ球の検出、すなわち過染色性（hyperchromatic）でくぼんだ（脳構造）核を有する細胞の検出に基づく（Willemze, R.ら, 前掲)。すべてでないにせよ、大部分の症例においては、これらの細胞はＣＤ４表面マーカーを発現し、これは免疫組織化学的に検出し得る（Willemze, R.ら, 前掲）。したがって、診断の精度は、病理学者によってなされる視覚的等級付けおよび印象に依存し、非常に少ない悪性腫瘍細胞しか有していない、またはまだ正常な形態を有する染色体クローナル悪性リンパ腫しか有してない初期障害は見逃し得る。

さらに、血液または皮膚障害由来のＤＮＡにおけるＴ−細胞受容体（ＴＣＲ）再構成の証明は、ＣＴＣＬの診断における補足的な方法として用いられている。しかしながら、ＴＣＲ再構成は疾患特異的なマーカーではない。それは反応性クローナル細胞も同定するからである［Guitart J.およびKaul K., Arch. Dermatol. 135 (1999) 158-62］。

また、分子細胞遺伝学実験においてＣＴＣＬにおいては幾つかの染色体異常、とりわけ数に関する（numerical）異常が観察されており、これらを診断に用い得る。詳細には、細胞遺伝学的変化が組織学的に同定可能な悪性腫瘍の先に起こることが示されている［Whang-Peng, J.ら, Cancer 50 (1982) 1539; Berger, R.ら, Cancer Genet Cytogenet 27 (1987) 79; Karenkoら, 1997, 前掲］。しかしながら、疾患の初期フェーズにおいては、これらの異常は非クローナルであって、これは検出を非特異的なものにしてしまう。

ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患における残余の悪性腫瘍細胞のための早期の診断および治療介在の追跡が可能な新たな方法を開発することは最も重要である。また、療法を開始および追跡するための新たなガイドラインを開発するためのさらなる手段も非常に必要とされている。

発明の概要
ここに、本発明者らは、第１２染色体、詳細には１２ｑ１４−１２ｑ２４に、皮膚Ｔ細胞リンパ腫と関連する特定の繰り返し染色体ブレークポイントおよび／または転座を同定した。また、本発明者らは、かかる染色体ブレークポイントおよび／または転座に含まれる遺伝子も同定した。かかる特異的な染色体ブレークポイントおよび／または転座ならびに遺伝子および／または遺伝子の転座、欠失または他の欠陥の同定により、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を検出および追跡および治療するための新規な診断および治療方法の開発が許容される。

本発明の目的は、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断するための新規な方法および手段を提供することであり、かかる方法および手段によって該疾患の早期診断が許容される。

本発明のもう１の目的は、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断するための新規な方法および手段を提供することであり、かかる方法および手段は特異的かつ信頼できる。

本発明のなおもう１の目的は、疾患の進行およびＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患における攻撃的形態へのそのトランスフォーメーションを予想するための新規な方法および手段を提供することであり、かかる方法および手段によって人命救助になり得る治療的介入が時宜に許容される。

本発明のいまだもう１の目的は、治療的介入を開始および追跡するための新たなガイドラインを開発するためのならびにＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患の新たな治療物理療法を開発するための新規の方法および手段を提供することであり、かかる方法および手段は疾患の軽減ステージを延長し、疾患を駆逐しかつ患者を回復させるための新たな可能性を導入する。

本発明は、臨床試料中における、第１２中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座の存在または不存在を検出することを含み、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座はリンパ球異常増殖疾患と関連している、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡するための新規な方法に関する。

さらに、本発明は、臨床試料中における、リンパ球異常増殖疾患と関連するニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物または機能的フラグメントの存在または不存在を検出することを含む、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡するための新規な方法に関する。

いまださらに、本発明は、臨床試料中における、リンパ球異常増殖疾患と関連する第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）またはその等価物もしくはフラグメントの転座または欠失または他の欠陥の存在または不存在を検出することを含む、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡するための新規な方法に関する。

また、本発明は、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座および／または第１２中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物または機能的フラグメントの転座または欠失または他の欠陥の検出に基づき、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座および／または遺伝子の転座、欠失または欠陥が細胞遺伝学的変化と関連している、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患に苦しむ患者から得た臨床標本中の分子細胞遺伝学的変化を同定するための高速試験系に関する。

さらに、本発明は、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患またはその白血病変異型を発症する危険性があり、かつ、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座および／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物または機能的フラグメントの転座または欠失または他の欠陥の存在または不存在を検出することによる時宜な療法相互作用によって助け得る患者を同定するための方法に関し、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座および／または遺伝子の転座、欠失または欠陥は該患者から得た生物試料中の疾患亜型と関連する。

さらに、本発明は、疾患に苦しむ患者から得た生物試料中における、第１２染色体、詳細には１２ｑ１４−１２ｑ２４中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座および／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの転座または欠失または他の欠陥の存在または不存在を検出することによって、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患の進行およびその攻撃的変異型へのトランスフォーメーションを予想する方法に関し、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座および／または遺伝子の転座、欠失または欠陥は疾患亜型と関連する。

また、本発明は、該疾患を診断するための、第１２染色体、詳細には１２ｑ１４−１２ｑ２４中の特定の染色体ブレークポイントまたは特定の複数の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の転座の使用に関し、ここに該染色体ブレークポイントおよび／または転座はＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連する。

また、本発明は、該疾患を診断するための、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントおよび／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの転座、欠失または他の欠陥の使用にも関し、ここに該遺伝子、転座、欠失または欠陥はＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連する。

また、本発明は、該疾患の療法を開発するための、第１２染色体中の特定の染色体ブレークポイントまたは複数の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の転座の使用にも関し、ここに該染色体ブレークポイントおよび転座はＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連する。

また、本発明は、該疾患の療法における、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連するニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントのおよび／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの転座、欠失または他の欠陥の使用にも関する。

図面の簡単な説明
図１は、ＳＳ患者からの試料中の染色体１２ｑ（ワインレッド色）および染色体１８ｑ（赤色）の間の転座のＳＫＹ−分析を示す。正常な染色体は、Ｎで、転座した染色体はＴで印を付している。

図２は、染色体１２ｑ、４ｑおよび１０間の転座のＦＩＳＨ−解析を示す。最上部分のサブウインドウは正常な第４染色体を示している。第２のサブウインドウは染色体長腕中の第１２染色体の遠位に転座した構成要素を有する第４染色体を示す。第３のサブウインドウは、ｑ２２中のブレークポイントを有する第１２染色体長腕、および短腕中の第１０染色体の遠位に転座した構成要素を示す。最下部のサブウインドウは短腕中の第１０染色体を示す。各染色体のＦＩＳＨの結合したカラーは各サブウインドウの右手側に示している（Ｎ＝正常、Ｔ＝転座）。

図３は、染色体試料のＦＩＳＨ分析を示す。図３Ａ）および３Ｂ）は同一細胞中の第１２染色体と第１８染色体とのカラー組合せを表す。染色体の組み合わさった発色は、両方の図の右側に示されている。発色スペクトルは、中位サブウインドウに示されている。試料は、図１と同一の患者から得た。

図３Ａ） 最上部サブウインドウは正常な第１２染色体（Ｎ１）を示しており、これはバックグラウンド図の右側の３の第１２染色体の群のうちの中位の染色体でもある。第１２染色体のセントロメアは赤色シグナルを与え、これはサブウインドウにおいて鮮やかな赤色およびワインレッド色の組合せとして見える。ＹＡＣ ８０３−Ｃ−２はすべてのサブウインドウおよびバックグラウンド図においてワインレッド色シグナルである。ＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６は正常第１２染色体（Ｎ１）中の緑色スポットであり、最上部サブウインドウおよび第１２染色体の群の中位の第１２染色体において見える。２のつぎのサブウインドウにおいて緑色シグナルは欠失しており、それが第１２染色体の２の他のコピー（Ｔ１およびＴ２）から引っ越したことを示している。緑色はバックグラウンド図の正常第１２染色体の両方の側の染色体からも欠失しているが、ワインレッド色ＹＡＣ ８０３−Ｃ−２スポットはＹＡＣ ８０３−Ｃ−２由来の構成要素がこれらの２コピー中に存在することを示している。最下部のサブウインドウは、ＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６に対応する構成要素を受容した第１８染色体（Ｔ３）を図示する。第１８染色体のセントロメアは上部の緑色スポットであり、下部の緑色スポットはＢＡＣである。転座した構成要素を示す対応する第１８染色体は、バックグラウンド図中の４の第１８染色体の群中の最も左側（Ｔ３）である。

図３Ｂ） ２の上部サブウインドウは、緑色に発色するセントロメアのみを示す正常な第１８染色体（Ｎ２およびＮ３）を表している。３番目のサブウインドウは、第１２染色体から構成要素を受容した第１８染色体（Ｔ４）を示している（ＢＡＣ ３５９Ｍ６は緑色に発色するセントロメア下では他の緑色である）。この染色体（Ｔ４）はバックグラウンド図中で右から２番目である。

図４は、ＢＡＣ ３６Ｐ３およびＹＡＣ ８５７Ｆ６を用いた第１２染色体および第１８染色体間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。最上部のサブウインドウは正常な第１２染色体を示しており：セントロメアは赤色シグナルを与え；ＢＡＣ ３６Ｐ３はセントロメア下の小さな赤色シグナルを与え；ＹＡＣ ５８７Ｆ６は緑色シグナルを与えている。３番目のサブウインドウは異常な第１８染色体を示しており：セントロメアは緑色シグナルを与え；ＢＡＣ ３６Ｐ３は赤色シグナルを与えて第１２染色体から転座した構成要素を示している。最下部のサブウインドウは正常な第１８染色体を示しており：セントロメアは緑色シグナルを与えている。各染色体のＦＩＳＨの合わせた発色は各サブウインドウの右側に示している。上部バックグラウンド図は、左側および右側に各々正常および異常な第１２染色体を示しており、下部バックグラウンド図は、右側および左側に各々正常および異常な第１８染色体を示している。

図５は、ＳＳ患者からの試料中におけるＢＡＣ ３６Ｐ３を用いた第１２染色体（セントロメア 赤色）および１８ｑ（セントロメア 緑色）間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。上列は左から右に：２の異常な第１２染色体および１の正常な第１２染色体；第１２染色体のセントロメアおよびＢＡＣ ３６Ｐ３は両方とも赤色シグナルを与えており、これは第１２染色体が短いために没入している。下列は左から右に：２の異常な第１８染色体および２の正常な第１８染色体であるが、セントロメアは緑色シグナルを与え、転座したＢＡＣ ３５Ｐ３は赤色シグナルを与えている。

図６は、ＢＡＣ ７８１Ａ６（緑色）およびＢＡＣ １３６Ｆ１６（赤色およびワインレッド色）を用いた第１２染色体と第１８染色体との間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。最上部サブウインドウは転座後の第１２染色体を示しており：セントロメアはスミレ色シグナルを与え；ＢＡＣ １３６Ｆ１６は存在しておらず；ＢＡＣ ７８１Ａ６は緑色シグナルを与えている。２番目のサブウインドウは正常な第１２染色体を示しており：セントロメアはスミレ色シグナルを与え；ＢＡＣ １３６Ｆ１６はセントロメア下の赤色およびスミレ色の二重シグナルを与えており；ＢＡＣ ７８１Ａ６は緑色シグナルを与えている。３番目のサブウインドウは特異的なシグナルを含まない正常な第１８染色体を示している。最下部のサブウインドウは転座後の第１８染色体を示しており：ＢＡＣ １３６Ｆ１６は赤色およびスミレ色の二重シグナルを与えている。各染色体のＦＩＳＨの組み合わせた発色を各サブウインドウの右側に示す。上部のバックグラウンド図は、右側および左側に、各々正常および異常な第１２染色体を示しており、下部バックグラウンド図は左側および右側に、各々正常および異常な第１８染色体を示している。

図７は、ＢＡＣ ４９４Ｋ１７（緑色）およびＢＡＣ １４４Ｊ４（１２ｑ２４）（赤色）を用いた第１２染色体のＭＦＩＳＨ分析を示している。上部のサブウインドウは正常な第１２染色体を示しており：セントロメアはスミレ色シグナルを与えている。下部サブウインドウは転座後の第１２染色体を示しており：ＢＡＣ ４９４Ｋ１７（緑色）が残存しており；ＢＡＣ １４４Ｊ４（赤色）は消失している。

図８は、すべてＣＴＣＬの白血病亜型であるＳＳに罹った患者１、２および３において観察された異常な第１２染色体中の幾つかの対応する遺伝子を用いたＦＩＳＨアッセイにおけるＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰａｃ（Ｐ１）プローブのシグナルを示しており、ハイブリダイゼーションを用いて調べた長い染色体距離を示している。

図９は、ＢＡＣプローブを用いて行ったＦＩＳＨで検出された患者３における転座に含まれていたＮＡＶ３遺伝子の一部分を示している。ＢＡＣ ＲＰ１１−４９４Ｋ１７の範囲内の正確なブレークポイント（？マーク）は近似である。

発明の詳細な説明
本発明は、染色体構成要素の他の染色体への転座を有するかまたは有しない、第１２染色体長腕中の、具体的には１２ｑ１４−ｑ２４中の特定のブレークポイントまたは特定の複数のブレークポイントを同定したことに基づき、該ブレークポイントはＣＴＣＬと関連している。

本明細書中で用いる"染色体ブレークポイント"および"染色体ブレーク"なる語は、そこから染色体が構成要素を失ったポイントをいい、したがって染色体の構造異常である。本明細書中で用いる"転座"なる語は、非相同染色体間の染色体領域の移動をいう。

本明細書中で用いる"ニューロンナビゲーター３遺伝子"（ＮＡＶ３）なる語は、配列番号：１として同定される配列を有する遺伝子、または実質的に同一の機能を有し、かつ、実質的に同一のタンパク質をコードするその等価物をいい、あるいは、配列番号：３として同定される配列を有する遺伝子、またはその等価物をいう。"等価物"なる語には、さらに、配列番号：２として同定される配列またはそれにハイブリダイズ可能な機能的に等価な単離されたＤＮＡ配列のごときＮＡＶ３の機能性フラグメントまたは変異型も含まれる。

本明細書中で用いるＮＡＶ３遺伝子の"機能的に等価なフラグメント"なる語は、本発明の方法で検出可能であるかかる遺伝子フラグメントをいう。

本明細書中で用いるＮＡＶ３遺伝子の"欠失または他の欠陥"なる表現は、存在しないと遺伝子の機能に悪影響を及ぼす遺伝子配列中のヌクレオチドまたは複数のヌクレオチドおよび／またはエキソンまたは複数のエキソンの不存在をいう。

ブレークポイントは、ＣＴＣＬの白血病形態であるセザリー症候群（ＳＳ）に罹った７の患者のうちの６において領域１２ｑ１４−１２ｑ２４において、ならびにＣＴＣＬの亜型である菌状息肉腫症（ＭＦ；ステージＩＡ−ＩＩＢ）に罹った４の患者のうちの３において観察された（図１および２を参照されたい）。２の患者においては、ブレークポイントは領域１２ｑ１４−ｑ２１．３（図３）に特定された。これらの後者の患者のうちの１において、１２ｑ中の欠失は、遠位のブレークポイントが１２ｑ２３または１２ｑ２４中に存在するように間欠的である。ＳＳに罹った３の患者において、染色体構成要素は第１８染色体短腕または１８ｑ１２−１８ｑ２１に転座していた。１のＳＳ患者において、第１２染色体由来の構成要素の転座は第４染色体において起こっており（図２）、第２２染色体への転座も認められた。

染色体のブレークポイントおよび転座は、コンビナトリアルマルチ蛍光ＦＩＳＨ［ＭＦＩＳＨ, Speicher, M. R.ら, Nat. Genet. 2 (1996) 368-375］または分光核型決定［ＳＫＹ; Schrock, E.ら, Science 273 (1966) 494- 497］のいずれかを用いるマルチカラー蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションを用いて同定した。転座およびブレークポイントはさらに、対立遺伝子特異的な市販のプローブ、ＹＡＣ ８０３−Ｃ−２（１２ｑ１４−ｑ１５）およびＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６を用いるＦＩＳＨでさらに特定した。Ｙａｃ ８０３−Ｃ−２は、１２ｑ１５の公表されているＹＡＣ−コンティグの一部分である［Scoenmakersら, Genomics 29 (1995) 665-678］。それはこれらのマーカーを含むＤＮＡマーカーＳＴＳ１２−９８とＳＴＳ−７２との間に位置し、コンティグの隣接する末端付近に位置する。Ｙａｃ ８０３−Ｃ−２はキメラではない。ＹＡＣ ８０３−Ｃ−２はＨＭＧタンパク質遺伝子ＨＭＧＩ−Ｃ［Schoenmakersら, Nature Genetics 10 (1995) 436-444; Schoenmakersら, Genomics 29 (1995) 665-678］を含む。ＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６は公表されている［AC027288.26 8422.. 8574 www. ncbi.nlm. gov (Roswell Park Cancer Institute Human BAC Library, complete sequence 177080］。ＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６は、ヒトＰＡＷＲ−遺伝子を含む［位置12q21; Johnstoneら, Genomics 53 (1998) 241-243; BACについては www. ncbi.nlm. nih.gov1を参照されたい］。１２ｑ２４はレトロ偽遺伝子ＨＭＧＩＹを含み［Rogallaら, Cancer Genet. Cytogenet. 130 (2001)51-56］、これはＨＭＧタンパク質遺伝子のもう１のメンバーである。子宮筋腫においては、１２ｑ２４.１のミトコンドリア・アルデヒド・デヒドロゲナーゼ（ＡＬＤＨ２）遺伝子がＨＭＧＩＣに対する転座パートナーであることが見出されている［Kazmierczakら, Cancer Res 55 (1995) 6038-6039］。

ＦＩＳＨ分析によって、ＳＳ患者から得られた生物試料における１２ｑ１４−ｑ２１中の染色体ブレークポイントおよびその１８ｑ１２−ｑ２１への転座は、第１２染色体からの緑色のＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６スポットの消失（図３Ａ、最上部サブウインドウ、正常な染色体と２のつづくサブウインドウ、欠陥染色体とを比較）、および第１８染色体におけるさらなる緑色のＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６スポットの出現（図３Ｂ、２の上部サブウインドウ、正常染色体と最下部サブウインドウ、欠陥第１８染色体とを比較）として観察された。

染色体の破壊および転座の結果として、腫瘍抑制遺伝子が砕け得るか、細胞増殖またはアポトーシスを促進する遺伝子の転写が増幅され得るか、あるいは細胞増殖を調節している公知の転写因子間に介在しているネオジーン（neogene）が形成されて、疾患のその悪性形態へのトランスフォーメーションを誘導し得る。

観察されたブレークポイントおよび転座をさらに同定するために、ならびに転座した構成要素を同定するために、さらなる特定のＹＡＣ−およびＢＡＣ−プローブを用いたさらなる分析を行った（図８）。

プローブＹＡＣ ８５５Ｆ７は異常な第１２染色体と異常な第１８染色体との間に分割されることが示され、これは調べた患者試料中の転座ブレークポイントがこのＹＡＣの範囲内に存在することを示している。ＹＡＣ ８５５ＦはＹＡＣ−コンティグ１２.４の一部分であり(NIH : www. ncbi.nim. nih. gov)、マーカーＣＨＬＣ．ＧＡＴＡ６５Ａ１２およびＷＩ−６４８７の間の領域に広がっている。ＮＣＢＩデータベースにより、対応するゲノムコンティグ（ＮＴ ００９５５１）中のこれらのマーカーの間の連続する対立遺伝子、すなわちＬＯＣ２５５３７９、ＬＯＣ２５５３１５、ＬＯＣ２０４０４０、ＬＯＣ１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８を明らかにした。遺伝子座特異的なＳＴＳ−マーカーを用いたＰＣＲおよびＢＬＡＳＴＡコンピュータ解析(www. ncbi.nim. nih. gov)により、これらの遺伝子座はＹＡＣ ８５５Ｆ７ ＤＮＡおよび４のＢＡＣ：ＲＰ１１−７８１Ａ６、ＲＰ１１−４９４Ｋ１７、ＲＰ１１−１３６Ｆ１６およびＲＰ１１−３６Ｐ３（各々、受託番号ＡＣ０７３５５２．１、ＡＣ０２２２６８.５、ＡＣ０７３５７２．１４およびＡＣ０７３６０８.１９））に位置することが判明した。

ＢＡＣ ＲＰ１１−４９４Ｋ１７は、遺伝子座２５５３１５およびほぼ全体の遺伝子座２０４０４０が含まれる。後者の遺伝子座の一部分はＢＡＣ Ｆ１６にも存在し、これは全体遺伝子座１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８の小部分も含まれる。ＢＡＣ ＲＰ１１−３６Ｐ３は全体遺伝子座ＫＩＡＡ０９３８を含むが、遺伝子座１２３１８の配列は含んでいない。ＢＡＣ ７８１Ａ６は遺伝子座２５５３７９および遺伝子座２５５３１５の小さい部分を含む（図８を参照されたい）。

ＢＬＡＳＴＡ分析およびMaesら［Genomics 80 (2002) 21-30］によると、遺伝子座２５５３１５、２０３０４０、１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８は一緒になってＲＡＩＮＢ１−遺伝子ホモログ、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子（配列番号：１）またはその部分コーディング配列（ＡＦ３９７７３１）を形成している。ＬＯＣ２５５３１５（配列番号：２）はその配列４９８ないし６６８をＮＡＶ３配列の１ないし１７１と共有しているが、ポジション５９４の１のヌクレオチドは除かれる。完全５’末端を含むＮＡＶ３遺伝子配列を配列番号：３として掲載する。

ＦＩＳＨ分析によって、ＳＳ患者から得た生物試料中の１２ｑ１４−ｑ２１中の前記に観察された染色体ブレークポイントおよび転移ｔ（１２；１８）（ｑ２１；ｑ１２−２１）は、第１２染色体からの赤色のＢＡＣ ３６Ｐ３スポットの消失（図４Ａ、最上部サブウインドウ、正常染色体とつぎのサブウインドウ、異常染色体とを比較）および第１８染色体におけるさらなる赤色ＢＡＣ ３６Ｐ３スポットの出現（図４、３番目および４番目のサブウインドウ、各々、異常な第１８染色体および正常な第１８染色体）によって確認された。ＹＡＣ ８５７Ｆ６は第１２染色体に残存している。第１２染色体から第１８染色体への染色体構成要素の転座は、ＳＫＹ−分析によっても観察された（図１）。

ＳＳ患者からの試料中のＢＡＣ ３６Ｐ３での第１２染色体（セントロメア、赤色）および第１８染色体長腕（セントロメア、緑色）の間の転座は、さらに、さらなるＦＩＳＨ−分析によっても確認された（図５）。

ＳＳ患者試料を用いたさらなるＦＩＳＨ分析において、ＢＡＣ ７８１Ａ６（図６中の緑色シグナル）およびＢＡＣ １３６Ｆ１６（図６中の赤色およびワインレッドシグナル）は、正常な第１２染色体と比較した場合の異常な第１２染色体における赤色スポットの不存在および緑色スポットの存在から判断されるように、転座において互いに分離する。この構成要素は第１８染色体に転座していた（図６中の異常な第１８染色体における赤色スポットを参照されたい）。一方、ＢＡＣ ４９４Ｋ１７は第１２染色体に残存し（図７中の異常な第１２染色体中の緑色シグナル）、ＢＡＣ １４４Ｊ４は第１２染色体から離れて移動した（図７中の異常な第１２染色体における赤色シグナルの消失）。

上記のＢＡＣは一緒になってＮＡＶ３遺伝子を形成する遺伝子座を含むため、遺伝子座の分離を示すシグナルの分離は、転座におけるＮＡＶ３遺伝子の２の部分への分裂を示している。その１の部分は第１２染色体中に残存し（ＢＡＣ ＲＰ１１−７８６Ａ１および４９４Ｋ１７に位置する部分および遺伝子座）、もう１の部分は第１８染色体長腕に転座する（ＢＡＣ １３６Ｆ１６および３６Ｐ３に位置する部分および遺伝子座）。

ＦＩＳＨ実験から推定されるブレークポイントは、ＢＡＣ ４９４Ｋ１７によってカバーされる領域の末端部分に位置する（おそらく、遺伝子座２０４０４０、図８）。より正確な決定には、ＤＮＡレベルの実験、例えば転座ブレークポイントのクローニングが必要であろう。

これは、特定の再発ブレークポイントまたは転座がＣＴＣＬにおいて認められたという最初のものであるが、染色体ブレークポイント／転座を有する造血系の他の悪性腫瘍は記載されている。最もよく知られているのは、第９染色体と第２２染色体との間の転座であり、ＣＭＬにおいて同定されたいわゆるフィラデルフィア症候群を生じる［Nowell, P.およびHungerford, D., Science 132 (1960) 1497; Rowley, J. , Nature 243 (1973) 290-293.］。このトランスフォーメーションはＢＣＲおよびＡＢＬ遺伝子の融合を生じ、これはＣＭＬの発達に必須である［Shtivelman, E.ら, Nature 315 (1985) 550-554］。この融合遺伝子はチロシンキナーゼ活性を有する。ＭＬＬ（混合性白血病）遺伝子はヒト急性白血病と関連する染色体転座の一般的なターゲットである。後者の転座は、３０の異なるパートナータンパク質のうちの１とインフレームで融合したMLLのアミノ末端を含む新規なキメラタンパク質を生成することによってMLL機能の取得を生じる。この融合タンパク質の発現は必要であるが、マウスモデルにおける白血病発生に十分なものではない［Ayton, P.およびCleary, M. , Oncogene 20 (2001) 5695-707］。

急性前骨髄性白血病はｔ（１５；１７）転座によって特徴付けられ（Xuら, Leukemia 9 (2001) 1358-68］、脾辺緑帯Ｂ細胞リンパ腫はｔ（１１；１４）（ｐ１１；ｑ３２）転座によって特徴付けられ［Cuneo, A.ら, Leukemia 15 (2001) 1262-7］、濾胞性リンパ腫はｔ（１４；１８）（ｑ３２；ｑ２１）を有し、これはＩＧＨ遺伝子のプロモーター領域と第１８染色体上の抗アポトーシスタンパク質Ｂｃｌ−２のコーディング領域との並置を生じる［Fukuhara, S.ら, Cancer Res 39 (1979) 3119-3128, Tsujimoto, Y.ら, Science 266 (1984) 1097-1099］。再発性の相互に平衡のとれた転座ｔ（２；５）（ｐ２３；ｑ３５）が、ＣＤ３０＋未分化大細胞型リンパ腫において見出されており［Kadin, M. E.およびMorris, S. W., Leuk Lymphoma 29 (1998) 249-56］、ＣＤ３０＋原発性ＣＴＣＬの５０％に上ることが判明している［Beylot-Barry, M.ら, Blood 91 (1998) 4668-76］。この転座は新規な融合タンパク質を生成し、これはイン・ビトロ（in vitro）においてトランスフォーミング特性を有する。

同様にして、これは、特定の遺伝子NAV３およびその転座が、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連しているという初めてのものである。

ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子は、ケノルハブディティス・エレガンス（Caenorhabditis elegans）からの細胞ガイダンス遺伝子であるｕｎｃ−５３に対してホモロジーを示す最近同定されたヒト遺伝子ファミリーのメンバーである(Maesら, 前掲)。それは、ｕｎｃ−５３の哺乳動物ホモログである［Merrillら, PNAS 99 (2002) 3422-3427］、ヒトＲＡＩＮＢ１（神経芽腫細胞に誘導可能なレチノイン酸）と相同配列を共有する。ＮＡＶ３は３９のエキソンからなり、ｍＲＮＡ検出に基づくその発現は脳組織に大きく限定されている(Maesら, 2002, 前掲)が、いままで,造血またはリンパ腫組織は全く調べられていない。ＮＡＶ３は異なる長さのタンパク質をコードする転写物を生成することが示され、それは組織特異的な別のスプライシングに付され得ることが示された。ＮＡＶ３のサブセルラー局在性は知られていない。予想された構造に基づいて、相同タンパク質ＵＮＣ−５３は、ＳＨ３−結合ドメインを表し得る２のポリプロリンに富むドメイン、中央コイル化コイル領域（おそろくは他のタンパク質と相互作用している）および推定ＡＴＰ／ＧＴＰ−ヌクレオチド結合サイトを有する［Stringham, E.ら, Development 129 (2002) 3367-3379)］。それは２の推定アクチン−結合ドメインも含んでいる［Stringham, E.ら, Development 129 (2002) 3367-3379］。

前記した相同性遺伝子およびタンパク質の最近の知見に基づいて、本発明者らは、配列番号：１または３として掲載するＮＡＶ３がその機能をシグナル伝達において発揮し、その不存在（遺伝子欠失）または（転座の結果としての）妨害もしくは増幅された機能は、おそらくはアポトーシスに対する調節応答を介して、細胞に対して増殖許可を提供し、つぎにこれは悪性腫瘍への必須であると予想している。

レチノイドはＣＴＣＬにおいて治療活性を発揮することが知られており［Zackheim, H. S., Dermatology 199 (1999) 102-105)、ＮＡＶ３遺伝子はその前記したホモログと同様に全トランスレチノイン酸によって誘導されるようであるため、本明細書中に示すようにＮＡＶ３の欠失／転座は（本明細書中に示す実験において調べたすべての３の患者での症例と同様に）イン・ビボ(in vivo)においてかかる療法に対する耐性を提供することは理解し得る。

さらに、本発明は、リンパ球異常増殖疾患、すなわちＣＴＣＬおよびとりわけその白血病形態のセザリー症候群におけるその関与を示すことによってＮＡＶ３遺伝子に対する新たな潜在的機能を同定する。

本発明は、細胞遺伝学的知見を特徴付けし、特定の細胞遺伝学的異常を有するＴ細胞クローンを同定する。同定した細胞は定義によって真正な悪性腫瘍であり、臨床組織標本におけるかかる細胞の実証は疾患が存在することを示した。

本発明は、転座およびその結果として起こるネオジーン形成ならびにリンパ球異常増殖疾患、すなわちＣＴＣＬおよびとりわけその白血病形態であるセザリー症候群と関連する特定の遺伝子欠失および転座を同定する。上記の知見、病態生理学的スキームと他のリンパ球異常増殖疾患に対するモデル特性とを統合することによって、新たな診断ツールを提供する。

本発明の診断方法によれば、染色体ブレークポイントまたは複数のブレークポイントの存在または不存在を、ブレークポイントおよび転座を検出するのに好適ないずれかの公知の検出方法によって生物試料から検出し得る。かかる方法は、当業者によって簡単に認識され、マルチカラー蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションのごとき、蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーションが含まれ、それは特定の色、スペクトル、色の割合または色の強さまたはそれらの組合せで第１２染色体を色分けする染色体特異的またはアーム特異的色分けプローブに基づく。色分けプローブは単独またはマルチ蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション［MFISH, Speicher, M. R.ら, Nat Genet 12 (1996) 368-375によって記載］、または分光核型決定［SKY, Schock, E.ら, Science 273 (1996) 494-497によって記載］、またはコンバインド・バイナリーレシオラベリング［COBRA, Tanke, H. J.ら, Eur J. Hum. Genet 7 (1999) 2-11によって記載］または色変化核型決定［CCK, Henegariu,O.ら, Nat. Genet. 23 (1999) 263-4］におけるのと同様に、またはセントロメア特異的プローブまたは転座領域における遺伝子座に対して特異的な遺伝子座特異的またはバンド特異的プローブを用いて、他の染色体または染色体アームを検出する他の色分けプローブと組合せて用い得る。従来のＧ−バンド技術でさえこの場合に用い得、これは十分とみなせる転座の粗い検出であった。好ましい方法は、ＭＦＩＳＨおよびＳＫＹのごとき臨床的研究室で使用するのに好適なものである。

リンパ球異常増殖疾患におけるＮＡＶ３遺伝子の同定に有利な本発明の１の好ましい具体例によれば、ＮＡＶ３遺伝子またはその等価物またはフラグメントの存在または不存在を、遺伝子発現（またはコピー数）を検出するのに好適ないずれかの公知の検出方法、すなわち遺伝子（またはＤＮＡ）のコピー数を検出することに基づく方法および／または遺伝子発現産物（ｍＲＮＡまたはタンパク質）を検出することに基づく方法、によって生物試料から検出し得る。かかる方法は当業者によって容易に認識され、蛍光イン・サイチュハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のごときイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡイン・サイチュ・ハイブリダイゼーション、ノザン分析、ＲＴ−ＰＣＲ、サザンおよびウエスタン分析、免疫組織化学、およびＥＬＩＳＡのごとき他のイムノアッセイが含まれる。好ましい方法は、ＦＩＳＨ、ＲＴ−ＰＣＲ法および免疫組織化学のごとき日常的な臨床研究室で使用するのに好適なものである。

療法においては、ＮＡＶ３遺伝子の正常な機能の回復を使用し得る。これは、増殖性疾患の進行を防ぐための遺伝子療法に現在利用可能ないずれかの技術で、機能的に相同な遺伝子の発現を高めることによって、インタクトなＮＡＶ３遺伝子を導入することによって、または変化した形態のＮＡＶ３遺伝子またはＮＡＶ３に対するアンチセンス・オリゴヌクレオチドを用いることによって達成し得る。特に、腫瘍細胞の増殖は、かかる療法によって減速または停止さえし得る。かかる技術にはエクス・ビボ(ex vivo)およびイン・サイチュ（in situ）療法が含まれ、前者には、組換体またはペプチド形態中またはアンチセンス・オリゴヌクレオチドとしてまたはベクター中のインタクトまたは改変したＮＡＶ３遺伝子（またはその機能ドメイン）を患者に導入またはトランスフェクトすることが含まれ、後者には、改変した遺伝子またはオリゴヌクレオチドを担体に挿入し、ついでこれを患者に導入することが含まれる。治療する疾患に依存して、一時的な治癒または永続的な治癒を達成し得る。あるいは、ＮＡＶ３タンパク質または転座の結果として生成した融合遺伝子に結合するモノクローナル抗体またはヒト化抗体またはペプチドを用いて、変化したＮＡＶ３タンパク質の機能を抑制することができ、したがって腫瘍細胞の増殖を減速または停止させし得る。ＮＡＶ３に対する抗体を用いて、ＮＡＶ３遺伝子を過剰発現しているガン細胞まで細胞毒性物質のごとき他の剤を運搬させ得る。ついで、かかる剤を用いて、ガン細胞を特異的に殺すことができる。

本発明により、臨床標本における同定した分子細胞遺伝学的変化に対する高速試験系の開発も許容される。かかる系には、染色体ブレークポイント（複数のブレークポイント）に広がり、異なる発色または蛍光マーカーで標識し、簡単に入手可能な非分裂性の皮膚または血液細胞（間期細胞。にハイブリダイズするた２のＤＮＡプローブが含まれる。プローブ間の領域中の染色体ブレークポイントが試料中に存在する場合には、視覚化されたシグナルは視覚的に互いに離れるか、消失するか、または没入するかのいずれかである。本発明のこの具体例に有用なプローブは、例えば、ヒト遺伝子座特異的な配列を含む、ＹＡＣまたはＢＡＣ、Ｐ１またはコスミドをベースとするものである。実施例２も参照されたい。プローブは異なる手法、例えばＹＡＣのヒト・インサートを富化するためのＰＣＲ、および異なる標識手法によってさらに発展し得る。

本発明の１の具体例は診断キットであり、これにはＮＡＶ３遺伝子、その遺伝子産物またはフラグメントの検出に必要な試薬が含まれる。これらの試薬には、ＮＡＶ３またはその遺伝子産物またはフラグメントを同定することができる特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、視覚化または定量に必要であるマーカーおよび標準物質、ならびに、市販の試薬キットに一般的に含まれているバッファー、希釈剤、洗浄溶液などが含まれる。あるいは、本発明の診断キットには、ＮＡＶ３タンパク質に対する抗体の検出に必要な前掲したごとき好適な試薬と一緒に、ＮＡＶ３遺伝子産物またはその機能的変異型またはフラグメントが含まれ得る。

本発明の方法においては、生物試料は、皮膚またはリンパ節からのバイオプシー、全血、リンパ液または脳脊髄流体試料のごとき体液のごときいずれの好適な組織試料ともし得る。必要な場合には、生物試料は、当業者に知られている好適な方法で予め処理し得る。

第１２染色体中の染色体ブレークポイントおよび／またはその転座の検出は、組み合わせた診断アプローチによって、とりわけ原発性皮膚T細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患の進行／トランスフォーメーションの早期の診断において、および、予期することにおいて価値がある。例えば、ＣＴＣＬにおいては、本発明により検出した第１２染色体中の頻発ブレークポイント（複数のブレークポイント）および／またはその転座（複数の転座）によって、初めて凝集形態のＣＴＣＬが同定され、重要なことには疾患の初期ステージにおいて同定された。しかしながら、この染色体転座の証明と後に記載するものとを組み合わせると、リンパ球異常増殖疾患の特定の臨床過程と関連する染色体異常のパターンの作成の基礎が得られるであろう。また、罹患したリンパ球の機能的能力を確認するために、本明細書に記載する発明は、公知のセントロメア特異的な染色体プローブについて以前に記載されているごとく細胞の表面マーカーの実証に結合し得る［Karenko, L.ら, J. Invest. Dermatol. 116 (2001) 188-193］。

本発明は、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患のより信頼性が高く、より早期の、より簡便な診断を提供し、その療法における新たな可能性を公開する。

以下の実施例は本発明をさらに説明するために提供するものである。
実施例１
第１２染色体中の転座の同定
ａ）細胞培養および慣用的な染色体の調製
末梢血液リンパ球をＦｉｃｏｌｌ−Ｉｓｏｐａｑｕｅ密度勾配遠心を用いて単離し、ＲＰＭＩ １６４０（Gibco BRL, Life Technologies）で洗浄し、２０％のウシ胎児血清（Gibco BRL）、Ｌ−グルタミン（１００×液体、１×として使用、Gibco BRL）、抗生物質（ペニシリン １００００ＩＵ／ｍｌ、ストレプトマイシン １００００ｍｇ／ｍｌ、１：１００として使用）およびフィトヘマグルチニン（ＰＨＡ １０５７６−０１５、Gibco BRL、１：１００として使用）存在下、ＲＰＭＩ １６４０中で３日間培養した。この細胞を低張ＫＣｌ溶液で処理した後に、氷酢酸−メタノール（１：３）で固定し、その細胞懸濁液を対物スライドに落として従来の染色体調製物を作成した。

ｂ）ＭＦＩＳＨ法
風乾した調製物を０.１％のパラホルムアルデヒドで固定し、一連のエタノール（７０％、８５％、１００％）中で乾燥した。染色体特異的な蛍光色素の組合せで標識した各染色体対に特異的なペインティング・プローブを含有するプローブ混合物（24×Cyte−MetaSystems' 24 color kit, MetaSystem GmbH, Altlussheim, Germany）を、製造業者の指示書に従って、７５℃の水浴中で６分間変性させ、短時間氷上に置き、ついで３７℃のインキュベーター中で３０ないし６０分間維持した。染色体のＤＮＡは２×ＳＳＣ、ｐＨ７.０中の７０％のホルムアルデヒド中で２分間変性させ、スライドを、各々７０％、８５％および１００％のエタノール中で乾燥させ、３７℃の加温プレート上に置いた。プローブをスライド上の染色体にアプライし、ラバーセメント（Starkey Chemical Co., IL, USA）を用いてカバーガラスを覆った。スライドを加湿チャンバー中、３７℃にて３ないし５日間インキュベートした。

そのスライドを２×ＳＳＣ、ｐＨ７.３、４２℃中の５０％のホルムアミドで２×５分間、ついで２×ＳＳＣ、ｐＨ７.０、４２℃中のもので２×５分間、および０.０１％のＴｗｅｅｎ２０（＝ＳＳＣＴ）、ｐＨ７.０を含む４×ＳＳＣ中で１分間洗浄した。ビオチン標識は、製造業者の指示書に従って１または２層のストレプトアビジン−Ｃｙ５で検出し（B-tech kit, MetaSystems GmbH）、調製物をantifadeおよびＤＡＰＩ(B-tech kit, Metasystems GmbH)中でマウントした。

中期をＵＶ顕微鏡（Axioplan imaging 2, Zeiss, Germany）を用いて撮影し、ＭＦＩＳＨ−プログラムモジュールとMetaSystems GmbHのコンピュータ・プログラムＩｓｉｓを用いて解析した。

ブレークポイントは従来のＧ−バンド染色法（Verma, R. S.およびBabu, A., Human Chromosomes. Manual of basic techniques, 初版, Pergamon Press, New York, 1989)を用いてさらに明らかにし、そこではマーカー染色体および欠失した染色体の中のこれらの転座した染色体を見出すことが可能である。

１ｃ）ＳＫＹ法（ＭＦＩＳＨの代替法）
ＳＫＹ［Schroeck, E.ら, Science 273 (1996) 494-497によって記載された］は、ＡＳＩ(Applied Spectral Imaging）によって推奨されているごとく行った。簡単には、プローブ混合物（ＳＫＹキット, ASIからの）を３７℃にて１時間変性およびインキュベートした。スライドを７０％のホルムアミド／２×ＳＳＣ中で変性させ、脱水した。そのプローブを中期の展開にアプライして、３７℃にて２日間ハイブリダイズさせた。ビオチニル化プローブはアビジン−Ｃｙ５で検出し、マウス抗ジゴキシゲニン抗体とジゴキシゲニン標識プローブにつづいてＣｙ５.５にコンジュゲートしたヤギ抗マウス抗体で検出した。

ＭＦＩＳＨまたはＳＫＹのいずかを用いて、ブレークポイントは、ＣＴＣＬの白血病形態であるセザリー症候群（ＳＳ）に罹った６患者のうちの５患者において、およびＣＴＣＬの亜型である菌状息肉腫（ＭＦ）を患う２の患者において、領域１２ｑ１４−１２ｑ２４に観察された。ＳＳを患う３の患者においては、染色体構成要素は染色体１８ｐまたは１８ｑ１２−ｑ２１に転座し（図３）、１の患者においては第４染色体に転座していた（図２）。

実施例２
転座の特徴付け
対立遺伝子特異的なＹＡＣプローブまたはＢＡＣプローブ（YAC-probes, CEPH, Fondation Jean Dausset, FranceからのYAC; Research Genetics, Groningen, tThe NetherlandsからのBAC-probes）を用いることによるＦＩＳＨを用いて転座をさらに明らかにした。ＹＡＣはＡＨＣブロス中で増殖させ、Genomesystems（St. Louis, Missouri, USA）の指示書に従って精製した。ＢＡＣはResearch Genetics（Groningen）の指示書に従って増殖および精製した。ＹＡＣおよびＢＡＣは両方ともＦＩＴＣ（フルオレセイン−１２−ｄＵＴＰ, NEN Life Science Products, Inc, Boston, MA, USA）、Alexa 488（登録商標）またはAlexa 594（登録商標）（両方とも、Molecular probes, Leiden, The Netherlands）またはビオチン（Oncor Inc. Gaithersburg, MD, USA）でニックトランスレーションを用いて標識した。ＢＡＣはResearch Genetics（Groningen）の指示書に従って増殖および精製した。ＹＡＣ ８０３−Ｃ−２およびＢＡＣ ＲＰ１１−３５９Ｍ６に関しては、発明の詳細な説明の章を参照されたい。

含まれる染色体は、ビオチン（Oncor Inc. Gaithersburg, MD, USA）またはジゴキシゲニン（Oncor Inc.）で標識した第１２染色体または第１８染色体のセントロメア特異的プローブで同定した。ビオチン標識は、２層のアビジンＣｙ３(ExtrAvidin-Cy3コンジュゲート, Sigma-Aldrich, Saint Louis, Missouri, USA)およびそれらの間のビオチニル化抗アビジン抗体（ヤギ, Vector)を用いて検出した。ジゴキシゲニン標識は、ヒツジにおいて生成した抗ジゴキシゲニン抗体(Roche, Mannheim, Germany)につづいてロバにおいて生成し、ＦＩＴＣ(Jackson West Grove, Pennsylvania, USA)で標識した抗−ヒツジ抗体を用いて検出した。調製物はＤＡＰＩを含むVectashield（登録商標）(Vector Laboratories, Inc, Burlingame, CA, USA)を用いてマウントした。

中期はＵＶ顕微鏡（Axioplan imagining 2, Zeiss, Germany）を用いて撮影し、
ＭＦＩＳＨ−プログラムモジュールとMetaSystems GmbHのコンピュータ・プログラムＩｓｉｓを用いて分析した。

前記した方法を用いて、ブレークポイントは２の患者において領域１２ｑ１４−ｑ２１.３に特定された（図３）。

実施例３
転座中のＮＡＶ３遺伝子の同定
転座をさらに同定するために、さらなるプローブをＦＩＳＨに用いた。実施例２に記載したごとく、ＹＡＣ ８５５Ｆ７（ＣＥＰＨ）を増殖させ、精製し、ニックトランスレーションを用いてジゴキシゲニン−１１−ｄＵＴＰ（Roche）で標識した。ハイブリダイゼーションは実施例２に前記したごとく行い、ハイブリダイズしたプローブはヒツジ抗ジゴキシゲニン−ローダミン抗体（Roche, Mannheim）を用いて検出した。

ハイブリダイズしたプローブは撮影し、紫外線顕微鏡およびＩｓｉｓ ３−コンピュータ・プログラムを用いて分析した（図８）。ＳＳに苦しむ患者３からの試料においては、ＹＡＣ ８５５Ｆ７が２の染色体１２ｑおよび１８ｑの間に分割された。さらなるＹＡＣを用いる他のハイブリダイゼーションにおいては、ＹＡＣはＹＡＣ ８５５Ｆ７上の領域に位置したＹＡＣ（図８、患者応答ブロックを参照されたい）は異常な１２ｑのその対応する場所に残存して、ＹＡＣ ８５５Ｆ７以下のＹＡＣは異常な１２ｑから異常な染色体１８ｑに転座することが見出された。患者１および２からの試料においては、ＹＡＣ ８５５Ｆ７は正常な第１２染色体のホモログにのみ存在し、いずれの他の染色体においても見えなかった。ＮＡＶ３と同様に、ＹＡＣ ８５５Ｆ７に表される遺伝子の１のホモログのみが細胞中に存在した。

ＹＡＣ−コンティグ１２.４（ＮＩＨ： www. ncbi. nlm. nih. gov)の一部分であるＹＡＣ ８５５Ｆ７は、マーカーＣＨＬＣ.ＧＡＴＡ６５Ａ１２およびＷＩ−６４８７の間の領域に広がる。５の連続する遺伝子座、すなわちＬＯＣ２５５３７９、ＬＯＣ２５５３１５、ＬＯＣ２０４０４０、ＬＯＣ１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８は、対応するゲノムコンティグ（ＮＴ ００９５５１）中にＮＣＢＩデータベース(www.ncbi. nim. nih. gov)から見出された。遺伝子座およびＢＡＣ特異的ＳＴＳ−マーカー（各々、ＳＨＧＣ−１５５０３４、Ｇ６２４９８、ＳＨＧＣ−７９６２２およびＷＩ−６４８７）のＰＣＲおよびＢＬＡＳＴＡコンピュータ分析(www. ncbi.nim. nih. gov)によって、これらの遺伝子座がＹＡＣ ８５５Ｆ７ ＤＮＡおよび４のＢＡＣ ＲＰ１１−７８１Ａ６、ＲＰ１１−４９４Ｋ１７、ＲＰ１１−１３６Ｆ１６およびＲＰ１１−３６Ｐ３（各々、受託番号ＡＣ０７３５５２．１、ＡＣ０２２２６８．５、ＡＣ０７３５７１．１４およびＡＣ０７３６０８．１９）中に位置することが判明した。

４のＢＡＣ、ＲＰ１１−７８１Ａ６、ＲＰ１１−４９４Ｋ１７、ＲＰ１１−１３６Ｆ１６およびＲＰ１１−３６Ｐ３は前記したごとく精製し、標識し、ハイブリダイズさせ、撮影した。ＳＳに苦しむ患者３からの試料においては、ＢＡＣ ＲＰ１１−７８１Ａ６およびＲＰ１１−４９４Ｋ１７は異常な第１２染色体中のそれらの位置に残存していたが、ＲＰ１１−１３６Ｆ１６およびＲＰ１１−３６Ｐ３は染色体１８ｑに転座していた。ＳＳ患者１および２からの試料においては、ＢＡＣ ＲＰ１１−３６Ｐ３に対応する１のホモログが正常な１２ｑにのみ存在するシグナルを全体的に欠いていた（図８、拡大部分）。

ＢＬＡＳＴＡ解析およびMaesら(2002)によれば、前記遺伝子座２５５３１５、２０４０４０、１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８は一緒になってＲＡＩＮＢ１−遺伝子ホモログであるニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）を形成する。この遺伝子は配列番号：１（ＡＦ３９７７３１）、あるいは３を有する。

ＢＡＣ ＲＰ１１−４９４Ｋ１７は遺伝子座２５５３１５およびほぼ全体の遺伝子座２０４０４０を含む。後者の遺伝子座の一部分はＢＡＣ １３６Ｆ１６、ならびに全体遺伝子座１２１３１８およびＫＩＡＡ０９３８の小さい部分にも表されている。ＢＡＣ ＲＰ１１−３６Ｐ３は全体の遺伝子座ＫＩＡＡ０９３８を含むが、遺伝子座１２１３１８の配列は含まない。ＢＡＣ ７８１Ａ６は遺伝子座２５５３７９および遺伝子座２５５３１５の小さい部分を含む（図９）。したがって、患者３の試料中の転座においては、ＮＡＶ３遺伝子は、一部分が染色体１２ｑに残存するが、他の部分が染色体１８ｑに転座するように２の部分に分かれる。調べた２の他のＳＳ患者からの試料においては、遺伝子（ＢＡＣ ＲＰ１１−３６Ｐ３）の少なくとも最小の低い部分は全体的に欠失している。

図１は、ＳＳ患者からの試料中の染色体１２ｑ（ワインレッド色）および染色体１８ｑ（赤色）の間の転座のＳＫＹ−分析を示す。 図２は、染色体１２ｑ、４ｑおよび１０間の転座のＦＩＳＨ−解析を示す。 図３は、染色体試料のＦＩＳＨ分析を示す。図３Ａ）は同一細胞中の第１２染色体と第１８染色体とのカラー組合せを表す。 図３は、染色体試料のＦＩＳＨ分析を示す。図３Ｂ）は同一細胞中の第１２染色体と第１８染色体とのカラー組合せを表す。 図４は、ＢＡＣ ３６Ｐ３およびＹＡＣ ８５７Ｆ６を用いた第１２染色体および第１８染色体間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。最上部のサブウインドウは正常な第１２染色体を示しており：セントロメアは赤色シグナルを与え；ＢＡＣ ３６Ｐ３はセントロメア下の小さな赤色シグナルを与え；ＹＡＣ ５８７Ｆ６は緑色シグナルを与えている。 図５は、ＳＳ患者からの試料中におけるＢＡＣ ３６Ｐ３を用いた第１２染色体（セントロメア 赤色）および１８ｑ（セントロメア 緑色）間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。 図６は、ＢＡＣ ７８１Ａ６（緑色）およびＢＡＣ １３６Ｆ１６（赤色およびワインレッド色）を用いた第１２染色体と第１８染色体との間の転座のＦＩＳＨ分析を示している。 図７は、ＢＡＣ ４９４Ｋ１７（緑色）およびＢＡＣ １４４Ｊ４（１２ｑ２４）（赤色）を用いた第１２染色体のＭＦＩＳＨ分析を示している。 図８は、すべてＣＴＣＬの白血病亜型であるＳＳに罹った患者１、２および３において観察された異常な第１２染色体中の幾つかの対応する遺伝子を用いたＦＩＳＨアッセイにおけるＹＡＣ、ＢＡＣまたはＰａｃ（Ｐ１）プローブのシグナルを示している。 図９は、ＢＡＣプローブを用いて行ったＦＩＳＨで検出された患者３における転座に含まれていたＮＡＶ３遺伝子の一部分を示している。

【配列表】

Claims (21)

1. 生物試料において、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイント（breakpoint）および／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座の存在または不存在を検出することによって特徴付けられ、ここに該ブレークポイントおよび転座がリンパ球異常増殖疾患と関連している、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡（follow-up）する方法。
2. 生物試料において、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの存在または不存在を検出することによって特徴付けられ、ここに該ＮＡＶ３またはその等価物またはフラグメントがリンパ球異常増殖疾患と関連している、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡する方法。
3. 臨床試料において、第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物の転座または欠失または他の欠陥の存在または不存在を検出することによって特徴付けられ、ここに該転座または欠失または他の欠陥がリンパ球異常増殖疾患と関連している、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断および追跡する方法。
4. リンパ球異常増殖疾患に苦しむ患者から得た生物試料において、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座および／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの転座または欠失または他の欠陥を検出することによって特徴付けられ、ここに該染色体のブレークポイントまたは転座および遺伝子の転座、欠失または欠陥が疾患亜型と関連している、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患の攻撃形態の発達の危険性のある患者を同定する方法。
5. 第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の少なくとも１の転座および／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの転座または欠失または他の欠陥を検出することによって特徴付けられ、ここに該染色体のブレークポイントまたは転座および遺伝子の転座、欠失または欠陥が疾患亜型と関連している、原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）のごときリンパ球異常増殖疾患の進行を予想する方法。
6. 第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントを領域１２ｑ１４−１２ｑ２４中に検出することによって特徴付けられる請求項１または３ないし５いずれか１項記載の方法。
7. 第１２染色体由来の構成要素の第４染色体または第１８染色体への転座を検出することによって特徴付けられる請求項１または３ないし５いずれか１項記載の方法。
8. 第１２染色体、領域１２ｑ１４−１２ｑ２４中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントおよびその第４染色体または第１８染色体への転座を検出することによって特徴付けられる請求項１または３ないし５いずれか１項記載の方法。
9. ＮＡＶ３遺伝子の一部分の第１８染色体への転座を検出することによって特徴付けられる請求項１または３ないし５いずれか１記載の方法。
10. 検出を、特異的な発色、スペクトル、発色比または発色強度またはそれらの組合せで第１２染色体を検出する染色体特異的またはアーム特異的なペインティング・プローブ（painting probe）に基づく蛍光イン・サイチュ（in situ）・ハイブリダイゼーション法で行うことを特徴とする請求項１ないし９いずれか１項記載の方法。
11. 検出を、マルチ蛍光イン・サイチュ・ハイブリダイゼーション（ＭＦＩＳＨ）または分光核型決定（ＳＫＹ）で行うことを特徴とする請求項１０記載の方法。
12. 第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントが原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）と関連していることを特徴とする請求項１ないし１１いずれか１項記載の方法。
13. 原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）が菌状息肉腫（ＭＦ）であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
14. 原発性皮膚Ｔ細胞リンパ腫（ＣＴＣＬ）が白血病セザリー症候群（ＳＳ）であることを特徴とする請求項１２記載の方法。
15. ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断するための、第１２染色体中の特定の染色体ブレークポイントおよび／または第１２染色体からの染色体構成要素の転座の使用であって、ここに該ブレークポイントおよび転座が該疾患と関連している該使用。
16. リンパ球異常増殖疾患の療法を開発するための、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連する特定の染色体ブレークポイントまたは転座または特定の複数の染色体ブレークポイントまたは転座の使用。
17. ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患を診断するための、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントのおよび／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子の転座、欠失または他の欠陥の使用であって、ここに該遺伝子、転座、欠失または欠陥が該疾患と関連している該使用。
18. ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患の療法における、該疾患と関連するニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントの、および／または該疾患と関連する第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子の転座、欠失または他の欠陥の使用。
19. 第１２染色体中の染色体ブレークポイントまたは複数のブレークポイントに広がり、異なる発色または蛍光マーカーで標識され、かつ生物試料中の第１２染色体にハイブリダイズする少なくとも２のＤＮＡプローブ、および蛍光イン・サイチュ（in situ）・ハイブリダイゼーション分析を行うための試薬を含むことによって特徴付けられる、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントまたはその転座（ここに該ブレークポイントまたは転座はＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連している）を検出するための、または、ＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患に苦しむ患者から得た臨床標本中の第１２染色体中の分子細胞遺伝学的変化を同定するための試験系。
20. ＮＡＶ３またはその遺伝子産物またはフラグメントを同定することができる特異的抗体、好ましくはモノクローナル抗体、および視覚化または定量に必要である他の抗体、マーカーおよび標準物質を含む必要な試薬、ならびにバッファー、希釈剤、洗浄溶液などを含むことによって特徴付けられる、第１２染色体中の少なくとも１の特定の染色体ブレークポイントまたはその転座（該ブレークポイントまたは転座はＣＴＣＬのごときリンパ球異常増殖疾患と関連している）を検出するための、または、ニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子またはその等価物またはフラグメントおよび／または第１２染色体中のニューロンナビゲーター３（ＮＡＶ３）遺伝子の転座、欠失または他の欠陥を検出するための診断キット。
21. 第１２染色体中のＮＡＶ３遺伝子またはその等価物またはフラグメントの不存在を検出することによって特徴付けられる請求項２記載の方法。
    

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