KR102353374B1 - 결장직장암 분류를 위한 마커 유전자, 결장직장암의 예후를 위한 림프노드 전이를 판단하는 방법 및 이를 위한 키트 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 결장직장암 대상체의 분류, 예후 예측 및 치료 결정 안내를 위한 객관적 및 정량적 방법에 사용하기 위한 유전자 SLC35 D3, POSTN, KLK6 및 MUC2를 포함하는 분자 바이오 마커 군을 제공한다. 보다 상세하게는, 본 발명은 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드, 원발성 장 종양, 혈액 또는 대변 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및/또는 MUC2의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계를 포함하는, 대상체의 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법을 제공한다.
Description
본 발명은 암, 특히 결장직장암의 분류, 예후 및 치료 분야에 관한 것이다.
결장직장암(colorectal cancer, CRC)은 전 세계의 암 환자 중에서 두 번째로 주된 사망 원인이며, 전 세계적으로 세 번째로 가장 많이 진단되는 암의 형태이다. 이는 의료 시스템에 막대한 부담을 안겨준다. CRC의 가장 중요한 예후 특징은 림프노드(lymph node) 전이의 존재 또는 부재이다(Chang G. J. et al. J. Natl. Cancer Inst., vol.99, p. 433-441 (2007); Iddings D. and Bilchik A. J. Surg. Oncol., vol. 96, p. 671-677 (2007); Nicastri D. G. et al. J. Mol. Diagn., vol. 9, p. 563-571 (2007)). 관련 림프노드는 환자가 치료를 위해 절제될 경우에만 조사할 수 있다. 따라서, 절제된 종양 표본에서 림프노드 상태의 철저한 결정이 중요하다. 현재, 종양 세포 양성 림프노드가 있는, 즉 III기 CRC(임의의 TN1-2M0) 환자의 대략 50% 및 종양 세포 양성 림프노드가 검출되지 않은, 즉 I기(T1-2 N0M0) 및 II기(T3-4N0M0) 환자의 약 25%는 재발할 것이다(Bockelman C. et al. Acta Oncol., vol. 54, p. 5-16 (2015)). 이들 결과는 림프노드에서의 종양 세포가 공격성이 다양할 수 있고, 많은 경우 노드에서 종양 세포의 존재를 현재의 표준 방법에 의해 놓치게 된다는 점을 강력하게 시사한다. 따라서, 1) 림프노드에서 종양 세포의 존재를 정확하게 검출하고, 2) 그것들의 전이 가능성, 즉, 그것들의 공격성을 결정하는 것이 가장 중요하다. 림프노드 상태의 결정인 N 병기결정(N-staging)을 개선하고 확산 종양 세포에 대한 공격성 파라미터를 도입함으로써 개선된 병기 결정이 달성될 것이며, 이에 의해 I기 및 II기 환자의 불충분한 치료 및 III기 환자의 과잉 치료를 피할 것이다. 또한, 림프노드에 종양 세포가 있는 환자가 재발 및 암 사망 위험의 차이에 따라 하위 그룹으로 분류될 수 있을 경우, 이 정보는 현재의 약물치료를 위해서뿐만 아니라, 새로운 약물, 새로운 치료 스케줄의 개발에, 그리고 재발 등의 위험에 대해 조정된 후속 스케줄을 위해서도 이용될 수 있다.
임상 실무에서, 림프노드 전이의 존재 또는 부재는 현재 절제된 국소(regional) 림프노드의 헤마톡실린 & 에오신(H&E) 염색된 조직 절편의 조직병리학적 검사에 의해 결정된다. 현재의 지침은 적어도 12개의 림프노드를 검사해야 한다고 규정하고 있다(Tsai H. L. et al. BMC Surg., vol. 16, p. 17 (2016)). TNM 분류에서, N1은 1개 내지 3개의 검사된 노드가 종양 세포의 존재에 대해 양성이었고, N2는 4개 내지 6개의 노드가 양성이었음을 나타낸다. N2 환자는 N1 환자보다 더 불량한 예후를 갖는다. 게다가, 림프노드 비율, 즉, 검사한 림프노드의 총 수에 대한 양성 림프노드의 수는 중요한 예후 인자이며, 비율이 높을수록 예후가 더 나쁘다(Parnaby C. N. et al, Br. J. Cancer, vol. 113, p. 212-219 (2015)). 통상의 방법에 의해 세포를 놓치는 주된 이유는 두 가지이다: 너무 작은 샘플 크기와 불충분한 민감도. 기껏해야 림프노드 부피의 몇 %만이 조직 절편의 H&E 염색에 의해 검사된다. 대안적인 방법은 이 유형의 모든 종양 세포에서 발현되는 하나 또는 여러 개의 바이오 마커의 mRNA 수준을 결정하는 것, 그리고 전체 림프노드로부터 또는 윤리적인 이유로 현재의 옵션인 절반의 림프노드로부터 RNA를 추출하는 것이다. 카피 표준물질(copy standard)을 이용한 실시간 정량적 역전사효소-중합효소 연쇄반응(qRT-PCR) 분석법은 바이오 마커의 mRNA 분석에 가장 유용한 방법인 것으로 밝혀진 바 있다. 이 분석법은 매우 민감하고, 객관적이며, 정량적이고, 자동화를 위해 수정 가능하다. 바이오 마커인 암배아 항원(CEA, CEACAM5)의 mRNA 분석은 대장으로부터 유래하는 종양 세포의 검출에 매우 유용한 것으로 나타났다. 이 바이오 마커는 현재의 최적 표준(gold standard), 즉 H&E 염색된 절편의 조직병리학에 의해 검출되지 않은 림프노드에 종양 세포가 있는 I기 및 II기 환자의 확인을 가능하게 하였다(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006); Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)). 이들 환자 중 일부는 재발성 질환으로 사망하였다(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006); Ohlsson L. et al. Int.J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)). 따라서 최적 표준만을 비교하였을 때 이 마커를 사용함으로써 더욱 정교한 계층화가 얻어졌다. 바이오 마커 시토케라틴 20(CK20) 또한 다소 민감도가 떨어지긴 하지만 이 목적에 유용하다(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006). 현재 공격성 마커의 성질을 나타내는 공개된 CRC 바이오 마커는 단 하나, 즉 칼리크레인 관련 펩티드 분해효소 6(kallikrein related peptidase 6, KLK6)이다(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 107, p. 150-157 (2012)) 뿐이다. 그것은 CRC 종양 세포에서 이소성으로(ectopically) 발현되며, 공격성이 증가함에 따라 점점 더 높은 수준으로 발현되는 것으로 보인다.
CRC에서 원격 전이의 발생에 대해 일반적으로 수용되는 경로는 종양 세포가 림프관을 통해 결장 또는 직장의 원발(primary) 부위를 떠나 국소 림프노드에 먼저 자리잡고, 그 후에 간과 같은 먼 부위로 확산되는 것이다. 결국, 환자를 사망하게 하는 것은 원격 전이이다. 이 경로에 대한 증거는 국소 림프노드에서의 종양 세포의 존재 또는 부재가 CRC 사망 또는 생존에 대한 최선의 예후 마커라는 사실이다.
본 발명은 1) CRC에 대한 2개의 새로운 공격성 바이오 마커; CRC 종양 세포 자체에서 발현되는 바이오 마커 및 림프노드의 미세환경에서의 지지 세포에서 발현되는 바이오 마커의 확인, 및 2) 림프노드에서 종양 세포의 존재 또는 부재를 정확하게 검출하는 것 이외에도 이들 세포의 공격성에 대한 정보를 제공하는, 림프노드 상태의 결정 방법에 관한 것이다. 제안된 방법에서, 2개의 새로운 바이오 마커 및 3개의 이전에 기술된 바이오 마커의 정량적 mRNA 수준이 결정된다. CRC 림프노드 분석에 적용될 경우, 그것은 림프노드 병발(involvement)을 정확하게 결정하고, CRC 환자를 1차 치료, 즉 종양의 외과적 절제 후 재발 및 암 사망의 위험과 관련하여 상이한 위험군으로 분류할 수 있게 한다. 이 목표는 지금까지는 달성할 수 없었다.
본 발명의 목적은 결장직장암을 앓는 대상체의 분류, 예후의 예측 및 치료 결정 안내(guiding)에 유용한 분자 바이오 마커 군을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 대상체에서 결장직장암을 분류하기 위한 것뿐만 아니라, 대상체의 예후를 예측하고 대상체에 대한 치료 결정을 내리기 위한 분류에 사용하기 위한 객관적이고 정량적인 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 유전자 용질 담체 패밀리 35 멤버 D3(solute carrier family 35 member D3, SLC35D3)(GenBank NM_001008783) 및 골아세포 특이적 인자인 페리오스틴(periostin, osteoblast specific factor, POSTN)(GenBank NM_006475)의 발현 수준을 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 데 이용할 수 있는 분자 바이오 마커로서 확인하였다.
유전자 SLC35D3 및 POSTN의 발현 수준은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성 결정을 위하여, 바람직하게는 유전자 칼리크레인 관련 펩티드 분해효소 6(kallikrein related peptidase 6, KLK6)(GenBank NM_002774)의 발현 수준과 함께 이용될 수 있고, 훨씬 더 바람직하게는 유전자 뮤신 2(올리고머성 점액/겔 형성)(MUC2)(GenBank NM_002457)의 발현 수준과도 함께 이용될 수 있다.
방법은 대상체로부터 얻은 국소 림프노드 샘플에서 또는 대상체로부터 얻은 원발성 장 종양, 혈액 및/또는 대변 샘플에서 유전자 발현 수준을 결정하기 위하여 적용될 수 있다.
이들 유전자의 발현 수준은 공지된 종양 마커이고/이거나 18S rRNA의 수준과 관련이 있는 유전자인 암배아 항원 관련 세포 부착 분자 5(carcinoembryonic antigen related cell adhesion molecule 5, CEACAM5)(GenBank NM_004363)의 발현 수준과 관련될 수 있다.
따라서, 본 발명의 일 양태는 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준(reference) 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하고,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있다.
바람직하게는, 방법은 상기 샘플에서 유전자 KLK6의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
따라서, 일 구현예에서, 본 발명의 제1 양태는 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하고,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있다.
바람직하게는, 방법은 상기 샘플에서 유전자 MUC2의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계를 더 포함할 수 있다.
따라서, 또 다른 구현예에서, 본 발명의 제1 양태는 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하고,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있다.
바람직하게는, 방법은
c) 상기 샘플에서 유전자 CEACAM5의 유전자 발현 수준 및 18S rRNA의 수준을 결정하는 단계;
d) 단계 a) 및 c)에서 얻어진 결과를 기초로, SLC35D3/CEACAM5, KLK6/CEACAM5, POSTN/18S rRNA 및 MUC2/CEACAM5의 비율을 계산하는 단계;
e) 단계 d)에서 얻어진 비율이 상기 기준 환자 집단에서의 동일한 비율에 기초한 컷오프(cut-off) 값보다 큰지에 따라 상기 비율에 (+1) 또는 (0)의 값을 제공하고, 컷오프 값보다 큰 비율은 (+1)의 값을 얻고 컷오프 값보다 작은 값은 (0)의 값을 얻는 단계; 및
f) 단계 e)에서 얻어진 비율 및 식 [A = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5]를 이용하여 지수(index)를 계산하는 단계
를 더 포함할 수 있고, 여기에서 지수 (+3)은 매우 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있고, 지수 (+2) 및 (+1)은 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있으며, 지수 (0) 및 (-1)은 낮은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있다.
상기 컷오프 값은 상기 기준 환자 집단의 7 십분위(7th decile)의 비율, 상기 기준 환자 집단의 3 사분위(3rd quartile)의 비율, 또는 상기 기준 환자 집단의 8 십분위의 비율일 수 있다.
방법은 시험관 내(in vitro)에서 및/또는 생체 외(ex vivo)에서 수행될 수 있다.
방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 결장직장암을 치료하는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법을 제공하며, 이는
a) 대상체로부터 얻어진 원발성 장 종양, 혈액 또는 대변 샘플에서 유전자 SLC35D3, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계;
b) 단계 a)에서 얻어진 결과를 기초로, SLC35D3/CEACAM5, KLK6/CEACAM5 및 MUC2/CEACAM5의 비율을 계산하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 결정된 비율을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 발현 수준으로부터 계산된 기준 비율과 비교하는 단계
를 포함하고,
여기에서 기준과 비교하여 더 높은 SLC35D3/CEACAM5 및 KLK6/CEACAM5의 비율은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있고, 기준과 비교하여 더 높은 MUC2/CEACAM5의 비율은 감소된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있다.
방법은 시험관 내에서 및/또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 결장직장암을 치료하는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따르면, 유전자 발현 수준은 상기 유전자로부터 발현된 mRNA의 양을 정량함으로써 결정될 수 있다.
mRNA의 양은 혼성화, 시퀀싱 또는 정량적 RT-PCR에 의해 결정될 수 있다.
보다 상세하게는, mRNA의 양은 마이크로어레이 및 비드 어레이 기술, 전사체(transcriptome) 시퀀싱, 실시간 정량적 RT-PCR, 다중 정량 RT-PCR로부터 선택되는 방법을 이용하여 결정될 수 있다.
방법에 따르면, 유전자 발현 수준은 RNA 또는 DNA 카피 표준물질을 이용하여 결정될 수 있고/있거나, 18S rRNA 수준은 18S rRNA 표준물질을 이용하여 결정될 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 결장직장암으로 진단된 대상체의 예후를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 낮은 경우 대상체가 좋은 예후를 갖는다고 결정하거나, 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 높은 경우 대상체가 불량한 예후를 갖는다고 결정하는 단계를 포함할 수 있다. 불량한 예후는 좋은 예후와 비교하여 생존 가능성이 감소하는 것일 수 있다.
방법은 시험관 내에서 및/또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 결장직장암을 치료하는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 결장직장암으로 진단되고 종양을 가지고 있는 대상체의 치료를 결정하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 단계 및 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 결정됨에 따라 상기 대상체에 대한 치료를 결정하는 단계를 포함할 수 있다.
방법은 시험관 내에서 및/또는 생체 외에서 수행될 수 있다.
방법은 이를 필요로 하는 대상체에서 결장직장암을 치료하는 추가적인 단계를 더 포함할 수 있다.
치료는 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 갖는 것으로 결정된 환자에게 수술 후 치료, 예를 들어 화학요법을 제공하는 것일 수 있다.
치료는 낮은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 갖는 환자에 대한 수술 후 치료를 중단하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다. 키트는 유전자 CEACAM5, KLK6, POSTN, SLC35D3 및 MUC2 중 1종 이상의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머와 프로브 및 선택적으로 18S rRNA의 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머와 프로브를 포함할 수 있다.
일 구현예에서, 본 발명은 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 SLC35D3, POSTN 및 MUC2의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트를 제공한다.
핵산 프라이머 및 프로브는 표 1에 제공된 것들로부터 선택될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 핵산 프라이머 및 프로브는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택될 수 있다.
키트는 mRNA, RNA 및/또는 DNA 카피 표준물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 결장직장암의 치료 방법을 제공한다. 상기 방법은 본 발명에 따른 방법을 이용하여 대상체에서 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 단계 및 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 결정됨에 따라 상기 대상체를 치료하는 단계를 포함할 수 있다.
치료는 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 갖는 것으로 결정된 환자에게 수술 후 치료, 예를 들어 화학요법을 제공하는 것일 수 있다.
치료는 낮은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 갖는 환자에게 수술 후 치료를 중단하는 것일 수 있다.
도 1. 원발성 CRC 종양(●)(n = 56) 및 정상 결장 조직(n = 5)(○)에서 CEACAM5, MUC2, KLK6, POSTN 및 SLC35D3 mRNA의 발현 수준.
도 2. I기 내지 IV기 CRC 환자 및 대조군 환자(Ctr)의 림프노드에서 (A) SLC35D3 및 (B) POSTN mRNA 발현 수준. 166명의 CRC 환자 및 23명의 대조군 환자 각각은 최고 mRNA 값을 갖는 림프노드로 대표된다.
도 3. I기 내지 IV기 CRC 환자로부터의 림프노드에서 CEACAM5 mRNA에 대한 바이오 마커 mRNA의 비율. 166명의 환자 각각은 최고 mRNA 값을 갖는 림프노드로 대표되며, 채워진 원으로 나타낸다.
도 4. CRC 환자(n = 166)에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier)에 따른 누적 생존 곡선. 환자는 바이오 마커 SLC35D3, POSTN, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 mRNA 값에 기초하여 그룹(-1, 0, +1, +2 및 +3)으로 분류되고, 식에 따라 계산된다(식 A = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5). 각 마커에 대한 mRNA 값의 8 십분위를 이용하여 마커 값을 양성 또는 음성으로 분류하여, 전자에 (1)의 값을 후자에 (0)의 값을 부여하였다. 최고 CEACAM5 mRNA 값을 갖는 림프노드가 환자를 대표하는 것으로 선택되었다. 자세한 사항은 본문 참조.
도 5. CRC 환자(n = 166)에 대한 카플란-마이어에 따른 누적 생존 곡선. 환자는 바이오 마커 SLC35D3, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 mRNA 값에 기초하여 환자를 그룹(-1, 0, +1, 및 +2)으로 분류되고, 식에 따라 계산된다(식 E = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5). 자세한 사항은 도 4에 대한 설명 및 본문 참조.
도 2. I기 내지 IV기 CRC 환자 및 대조군 환자(Ctr)의 림프노드에서 (A) SLC35D3 및 (B) POSTN mRNA 발현 수준. 166명의 CRC 환자 및 23명의 대조군 환자 각각은 최고 mRNA 값을 갖는 림프노드로 대표된다.
도 3. I기 내지 IV기 CRC 환자로부터의 림프노드에서 CEACAM5 mRNA에 대한 바이오 마커 mRNA의 비율. 166명의 환자 각각은 최고 mRNA 값을 갖는 림프노드로 대표되며, 채워진 원으로 나타낸다.
도 4. CRC 환자(n = 166)에 대한 카플란-마이어(Kaplan-Meier)에 따른 누적 생존 곡선. 환자는 바이오 마커 SLC35D3, POSTN, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 mRNA 값에 기초하여 그룹(-1, 0, +1, +2 및 +3)으로 분류되고, 식에 따라 계산된다(식 A = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5). 각 마커에 대한 mRNA 값의 8 십분위를 이용하여 마커 값을 양성 또는 음성으로 분류하여, 전자에 (1)의 값을 후자에 (0)의 값을 부여하였다. 최고 CEACAM5 mRNA 값을 갖는 림프노드가 환자를 대표하는 것으로 선택되었다. 자세한 사항은 본문 참조.
도 5. CRC 환자(n = 166)에 대한 카플란-마이어에 따른 누적 생존 곡선. 환자는 바이오 마커 SLC35D3, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 mRNA 값에 기초하여 환자를 그룹(-1, 0, +1, 및 +2)으로 분류되고, 식에 따라 계산된다(식 E = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5). 자세한 사항은 도 4에 대한 설명 및 본문 참조.
실시예
결장직장암
대상체에서의
암 사망 위험과 유의미하게 관련이 있는 유전자 및 유전자 표지(gene signature)의 확인
종양 진행에 중요한 유전자는 원발성 종양 조직 및 장에서 배액시키는 국소 림프노드에 존재하는 2차 종양 양쪽 모두에서 발현될 가능성이 크다. III기 CRC 환자 4명의 4개의 상이한 H&E 양성 림프노드(즉, 종양 세포를 함유하는 림프노드) 및 이들 환자 중 3명으로부터의 3개의 원발성 종양으로부터 RNA를 분석하여 진행 마커에 대한 마이크로어레이 탐색을 수행하였다. 또한, 7명의 대조군 환자(2명의 궤양성 대장염 환자, 1명의 크론 대장염 환자, 1명의 대장 지방종 환자로부터의 림프노드 및 3개의 정상 결장 상피세포 샘플)로부터의 RNA를 분석하였다. CRC 샘플을 하나의 그룹으로서 모든 대조군 샘플에 대하여 개별적으로 비교하였다. 마이크로어레이 데이터는 통계적 유의성을 P < 0.05로, 배수 변화를 ≥ 5로, 최소 강도를 15로 설정하여 필터링 하였다. 이러한 방식으로 배수 변화가 ≥ 5배인 대부분의 CRC 샘플(≥ 5/7)에서 발현된 다수의 유전자를 확인하였다. 이들 중에 SLC35D3, POSTN 및 KLK6이 있었다.
상업적으로 이용 가능한 실시간 qRT-PCR 분석법을 이용하여 POSTN, SLC35D3 및 KLK6에 대한 마이크로어레이 결과(TaqMan 유전자 발현 분석법)를 검증하였다. 후자의 경우, 상이한 스플라이스 형태에 대해 3가지 경우를 분석하였다. 세 개의 유전자 모두가 원발성 CRC 종양 샘플의 패널(n = 8)에서 발현되었고, SLC35D3 및 KLK6은 모든 CRC 세포주(n = 5)에서 발현되었으나, POSTN은 그렇지 않았다.
| 유전자 |
3' 프라이머 서열
(역방향) |
5' 프라이머 서열
(정방향) |
프로브 서열 |
| SLC35D3 | AGC ACT CCC GTG ACG TAC C (서열 번호 1) |
TCA TCA CCA CCT GCG GC (서열 번호 2) |
CCT GGC AGG AGC CGG CGA (서열 번호 3) |
| POSTN | CCC TTG CTT ACT CCC TTT CTC (서열 번호 4) |
ACA GCT CAG AGT CTT CGT ATA TCG (서열 번호 5) |
ACA GCT GTC TGC ATT GA (서열 번호 6) |
| KLK6 | AAG GTT ATG CTT CCC CAG G (서열 번호 7) |
CTT ATC CAT CCA CTG TGG GTC (서열 번호 8) |
CAC TGC AAA AAA CCG AAT CTT CAG GTC (서열 번호 9) |
| MUC2 | TAG TGT CCA GCT CCA GCA TGA (서열 번호 10) |
AAG AGC GAT GCC TAC ACC AAA (서열 번호 11) |
TCC CGG TTC CAC ATG A (서열 번호 12) |
| CEACAM5 | TGT AGC TGT TGC AAA TGC TTT AAG (서열 번호 13) |
CTG ATA TAG CAG CCC TGG TGT AGT (서열 번호 14) |
AGG AAG ACT GAC AGT TGT (서열 번호 15) |
| 18S rRNA | CCG CTC CCA AGA TCC AA (서열 번호 16) |
GTA ATT CCA GCT CCA ATA GCG TA (서열 번호 17) |
CTG CAG TTA AAA AGC (서열 번호 18) |
기술된 바와 같은 Taqman EZ RT-PCR 기술((Fahlgren A. et al. Clin. Exp. Immunol., vol. 131, p. 90-101 (2003); Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011))을 이용하여 RNA 카피 표준물질을 이용한 실시간 qRT-PCR 분석법을 구축하였다. SLC35D3, POSTN, KLK6, MUC2 및 CEA, mRNA에 대한 실시간 qRT-PCR 분석을 위한 프라이머 및 프로브 서열을 표 1에 나타내고, RNA 카피 표준물질의 제작을 위한 프라이머를 표 2에 나타낸다. 이들 분석법을 이용하여, 원발성 CRC 종양, 정상 결장 조직 및 정제된 결장 상피세포, CRC 세포주, 말초 혈액 단핵구 세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC), 상이한 면역 세포주 및 섬유아세포 세포주를 포함하는 RNA 샘플의 패널을 분석하였다(표 3). 56개의 원발성 CRC 종양 및 5개의 정상 결장 샘플의 개별 값을 도 1에 나타낸다. 비교를 위해, CEACAM5 및 MUC2에 대한 결과가 포함되어 있다(Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011)).
비록 특정 mRNA가 암호화하는 단백질 분자의 풍부도(abundance)를 반영하는, CEACAM5에 대한 164의 중간값에서 SLC35D3에 대한 0.17까지의, 샘플 내의 18S rRNA 함량에 대해 정규화된 비록 매우 상이한 카피 수(copy number) 수준이긴 하지만, 모든 5개의 바이오 마커 mRNA가 원발성 CRC 종양에서 발현된다는 것은 명백하다.
둘째, CRC 세포주는 POSTN을 제외한 모든 마커 mRNA를 발현하며, POSTN은 대신 섬유아세포 세포주에서 높은 수준으로 발현된다.
셋째, 어떠한 마커도 면역 세포주에서 유의미한 정도로 발현되지 않는다.
넷째, CEACAM5는 원발성 CRC 종양 및 정상 결장 상피세포에서 유사한 수준으로 발현된다. 후자의 발견 및 이전의 지식(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006))에 기초하여, CEACAM5는 대장으로부터 유래하는 세포에 대한 바람직한 마커인 것으로 간주하였다. 나아가, 그것의 높은 발현 수준은 림프노드에서 결장직장암 세포의 검출을 위한 매우 민감한 마커가 된다.
다섯째, 결장 및 직장에서 지배적인 뮤신인 MUC2는 CRC 종양이 어느 정도까지 점액성인지의 여부를 측정한다. 점액성 종양 환자는 비 점액성 종양 환자보다 더 좋은 예후를 갖는다(Byrd J. C. and Bresalier R. S. Cancer Metastasis Review, vol. 23, p. 77-99 (204); Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)).
마지막으로, CEACAM5 및 MUC2와 대조적으로, KLK6 및 SLC35D3는 둘 다 CRC 종양 및 대부분의 CRC 세포주에서 발현되었으나, 정상 결장 상피세포에서는 그렇지 않았다. 즉, 그것들은 CRC 종양에서 이소적으로 발현된다.
| 유전자 |
3'
프라이머
서열
(역방향) |
5'
프라이머
서열
(정방향) |
| SLC35D3 | CAGCACTCCCGTGACGTAC (서열 번호 19) |
CATCGGCGTCCTGGTTC (서열 번호 20) |
| POSTN | CCCTTGCTTACTCCCTTTCTC (서열 번호 4) |
ACAGCTCAGAGTCTTCGTATATCG (서열 번호 5) |
| KLK6 | TGGATCACAGCCCGGA (서열 번호 21) |
TACACCTCGGGCCACTTG (서열 번호 22) |
| MUC2 | TAGTGTCCAGCTCCAGCATGA (서열 번호 10) |
CCGGGCTGCTCATTGAGA (서열 번호 23) |
| CEACAM5 | TGGCTAGGATGGTCTCGAT (서열 번호 24) |
GGACCTATGCCTGTTTTGTCT (서열 번호 25) |
| 18S rRNA | CGCTCCCAAGATCCAACTAC (서열 번호 26) |
GTAATTCCAGCTCCAATAGCGTA (서열 번호 17) |
| 공급원 | n | mRNA 카피/ 18S rRNA 단위 | |||||
| SLC35D3 | POSTN | KLK6 | MUC2 | CEACAM5 | |||
| 원발성 CRC 종양 | 56 | 0.1* (0.04-0.4) |
9.7 (4.6 - 22.2) |
2.9 (0.9-8.5) |
1.1 (0.3 - 4.2) |
175 (107- 283) |
|
| CRC 세포주 | 1** | LS174T | 0 | 0 | 79 | 4.3 | 328 |
| 1 | HT29 | 0.02 | 0 | 256 | 0.01 | 32 | |
| 1 | T84 | 0.7 | 0 | 316 | 0.5 | 33 | |
| 1 | HCT8 | 0.07 | 0 | 32 | 0.02 | 32 | |
| 1 | CaCo2 | 0.09 | 0.0009 | 0.4 | 0.04 | 3 | |
| 정상 결장 조직 | 5 | 0.02 | 5.9 | 0 | 9 | 222* | |
| 정상 결장 EC | 5 | 0.0009 | 0.2 | 0 | 32 | 300 | |
| PBMC | 1 | 0.06 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| 활성화 PBMC | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | |
| T 세포주 | 1 | Jurkat | 0 | 0.009 | 0 | 0 | 0 |
| B 세포주 | 1 | B6+KR4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 혈장 세포주 | 1 | U266 | 0 | 0.005 | 0 | 0 | 0 |
| 단핵구 세포주 | 1 | U937 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0.005 |
| 과립구 세포주 | 1 | HL60 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| 전-적혈구 세포주 | 1 | K562 | 0.09 | 0.001 | 0 | 0 | 0 |
| 섬유아세포 세포주 | 1 | FSU | 0 | 5.5 | 0 | 0.004 | 0.0002 |
| 간 전이 | 2 | 0.07 | 22.6 | 2 | 0.003 | 78 | |
| 정상 간 | 2 | 0 | 2.3 | 0 | 0.00004 | 0.01 | |
* 중간값 및 25 내지 75 백분위수(percentile)의 사분위간 범위. ** 세포주 및 PBMC, 3회 결정의 평균값. EC, 정제된 상피세포; PBMC, 말초 혈액 단핵구 세포; 0, < 0.00001 mRNA 카피/18S rRNA 단위.
CRC-사망 가능성 예측을 위한 혼합 바이오 마커 mRNA 분석의 적용
166명의 수술 치료를 받은 모두 4개의 TNM 시기결정(TNM staging)을 나타내는 CRC 환자로부터의 림프 노드의 임상 재료를 대상으로, 공지된 CEACAM5 mRNA, KLK6 mRNA, MUC2 mRNA 및 18S rRNA 발현 수준을 이용하여 SLC35D3 mRNA 및 POSTN mRNA의 발현 수준을 분석하였다. 600개가 넘는 림프노드로부터 총 mRNA를 분석하였다. mRNA 값을 18S rRNA에 대해 정규화하고, mRNA 카피/18S rRNA 단위로 표현하였다. 본 발명자 집단의 이전 연구는 18S rRNA가 정규화를 위한 우수한 RNA 종임을 증명한 바 있다(Bas A. et al, Scand. J. Immunol., vol. 59, p. 566-573 (2004); Ohlsson L. et al. Int. J. Cancer, vol. 130, p. 1833-1843 (2012)). 최고 mRNA 발현 수준을 갖는 노드를 추가 분석에서 환자를 대표하는 데 사용하였다. 이것은 H&E 양성 노드가 유익한 것으로 간주되는 반면, H&E 음성 노드는 모든 노드가 음성인 경우를 제외하고는 비정보적인 것으로 간주된다는 점에서 현재의 임상 실무와 유사하다. 도 2는 그 결과를 보여준다. 도 2는 또한, 비 CRC 대조군 환자로부터의 림프노드에 대한 mRNA 값을 보여주며, 점선은 이 대조군의 최고값을 나타낸다. III기 및 IV기 환자로부터의 림프노드는 I기 및 II기 환자로부터의 노드보다 더 많은 부분의 컷오프 수준 이상의 mRNA 값을 가진 노드를 나타낸다[SLC35D3: I기 = 18%, II기 = 9%, III기 = 25% 및 IV기 = 79%; POSTN: I기 =25%, II기 = 13%, III기 = 32% 및 IV기 = 69%].
SLC35D3- 및 POSTN mRNA 발현 수준의 분석 결과를 CRC 환자의 동일한 노드에서의 CEACAM5-, KLK6- 및 MUC2 mRNA에 대한 공지된 발현 수준과 조합하여 이용하였다(Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 95, p. 218-225 (2006); Ohlsson L. Thesis, ISBN 978-91-7459-318-1 (2011); Ohlsson L. et al. Br. J. Cancer, vol. 107, p. 150-157 (2012)). 5개의 바이오 마커에 대한 컷오프 수준을 다음과 같이 결정하였다: 최고 림프노드에서의 바이오 마커 발현 수준에 따라 환자의 순위를 매긴 다음, 동일한 수의 환자로 구성된 다섯 개 그룹으로 나누었다. 콕스 회귀 분석을 이용하여 무 질병(disease-free) 생존율와 관련하여 그룹을 비교하였다. 이 분석으로부터, 컷오프 수준을 8 십분위에서의 mRNA 발현 수준으로 정의하였는데, 이는 모든 5개의 마커에 대해, 8 십분위 미만의 그룹은 무 질병 생존율에서 유의미하게 다르지 않았기 때문이다. CRC 이외의 원인으로 사망한 환자는 무 질병으로 간주하였다. 환자를 컷오프 값보다 높은 mRNA 발현값과 컷오프 값보다 낮은 mRNA 발현값의 두 개의 그룹으로 나누고, 각 그룹에 대해 수술 후 평균 생존 기간을 카플란-마이어에 따른 누적 생존 분석에 의해 계산하고, CRC 재발 위험을 일변량 콕스 회귀 분석에 따라 추정하였다. 5개의 바이오 마커에 대한 결과를 표 4에 나타낸다. 보다시피, 바이오 마커 전부에 대해 컷오프 수준 이상의 mRNA 값은 매우 유의미한 P-값을 갖는 더 불량한 예후와 상관관계가 있었다.
|
바이오
마커 |
mRNA (카피/18S rRNA 단위) |
수술 후 생존기간(개월) |
CRC 재발 위험
|
|||
| 수준 | 평균 |
차이 대(vs) 마커 (-) |
P -값 | 위험 비율 | P -값 | |
| SLC35D3 (-) | <0.0059* | 103** | ||||
| SLC35D3 (+) | >0.0059 | 54 | 49 | 0.002 | 2.48*** | 0.002 |
| POSTN (-) | <11.05 | 107 | ||||
| POSTN (+) | >11.05 | 76 | 31 | 0.001 | 2.52 | 0.002 |
| KLK6 (-) | <0.0831 | 110 | ||||
| KLK6 (+) | >0.0831 | 46 | 64 | <0 0001 | 4.01 | <0.0001 |
| MUC2 (-) | <0.0045 | 108 | ||||
| MUC2 (+) | >0 0045 | 64 | 44 | 0.001 | 2.53 | 0.001 |
| CEA (-) | <4.2 | 112 | ||||
| CEA (+) | >4.2 | 44 | 68 | <0.0001 | 4.67 | <0.0001 |
* 컷오프 수준은 환자 집단의 8 십분위수이다.
** 카플란-마이어에 따른 누적 생존 분석에 의해 계산된 수술 후 평균 생존 기간.
*** 일변량 콕스 회귀 분석에 따라 계산된 위험 비율.
5종의 바이오 마커 모두에 대한 수준 결정 및 상이한 측정치 조합으로 환자 그룹을 생존과 관련하여 추가적으로 차별화하였다. 본 발명의 일 구현예에서는, 수술 후 생존을 예측하기 위하여 바이오 마커 분석으로부터 도출된 조합 정보가 다음과 같이 사용된다: 각각의 최고 림프노드에 대하여, 바이오 마커 SLC35D3, KLK6 및 MUC2에 대한 값을 먼저 그것들의 상응하는 CEACAM5 값으로 나눈다. 그런 다음, SLC35D3/CEACAM5 및 KLK6/CEACAM5의 경우, 비율을 두 개의 그룹 >0.00001 또는 < 0.00001 중 하나로 표시하였다(도 3). 전자 그룹에는 1의 값을 부여하였고, 후자 그룹에는 0의 값을 부여하였다. MUC2/CEACAM5의 경우, 분할은 3.0의 비율에서 이루어졌고, 3.0 이상의 값을 갖는 노드에는 1의 값을 부여하였고, 그 이하의 값의 노드에는 0의 값을 부여하였다(도 3). POSTN의 경우, POSTN/18S rRNA 비율 및 임상적 컷오프(8.0 카피/18S rRNA 단위; 도 2)를 이용하여 두 개의 그룹을 달성하였고, 임상적 컷오프 이상인 경우 1의 값을, 그 이하인 경우 0의 값을 부여하였다. 식 (식 A: SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5)을 이용하여 각각의 환자를 다섯 개 그룹 중 하나로 분류하였고(식 결과: -1, 0, +1, +2, +3), 카플란-마이어에 따른 누적 생존 분석을 이들 그룹에 대해 수행하였다. 결과를 도 4에 나타낸다. 다섯 개의 상이한 곡선을 얻었다. 그룹 (-1) 및 (0)은 양호한 3년 및 5년 생존을 보여주고, 그룹 (+1) 및 (+2)는 상대적으로 불량한 생존을 보여주며, 그룹 (+3)은 매우 불량한 생존을 보여준다(표 5). 그룹 (-1)과 비교하여, 그룹 (0), (+1), (+2) 및 (+3)에 대해 일변량 콕스 회귀 분석에 따라 계산한 위험 비율을 표 6에 나타낸다.
본 발명의 다른 구현예에서, 이들 식, 예를 들어 식 B 내지 식 E에서, 조건(term) 중 하나를 체계적으로 배제시켰다는 점을 제외하고는 바이오 마커 mRNA 측정치를 식 A에서와 동일한 방법으로 계산하였다. 도 5는 식 E에 따라 계산한, 카플란-마이어에 따른 누적 생존을 보여준다. 표 5는 다섯 개의 식(식 A 내지 식 E)에 의해 결정된 바와 같은 바이오 마커 mRNA 측정치에 대한 3년 및 5년 생존을 요약한 것이고, 표 6은 식 A, B 및 C에 의해 결정된 바와 같은 바이오 마커 mRNA 측정치에 대한 위험 비율을 요약한 것이다. 수술 후 생존과 관련한 유용한 정보는 식 B 내지 식 E에 따라 처리된 바이오 마커 데이터에 의해 생성되지만, 식 A에 따라 바이오 마커 mRNA 데이터를 처리하는 것이 이들 바이오 마커 전부가 결과에 기여한다는 것을 보여주는 가장 유익한 정보임이 분명하다.
| 식 | ||||||||||
| A | B | C | D | E | A | B | C | D | E | |
| 그룹 | 3년 | 5년 | ||||||||
| -1 | 7 | 10 | 5 | - | 10 | 14 | 15 | 12 | - | 18 |
| 0 | 10 | 13 | 14 | 9 | 10 | 20 | 26 | 21 | 15 | 19 |
| +1 | 28 | 31 | 34 | 20 | 29 | 37 | 38 | 42 | 32 | 38 |
| +2 | 42 | 57 | 41 | 51 | 42 | 47 | 84 | 80 | 58 | 65 |
| +3 | 56 | - | - | 34 | - | 84 | - | - | 60 | - |
식 A: [SLC35D3/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1, +2, +3 제공
식 B: [SLC35D3/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1, +2 제공
식 C: [KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1, +2 제공
식 D: [SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA], 그룹 0, +1, +2, +3 제공
식 E: [SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1, +2 제공
| 식 A | 식 B | 식 C | ||||
| 그룹 | 위험 비율 | P-값 | 위험 비율 | P-값 | 위험 비율 | P-값 |
| -1 | * | * | * | |||
| 0 | 1.33 | ns | 0.49 | Ns | 0.41 | ns |
| +1 | 3.15 | 0.028 | 2.34 | Ns | 3.3 | 0.008 |
| +2 | 3.64 | 0.021 | 5.56 | 0.001 | 6.59 | <0.0001 |
| +3 | 6.98 | 0.001 | ||||
식 A: [SLC35D3/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1, +2 및 +3 제공
식 B: [POSTN/18S rRNA + SLC/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5], 그룹 - 1, 0, +1, +2 제공
식 C: [POSTN/18S rRNA + KLK6/CEACAM5 - MUC2/CEACAM5], 그룹 -1, 0, +1 및 +2 제공.
바이오
마커
mRNA의
결정을 위한
키트
본 발명은 또한 바이오 마커 mRNA 및 18S rRNA의 분석 및 미가공 데이터의 식 A 내지 식 E의 식으로 설명된 바와 같은 임상적으로 유용한 정보로의 변환을 위한 키트를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서, 표 1에 제공된 특정한 정방향 및 역방향 프라이머 및 프로브 서열이 실시간 정량적 RT-PCR에 사용된다. 정량화는 특정 카피 표준물질(RNA)과 샘플 내의 18S rRNA 함량 및/또는 CEACAM5 mRNA의 함량에 대해 정규화된 바이오 마커 mRNA 값을 갖는 역전사를 위한 3' 프라이머를 이용하여 달성된다. 수술 치료 CRC 환자로부터의 림프노드의 임상적 재료 분석으로부터 결정된 컷오프 수준을 갖는 바이오 마커 수준에 따라, 정규화된 값이 두 그룹(1 = 높은 재발 위험 및 0 = 낮은 재발 위험) 중 하나에 할당된다. 특별히 설계된 알고리즘을 이용하여, 각 바이오 마커에 대한 (1) 및 (0) 값은 -1, 0, +1, +2, +3의 범위를 갖는, 암 사망의 상대적인 위험의 추정치로 전환되며, 여기서 식: SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5를 기초로 하여, -1은 가장 낮은 위험을 나타내고, +3은 가장 높은 위험을 나타낸다.
도 4와 도 5 및 표 5와 표 6에 예시된 바와 같이 본 발명의 구현예에서, 바람직하게는, 가장 높은 바이오 마커 mRNA를 갖는 림프노드로부터의 정보만이 가치가 있다. 그러나 다수의 환자는 종양 세포를 포함하고 있는 림프노드를 하나 이상 가지고 있다. 본 발명에 따른 방법은 또한 이 경우, 즉 N1 및 N2 병기 환자 간의 차별화를 위해 사용되어 예후 값을 추가한다.
실험 방법
일반적인 방법
생물정보학 분석 - 마이크로어레이 유전자 발현 분석 결과를 직접 혼성화 분석법에 대한 일루미나 비드스튜디오(Illumina Beadstudio) 소프트웨어(버전 3.3)를 이용하여 분석하였다. 강도 데이터는 백그라운드를 빼고 비드스튜디오스 큐빅 스플라인 알고리즘으로 정규화하였다. 발현에서의 유의미한 차이는 벤자미니 및 혹버그 위발견율(Benjamini and Hochberg False Discovery Rate)을 이용한 다중검정교정(multiple testing correction)과 함께 비드스튜디오 소프트웨어 오차 모델 일루미나 커스텀(Error Model Illumina Custom)을 이용하여 계산하였다(Reiner A. et al. Bioinformatics, vol. 19, p. 368-375 (2003)). 유전자 발현의 차이를 배수 변화(fold change)로서 계산하였고, 대조군의 평균 신호에 대해 관심 CRC 샘플의 신호를 나누었다.
세포주 및 말초 혈액 단핵구 세포 - 다음의 확립된 인간 세포주를 이용하였다: LS174T, HT29, T84, HCT8 및 CaCo2(모두 결장암), Jurkat 및 Molt-4(T-세포 림프종), B6 및 KR4(EBV-형질전환 B 세포주), U266(형질세포종), U937(단핵구 유사 세포주), K562(적아구성 세포주(erythroblastoid cell line)), HL60(과립구 세포주), FSU(섬유아세포 세포주). 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 피콜-이소파크(Ficoll-Isopaque) 밀도 구배 원심분리에 의해 건강한 성인의 말초 혈액으로부터 단리하였다. PBMC를 0.4% 인간 혈청 알부민이 첨가된 HEPES 완충 RPMI 1640 중 OKT3 단일클론항체(50 ng/ml)와의 배양에 의해 시험관 내에서 활성화시켰다. 일곱 명의 개체로부터의 PBMC를 4, 7, 20, 48 및 72시간 동안 동종 배양액 중에서의 자극과 함께 배양하고, 세척하여 모으고, RNA를 추출하였다.
CRC 환자 및 대조군의 임상적 특징 - CRC 치료를 위한 수술을 166명의 환자에서 수행하였다[81명의 남자, 85명의 여자, 중간 연령 72세(범위 42 내지 90세)]. 종양 중 13개는 직장에 위치하였고, 153개는 결장에 위치하였다. 직장암 환자 중 일곱 명은 25 Gy의 수술 전 방사선치료를 받았다. 국소적 근치 종양 절제를 모든 환자에서 수행하였다. 종양 분화도는 11개 종양, 145개 종양 및 10개 종양에서 각각 불량, 중간 및 높음이었다. 2,351개 림프노드에 대해 통상적인 헤마톡실린 및 에오신(H&E) 염색을 수행하여, 환자당 13개(범위 1 내지 51개) 노드의 중간값을 제공하였다. TNM 분류에 따르면, 30명의 환자는 I기(T1-2N0M0), 74명은 II기(T3-4N0M0), 46명은 III기(임의의 TN1-2M0) 및 16명은 IV기(임의의 T 임의의 NM1)이었다. 34명의 환자(4명은 II기, 19명은 III기, 11명은 IV기)는 수술 후 화학요법을 받았다. 후속 조치 기간 중간값은 75(범위 33 내지 147)개월이었고, 어떠한 환자도 후속 조치에서 누락되지 않았다.
대조군은 궤양성 대장염(n=18), 크론 대장염(n=3), 직장탈출증(n=1) 및 대장 지방종(n=1)에 대한 수술을 겪은 18명의 남자와 5명의 여자를 포함하였다[중간 연령 25세(범위 10 내지 61세)].
환자 및 1건의 사례에서는 환자의 부모로부터 사전동의를 얻었다. 스웨덴 우메오 대학교 의학부 연구윤리위원회가 연구를 승인하였다.
원발성 및 원격 CRC 종양 및 정상 결장 조직 - 85개 원발성 CRC 종양으로부터의 113개 샘플을 대상으로 바이오 마커 mRNA 수준을 분석하였다(16명의 I기 환자로부터 22개 샘플, 35명의 II기 환자로부터 44개 샘플, 25명의 II기 환자로부터 41개 샘플 및 8명의 IV기 환자로부터 8개 샘플). 원발성 종양 병기 분포(pT1-pT4)는 각각 2, 14, 55 및 13이었다. 분화도는 11개 종양에서 불량, 71개 종양에서 중간 및 3개 종양에서 높음이었다. 크기가 대략 0.5 x 0.5 x 0.5 cm인 1개 내지 4개의 샘플을 절제 직후 원발성 종양 표본으로부터 수집하고, 스냅 동결(snap-frozen)하여, RNA 추출 시까지 -70℃에 보관하였다. 근위 또는 원위 절제연(resection margin)으로부터 회수한 여섯 개의 정상 결장 샘플 및 두 개의 원격 간 전이 샘플을 수집하여, 원발성 CRC 종양과 동일한 방식으로 처리하였다.
결장 조직으로부터의 상피세포 - 기술된 바와 같이 절제연에서 정상 결장 점막으로부터 결장 상피세포(EC)를 단리하였다(Fahlgren A. et al. Clin. Exp. Immunol., vol. 131, p. 90-101 (2003)).
림프노드 - 절제된 표본으로부터 림프노드를 회수하고, 별도의 멸균 칼로 2등분하였다. 각 림프노드의 절반을 통상적인 H&E-염색을 위해 10% 완충 포르말린에 고정시켰다. 다른 절반은 액체 질소에 스냅 동결하여 RNA 추출 시까지 -70℃에 보관하였다. CRC 환자로부터 503개의 림프노드(I기 내지 IV기 환자로부터 각각 91개, 253개, 107개 및 52개의 노드)를 수집하였다. 환자당 중간값 2개(범위 1 내지 15개)의 림프노드를 입수하였다.
대조군 환자로부터, 108개의 림프노드(궤양성 대장염, 크론 대장염, 대장 지방종 및 직장 탈출증으로부터 각각 82개, 9개, 13개 및 4개의 노드)를 수집하였다.
RNA 단리 -제1 균질화 단계에서 25 mg 조직당 4 M 구아니디늄 티오시아네이트, 25 mM 시트르산 나트륨(pH 7.0), 0.5% 사르코실 및 0.1 M 2-머캅토에탄올을 함유하는 용액 0.5 ml 및 최대 2.5 × 106개 세포를 첨가함으로써 산 구아니딘 페놀 클로로포름 방법(Chomczynski P and Sacchi N. Analyt. Biochem., vol. 162, p. 156-159 (1987))을 사용하여 림프노드, 정상 및 종양 결장 조직, 결장 상피세포, PBMC 및 세포주로부터 총 RNA를 추출하였다. 추출된 RNA를 리보핵산 분해효소(RNAse) 억제제인 RNAsin(1 U/μl; 프로메가(Promega), 미국 위스콘신 주 매디슨 소재)을 함유하는, 리보핵산 분해효소를 포함하지 않는 물(RNAse-free water)에 용해시켰다. 나노드롭(NanoDrop) ND-1000 분광광도계(나노드롭 테크놀로지스(NanoDrop Technologies))로 RNA 농도를 측정하고, 비드 마이크로어세이 분석을 위해 RNA 나노 분석법을 이용하는 2100 바이오분석기(애질런트 테크놀로지스(Agilent Technologies))로 RNA의 온전성(integrity)을 분석하였다.
RNA 카피 표준물질의 제조 - 원발성 CRC 종양, 두 명의 CRC 환자로부터의 두 개의 림프노드 및 결장암 세포주 LS174T 및 T84로부터의 총 RNA를 카피 표준물질 제조를 위한 출발물질로 이용하였다. RT- PCR에 이용된 프라이머는 표 2에 제공된다. 정량적 RT-PCR에서 증폭된 각각의 서열이 포함된 PCR 생성물을 클로닝하고, 시퀀싱하여, T7 중합효소/리보프로브 인 비트로 전사 시스템(T7 polymerase/RiboProbe In Vitro Transcription Systems, 프로메가)을 이용한 시험관 내 전사용 주형으로 이용하였다. 선형화된 DNA 3 내지 7 μg을 2 내지 3시간 동안 37℃에서 수행되는 대규모 합성 반응에 사용하였다. 그런 다음, 반응 생성물을 1 U/μg의 리보핵산 분해효소 불포함 DNA 분해효소(DNase, 프로메가)로 37℃에서 30 내지 40분 동안 처리하고, 페놀:클로로포름:이소아밀알코올(25:24:1) 및 클로로포름:이소아밀알코올(24:1)로 추출하였다. -70℃에서 적어도 1시간 동안 2.5 부피의 99.5% 에탄올 및 0.5 부피의 7.5 M 아세트산 암모늄으로 RNA를 침전시켰다. DNA 분해효소 처리를 적어도 2회 반복하였다. 마지막으로 카피 표준물질을 RT-PCR 및 PCR로 확인하여 DNA의 함량을 평가하였으며, DNA의 함량은 그것들 전부에 대해 0.2% 미만인 것으로 나타났다. 전사체 농도를 OD260 값, 전사체의 분자량 및 아보가드로 수를 기초로 하여 계산하였다. 표준물질을 최종적으로 108 카피/μl로 희석하였다.
실시간 qRT-PCR - Tacman EZ RT-PCR 기술(어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems), 미국 캘리포니아 주 포스터 시티 소재)을 이용하여 SLC35D3, POSTN, KLK6, CEACAM5 및 MUC2에 대해 RNA 카피 표준물질을 이용한 실시간 qRT-PCR 분석법을 구축하였다. 프라이머 및 프로브 서열은 표 1에 나타낸다. RT-PCR 프로파일은 2분 동안 49℃, 30분 동안 59℃, 5분 동안 94℃에 이어, 20초 동안 93℃ 및 1분 동안 61℃의 45 사이클이었다. 103 내지 108 카피/μl 농도의 각각의 RNA 카피 표준물질의 단계적 희석액을 각 분석에 포함시켰다. 모든 qRT-PCR 분석은 3반복(in triplicate) 수행하였다. 방출된 리포터 염료로부터의 방사를 ABI 프리즘 7900 서열 검출 시스템(퍼킨-엘머(Perkin-Elmer), 미국 매사추세츠 주 웰즐리 소재)으로 관찰하였다. mRNA 수준의 정규화를 위해, 제조업체의 프로토콜(어플라이드 바이오시스템즈)에 따라 실시간 qRT-PCR에 의해, 또는 표 1에 제공된 프라이머 및 프로브(서열 번호 16 내지 18) 및 표 2에 제공된 프라이머(서열 번호 26, 17)를 이용하여 제조된 카피 표준물질을 이용하여, 각 샘플에서 18S rRNA의 농도를 결정하였다. 결과를 18S rRNA 단위당 mRNA 카피 또는 18S rRNA 카피당 RNA 카피로 나타내고, 양자 모두의 경우에서 직접적으로 비교할만한 수준의 바이오 마커를 수득하였다.
통계 분석 - 환자 그룹 간 무질병 생존 및 수술 후 재발성 질병의 위험의 차이를 로그 순위 검정 및 일변량 콕스 회귀 분석과 조합한 카플란-마이어 생존 모델에 따라 계산하였다. P 값이 <0.05인 생존 기간 및 위험 비율의 차이는 통계적으로 유의미한 것으로 간주하였다. 사용된 소프트웨어는 SPSS(버전 18)이었다.
SEQUENCE LISTING
<110> Hiloprobe AB
<120> Marker genes for colorectal cancer classification
<130> 21090160
<160> 32
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 1
agcactcccg tgacgtacc 19
<210> 2
<211> 17
<212> DNA
<213> human
<400> 2
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<211> 18
<212> DNA
<213> human
<400> 3
cctggcagga gccggcga 18
<210> 4
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 4
cccttgctta ctccctttct c 21
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 5
acagctcaga gtcttcgtat atcg 24
<210> 6
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<212> DNA
<213> human
<400> 6
acagctgtct gcattga 17
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<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 7
aaggttatgc ttccccagg 19
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<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 8
cttatccatc cactgtgggt c 21
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<212> DNA
<213> human
<400> 9
cactgcaaaa aaccgaatct tcaggtc 27
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<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 10
tagtgtccag ctccagcatg a 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 11
aagagcgatg cctacaccaa a 21
<210> 12
<211> 16
<212> DNA
<213> human
<400> 12
tcccggttcc acatga 16
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 13
tgtagctgtt gcaaatgctt taag 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> human
<400> 14
ctgatatagc agccctggtg tagt 24
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<211> 18
<212> DNA
<213> human
<400> 15
aggaagactg acagttgt 18
<210> 16
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<212> DNA
<213> human
<400> 16
ccgctcccaa gatccaa 17
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> human
<400> 17
gtaattccag ctccaatagc gta 23
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<212> DNA
<213> human
<400> 18
ctgcagttaa aaagc 15
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<212> DNA
<213> human
<400> 19
cagcactccc gtgacgtac 19
<210> 20
<211> 17
<212> DNA
<213> human
<400> 20
catcggcgtc ctggttc 17
<210> 21
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<213> human
<400> 21
tggatcacag cccgga 16
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<211> 18
<212> DNA
<213> human
<400> 22
tacacctcgg gccacttg 18
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> human
<400> 23
ccgggctgct cattgaga 18
<210> 24
<211> 19
<212> DNA
<213> human
<400> 24
tggctaggat ggtctcgat 19
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> human
<400> 25
ggacctatgc ctgttttgtc t 21
<210> 26
<211> 20
<212> DNA
<213> human
<400> 26
cgctcccaag atccaactac 20
<210> 27
<211> 3420
<212> DNA
<213> human
<223> SLC35D3
<400> 27
agtcggacgc agagctgcct aaccgcaaga acgcctggcc ggagctgccc tctgcagccg 60
agccggcgcc ccctgccctt cgccgccgcg ctgggcgggc gcccccgccg ccctcactcc 120
gctgctcccg gctcctcgcg cgcaggtcgc ggagctccgc caccgctggg tgcggcgagg 180
ccggcgcgat gcggcagctg tgccggggcc gcgtgctggg catctcggtg gccatcgcgc 240
acggggtctt ctcgggctcc ctcaacatct tgctcaagtt cctcatcagc cgctaccagt 300
tctccttcct gaccctggtg cagtgcctga ccagctccac cgcggcgctg agcctggagc 360
tgctgcggcg cctcgggctc atcgccgtgc cccccttcgg tctgagcctg gcgcgctcct 420
tcgcgggggt cgcggtgctc tccacgctgc agtccagcct cacgctctgg tccctgcgcg 480
gcctcagcct gcccatgtac gtggtcttca agcgctgcct gcccctggtc accatgctca 540
tcggcgtcct ggtgctcaag aacggcgcgc cctcgccagg ggtgctggcg gcggtgctca 600
tcaccacctg cggcgccgcc ctggcaggtg agcgggcccc cgcgccgacc cccagccgac 660
cccacccacc ccgctccgtc gggcagagac cgcggggatc actgagttca acgacctcac 720
ttccagatgg ggagactgag gcagagagag ccggagagct ttgagagtgg tcgctcagct 780
cgcaaaaggg acttccgaga cccagagagc tccccagcgc cccaccaagt ccccctgccc 840
cctaatgtcc tggcttccga ccctcgccca tgcttcaccc ggcatcgccc ttcctgtcgc 900
cccctctcct ggtcttcccc tgtcacccca ttctccggga gaggtgggag ggccgcctga 960
gcctgggagc tggagtcctc caagcctgga ccaagccgga aggagggggc cgtgaacttc 1020
cttgggtcac gaggggctgg aatggaggtg ggggatgggg gcgaagctga gggttcccgg 1080
ggctactgcg gggtgtctcg tgctgcgcag ggggctgcgg ccctggggca gacgacccag 1140
gtgctgagcg agacgagagc ctgggcaggg ggaagcttca ctgggggcca gaacaggcgt 1200
tctcccccgc gcctggcccg ctccgggttg caggccactg gctggggctc cctctccctt 1260
tggtgcccca cggggcaggg gctccggggt gcaggtacca cgcgcccaag tgacctcggt 1320
gccagctcgg ggaagccaca gcacctgccc cgagggcatc tgcgctctcc ggggcctttg 1380
tcttggacag aggaagatgg agtgacccgg ggatatggcg ggaaggcgct ctgagcactg 1440
agtttggctg tcgcatttga cacgggtggc cgagggacgg cgggcgtctg tcactcagga 1500
atccggtggg cagagctggg gcgcgaaccc agtctccttt cctacccgac gcgttttccc 1560
cgtgggtccc cgcccacgcc aacctgctgt cttctctctt tttccttccc gcccgggctc 1620
ggccgtcctc ctcgtgcgcc gcaggagccg gcgacctgac gggcgacccc atcgggtacg 1680
tcacgggagt gctggcggtg ctggtgcacg ctgcctacct ggtgctcatc cagaaggcca 1740
gcgcagacac cgagcacggg ccgctcaccg cgcagtacgt catcgccgtc tctgccaccc 1800
cgctgctggt catctgctcc ttcgccagca ccgactccat ccacgcctgg accttcccgg 1860
gctggaagga cccggccatg gtctgcatct tcgtggcctg catcctgatc ggctgcgcca 1920
tgaacttcac cacgctgcac tgcacctaca tcaattcggc cgtgaccacc agcttcgtgg 1980
gtgtggtgaa gagcatcgcc accatcacgg tgggcatggt ggccttcagc gacgtggagc 2040
ccacctctct gttcattgcc ggcgtggtgg tgaacaccct gggctctatc atttactgtg 2100
tggccaagtt catggagacc agaaagcaaa gcaactacga ggacctggag gcccagcctc 2160
ggggagagga ggcgcagcta agtggagacc agctgccgtt cgtgatggag gagctgcccg 2220
gggagggagg aaatggccgg tcagaaggtg gggaggcagc aggtggcccc gctcaggaga 2280
gcaggcaaga ggtcaggggc agcccccgag gagtcccgct ggtggctggg agctctgaag 2340
aagggagcag gaggtcgtta aaagatgctt acctcgaggt atggaggttg gttaggggaa 2400
ccaggtatat gaagaaggat tatttgatag aaaacgagga gttacccagt ccttgagaag 2460
gaggtgcatg tacgtaccta tgtgcataca cttattttat atgttagaaa tgacgtgttt 2520
taatgagagg cctccccgtt ttattctttg aggagtgggg aagggaagaa aagaaagaag 2580
ctgaaaggta ctgacacaga gcaacaaaat tagcacctgt gtgaattatt tagtgtgact 2640
tcacctgagg catcacagag acaaaagaat gtgaagctac ttaacaaagt aaggcaacgt 2700
ttctgcttca gactcctggc acatttactt tttgtcatta taaccataac taaatatctg 2760
catgtaccaa gagtccctaa gccaccccct ccaaagatgg agtgtagaaa tgatgacagc 2820
acttagtaag ttcaaagatg acattcaggg atgcattttt tgatgataga actacagttt 2880
ttatcgccag ctgggcaaag agtatattgc tgaaatgata tataaatata ttgaattgat 2940
gtttactgtt tatagtcatc tgaaatatca tatttactct gattctactc acttgttttt 3000
taaaaataag tgtcctatta ttgtattata tattgataga aactgttaaa gctattttga 3060
aaatatgagt tcttagcttt aatcatgaag tctgaagttt gctttcagta attattttaa 3120
aagttgtttt ggttcattgc tttataatat ttattattga atgccaaacc tgttcttttt 3180
tttactgtgt ccaatattct ttcaagcaaa tgcaatggct ggaatataat tcagaattaa 3240
ctgaaaccca gccagaagag ggaccacctg taaagcaagt cctttcaagt ttcactgcac 3300
atcccaaacc atgttacaaa aagagcaact gctatattca cattatgata tttttctatc 3360
ttaaatttgt caaaataaag tatgagtcta actattaaag gatacattgt tagaaattta 3420
<210> 28
<211> 36263
<212> DNA
<213> Human
<223> POSTN
<400> 28
taatttcatt caatttcctt taatgagtac ttgttacagt aaaagaggta taaagtcctg 60
ttcccaagtc caaaccactt tttaacttaa atcttgagtt tttctgaatt actcaatttg 120
aagtaattct ctttatatct gaaaaatggt tttattgaaa cgtttgagat taaaaaatat 180
gcattgcaag aagcatatga caaacattct gagagtacaa aattagttgt aaaaaataac 240
ataatttacc agtaaaccca ctcatataga aatgtgcaaa gccttttgat ataaaaagtt 300
ttgtacacca agcacctatt tttataactt agcttcccat ggagagataa tggcttgcgt 360
gcattttatg tatccataac atacatacaa ggctcggtct tttcaatggg ataacagttc 420
acaactcttc gatttgaatt gtaatgaatc tggtgacaag gatttttctc taatggattc 480
caaagttagc cagaactttt aatgtcaaga tgaaaaaggg tgtaaggtgt tatattttct 540
tcaattcctt taccacagga ggctaactcc acaatttccc tcatgtttct cattcagaaa 600
aaaaaatatt aaatttgtgt tcagaattat ttgatgattg cttctttgtg ctgatgtttc 660
agttcctgaa gtcaacttgg ctctcacaat tttctaaggt caggttattg acttagggtt 720
gtataaacat ttttttctgg tttttggatt ttcactgaga acgaccttcc cttaatcgtc 780
ttctagatcc taattagaaa gaaaggagaa tgtatagact gtaaatgtta ggaaatttta 840
aaatttaaga atatattatt ctctgtatat ctatcagagg ccattatttt ttgtaataaa 900
ccttagatta tgttttctta atatcttcaa cttatggtga agcaaatatt atattttgat 960
caaaagtata taaaataata atttgaaatt taataatttt aactctttag aaaatttgtg 1020
tcaatttgga tatttacata gatttactga cacattcttt agttaaaaaa tatctgtgca 1080
gttgatcttt tactttcaaa ggtctgtata ttggattggt ttaaagtaag aagttcctat 1140
agcgcattga taagccttgt gtctcctttt cactactagt atctaattaa cccagaaatt 1200
ccaaacttgc aattccaaac ttgcaattta ctctagcttc cacaagggaa attcttgctc 1260
tctcaatgta ttggaatgta agataactta agtggaggaa ttagcaaatg cacatagtgt 1320
aattatgaaa taaattgtaa tgcacatgtg atatatacat atataatcta catatttaaa 1380
tgaacatttt gtaaatagct atattaatgg ttttttgcat atatacattt cttatttact 1440
tatgtctcaa actgtagcat tgtctcacat aataacattt ttaaggattc aggtccacct 1500
gcaatctaca tttgtttatc tctgatattc aacaatttct ttttgactta actcttatat 1560
acacaaaatt atatgtatac ttgtatatac aaaacattac atatatatat atatatatat 1620
atatatatat atatatatat atatatatgt atggagaata tacacttgag tctatctcaa 1680
gggttcaata tgcctagcag tttacatgag tatgttgacc tttcccttaa tatttgttat 1740
tagattctga tagtatagaa catgagaaat ttattttctg attgttatca aaattgtttt 1800
catcaaaact ggctagcttt tctctctgat cgataacaag tttcaataaa atactttaaa 1860
atctttccta ttgtttgatt tctcttcatg taacaaaaga ggccatatac acacattact 1920
atagccaata cacttacctt gaactttttt gttggcttgc aacttcctca cgggtgtgtc 1980
taaaattaaa ttgttgtagt tagaaatact tcgcaattat ggctaaaatc agacaggaga 2040
ccatggttaa acagaacagt gtaaagtctt aaataagtat cacttaaaca cgaagattat 2100
ttttagtagt taaattttat gatcctcaga gttttacatt ttttcgtaaa ggacaagtag 2160
acagacagtg ttttccatat atcataatga atgtttctta gttgcaaaac acattgtttc 2220
attatggatt ttggaacccc acctaatgtg ccatttttgc agagtaaatg acttacatga 2280
ttttttcaat ctttttgtaa aaaacattgc cttatgatga agggttatta aatgtcatat 2340
aaagtttaac acaagtatct tcccagagtt agccacccat ttttgcagtc atacctatgt 2400
gcaatgtctg cctctgtaaa attatcacta agatcaattt gtgattcctt tattgtacat 2460
tgacgacaac aaagtagcac tgacctaatg attctagaaa tgttataata agtaattcag 2520
aaagaatatg ccatcaccct tgttccacct cccaacctga ttcagtgtca atcctatgag 2580
atccttttaa aaaattaact aataaaagct tttatattta agaactgcaa gtgtttcaaa 2640
actatgctgt tttgtgttgt tatagttgta acatatttct caattttcct gtttttcttt 2700
tagtttattg acaagactac ctggtcggcc taaattcaca ttttcattca gtttttgggc 2760
atttgagatc aaagagtaag tatggtttct acagttactt catttttcta cttatctttt 2820
taaatttttt ctccaaattt tgacttcttt tatatgtatc atctatactc agcatgaagt 2880
ccagtttttt ctattatata catgttttca attcgctgaa atcatataaa aagtaagcaa 2940
tgaaactgtc accatgaata gttttggcta tatgacacca agcaaatttt ttaaaaaaga 3000
aataacattc aaaacaactt atatattctg tttctgtcta cttagcacat tttcacattt 3060
ctttcccccc agaatataag gcatataatc atttataaaa ccacattaat actagagtaa 3120
aatatagaac tatagaaaaa tctcactatg ttggataatg gggagaagtc tgtgtaaaac 3180
aaccaagtct gagttatgaa atattctcca acagatataa atagatgtaa atataaatat 3240
ttcttaactt caggtttatt tggtaacgaa ataatggctt ctaaaaaatt gtcaagaaga 3300
gacagatcca acctttaatt ggtgtgcagg cacattgctt atagtggact tattaaattc 3360
caaatagcag ttaattgtat aacttaaaac tgcatcatag aagtatttac caatttcttt 3420
tcaaaacaag tgtgctcact cagatttcct ttcataattt tgatagcatc caattaatga 3480
ggttttgctg tgataatatt ccagaataaa aaacattcaa tgtgtcaaac aaatactttg 3540
aaagaacagc ttgattaatg tgtagaaaac aggtttactc ctagcagctc tctgctatgt 3600
caacatgaat gagagttata ttagatcatg tttagagcag caaaacatgg gaagataaac 3660
caattacttg aatatattgg cacaaagaac caccctacat cttatttcct aaagcatgca 3720
aagtactcag ctcaattatt ttgacatttt atttgcatgt ttgttttttg tatgtttcca 3780
tggttatgac tatggaaatt taaagttggg tgagaaacat tacttaattg accatgttaa 3840
tgtcaattga tgattgacag taacatttga tgacagctta ctttgtgctg aacattgttc 3900
taagagcttg tcatatatta acttatttag actgtaggta tcactactat cctcactttc 3960
agatgaagga aacaagcaag aaaagagtca actaatttgg gattgagttg gggctcagac 4020
tgaatgcaga cctacaactc gatctactat tctctataga ggttacaaat cttaacctct 4080
tatgttggca gatttgcgaa aaccttcaaa aatgactttt tgttgttgtt cctttcgaca 4140
tagtctgtta ttctccttta attgcttgag tcgtttcaga atgcataatt ctaaggtaag 4200
cccaaaaatt ttatgcattt aatgagaaat tttttcagtt aaggtcttgg aagtgtatca 4260
gtgacaaatc acaacatcag tactcaaagt accagttagc catgttaata gtcatgactt 4320
aaatgattga gaaatatact caaattacca aaagtacaaa aaatgtacta catggccggg 4380
cgcggtggct cacgcctgta atcccagcac tttgggaggc cgaggcgggc ggatcacgag 4440
gtcaggagat cgagaccatc ccggctaaaa cggtgaaacc ccgtctctac taaaaataca 4500
aaacattagc cgggcgtagt ggcgggcgcc tgtagtccca gctacttggg aggctgaggc 4560
aggagaatgg cgtgaacccg ggaggcggag cttgcagtga gccgagatcc cgccactgca 4620
ctccagcctg ggcgacagag cgagactccg tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aatgtactac 4680
atgtaccaca atgtatacga tatgaactgt ttagatagaa aattcagttt taggtagaac 4740
ttattgagtt gaagagcatg gttcagatat gtattaattg gccagacctt ggaaaaaaaa 4800
aaagtcttac atagtgtaat ctttactagc ttcttttatc aatgcctttt aggatctaga 4860
caaggggata cttgtgactc agtaatgacc tgatggtttt agatagctgg aaaaaagaaa 4920
acaagcatgt ccaattaatg ctggtactag taattctacc gcatatagtg tttttcctac 4980
aaaaagcaaa accttggaga aatgatttga taaaaacttt taattttttt tgttttttca 5040
caatgctata atagttgacg tggcattgtg aaaaccgatg ccttacagat atgtagagag 5100
atcatacact gggaactaaa ggaataaact tctgggatga tcagaggcaa gagctaagaa 5160
aggagttcat taactaaaaa ttgaatgtca tatacttaac ttgtagcagt tatatgtttt 5220
cttggctgaa gcaattcttt agtatttaac tggatttttc atagtggcct caataacagg 5280
ggcttatcaa aggggaagaa aatatactta cctgaaattt aatcctaaat gaattaaagc 5340
aatataaact gatgcagcta ctaatttatt gattccctaa aaagcactac cattctacaa 5400
agctgcttac tatggcaagg actgaaagaa aaaaaaaaga attcaattta atcttcataa 5460
tgtgtttgtc tcttccctca aatccttaga tttttttcct agcagacagt tgagcattta 5520
ggggtagata gtgaattctt tgttagatcc tacaggaatc tttggttccg ttatggctct 5580
gttgtgctat gtactcttag aattctggga ggaaacttgt atttttcaga catatatatt 5640
tctattgagg gaaaattcaa tcattggttg aattaaaaat ttttaaacta tcactgacaa 5700
gtttctaaat actatttaag agattttacg tttattaaac tacagaatat agaaataata 5760
attgctaaaa atatagaaag tcccaagata atttacattt tcttggacat agtgatacag 5820
ttttaaaaag tataagctga aaagccatct ggactgtgtt ttggataaac atcaaacttc 5880
agttatgttt ctcaattaat agtatatttc aaagtgccta tttggttttt ctaaagaata 5940
taaatacatg tttcacaaaa aataattttt cagcttaatt ctttccttgt taaaaaatga 6000
agtagaaatt tgtttattca aatgccaatg atacaaatta tgtatctata taaacaacat 6060
ctttgaataa ttactatgta gggtttgtgt aagattttga attctttttt ttttgttctt 6120
aaggttcatt taatgccaca gacagagaac attccataaa agattaagat taattttata 6180
tgcaaaataa cttatatcta caggtataga ttatcactca aactgttaga agaaacagat 6240
attcattccc aagaatatag ttttggaaaa gaatgttact aaatgcacta tttttggcta 6300
tatctatgta tagaatttaa agacatgcct tgattgctct tatgggggca gtgaatataa 6360
ttttttaaat ataaaaagta tatcaaattt gggcttgttt aacagctagc aatttaacaa 6420
ttatttccct tttgcatact taaaaggccc ttaaaattat ctgaatcaaa gcaaaaaaaa 6480
tattcattgc tccccaaact ttataccata gaacttttta aagactgttt aaactagtaa 6540
tcatttcttc ataactatta actaccattg aaccaatcca tctattaaga caacagtgga 6600
tgttgtcttt ttttttttta acccaattaa aagaaaaaat ctgcttgctc agtctttaaa 6660
aagttgaact cagtcactag aacctgttaa gggggttagt tgttgtcctt ttactaacct 6720
ccctgaagca gtcttttaat ttcttcatct tcaaataaat gaccatcacc accttcaatg 6780
aatttggtga ccttggtgac ctctgagagg atacatgttt atagcagaaa ttggtttata 6840
taacaaaata aagacagcag actttatgtc ataaataatg gcatctgccc aataatgaat 6900
tccagcccaa cactcgattc tttcacaaat tttagtgctg ttttctgaca tactaatatt 6960
cttataaagt tgttgaacaa aatactgtat aaaaaatatg actgccattt atgcttaatt 7020
ccttattctt gtgctttttt cttgttggta tggaaatgaa caatagattg agatagagta 7080
gaaaacatgt agaatgttat tttagacttg tatatggata gcttaggtaa agtcacattc 7140
ttattttcct agaaatgctg accttcttgt aacaatttct tcagagtttc ttctgtttct 7200
ccacctccag tagaaatcct agtgtatttt atttcaggac ctatgagaag gacaatgaaa 7260
aaggtctaaa acagaagtag gcaaacttct tctgcgaagt gacagagagt aagtatttta 7320
cacttgtggg ccatgtagtc tgtgttgcca ttgttcaact ctgatacttc agtgtgaaag 7380
cagccttagg tattatataa atggatggga aagactgtgt tccgataaaa ctttatttcc 7440
ataaatgggt ggcacaagcc acacttgctc actaattgtt taaacaaata cttaaagaat 7500
agctgaatta aggattttcg gcgaatttta ggctaatttg gaccaactgg acgctagttt 7560
ggaagtctga tatgaggttt actgaaaata ttgatcaatt gctttgtata aacttgcttc 7620
tattttggca ggtagatgta cagaccttaa gattaatgga agctcaaatg aggaaatggc 7680
ttttcttcta gggtcctcta actcattaac aaacagtaaa gtgaaaatgg aatatcatat 7740
caatggtata tcatattaca tgtatgtatg catacatgta ataaaaacaa atgcttttag 7800
atttgtctac aaattttcaa ttcagagtaa aacatagatt acatatttag aataatatta 7860
tatctgccaa aatatgaagt aactttagta atcactatga aaatgacttg tttctttaat 7920
gattcttata tttggggatt aactataatt tgatctttat aatctaggca tagatccatg 7980
tatggaatta atggctacct gtaatgattc gttcttctcg tgtctctttt tcagttattt 8040
ccacaggcac tccatcaatg attttggtgt attttttaat aattggctct aaaagcaggg 8100
gaatacaaat gcatttgatt taccctcata ttgtgactat acatccataa gctagacatt 8160
gtaatgatta actatatttc tacaaatatt accatttaag attcaatcat aaacattttt 8220
agaacatatc ccccaaaaat catatcaata gggatctaaa aggtaatagc tatgtcctga 8280
atcttggttg agagagaggg ccatttgaca tcctaactct ccatgtcata cttgttttct 8340
ggatgtggaa taaatactta gtgagaatcc agggagttct atatcattgg aatgggagcc 8400
ctatcataaa tcctagtagt ggagtggctt attagacaga gacttataca atggtcattt 8460
tttcctactg tttctaatat ttccttttat actgacatta atgttacaat tttattccac 8520
aatcctcact tgtatatgca aaaatcatga cattttgttg ggcccagtga cttaatagat 8580
aaattaattc caactagatc cattaaaagc taactatgtt ttatttctga ccagctaata 8640
agaactcata gctgaggaaa taattcccac aatttttata aaataagaac taagagaaaa 8700
tatcagatgt tcaatatttc taaaccaaca ctatttcaaa ataatcacag cgaaggtagt 8760
cggccccagg taacataagg aacgcacctc catggatcac ttcagttatt gtttcacctt 8820
ctttaatcag tctgaattca ggttcacctt caattttgac ttttgttagt gtgggtcctg 8880
ggacattatt ttaggagaca aattatcatg ttaaaacagt cctttaaatt taccggaata 8940
ggacatttat ttcaacattc ggtgtgactc aactcaaatg tcaaagtggt ttcaggctct 9000
atgaaatcac ttttaaatat ttcccattgt cttcaaatta gacaagagtt atgagaacaa 9060
atgatttagt ctgtttgtgt gctactaaaa ttactttcat ctgctttagc ttttaaacag 9120
atggataaat ccatctgttt attcgtagtt ataaagtatg attatgcaaa atattatatg 9180
tggctacact ttgcagatca tgcagtatgt acacatttgt gtttctctga taactggtgt 9240
agatcccact ttatcatact gatattgtct attacttttt ccttattaaa atttttcatt 9300
taagttttaa aatcactcag taccttatat ttttgatcta gtgggtatag gagtgaacat 9360
aagaaagtac caaatgtata cctaccttta agatgctgaa tgtcaggttt tatgaggaaa 9420
ataatttgag tacttacctt ctgtatggga atgatacaca attaaccagt taatagttaa 9480
acagtccttc aaatgcaaaa gataaactag tgttgcattt gacttgcaaa atgattttgc 9540
taccacagaa aatcattttg aaggttagaa agctgcttac tacattagtt aattaagact 9600
gtttcacaga ggagtaagaa aaataagttc agtacattta actcatactg taatagcctt 9660
caatagtgga atgcaactgt tgcttgctta tctttgagag catttttttt tgcttgttca 9720
gaaattgtca atgtacatga ttaccaaaac gaaaccagcc tagaacaatc caaaataatg 9780
aaaataaaag taaagttttt tgaaaccata agtatttcat gccataatat ttgatatata 9840
aggccaaggg atattgagca caaaacataa agccaggttt ttaaggtgcg gtaacttcaa 9900
aagaaaggac gcctaaggaa tttaagaacc aaaaatgcgt taataaaata tctaaatcaa 9960
tatttcttta gaaaagccaa actgaaattt tggaaacatc ctttatagtt aagctctata 10020
aaagaagaga ttttctcaaa attgttttcc tatttactcc caacacctca gaaagtaccc 10080
agcagaatag ctgctcaata actatttgtt gaattgaatt ttagctgatt tattcttaat 10140
tccaaaatgc tgttatgtat cttttataag agacacctta aaattgtgtc ctggagttta 10200
attcatttag taagaattta aaagtcatca ataaatctgt aattgttcaa atagtaagaa 10260
ggaaatgcca gtagcaatcc tggaagctgg accattgtaa attactacta agataaatat 10320
ttgtttcctt cattatgcta cacaggagtg taatttctga actcaagtta ttaatgagta 10380
ggtgacacaa ctccattttt catccatgtt ccctttataa gaagaagcca tgtagagatg 10440
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ttgaggagat aaataagttg aataaagaag cttcaaagga gaagaatctt tgaaaataag 10560
aacattggca catgtaaata atttcaggta aagaagctgt gcacaattat agtgcaaaat 10620
tttagggaat ctgattttta aaaacaggac aagatttgat tttaaaatca attgtattat 10680
caaagatcat tgtgtcatgt tttattacaa tgatcaagga acattttttc aacaaaactt 10740
tctgatttaa tttcttctta aaataccgaa ttgtcttcat cactatagaa agtcgattaa 10800
ataattataa ttatagtatt tttttcaaga aaaaaacaag gatagatttc aaagaataac 10860
tcaattttaa gtctcaagaa taaatactaa tatagataac taattagcta ggaaataagt 10920
ttttacctat gtattttcag tgtataaatt taaattaatg acttacttta aaaaatatag 10980
ataaaagtat tcaagaagtt accttctcaa accaccaaaa gaaatagcaa aaccaaacat 11040
aagtataatt acagtttccc aaagattcca tcaaagatat aatctgttct ctttttggaa 11100
gactgtttct agctttctta tagcacaaag gagataacta gttcttttct ctgggtaagt 11160
tgctacatta agatgcttat acatggaaat cttaaaaaat ttaaattgtg atccttggac 11220
ataattaaaa tacatgaaat gaaagtaaca tcaaagatgt tgaagttggc taacatacat 11280
agtgggagta gagagaaaag taactgctta tttaatgttc tagtctgaaa catcaggaga 11340
gaatgtgtgt gtgtgtctgt attatatata tctcatgtat aatatatacg tctgtatgta 11400
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aaaagctttc agtaaacata gcttctatgc tatcttatgt tacacaatga aaaatgccta 11580
tacttttttt ttttggaaga gcttcttgca ctgttataag aaagaacatg tgggagattg 11640
caaacaaagc aacataaaga gtatacagcc tgtaggagtc tgactaaagt aaaaaaaact 11700
catgtctttg tttagtgagt atctgtatac taagttaatg caatgccaat tagattcaaa 11760
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atgtggtaat atgttcaggc agtcagatac aggaaatatt tatggtacat aatataatat 12240
cttctcatgt ccaggtgttg aactctgaag tctagtgact tgaatttgat ctagtgaaat 12300
atatactcac aaagtgagga attatatcta gaaatctgta atttttaatt gtaccgctaa 12360
agcgctttac cttcttttgt acttcttgaa aatactggct gcattgcaac agaagacaaa 12420
tatgattaat gtcatgcaat tcataatatc ttaaattgca ttgctggatt ctttctcaat 12480
taaaagaaaa aatgaaagaa aaaggctttt aaaatgtttt tcatgcatct gataacagtg 12540
acatagaaag gaaaaaatga aacatagttc agaatactta aaagtaagaa taaatttcag 12600
ccagccagac atgagctcta ttcaacaaac atgatatgat cagtatttaa gttataggct 12660
aaaatgtctt taattttcag ctttgttatc actatccttt ttttttttta atttaaaggt 12720
atatatttta aacgtgtgtc gtctacctaa gtaagataat agtctttgaa ctaggtacta 12780
tgtttgctgt ttgggtgatg ggttcactag aagcctaaac cccagcatta ctcaatatat 12840
ccatctatca aacctacgtg tgtacccccc tagatctata ataaaagtaa attaaaataa 12900
attaaatacc agtcaactat ttggttgact ttggttgtac tgattaactg gaaatgtgcc 12960
tctgaagcca cacagccaga gcaactggct ttttgtcatt tctaatgaaa agccttgaaa 13020
gatggttcta ttagataacg ggccacactg aagctaactg tgcatctaga tcacatcaaa 13080
gcagtagagg tgagatgtta gcacagcttt ggtttctgca gttctcacct catgcttgta 13140
agatgtttag ctgtgtcaac tttttgaatt aatgtgggtt cttagccttc atagaccctg 13200
tgtttcagcc ttattaggtt ttgtattttg agatctcaaa ttgtgaagct ctaaaataaa 13260
acaaatctgt gtgtttaggt actagttcca caggtggtct tgccacagaa gaacctttcc 13320
atgaaagtcg aatacgaata cacagggctc tctattgctg ctatcaaaat ggactaattc 13380
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ttataccaaa aacagcatcc ttcccctcaa ctatacactt taaaatggat gttattttgg 13620
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tataaaaata gaaaatttgg tttaatttat ctttacttct actttaaaat acttcttaat 13740
aacagcatac cgtctaagga ggagtaaaag aaacatctta cattggaatg taaatgttag 13800
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tgctcattgt aatcaagata ttgcattcac atatatagaa agtagtgaaa ctaagatgga 13980
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atatttatac ctttgatgaa gaaagatgac ataacatgtc tgatgaatag agcccataag 14100
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actattccaa ttaaatcttt aatacagtgc tgagctggcc tgatcctgga attgcatgtt 14220
attattgcat aattgaaatc aacaacagca gcagacattt tgttttgctc cttacattgg 14280
ctttactcct tttccatatc tagtataaat cttaagggaa attttcttaa ttaaataact 14340
ggatgctcat ggtataaaat ggaatgattt tctagccaga ataaatgtgg gtattgaagt 14400
aatgttttag ctactgatac actttgagtg tttaattaca gagccaaaac aaaatgaaaa 14460
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tcagcctgcc cttagatagc tcagggcttg agggtggcgt gaacaacaag tcttggctaa 14820
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ttataaaatc agagctgttc aactagagaa gatgaagttt tgccaagtag ttgagttcca 29220
tgttcctaga caagttcaaa gaacaggatt ttgtaaagag ttttgttcct gaagggaagc 29280
tgaactaatt taaatttgtg actaagtttc tgttgtattg cccagcatcc agtgcatgag 29340
aaatatgctc ttatatttta tcattcataa attcatgatt aacacaaaaa taggagggat 29400
atatcttgga tttaggatgg tgctgaatac acacatacac aattggcttc tccacaagcc 29460
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catgttacta tagaaaagtt ccataatgtt gatccagaag aacgacattt gggtcctagt 30120
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<211> 11043
<212> DNA
<213> Human
<223> KLK6
<400> 29
tcataataaa attcattctt tattgagtgc atggtggccc aggtgctatt ccatgtatgt 60
cataggtgtg aaaccttaaa tctttccaac agccactgcc ttatggagac tgtatcatcc 120
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aggaggagga ggaagaggag gaggaagagg agaaggagga ggaggaagag gaggaggaag 1200
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ttagacagag tctggctctg tccccaggct ggagtgcagt ggcgtgatct cagctcactg 2040
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tgggattaca ggcatgagcc actgtgccca tcctaatttt tgtattttta gtagagatag 2460
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cggcctccca aggtgctggg attacaggca tgagccactg tgcccatcct aatttttgta 2580
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catcctaatt tttgtatttt tagtagagat agggtttcac catgttgatc aggctggtct 2760
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atttgctata tgtggctgat ggctaccata ttagacagtg cagctctagg atgtcaagat 6000
ggggattttt gttctattca gatatagtat ctccagtgcg ttgatcagca cctggcacag 6060
gataggtgtt tgatacatat tcctgaaaca gagagtcact cccttgctca gacatcaccc 6120
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gtgtgatctg gctgtagtca ctttccaacc ttatctccca gcaccttctg ccccccagtg 6240
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caccccaggg attgtcactt gctatttccc tgcacctcag tttcctcatt tgcaaaatgg 7200
tgccaagagt cccttgtggt gggcattcca ggaaaggtgt gtacatggtt tcactcagca 7260
cctgattggt agttagcatc aaacaagtgg cagctgtcgt gaatctgact agtgaggatc 7320
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gctttgagac gaggaggcag aaagagttag aaatgcgggg agccgtgagg agagaagaca 10020
ctcagatgca gtggcagagc caagcggagg acgcaggggc cgcagagccc agggctgcag 10080
ggactgccag acacacaccc ccagctccca ggcctccctg gaagaggctg gttctgtccc 10140
cagatgcttc tggaacgtcc ttttaacccc tgtctctcag gtccctgagc caggagactg 10200
gctacaccct tttcctcctt acccaggcct cccacacaca ttcctcccgc ccccacgctc 10260
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gctgggggcc tggactcctg agtctgaggg aggaggtggg aacttggact cctgggtctg 10560
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gcc 11043
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<211> 35634
<212> DNA
<213> Human
<223> MUC2
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caacccacac cgcccctgcc agccaccatg gggctgccac tagcccgcct ggcggctgtg 60
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cgggagctgg ggggacactc accacgggca ctgggagctg gggggacact cactgagggc 4440
accgggagct ggggggacac tcactgtgac gggcaccgag agctgggggg acactcactg 4500
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agctgggcgt ctggctcttc ccgtccctca caccaccccg tggtcctctg cagacaagga 10200
tgtgggctcc tgccccaact cgcaggtctt cctgtacaac ctgaccacct gccagcagac 10260
ctgccgctcc ctctccgagg ccgacagcca ctgtctcgag ggctttgcgc ctgtggacgg 10320
ctgcggctgc cctgaccaca ccttcctgga cgagaagggc cgctgcgtac ccctggccaa 10380
gtgctcctgt taccaccgcg gtctctacct ggaggcgggg gacgtggtcg tcaggcagga 10440
agaacgatgg tgggtacctg ctcgggggtc aggtgtggcg tgggggcggg ggaactcctt 10500
ctgaacctgc cccaagcgga gacctgggag tctctacctg gggaagctga gacacccaag 10560
gctgaggggt gcctggggtg gggggcgctg agaggcatca ggctcacatc tgcggggaag 10620
ctgctggctg tctgtggccg tcctgcatgg gccccgctca tccctggcct tttccacagt 10680
gtgtgccggg atgggcggct gcactgtagg cagatccggc tgatcggcca gagtaagtgg 10740
cactgccccg gccacccctc cccagccacc cctccctgcc tgccctggcc accctccccg 10800
gccacccctc ccgggcctgc ctgagaccct cagcttcagc tggagctgag gtggcccctc 10860
cgtcccacag gctgcacggc cccaaagatc cacatggact gcagcaacct gactgcactg 10920
gccacctcga agccccgagc cctcagctgc cagacgctgg ccgccggcta tgtgcgtgtt 10980
gggggcgctg ctgtgggcgg gcagggattc ctggctggct gagcctggct cttgtgctgt 11040
gcccccgcta gggtctgggt gccgagtcct gaggacgcag gccctgttga tgctgtccct 11100
ggccctggga gggaagtggc agcctgtgag ccactggggc acaggggcca gtgtagggcc 11160
cttggccggc agccctcacc agtctcactg ccctgtggcg ggcccaaggg gagggaagcc 11220
tgagcccagg ccagggggag tggtgggagg tctgggacat gacagagact gcatggtcag 11280
gcctttcctg gttgcacatc caatcctgac cccagggagg gctgcagcct cacctgtcca 11340
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ttgcgtccat aacaacgacc tgtattcttc cggcgccaag atcaaggtgg actgcaatac 11520
ctggtaagct ggcccggcct gtcctggctg cctcccaggc cccacgtgct ccgcaggggt 11580
ggccactgga gagcggtcca aggggcaagt gcctctcctg ggggttccgc ctgggtcttg 11640
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cttgaagcca tgggggaagg gacatttgga gccacttttg gggcctgcag gtgtcctgtg 11760
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ggtcctgggt cccttcaggc tcctctcctg tcctcctcag cacctgcaag agaggacgct 11880
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tgtggtcacg ggcactgcct ggtcgggctg cttatggtca gggaccctct gcctgcccca 12060
agtgcagtgc ttagctcccc gagaaaccct gagacttggg aaggccggcc tttcctcagc 12120
cccagacccg cacctgcacc cgcaggagga ttcgttcttc tagccagggc tgggtagggg 12180
tggtaaaacc cctctgtact gcccagttct gtggttctcc tctgggtcct cctccgggtc 12240
ctcctccggg tcctcatctg ggtcctccct cctctggcct cctctgggtc ctccctcctc 12300
tgggtcctcc tctgggtcct ccctcctctg gcctcctctg ggtcctccct cctctgggtc 12360
ctccctcctc tgggtcctcc tccaggtcct cctctgggtc ctccctcctc tgggtcctcc 12420
ctcctctggg tcctcctcca ggtcctcctc tgggtcctcc ctcctctggg tcctcctctg 12480
ggtcctcctc tgagtcctcc ctcctctggg tcctcctcta ggtcctcctc tgtggtcctc 12540
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ctcactgggc tcattcagca tcatcaccga gaacgtcccc tgtggcacta cgggcgtcac 12960
ctgctccaag gccatcaaga tcttcatggg ggtgagtgct gctggccctg gggacgcgtg 13020
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ctacaccacg cgggaggtgg gccagtacct ggtggtggag tccagcacgg gcatcatcgt 13200
catctgggac aagaggacca ccgtgttcat caagctggct ccctcctaca aggtgggctg 13260
cctccctgcc tgccctgccc cctcctggcc agccccccac cccctgccct ggtgtttgca 13320
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tgactgtggg ctggggccat gggcggggcc gactgtaggc agagcagggc tgtagggggc 13740
ctgtgactat aggccggggc atggcggggc taactaggca gagcagggct gtaggtgggc 13800
tacagctgtg ggcggggcca tgggcggggc cgactaagca gagcagggct gtaggtgggc 13860
tatagctgtg ggcggggcca cgggcggggc cgactgtagg cagagcaggg ctgtaggtgg 13920
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gggctgtggc tgtgggcggg gccgactagg cagagcgggg ctatgggctg actgtggacg 14040
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tgctgcgtca cgcaccacac ggcgcttgtc ctccagcttt ggctctggcc gctgcctcct 14220
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ccctctgcct ccccaggctc agatattcac ccggagggag aaaggacatg tgtcccccat 14340
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ggctgatgtc tggagaccca tggggacacc cggagggagg cctgaccctc agggtaccca 15420
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cggtcacatg catgcatggt gcacacatgc acacatgaat ggatgccaac atgcaggcac 16260
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cctctcctcg cccctgctct gttcccacag ttacaaccca gtggggggct cttccggagc 17400
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tggttaagag tggagacaaa gccccttccg tcacacttcc ttactggaat gggaagctct 18960
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gacacccatc tccaccacca ctacggtgac cccaacccca acacccaccg gcacacagac 24000
cccaaccatg acacccatca ccaccaccac cacggtgacc ccaaccccaa cacccaccgg 24060
cacacagacc ccaacaacga cacccatcag caccaccacc acggtgaccc caaccccaac 24120
acccaccggc acacagaccc caacatcgac acccatcacc accaccacta cggtgacccc 24180
aaccccaaca cccaccggca cacagacccc aaccacgaca cccatcacca ccaccaccac 24240
ggtgacccca accccaacac ccactggcac acaggcccca accccaacag ccatcaccac 24300
caccagtacg gtgaccccaa ccccaacacc caccggcaca cagaccccaa ccacgacacc 24360
catcaccacc accactacgg tgacaccaac cccaacaccc accggcacac agtccccaac 24420
cccaacagcc atcaccacca ccactacggt gaccccaacc ccaacaccca ccggcacaca 24480
gaccccaaca ttgacgccca tcaccaccac cactacggtg accccaaccc caacacccac 24540
cggcacacag accccaaccc cgacacccat ctccaccacc actacggtga ccccaacccc 24600
aacacccacc ggcacacaga ccccaaccac gacacccatc accaccacca ccacggtgac 24660
cccaaccccg acacccaccg gcacacagac cccaaccacg gtactcatca ccaccaccac 24720
tacgatgacc ccaaccccaa cacccaccag cacaaagagt acaaccgtga cacccatcac 24780
caccacaact acggtgaccg caaccccaac acccaccggc acacagaccc caaccatgat 24840
acccatcagc accaccacta cggtgacccc aaccccaaca cccaccactg gaagcacggg 24900
gccccccacc cacacaagca cagcaccgat tgctgagttg accacatcca atcctccgcc 24960
tgagtcctca acccctcaga cctctcggtc cacctcttcc cctctcacgg agtcaaccac 25020
ccttctgagt accctaccac ctgccattga gatgaccagc acggccccac cctccacacc 25080
cacggcaccc acgaccacga gcggaggcca cacactgtct ccaccgccca gcaccaccac 25140
gtcccctcca ggtaagcaga gccgcttggt tcctctggcc tgggatgctt cttcctcccc 25200
ttgtgccggg caggactgtc ccaggaaggc tcaaggcacg ttctgggcgc ctctctgccc 25260
acgaagcttg gtcactgtgt gggcagaagc cactgacact ggccagtgct gggcagtgaa 25320
gccaaaggcc attccgcttg cccataggac agccttctga ggagctgctg acaccggcca 25380
gtgctgggca gtggagccct tggctatcct gctcgcccat aagacggcct tcttcagggg 25440
cccactgcta tgtgatgcgg tgctgtggga gcccatcaag gctggggggc agagagaggc 25500
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ggctgtggtg atactggcct tgccgctcca ccctgcctgg tgactctgag agcctgggag 25740
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agctggggag tggcagttgg gaccctgtgg catctgagat gtgcaacgtc tcagccctca 25860
ctggtgtctc ctgctctcac aggcaccccc actcgcggta ccacgactgg gtcatcttca 25920
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ccactctcca cacccagcat catcaggacc acaggcctga ggccctaccc ttcctctgtg 26040
cttatctgct gtgtcctgaa cgacacctac tacgcaccag gtactcaggc tgttcacatc 26100
ctgtgcttgg gtggccgagg ctggccccgg catgtaccaa tgggtcaggt gccagggctg 26160
agatcgcagt agaagcgtct caggaggcag cagccgtcga gggtggctgt gtccagggca 26220
cggcttccct tgggtggcct ctgtggggac ctccgctgtg gggacctcca cggggtccag 26280
cggctagccc tgcctccggc tagccctgcc tctggacggt gtgatcgtgg gtctgtctcc 26340
cttcgcaggt gaggaggtgt acaacggcac atacggagac acctgttatt tcgtcaactg 26400
ctcactgagc tgtacgttgg agttctataa ctggtcctgc ccatccacgc cctccccaac 26460
acccacgccc tccaagtcga cgcccacgcc ttccaagcca tcgtccacgc cctccaagcc 26520
gacgcccggc accaagcccc ccgagtgccc agactttgat cctcccagac aggtcagtgg 26580
gctgcaggcg gctttgtccc catggcactc tgcgcagcat gtccgggcag ctgaggcccc 26640
aggcaccact tcctgctggt cgtctgaggg ccgaggcctc cagcaaccct tgggtgcagg 26700
gtctgccgag ccctccacat tttcaccgtg ccccgctgtg cctggcgagg tggctggctg 26760
cagtgaggtc cgtggaagcc acttcggcct ccagcctccc ggctcagcac ccgcccctcc 26820
tgagcgcaga ccaccccatc ctgtgccggt ccccctgacg tcccttgcct cccgtcccca 26880
ggagaacgag acttggtggc tgtgcgactg cttcatggcc acgtgcaagt acaacaacac 26940
ggtggagatc gtgaaggtgg agtgtgagcc gccgcccatg cccacctgct ccaacggcct 27000
ccaacccgtg cgcgtcgagg accccgacgg ctgctgctgg cactgggagt gcgactgtga 27060
gtccggggcc cccaggccct ccccgcatct cctgccctct ccgtgggtgg gggctgcagg 27120
gcccgtctcc cgggggcgga agggctgagg ctccttgggc acagatccca ctgaggtgtt 27180
cgctgaggct gggtgacttc tgagggtctt ctcacagccc tgcttttgcc tcattgggtg 27240
gggagggcct gggcaggtgg agggcttgcc tggtggagtt agggctcctc cctggaacaa 27300
gggtgcttct gaggcaagag ggggctgagt tgaagtttga accctggtcc gtcctgcaga 27360
atgggccact gtgggtgcgc cagggcaagt gcagctcaga catccccgtg cccacgcaca 27420
ggagtggggt tttcaggccc cagcttcctg ctggctcttc ctgactatgc cccagcccag 27480
cccttgcacc cgaccccggc cgaggggcac aggtggcacg gctcactccg gctcccttgc 27540
aggctactgc acgggctggg gcgacccgca ctatgtcacc ttcgacggac tctactacag 27600
ctaccagggc aactgcacct acgtgctggt ggaggagatc agcccctccg tggacaactt 27660
cggagtttac atcgacaact accactgcga tcccaacgac aaggtgtcct gcccccgcac 27720
cctcatcgtg cgccacgaga cccaggaggt gctgatcaag accgtgcata tgatgcccat 27780
gcaggtgcag gtaggcacag cgtggccaca ggaggctggc atggaggcgg gtgctgacat 27840
gggccccaat gcaccctggt tccccagggg ccagaggact gggctgtggg ggtgccaagg 27900
catagcctct cctagagttg ggctagaagg taggatgggg tgggcgactg gctccgggac 27960
atatcagctc ttcctgcagg ccctccaggt gtgtcctggg cccctcgagc cctggcacca 28020
tgccacgctg ggcacagtct ctgcagcaga agctgcctcc tgaggacaga gtcagggaca 28080
gggctctgca cacccttggc tgagatgccc ctacttgcag gggaatcatt ggttctgagg 28140
ctcaggaggc cccgggagcc tgcgccgggc tccacagtcc ccaggtgctc ccaggagagc 28200
tccttcactg gctcacccat gggaccaggg tctggttggg agcagtggag tggaagcaag 28260
aaagggggca ggaaagcggg gtaggcaggg ccctctccct acatgtgtag gtcagagagc 28320
aggcggggtg gggcagccct ggagctctca caaggagagg accgaggcag ctgcagctcc 28380
catggtgtgt cggccacagg tgcaggtgaa caggcaggcg gtggcactgc cctacaagaa 28440
gtacgggctg gaggtgtacc agtctggcat caactacgtg gtggacatcc ccgagctggg 28500
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tcggggctgc tgtggccatc acccgggttc agtctctgtg aggagccaac aggagggggc 28800
ctggcctggt ctctgccctc ggccctggct ggccggtcct gggcatctgg gctggagaag 28860
ggcagggctt accctgtctg caacgtggcc tctctcactg atacaggcac ctgcaccaac 28920
accacctccg acgactgcat tctgcccagc ggggagatcg tctccaactg tgaggctgcg 28980
gctgaccagt ggctggtgaa cgacccctcc aagccacact gcccccacag cagctccacg 29040
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accccatctc ccctctgcca gctcatcaag gacaggtgac cccgcccagg cctgcctgtg 29160
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atcaggcgct aggtcgccgt ggggtccagg acccaggccc ttgggttcca cggggctgag 29340
ctgctacgtg cggcctgtgc ctttgctgaa ctccagtctc tcctggctcc cgggaaggtg 29400
cagggctggc cgagtgtgag gcccggagta aaccagtcaa cccaggacag agctcagggc 29460
tgatattggg agggcagatt tgggctttga cagagagggg gtgctcctaa cgctggcagt 29520
catggggggt cagcatcctg tccctggaag tataggggcc aggtataggc tgggtgtcca 29580
tctgccaggg ttgctggagg gggtcctgaa gctgatgacc acatagacgt ggtttctatc 29640
tctgggagcc gggctgcaga gccaccttgc tcggccatcc cttggtctgt ccctgagctg 29700
tccccctggc tggcctgtcc cttgaccctc catcagccac aggcgcctct ctggcgggtg 29760
ccggactcca ggaggacagt ccgggcagag acgctggggt agagagcagg ggagaggcag 29820
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tgcctcgact ggcggaacca cacgcatggg gcctgctgta agtgcccatc tgcccctgcc 30060
ctggagctgg gggcctgcag gccagacgtg gtctctaggc tctgccaggt gctgtgccca 30120
gcctgaagct agacctagat gggctgcggc cagggacgca gagatggcgg gtgtgagacc 30180
agggctgggg ccatggggtg gggaaggcca ggctggaggg gctgaggtgc tggggcttct 30240
gccagcatcg ctaaatgcaa ctgggtgccc accacccagc tcgggacaac ctcgagggtg 30300
gaggttgatg cccaggcagc tggtcaccct cctccgtgtg tggggcactg ggcagctgtc 30360
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tccctcagtg gtggagtgcc catctcacag ggagtaccag gcctgtggcc ctgcagaaga 30480
gcccacgtgc aaatccaggt atgttgtttg agggtccacc aggaccgtgg gctcgccttc 30540
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caccccacct gtctgacaat gccctcccgc ccccagctcc tcccagcaga acaacacagt 30660
cctggtggaa ggctgcttct gtcctgaggg caccatgaac tacgctcctg gctttgatgt 30720
ctgcgtgaag acctgcggta cgccacccac tcacactgtc ccctcctgcc tccctcctgc 30780
ctcctcctgg gtgtccacgg aggctgggac caggacgctg accacccccc acctctgatc 30840
cctgttgcac aaggactctg ctaacacaac ttgtctcctg ggtgtccatg gaggctggga 30900
ccaggaggct gaccaccccc acccctgctc cctgctgcac aaggactctg ctaacacaac 30960
ttgtttcttc cctcttccta ggctgtgtgg gacctgacaa tgtgcccaga gaggtaggcc 31020
ccaccgtgtt gctgggggat ccttccacaa attctgaatt ctggggagtg agggatggac 31080
atgaaaacct ggagcctcaa agattgagga atgaggtcat ctaagtcctg gatggctgag 31140
ttggcatgga caccacccac tcacccaccc atccttccac ccacccactc atccacctgt 31200
gcacccatct acccactcac ctacccctcc atccttccac ctacctagtc atcacccact 31260
catctatgca cccccccacc cacccactca tccatccatc catccaccat ccacctaccc 31320
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atccatccat ccacccatca tccatctacc atccacccac ccacctatcc atccatccat 31440
ccaccatctg tctaccatcc acccacccac tcatccatcc atccatccac catctgtcta 31500
ccatccaccc acccacctat ccatccaccc atccatccat ccatccatcc atccatccat 31560
ccatccatcc acccaccatc tgtctaccat ccacccaccc acctatccac ccatccaccc 31620
acccatccat ccacccaacc atccaccatc catccatcca tccatccatc caccatccat 31680
ctaccatcca ccctcccatc catccacgca tccacccaac catccatcca tccatccacc 31740
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catgcctcct acctgtggta gcagccatgt ggatgattcc ttagctaaat tctgtacaaa 31920
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agcaggtaat ggctttgtga tatcagtgaa tgagcagcta ctgtcctatc ccagaacctg 32040
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ctcagggtgg ctgtttctcc ccgctgacca cagctgcagc tccggggctg tggtgaggtg 32160
gggcctgcct ggtgccacct gtcctctcta ctcacccttc tttccctgca gtttggggag 32220
cacttcgagt tcgactgcaa gaactgtgtc tgcctggagg gtggaagtgg catcatctgc 32280
caacccaaga ggtgcagcca gaagcccgtt acccactgcg tggaagacgg cacctacctc 32340
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ccctggggcc catgccacct ctcaggggtg cacacatccc tgtaggctgg gctgcctgct 32460
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tgggattcga agtgaagagc aagatggtgc ctggaaggtg ctgtcctttc tactggtgtg 32880
gtaagcaggg ctggtgggca gggcagggag gaggctgccg cccggggtgg ggtggctgta 32940
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gctgatgcac ccaccccagc cctgagcgct cgctccatcc actgggtgtg caccgggagt 33060
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tctcccaaga gtccaagggg gtgtgtgttc acgggaatgc tgagtaccag gtgagccctg 33180
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ttgggctggc tgggatgctg gagaggcccc tgcctcatgt ctctccctgt gcccgaagcc 33300
cggttctcca gtttattcct ccaagtgcca ggactgcgtg tgcacggaca aggtggacaa 33360
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ggcccatgtc tgcatcgtga ccctttcttt cctcctttca acgccaacct gtccctgtcc 33540
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agattcagag ttagaacaca gacagacctt tgagggttgt gtgggctcca ggctggtgcc 34260
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gcagcagcta cccccgccca cggcatcgtg ggaaggtgct ctcatcccca ggaatgtccg 34740
ggggtcccgg gctcattctc ctttccctct agggctccat cacattcatg cccaatggat 34800
gctgcaagac ctgtgagtac agggcacagc ctggggggta ggcagggtgg gggcacaagg 34860
gctggtgccc tcagccccgc ctggggtggc tggaggctgg acaacggcct ctgggtgggc 34920
agtgagggct gggggctgag gccgagcctg gggaggggac gcagcgaggg agagcctcct 34980
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gagaccaggg tgccctgctc caccgtcccc gtcaccacgg aggtttcgta cgccggctgc 35100
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ccaggctggg agtgtgcctg gagggggtgg tggagacccc agggaggcga gaggccagcg 35220
ctggccccgg aaggtcaccc ctcactccgc cctcccccca ggtactcggc caaggcccag 35280
gccctggacc acagctgctc ctgctgcaaa gaggagaaaa ccagccagcg tgaggtggtc 35340
ctgagctgcc ccaatggcgg ctcgctgaca cacacctaca cccacatcga gagctgccag 35400
tgccaggaca ccgtctgcgg gctccccacc ggcacctccc gccgggcccg gcgctcccct 35460
aggcatctgg ggagcgggtg agcggggtgg gcacagcccc cttcactgcc ctcgacagct 35520
ttacctcccc cggaccctct gagcctccta agctcggctt cctctcttca gatatttatt 35580
gtctgagtct ttgttcagtc cttgctttcc aataataaac tcagggggac atgc 35634
<210> 31
<211> 21849
<212> DNA
<213> Human
<223> CEACAM5
<400> 31
gatgctgaga agtactcctg ccctaggaag agactcaggg cagagggagg aaggacagca 60
gaccagacag tcacagcagc cttgacaaaa cgttcctgga actcaagctc ttctccacag 120
aggaggacag agcagacagc agagaccatg gagtctccct cggcccctcc ccacagatgg 180
tgcatcccct ggcagaggct cctgctcaca ggtgaaggga ggacaacctg ggagagggtg 240
ggaggaggga gctggggtct cctgggtagg acagggctgt gagacggaca gagggctcct 300
gttggagcct gaatagggaa gaggacatca gagagggaca ggagtcacac cagaaaaatc 360
aaattgaact ggaattggaa aggggcagga aaacctcaag agttctattt tcctagttaa 420
ttgtcactgg ccactacgtt tttaaaaatc ataataactg catcagatga cactttaaat 480
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ctattgaatc cacgccgttc aatgtcgcag aggggaagga ggtgcttcta cttgtccaca 1200
atctgcccca gcatcttttt ggctacagct ggtacaaagg tgaaagagtg gatggcaacc 1260
gtcaaattat aggatatgta ataggaactc aacaagctac cccagggccc gcatacagtg 1320
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gatgtggggg acttagcagg gggaggtcag tctcagccaa gcaccccgtg ccctccccgt 1740
aaacctgacc ctgagaaaga ccctggagaa ctgcatcaga gcctggcctg agggacccct 1800
gggatattca cagagaagct cagccccagg gctcctggtt ccaggtgact caggggagcc 1860
tgtgccaggg ctgtgttgtg gcctcctggg caaggctaac tggaagcaag gacttagcag 1920
ctgtccaagg gctgtggctc ctggagctgg attctggatg cagaatcgga ctttctggcc 1980
acacttgttc cctgtcccca gagtctcatt tggacaagga cagagccttg tcctttactt 2040
gagactcaat gtggggagga tagatagaca aggttattag ggtgtcagtc cattgccctg 2100
gggacatagg tgactccatg ggaagctcag tgtccccagg aagaggaaca gaggagagaa 2160
gatgctcccg gcagctcctt gtccaccagg gatcaggccc agggccttct ctcttggagg 2220
caaataaaca taaatgatgt tcatttgagc agctcctctg tgcagagctg agatcaagta 2280
attgtaaata ttttgaggtt aattcacaaa caacctcaca gccaaatagc acttatccta 2340
cttattgaaa ggaaattgag gcacagggag acagtcacta acaagggtca cacaggccat 2400
aggtgtcaga ttgaagtcac atgaggtctg tctgtagcca cagccccctc ctctcctcaa 2460
ctgggggtgg gtggggctgt ttgttgttag gcatctgcat ctgagaccag tcatgggctt 2520
gcgttctttt gtcttgggca tccacagctc agaagcggag attctggtct ggagagtgat 2580
aagtaaatgg agaaataatc agttttactc tagaactaga tcacctcaac agtcagggtc 2640
agtgccggga ttgtccaggc ctctccctga gatccacagc cccctcacat gacctcaaat 2700
cctgtgtttc ccgatgtgtc agtgtcactc ccacggaagg ataaaggaaa ggacttcgct 2760
ttctctcccc actcacaccc tgtgccaaca gaggcccaaa gtgagacaca cgcttgctca 2820
gtagctctct catgaagggg ggaatgagtg aaggaatgat ccataacctc tatagagact 2880
ggatcctgga tgcagaatcc tgggaggttc tgaccacacc tgttccgtgt ccatcagggg 2940
ctgagatcca tgtaccattc ctctgacccc ctgtcccgaa agccacccta tctcatgtga 3000
ctctggggtt ccttggccat gggagggttt tcaaggctcc ctggtcctgg tcgggacagc 3060
caagggactc ctagtcctgg ggtctccgag gtcactatac cccgcatggc tcattgccat 3120
gggcatttct gactttcttc tattcctcca tgttcttcgt cttcctccct cttcattcca 3180
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ggcaataggg aaggcacaga aatcacaggc aatagggaag gcacagatgg agcccctgcc 3360
aggctccatc acaagccaat gtcaacaggt caccaggaga atgagcttcc gctgtgttcc 3420
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tgatgccatt gtcataaggt ggagtccctt ggactgagaa gtgaaccagc cactggcgtc 3780
tcacttagac tctacccagt tacaaaaact taaactctag ttgtgttttc tgaggttgat 3840
aggagaggaa gaaaaccttt cacatgcctg ttttgaggct tctcctcttt ttgcctaact 3900
ctgcacagga actaggggca gggagcgctt tctaaattta ctaacatcac acacattgct 3960
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ttcaaaccac tttcagcatc ttcctttgag cataatgtga tcactttgga attcagagca 4140
gacctaaacc ttagcataat attaaaagaa gtactacttc cagcaattga tcttagatct 4200
ttaggccatt gataagaatt tccacttatg gaaaaaattt aatgtttccc ccaaatgtct 4260
ttcacttttt taactatagt cagaaaataa catgagatct aaactcctga caaattttta 4320
agggcaaatt atagtactac agattgagta tcccaaatcc taaaatccaa aatctgaaat 4380
gctccaaaat ccaacatttt ttgaccactg acatgattct caaaagaaat gctcactgaa 4440
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tcacaaagtc aagagatcaa gaccatcctg gccaacatgg tgaaaccccg tctctactaa 4560
aaatacaaaa attagctggg cgtggtggca tgcacctaca gtctcagcta ctttggaggc 4620
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aagaaaagaa aaaagaaagg ctcactggag cactttggat tccgtatttt cagatttggg 4800
gtgctaaact ggtaagtata ttgcaaatat tcaaaactca aaaacagtca gaaatccaaa 4860
acacttttag tcctaagcct tacacataag acatactcaa tctgtatgaa ctataggcac 4920
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tccacaagtg tgactactct agggacttca tataagtgga atcctacagt atctgccctg 5100
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ctcaaagttc tgtctcataa ctgtcaaaca cacatggtcc ttgagggcca gatttccagc 5220
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atggagagat ccacagcatc ctcgcctgcc ctctgcaagg ggagaaggga cattaaagac 5340
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tctctactaa aaatacaaaa tttagctggg tgtggtggtg ggcgcctgta gtcccagcta 5520
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ccaaagacaa agaacataca tatggttctg ctgttaaatc cgggcagctc ctgcctgtca 5700
cctgaagttc tagatcattc cctggactcc actctatctt taggggtctc tggctcaagt 5760
cagtcatcat caaacacctg ggaaaaactg ccccaccttg tgcctccact gcctaacgac 5820
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gggccaagta gtcaactggt cagggaggga ccaggagagg caccaggagc tgtgacctcc 6120
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catctgtctt gtgacacatg cacccaccgt gggtttttaa gggctcaggt gggctgagag 6300
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ccaccatttc ccctctaaac acatcttaca gatcagggga aaatctgaac ctctcctgcc 7140
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gtaagtggat ccacgaagca ctgacatcat gttttgaggt ggagtctgtc tggttttcaa 7380
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ttctcatggc gggccccagg tccagcttgg aatgtgggga ggaggctccc tcagccccac 7560
agccctgtgt agtggaggaa gcttcacaga gcgggaagga gcaagggttc tcaaggtcaa 7620
gttgcttctc tctgtcacca atgtgtccct ttctgtcacc tctttgtgtt cttttgccta 7680
ctccatgagc tacaagcaac attcaaggct ttgaaacaag ctcatacttt tttcccaaat 7740
gagagaagga agccccttgg gtgagggaga cacagctcag actgctccct gctctgctct 7800
gggctcccct gggtgactgg ccttgcctga ctccacctag gtgggaacga ggtgtgtgga 7860
gaaggagccc gggtggtctg tcctgaattc ggctaaatca agctgccaat caacaccaaa 7920
gcttcccttc gtcccagtca ggctgcagga aaatggaaag agagggagcc tcagggcaga 7980
ctcctgagct gcgtcctggc tctgatgtca ccagctatat gaggctgtgg gcacagcaca 8040
tgggacacag cacaggggac agcaagtgac ccacacttgg agaaatcagg agattcacca 8100
caggggctct gcacggcagg gaatggcagt gtcaaaaatc gtgtgtttat acagatggta 8160
acagtacata tctaacacaa acttaccatc ttaacttttc tacacatgca gttcagtggt 8220
attaaatata ttccccttgt tctgcttcca tcaccaccat ctacccacag gactcttttc 8280
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gcccacagtc tgatccctga cttgtcacct ctagacatgc tcctagtctc ctgcactatt 8400
tctgctcaaa catccatctc catcatcacc tatctctagg atgtccttaa atagcaaagc 8460
ctcagagcaa acacaacttg gctgggtggt gtgggactgt gcagctggaa gaaacgcagc 8520
tccttcaaat tccaggtgag gaccccaatg ggccaggcag ccagccagtc aggaaaggac 8580
cagaagtgct gggggctgtg acccccagcc ctgtgtctgt ccacaaccca atgctactgc 8640
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ctgagccctc agatcattgt gcatctgtct tgtgacgcac acacacctgc catgagcttt 8760
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caaacccttc atcaccagca acaactccaa ccccgtggag gatgaggatg ctgtagcctt 8940
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cccggtcagt cccaggctgc agctgtccaa tgacaacagg accctcactc tactcagtgt 9060
cacaaggaat gatgtaggac cctatgagtg tggaatccag aacgaattaa gtgttgacca 9120
cagcgaccca gtcatcctga atgtcctctg tgagtatctt ctgttcctct gtggctcagg 9180
ctgccagccc aaatccacat agccaaagtc caggcctctc agtccctctc aggcccaagg 9240
acagagactt ttacccctgg acatccaggc tggccctacc cccagcaaat ccatgcaggc 9300
ccagtcctga ccaagaatag gaggggaggg tctgctcctg tcctgtaaca ctcgggatcc 9360
acagctagtg atgggagaaa cagatgaatg tctcagactc tggctaattg gatacagtag 9420
gggtttggtt aggacttcag gattgtgact tggctcaggg ggacactgtt gccctttcac 9480
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atgggaacat ccagcaacac acacaagagc tctttatctc caacatcact gagaagaaca 9720
gcggactcta tacctgccag gccaataact cagccagtgg ccacagcagg actacagtca 9780
agacaatcac agtctctggt aagtggatcc ctggaccgtt agcaatatgt tctggagcgg 9840
aatctgtctg gttttcagaa aagagccagg aagaaatttt ctttcctagt atgcatccaa 9900
tgggcacaag caatcccaaa ttcaatcctg agcactccca atttgtctct acaaacactc 9960
ttccccttgt ttttctgatt tctcatggct gaccttgtgt ccaccctgag aaatgtgggg 10020
aggggtcttc atcagccctg agccctatgt agtggaaggg gcttcacaga gggggaagca 10080
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actttgtgtt cttttaccta atccatgagc tacaaggaac aactgaggct ttgaaacaag 10200
ctcacacttt ttccccaaat gagaggagga tgccccttgg atgagggagg agcagctcag 10260
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ggggtgggat ccgggcatgt ggagaaggtg ctcaggtggc ctgtcctgaa tctggctaag 10380
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cttgcagtga gctgagatcg caccactgca ctccagccag ggtgacagag cgagactctg 15360
tcaaaaaaaa aaaaaaaaag tttttaattt tcatgaagtc cagtttatca atttttttct 15420
tttgttgcct atttgttgtt ataaccaaga catgactgtg aaattaaatg tcattaagct 15480
tttttcccta tgttttcttc tcagagtttt atacttttca ctcttacatt taggtctttg 15540
atccatttta ggttaatttg catatatggt atcaggcaaa gattcaactt gttcttgtgc 15600
atggatattc agctttccct atatcatttg ttgaaaagac tgtcctttcc ccattaaatg 15660
gtcttggcac cgttatcaaa aatcatttgg ccatatatgc aagcatttct ttctgggctc 15720
tatattctat tgctttggtt tcaatatctt cctttatgcc aataccacac tgtattgatt 15780
actgtggctt tatagcaaat gctgaaatca ggaagtgtga gtcctccagc ttcattcttt 15840
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ttttctattt ctgcaaaaaa tgtcactggg actctggtac aaattgcgtt gaacctgcag 15960
ctcactttga gtggtattgt cctcctagca atattgagac ttcccatcca tgaaaaaaaa 16020
atgtctttcc atctattgat gttgtcttta atttccttca gcagtgtttt atagttttca 16080
gggtacaatc ctttcacctc cttggttaag cttatttcta actattttat actattttat 16140
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attaactcta acaagttttt taatcttcag ggttttctac agagaagtcc aagttatctg 16320
aaaacacaga tcattttact tctttccaat ttggatgtct ttttttttct tgcctaattt 16380
ctctggctag gacttctaat actgtgtcga atagacgtgg caaaagcagg cattcttgtc 16440
ttgttcctgg tcttacaggg aaagctttca gtctttctcc attgagtatc atgttagcat 16500
tgggcttttc acacattgcc tttattatgc tgaggtggtt tccttccatt cataattaga 16560
gtgtttttgt tgtgaaagaa tggtgaattt tgtcaaatgc ttttattggt tctatctaat 16620
tataggccta ttaaattttt ttgtgtttcc aggaatttgt ccatttcatc taggttattc 16680
aacagtttgt tggcatacaa ttattcatag cattcttgta gtccttaata tttctgtaga 16740
atttgtagca ttggtagcaa tatctccatt ttcttttttt ttttcttttt tttttttaag 16800
agacagggtc tcactctgta gcccagcaca agctagagtg cagtggtgcc atcatagctt 16860
actgcagcct caacctccaa ggctcaagtg atcttctgcc ccagcctctt gagaagctgg 16920
gactacagac atgtgacacc aagcctggat agttttttaa agaaattttg tagacactgt 16980
gtctgcctat gttgcccagg ctggtcttga cctcctgacc tcaagtaatc ctcttgcttg 17040
agtctcccaa tgtgctggga ttaaatgtgt gagccgctat acctccattt tcatttctga 17100
ttttagtaat ttgaatcttc tctctttttt cttagtcaat ctaataaatg attgtcaatt 17160
ttgttgatct tttttgaaga accaactttt ggtttcattg attccttcta ttgtttttca 17220
attttccatt ttatttattt aaactctaat ccttattatt tccttcatgt actatctgtg 17280
gtttgaggtg gttctttttc tgtatcctga agttgtaaag ttaggttgtt gatttgagat 17340
ctctctttat atttaatgta tttaccatta aatttctcac acaagattct taacttctct 17400
gagccttcaa ttcttcaact gaaaattgta ataattctca tcaccaggaa atggaggaaa 17460
aatgaaaatt gcaataagaa tgactgttta acagtattgt tttaaagatt taatgtaata 17520
ttcgattaag ctttcagcaa aatgctacac acagagggaa acttcataaa tattagctgc 17580
tattatcact actgttatta ttagcttgaa gttaggcagt tctagagcca aatcctagat 17640
ccacttctca ctaattatat gactttggat aagttttttc accactccaa gtctctgtca 17700
tttcatctgt aagatggaaa tcatgcctac ccaacagggt tattgtatgg atcaaatgag 17760
atgccagaaa agcatttaca gtagctaaca tagcattaat catcagcctg agttgactag 17820
tgagagccaa gccccaaatg aaaacccact aggacatggt tactggctaa aaatggggga 17880
gagaaaaaaa agttaagtgc aaagaatcaa gcctggtatg ttagttttca tccactgaga 17940
ttcagccaag atggaattag aggtgcaaga taatttaccg gggggaacca ccatgaggaa 18000
aagtggagta gaagtgggag gagcctgaga gagccctcag accacgatgc agatctgatt 18060
cctgagaagg agaaagagga gagagtttta gatagtgatg cagttctcag agtttccaca 18120
aggctggtgg ggcgtcctca agcccctcac ccatgagaga gaagcagagt cccccagaac 18180
tgggcttttc attcccctgg tgggagccca tgagaagcga gttctctgtg caacggactt 18240
agtaaataca gaatgcacta gcctgggcct tctgccaatc aagtccctgc cacagagacc 18300
caacagactt atttatgcct accacaactg agacactgag aaaaagatgc aaccatgaaa 18360
agatagaaag ttctaatgac acgcaaaaat agcaatcaga ctttctcaaa tttcaaagcc 18420
ttcagaaata gctgagtgca gacaggccag ggtggaattg acagaagact gatcaccaac 18480
tagcaacaca gtgagagaga aaaaattgca actttcccac aaaactaatg cattccttga 18540
agcaacaagt agagactgct tcatgctgag agctggaacc tggggcaccc cactgtaaaa 18600
taacatcaca ttcattcctt ctcttttctt tccatgacgg acgattcagc atctggaact 18660
tctcctggtc tctcagctgg ggccactgtc ggcatcatga ttggagtgct ggttggggtt 18720
gctctgatat agcagccctg gtgtagtttc ttcatttcag gaagactggt aggtataatg 18780
gcctttcctc ttgttctgtt tcctgcagtg ctgactgcca tgcttgggag agggaaggga 18840
tttcttcacc tgtatctggg actggatctc ttcctcctac ccccaagctc ctgcttctca 18900
gcactaattc ctgcaggtct cttcttccct ggtcttcatg ctccctgtac gccactgtct 18960
cttagatata attatcccca ccctctgctc atttgtttcc cagattcaat acattgtcaa 19020
agcctcttgg tcctttttta acatctcaca cttgtgtcat tctctccatt cccataaacc 19080
tcaacaactg ctcaaagtcc tgcttgaccc cttgttgcca gtctttgaaa tctttcttgc 19140
atatgactgc ctcattacct tcctaaaatc tagttcactc gcctactcaa gaagacacag 19200
gggcctactg tggtgtatta gataagttca catttcttct ctttactaat cttttttact 19260
tcctttacca ccactccctt atataattcc atcatcctaa tagatctgtt tccctacaca 19320
tccctgcctc tccaccccac atgtacacag aattcttagt tccggtgtta cacctaaaaa 19380
catgtcaaac agggtgacct ccttccactg tctgcactgt ggagttaccc acacccttaa 19440
tcacaagcaa cttctgacct catgaagaac aaagactgta gcattaacct gtgagtctta 19500
agctcaggac acaactgtgc ctgtgactga gaaccttttc ctgataacca attcatatgt 19560
tcataacaga tacagaaatg aagaaggcaa ggtccttaat tctataacag gagacaaaac 19620
ctgaaaaata atcataatgc caaaatagaa aggagtgaac atcacaagaa attagagaaa 19680
tctgacggaa aatatagcta cacattggaa tcactcagaa acattttata aaatggatac 19740
ttaagtccca ccgataaatt ccgatttact ggtctggagt gggacccagg cattcgtaat 19800
ttttaagcct ccccagatgc tactaatgtg tagccaggat ggagaaaccc tgttctaaat 19860
aggtaggact tggggctaaa cccatgactt tcagctagga ggattagaat tgcccatgga 19920
gtttttctgg ctgggcacgg tggctcacgc ctataatccc agcactttgg gaggccaagg 19980
cggacggatc aggagttcaa gaccagcctg accaacatgg tgaaaccccc tctctactaa 20040
aaatacaaaa aaatcagctg ggcatggtgg cacgtgcctg taattccagc tactcagaag 20100
gctgaggcag gagaatcgct tgaacccggg aggtggagat tgcagtgagc cgagatcgtg 20160
ccactgcact ccagcctggg cgacagagca agactccgtc tcaaaaaaaa aaaaaaaaaa 20220
agaattgcct gtggagtttt tcaacatacg taagcctata ctttgttggc cctgttcatt 20280
aatgggctcc accaggaaat taggaatcta gttgagaaac agaagctgaa tggaaaggcc 20340
accttatttg atatgttaaa ttatatggga agcactgtca aatcattagt gatgttaaac 20400
cttctctaag ttatatttat gagtatgtta ttgatgtatt ccaaaagtta tataagaaat 20460
tctagaaatc taattggtta tcagccataa tgtcatatgc cacagaagta actaaatttc 20520
tatgtgagtt gtgttcttat tataataaat tatcatcaga tttttaactg tactcatttt 20580
aaatctttgt cattcacaga cagttgtttt gcttcttcct taaagcattt gcaacagcta 20640
cagtctaaaa ttgcttcttt accaaggata tttacagaaa agactctgac cagagatcga 20700
gaccatccta gccaacatcg tgaaacccca tctctactaa aaatacaaaa atgagctggg 20760
cttggtggcg cacacctgta gtcccagtta ctcgggaggc tgaggcagga gaatcgcttg 20820
aacccgggag gtggagattg cagtgagccc agatcgcacc actgcactcc agtctggcaa 20880
cagagcaaga ctccatctca aaaagaaaag aaaagaagac tctgacctgt actcttgaat 20940
acaagtttct gataccactg cactgtctga gaatttccaa aactttaatg aactaactga 21000
cagcttcatg aaactgtcca ccaagatcaa gcagagaaaa taattaattt catgggacta 21060
aatgaactaa tgaggataat attttcataa ttttttattt gaaattttgc tgattcttta 21120
aatgtcttgt ttcccagatt tcaggaaact ttttttcttt taagctatcc acagcttaca 21180
gcaatttgat aaaatatact tttgtgaaca aaaattgaga catttacatt ttctccctat 21240
gtggtcgctc cagacttggg aaactattca tgaatattta tattgtatgg taatatagtt 21300
attgcacaag ttcaataaaa atctgctctt tgtatgacag aatacatttg aaaacattgg 21360
ttatattacc aagactttga ctagaatgtc gtatttgagg atataaaccc ataggtaata 21420
aacccacagg tactacaaac aaagtctgaa gtcagccttg gtttggcttc ctagtgtcaa 21480
ttaaacttct aaaagtttaa tctgagattc cttataaaaa cttccagcaa agcaacttta 21540
aaaaagtctg tgtgggccgg gcgcggtggc tcacgcctgt aatcccagca ctttgatccg 21600
ccgaggcggg cggatcacga ggtcaggaga tccagaccat cctggctaac acagtgaaac 21660
cccgtctcta ctaaaaatac aaaaaaagtt agccgggcgt ggtggtgggg gcctgtagtc 21720
ccagctactc aggaggctga ggcaggagaa cggcatgaac ccgggaggca gggcttgcag 21780
tgagccaaga tcatgccgct gcactccagc ctgggagaca aagtgagact ccgtcaaaaa 21840
aaaaaaaaa 21849
<210> 32
<211> 1869
<212> DNA
<213> Human
<223> RNA18SN5
<400> 32
tacctggttg atcctgccag tagcatatgc ttgtctcaaa gattaagcca tgcatgtctg 60
agtacgcacg gccggtacag tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atggttcctt 120
tggtcgctcg ctcctctcct acttggataa ctgtggtaat tctagagcta atacatgccg 180
acgggcgctg acccccttcg cgggggggat gcgtgcattt atcagatcaa aaccaacccg 240
gtcagcccct ctccggcccc ggccgggggg cgggcgccgg cggctttggt gactctagat 300
aacctcgggc cgatcgcacg ccccccgtgg cggcgacgac ccattcgaac gtctgcccta 360
tcaactttcg atggtagtcg ccgtgcctac catggtgacc acgggtgacg gggaatcagg 420
gttcgattcc ggagagggag cctgagaaac ggctaccaca tccaaggaag gcagcaggcg 480
cgcaaattac ccactcccga cccggggagg tagtgacgaa aaataacaat acaggactct 540
ttcgaggccc tgtaattgga atgagtccac tttaaatcct ttaacgagga tccattggag 600
ggcaagtctg gtgccagcag ccgcggtaat tccagctcca atagcgtata ttaaagttgc 660
tgcagttaaa aagctcgtag ttggatcttg ggagcgggcg ggcggtccgc cgcgaggcga 720
gccaccgccc gtccccgccc cttgcctctc ggcgccccct cgatgctctt agctgagtgt 780
cccgcggggc ccgaagcgtt tactttgaaa aaattagagt gttcaaagca ggcccgagcc 840
gcctggatac cgcagctagg aataatggaa taggaccgcg gttctatttt gttggttttc 900
ggaactgagg ccatgattaa gagggacggc cgggggcatt cgtattgcgc cgctagaggt 960
gaaattcttg gaccggcgca agacggacca gagcgaaagc atttgccaag aatgttttca 1020
ttaatcaaga acgaaagtcg gaggttcgaa gacgatcaga taccgtcgta gttccgacca 1080
taaacgatgc cgaccggcga tgcggcggcg ttattcccat gacccgccgg gcagcttccg 1140
ggaaaccaaa gtctttgggt tccgggggga gtatggttgc aaagctgaaa cttaaaggaa 1200
ttgacggaag ggcaccacca ggagtggagc ctgcggctta atttgactca acacgggaaa 1260
cctcacccgg cccggacacg gacaggattg acagattgat agctctttct cgattccgtg 1320
ggtggtggtg catggccgtt cttagttggt ggagcgattt gtctggttaa ttccgataac 1380
gaacgagact ctggcatgct aactagttac gcgacccccg agcggtcggc gtcccccaac 1440
ttcttagagg gacaagtggc gttcagccac ccgagattga gcaataacag gtctgtgatg 1500
cccttagatg tccggggctg cacgcgcgct acactgactg gctcagcgtg tgcctaccct 1560
acgccggcag gcgcgggtaa cccgttgaac cccattcgtg atggggatcg gggattgcaa 1620
ttattcccca tgaacgagga attcccagta agtgcgggtc ataagcttgc gttgattaag 1680
tccctgccct ttgtacacac cgcccgtcgc tactaccgat tggatggttt agtgaggccc 1740
tcggatcggc cccgccgggg tcggcccacg gccctggcgg agcgctgaga agacggtcga 1800
acttgactat ctagaggaag taaaagtcgt aacaaggttt ccgtaggtga acctgcggaa 1860
ggatcatta 1869
Claims (24)
- a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준(reference) 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하며,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인, 대상체의 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법. - 제1항에 있어서,
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계;
를 포함하며,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인 방법. - 제1항에 있어서,
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN 및 MUC2의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하며,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3, POSTN 및 MUC2의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
a) 대상체로부터 얻어진 국소 림프노드 샘플에서 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계; 및
b) 단계 a)에서 결정된 유전자 발현 수준을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 기준 유전자 발현 수준과 비교하는 단계
를 포함하며,
여기에서 기준과 비교하여 유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 더 높은 발현 수준은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인 방법. - 제4항에 있어서,
c) 상기 샘플에서 유전자 CEACAM5의 유전자 발현 수준 및 18S rRNA의 수준을 결정하는 단계;
d) 단계 a) 및 c)에서 얻어진 결과를 기초로, SLC35D3/CEACAM5, KLK6/CEACAM5, POSTN/18S rRNA 및 MUC2/CEACAM5의 비율을 계산하는 단계;
e) 단계 d)에서 얻어진 비율이 상기 기준 환자 집단에서의 동일한 비율에 기초한 컷오프(cut-off) 값보다 큰지에 따라 상기 비율에 (+1) 또는 (0)의 값을 제공하고, 컷오프 값보다 큰 비율은 (+1)의 값을 얻고 컷오프 값보다 작은 값은 (0)의 값을 얻는 단계; 및
f) 단계 e)에서 얻어진 비율 및 식 [A = SLC35D3/CEACAM5 + KLK6/CEACAM5 + POSTN/18S rRNA - MUC2/CEACAM5]를 이용하여 지수(index) A를 계산하는 단계
를 더 포함하며,
여기에서 지수 (+3)은 매우 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있고, 지수 (+2) 및 (+1)은 높은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있으며, 지수 (0) 및 (-1)은 낮은 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인 방법. - 제5항에 있어서,
상기 컷오프 값은 상기 기준 환자 집단의 7 십분위(7th decile)의 비율, 상기 기준 환자 집단의 3 사분위(3rd quartile)의 비율, 또는 상기 기준 환자 집단의 8 십분위(8th decile)의 비율인 것인 방법. - 대상체의 결장직장암의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 방법으로서,
a) 대상체로부터 얻어진 원발성 장 종양, 혈액 또는 대변 샘플에서 유전자 SLC35D3, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 유전자 발현 수준을 결정하는 단계;
b) 단계 a)에서 얻어진 결과를 기초로, SLC35D3/CEACAM5, KLK6/CEACAM5 및 MUC2/CEACAM5의 비율을 계산하는 단계; 및
c) 단계 b)에서 결정된 비율을 기준 환자 집단에서의 동일한 유전자의 발현 수준으로부터 계산된 기준 비율과 비교하는 단계
를 포함하며,
여기에서 기준과 비교하여 더 높은 SLC35D3/CEACAM5 및 KLK6/CEACAM5의 비율은 증가된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있고, 기준과 비교하여 더 높은 MUC2/CEACAM5의 비율은 감소된 전이 가능성 및/또는 종양 공격성과 관련이 있는 것인, 방법. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
유전자 발현 수준은 상기 유전자로부터 발현된 mRNA의 양을 정량함으로써 결정되는 것인 방법. - 제4항에 있어서,
유전자 발현 수준은 상기 유전자로부터 발현된 mRNA의 양을 정량함으로써 결정되는 것인 방법. - 제8항에 있어서,
상기 mRNA의 양은 혼성화, 시퀀싱 또는 정량적 RT-PCR에 의해 결정되는 것인 방법. - 제10항에 있어서,
상기 mRNA의 양은 마이크로어레이 및 비드 어레이 기술, 전사체 시퀀싱, 실시간 정량적 RT-PCR, 다중 정량 RT-PCR로부터 선택되는 방법을 이용하여 결정되는 것인 방법. - 제8항에 있어서,
상기 mRNA의 양은 RNA 또는 DNA 카피 표준물질(copy standard)을 이용하여 결정되는 것인 방법. - a) 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 이용하여 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 단계; 및
b) 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 낮은 경우 대상체는 좋은 예후를 갖는다고 결정하거나, 또는 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 높은 경우 대상체는 불량한 예후를 갖는다고 결정하는 단계
를 포함하는 것인, 결장직장암으로 진단되고 종양을 가지고 있는 대상체의 예후를 결정하는 방법. - a) 제4항에 따른 방법을 이용하여 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하는 단계; 및
b) 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 낮은 경우 대상체는 좋은 예후를 갖는다고 결정하거나, 또는 전이 가능성 및/또는 종양 공격성이 높은 경우 대상체는 불량한 예후를 갖는다고 결정하는 단계
를 포함하는 것인, 결장직장암으로 진단되고 종양을 가지고 있는 대상체의 예후를 결정하는 방법. - 제13항에 있어서,
불량한 예후는 좋은 예후와 비교하여 생존 가능성이 감소하는 것인 방법. - 유전자 SLC35D3 및 POSTN의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는, 결장직장암으로 진단된 대상체의 전이 가능성 및/또는 종양 공격성을 결정하기 위한 키트.
- 제16항에 있어서,
유전자 SLC35D3, POSTN 및 KLK6의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트. - 제16항에 있어서,
유전자 SLC35D3, POSTN 및 MUC2의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트. - 제16항에 있어서,
유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6 및 MUC2의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트. - 제16항에 있어서,
유전자 SLC35D3, POSTN, KLK6, MUC2 및 CEACAM5의 유전자 발현 수준의 결정을 위한 핵산 프라이머 및 프로브를 포함하는 키트. - 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
핵산 프라이머 및 프로브는 서열 번호 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 또는 15로부터 선택되는 것인 키트. - 제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
mRNA, RNA 및/또는 DNA 카피 표준물질을 더 포함하는 키트. - 삭제
- 삭제
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