KR20140040694A - 결장직장암 재발에 대한 예후 서명 - Google Patents

Abstract

본 발명의 검정 시스템은 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하는 데에 유용하다. 상기 검정 시스템은 결장직장암 재발과 상관된 예후 유전자 프로파일의 양적 발현에 대하여 환자 샘플을 분석하도록 적합화되어 있다. 상기 프로파일은 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열의 발현을 포함한다.

Description

결장직장암 재발에 대한 예후 서명 {PROGNOSTIC SIGNATURE FOR COLORECTAL CANCER RECURRENCE}

관련 출원의 상호 참조

본 출원은 발명의 명칭이 "결장직장암 재발에 대한 5-유전자 예후 서명 {5-GENE PROGNOSTIC SIGNATURE FOR COLORECTAL CANCER RECURRENCE}"인 2011년 1월 18일자로 출원된 미국 특허 가출원 일련 번호 61/433,798에 대한 우선권을 주장하는 바, 그의 개시내용은 전문이 본원에 참조로 포함된다.

발명의 분야

본 발명은 일반적으로 진단 시험에 관한 것이다. 더 구체적으로, 본 발명은 결장직장암과 연관된 서명을 위한 진단 시험에 관한 것이다.

결장직장암은 미국에서 세 번째로 많이 자주 진단되는 암으로써, 매년 150,000 건 가량이 진단되며, 암-관련 사망의 세 번째로 큰 원인이기도 하다. 수술만으로 결절-음성(node-negative) 결장직장암에 대하여 치료된 환자들 중 사분의 일이 "치유"되었으나 5년 안에 재발을 겪게 되는 것으로 생각되고 있다. 현재는, 국립 종합 암 네트워트(National Comprehensive Cancer Network) (NCCN) 임상 실행 지침이 결장직장암 환자에서 재발의 위험성을 예측하는 데에 사용되고 있다. NCCN 지침에 의해 제공되는 것보다 더 우수한 위험성 예측에 의해 더 우수한 치료 계획 및 환자 성과를 달성하기 위해서, 더 높은 암 재발 위험성이 있는 환자를 확인하기 위한 개선된 기술이 요구되고 있다.

개요

전기한 요구는 한 측면에서 적어도 어느 정도까지 결장직장암 재발의 예측을 향상시키는 진단 시험이 개시된 본 발명에 의해 크게 충족된다.

본 발명은 환자에서 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 가능성을 예측하는 데에 유용한 예후 바이오마커 유전자들을 제공한다. 구체적으로, 유전적 프로그래밍 분석(genetic programming analysis)에 의해, 특정 유전자들이 결장직장암 재발 및 비-재발의 예측에 중요한 것으로 확인되었다. 이러한 예후 바이오마커 유전자들은 지도 학습(supervised learning) 기술을 사용하여 예후 규칙 (알고리즘)을 생성시키기 위한 기초를 제공한다. 생성된 예후 규칙은 예를 들어 예후 규칙을 포함하는 기계-판독가능 소프트웨어에 의해 개별 대상체에서의 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발 위험성의 예측에 적용된다.

지도 학습 모드의 유전적 프로그래밍을 사용하여, 확인된 예후 바이오마커 유전자인 BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA의 발현 수준을 기초로 하는 대표적인 예후 규칙이 생성되었다. 이와 같은 규칙, 및 이후의 다양한 지도 학습 기술, 예컨대 유전적 프로그래밍, CART 분석, 지지 벡터 머신(Support Vector Machine) 및 선형 판별 분석(Linear Discriminant Analysis)의 적용에 의해 상기 확인된 예후 바이오마커 유전자들로부터 생성될 수 있는 다른 규칙은 결장직장암 환자의 암 재발 또는 비-재발 위험성을 예측하는 데에 유용한 도구를 제공한다.

본 발명은 대상체의 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성을 예측하는 데에 본 발명의 예후 바이오마커 유전자 (BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA) 및/또는 예후 규칙(들)을 이용하도록 적합화된 시스템, 도구, 키트, 핵산 어레이, 매트릭스, 소프트웨어, 컴퓨터 프로그램 등을 제공한다. 예를 들어, 시스템, 검정, 키트 또는 표면은 대상체의 측정된 유전자 발현 수준을 예후 규칙(들)에 적용하여 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성의 평가를 생성하도록 적합화 및/또는 설계된 개시 바이오마커 유전자, 증폭 프로브, 혼성화 프로브, 검정 시약, 데이터 수집물, 컴퓨터 연산(computation), 및 출력 모듈, 컴퓨터 소프트웨어, 기계-판독가능 매체 등 중 1종 이상을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 환자로부터 수득된 샘플에서 예후 바이오마커 유전자 (BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA)의 유전자 발현 양을 측정하는 단계, 및 해당 위험성을 측정하기 위하여 바이오마커 유전자 발현의 측정된 양을 예후 규칙에 적용하는 단계를 포함하는, 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성의 예측 방법을 제공한다. 예후 규칙은 하기 실시예에 확인되어 있는 규칙일 수 있거나, 또는 재발 또는 비-재발을 나타내는 것으로 분류된 결장직장 환자 샘플 군집에서의 바이오마커 유전자 BMI, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA 발현의 지도 학습 분석에 의해 생성될 수 있다. 재발 또는 비-재발의 위험성을 예측하기 위한 바람직한 규칙은 하기에 나타낸 규칙 1이다: [(((BMI1/H3F3B) * VEGFA) - ((ETV6/RPS10) * H3F3B)) ≥ -4.4777]일 경우, 재발함.

이에 따라, 본원에서의 그의 상세한 설명이 더 잘 이해될 수 있도록, 그리고 업계에 대한 본원의 기여를 더 잘 알 수 있도록, 소정의 본 발명 실시양태들이 비교적 광범위하게 개괄되었다. 물론, 하기에 기술되어 본원에 첨부된 청구범위의 주제를 형성하게 될 본 발명의 추가적인 실시양태들도 제시되어 있다.

이와 관련하여, 본 발명의 하나 이상 실시양태를 상세하게 설명하기 전에, 본 발명이 그의 적용에 있어서 구성상의 세부사항으로 제한되는 것은 아니며, 하기 상세한 설명에 제시되어 있거나 도면에 도시되어 있는 구성요소의 배열로 제한되는 것은 아니라는 것이 이해되어야 한다. 본 발명은 기술되어 있는 것들 이외의 실시양태를 수용할 수 있으며, 다양한 방식으로 실시 및 수행될 수 있다. 또한, 본원은 물론 요약서에서 사용되는 어구 및 용어는 설명을 목적으로 하는 것으로써, 제한하는 것으로 간주되어서는 안된다는 것이 이해되어야 한다.

따라서, 업계 숙련자라면, 본 개시가 기초하는 개념이 본 발명의 몇 가지 목적을 수행하는 다른 구조, 방법 및 시스템의 설계를 위한 기초로서 용이하게 이용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 이에 따라, 그것이 본 발명의 기술사상 및 영역에서 벗어나지 않는 한, 그와 같은 등가의 구성들은 청구범위에 포함되는 것으로 간주된다는 것이 중요하다.

도 1은 실시예 2에서 예후 규칙 1에 따라 결장직장암 재발의 높거나 낮은 위험성을 가지는 것으로 예측된 환자 샘플에 있어서의 3년 기간 동안의 무-재발 환자의 비율을 나타내는 그래프이다.
도 2는 상기 도 1에 나타낸 것과 동일하지만 결장직장암 재발의 높거나 낮은 위험성을 예측하는 데에 NCCN 지침을 사용한 환자 샘플에 있어서의 생존 곡선을 나타내는 그래프이다.

정의

다르게 주지되지 않는 한, 본 발명은 분자 생물학 및 관련 분야의 통상적인 기술을 사용한다. 그와 같은 기술에 대해서는 예를 들어 문헌 [Sambrook et al., 2001, Molecular Cloning: A Laboratory Manual] 및 [Ausubel, et al., 2002, Short Protocols in Molecular Biology, (2002)]과 같은 교재를 포함한 문헌에 기술되어 있다. 본원에서 언급되는 모든 특허, 특허 출원 및 공개는 그 전체가 본원에 참조로 명시적으로 포함된다.

다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 업계의 사람들에 의해 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 바람직한 방법 및 물질들이 기술되지만, 본 발명의 실시 또는 시험에서는, 본원에서 기술되는 것들과 유사하거나 등가인 소정의 방법 및 물질들이 사용될 수 있다. 본 발명의 목적상, 하기의 용어들은 하기에서 정의되는 바와 같다.

본원에서, 관사 "a" 및 "an"은 하나이거나 하나를 초과하는 (즉, 하나 이상인) 관사의 문법적 대상을 지칭하는 데에 사용된다. 예를 들자면, "요소(an element)"는 하나 이상의 요소를 의미한다.

본원에서 사용될 때의 "환자 샘플"이라는 용어는 환자 또는 대상체로부터 수득되어 바이오마커 유전자 발현에 대하여 검정될 수 있는 샘플을 지칭한다. 환자 샘플에는 생물학적 유체, 조직 생검물 등이 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 샘플은 조직 샘플, 예를 들어 종양 조직으로써, 생, 냉동, 및/또는 기록용(archival) 파라핀 매립 조직일 수 있다.

본원에서 사용될 때의 "유전자"라는 용어는 세포 게놈의 소정의 그리고 모든 별개 코딩 영역은 물론, 관련 비-코딩 및 조절 영역을 지칭한다. 유전자는 또한 특정 폴리펩티드, 인트론, 및 발현의 조절에 관련된 인접 5' 및 3' 비-코딩 뉴클레오티드 서열을 코딩하는 오픈 리딩 프레임(open reading frame)을 의미하고자 하는 것이다. 이와 관련하여, 유전자는 추가적으로 조절 신호 예컨대 프로모터, 인핸서, 자연상에서 주어진 유전자와 연관되어 있는 종료 및/또는 폴리아데닐화 신호, 또는 이종유래 조절 신호를 포함할 수 있다. DNA 서열은 cDNA 또는 게놈 DNA, 또는 이들의 단편일 수 있다.

"예후 유전자 프로파일(prognostic gene profile)"은 그의 양적인 발현 수준이 환자에서 암 재발 및/또는 비-재발의 위험성을 예측하기 위한 예후 규칙에 사용될 수 있는 핵산 서열들의 조합을 지칭한다. 본원에서 확인되는 예후 유전자 프로파일은 하기의 실시예에서 확인되는 하기 바이오마커 유전자들의 조합을 포함한다: BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA.

본 발명의 "예후 바이오마커 유전자"는 하기의 유전자들을 지칭한다: BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10, VEGFA, AKT1, ARAF, ARHGDIB, B2M, CD82, DIABLO, FGFR4, GUSB, HMOX1, ITGB1, MAPK14, MAX, MMP2, NFKB1, POLR2L, PSMB6, PTK2 및 UBC.

"예후 규칙"은 결장직장암 환자로부터 수득되는 샘플에서의 예후 바이오마커 유전자들의 양적 발현을 암 재발 및/또는 비-재발의 위험성과 관련시키는 하나 이상 일련의 수학식 또는 알고리즘을 지칭한다.

표 1의 예후 바이오마커 유전자들로부터의 예후 규칙의 생성에 적용될 때의 "지도 학습"은 일련의 데이터에 적용되는 다양한 수학적 학습 기술을 지칭하는 것으로써, 출력은 예를 들어 재발 또는 비-재발로 정의되며, 분석은 제공되는 예로부터 학습한다. 지도 학습 기술에는 예를 들어 유전자 프로그래밍, CART 분석, 지지 벡터 머신, 및 선형 판별 분석 등이 포함된다.

"재발"은 치료 36개월 이내의 환자에 대한 결장직장암의 복귀를 지칭한다.

"비-재발"은 치료 후 36개월 이상 동안의, 환자에서의 확인된 결장직장암의 부재를 지칭한다.

"핵산 마이크로어레이(nucleic acid microarray)"는 일반적으로 기판상에 위치되며 비-공유 결합 상호작용을 통하여 상보적 서열을 가지는 샘플에 결합할 수 있는 폴리뉴클레오티드 프로브와 같은 혼성화가능 핵산 어레이 요소의 정돈된 배열을 지칭한다.

펩티드의 "단편" 또는 "일부"는 또 다른 펩티드 서열의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 250개의 연속되는 아미노산 잔기를 포함하는 펩티드를 지칭한다.

유전자 또는 폴리뉴클레오티의 "단편" 또는 "일부"는 또 다른 폴리뉴클레오티드 서열의 적어도 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175, 200, 또는 250개의 연속되는 핵산 잔기를 포함하는 핵산 분자를 지칭한다.

핵산 서열과 관련하여 사용되는 "상보체(complement)"라는 용어는 그 서열이 제2의 핵산 서열의 것과 상보적이며 그에 따라 제2 서열에 혼성화될 수 있는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

"프로브"는 비공유 (예컨대 수소 결합) 상호작용을 통해 폴리뉴클레오티드 표적 서열을 인식하여 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 또는 그의 유사체이다. 프로브는 일반적으로 길이가 8개 뉴클레오티드 이상이나 유전자의 전체 길이 미만인 것이다. 프로브는 검출가능한 태그 및/또는 켄처(quencher) 분자를 사용하여 변형될 수 있다.

"단리된" 및/또는 "정제된"이라는 용어는 해당 자연 상태에서 보통 그것에 동반되는 성분으로부터 분리된 물질을 지칭한다. 예를 들어, 본원에서 사용될 때의 "단리된 폴리뉴클레오티드"는 보통 해당 단편에 인접하는 서열로부터 제거된 DNA 단편과 같이, 자연-발생 상태에서 그 폴리뉴클레오티드에 인접동반되는 서열로부터 정제된 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

"특이적으로 ~에 혼성화되는" 등의 구는 해당 서열이 복합 혼합물, 예를 들어 총 세포 DNA 또는 RNA, 또는 그의 혼합 폴리뉴클레오티드 추출물 중에 존재할 때, 염격 조건하에서 특정 뉴클레오티드 서열에만 분자가 결합, 이중체화 또는 혼성화되는 것을 지칭한다.

바이오마커의 확인

하기 실시예에서 기술되는 바와 같이, 유전적 프로그래밍 분석에 의해, 암 재발을 나타내는 환자 및 재발을 나타내지 않은 환자로부터 수득된 샘플들 사이에서, 특정 예후 바이오마커 유전자들이 단독 또는 다른 유전자와의 조합 중 어느 하나로써 상당히 차별적인 발현을 나타내는 것으로 확인되었다. 구체적으로는, 하기 5종 바이오마커 유전자들의 발현 수준이 결장직장암 재발의 위험성을 예측하는 데에 특히 유용한 것으로 확인되었다: BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA.

이들 5종의 중요한 바이오마커 유전자들의 발현 수준은 이들 유전자의 조합 (예후 유전자 프로파일)의 양적 발현을 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 예측에 적용하는 예후 규칙을 생성시키기 위하여 하기 실시예에 기술되어 있는 바와 같은 추가 분석에 적용될 수 있다. 결장직장암 재발을 예측하는 데에 유용한 예후 유전자 프로파일은 하기 실시예에서 확인되는 하기 바이오마커 유전자들의 조합을 포함한다: BMI1, ETV6, H3F3B, RPS10 및 VEGFA.

확인된 예후 바이오마커 유전자들로부터, 다양한 패턴 인식 기술 및 상관 분석, 예컨대 유전적 프로그래밍, 선형 회귀, 로지스틱 회귀(logistic regression), 인공 신경 네트워크, 지지 벡터 머신 (SVM), 클러스터링 모델(clustering model), CART 분석 등을 사용하여 예후 규칙이 생성될 수 있다. 바람직한 실시양태에서는, 바이오마커 유전자들의 유전적 프로그래밍 분석이 예후 규칙을 생성시키는 데에 사용된다. 생성되는 예후 규칙은 예후 바이오마커 유전자들의 양적 발현을 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 위험성에 관련시키는 수학식 (알고리즘)이다. 하기 실시예에 기술되어 있는 바와 같은 유전적 프로그래밍을 사용하여 개발된 대표적인 예후 규칙은 하기의 바람직한 규칙이다:

[(((BMI1/H3F3B) * VEGFA) - ((ETV6/RPS10) * H3F3B)) ≥ -4.4777]일 경우, 재발함.

분석에서는, "가계 유전자(housekeeping gene)"의 발현이 대조로 사용될 수 있다. 그와 같은 가계 유전자에는 예를 들어 GAPDH, 베타-액틴, S9 리보좀, 유비퀴틴, 알파-튜불린, 18S rRNA, GUS, HPRT, B2M, TBP, CYC, HuPO, PGK, HuTfR, G6PDH (문헌 [Blanquicett, et al ., 2002, Anal Biochem, 303: 209-14]); RPLP0, GAPD, HPRT1, B2M, POLR2A, RPS14, MAN1B1, ACTB, MTR (문헌 [Dydensborg et al ., 2006, Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 290: G1067-74]); HPRT, ADA, TAF2, POLR2L, CETN2, ACTB, UBE2D2, PSMB6, CAPN2, TXNRD1, SDHA, GUS, CYCC, PMM1, AGPATI, HDAC10, B2M (문헌 [Rubie et al ., 2005, Mol Cell Probes, 19: 101-9])이 포함된다.

유전자 발현 분석

유전자 발현은 다양한 공지의 방법, 예를 들어 샘플, 예컨대 조직 샘플에서 유전자 발현에 의해 생성된 mRNA, cDNA 또는 단백질의 양을 측정하는 것에 의해 양적으로 분석될 수 있다. 추가 분석을 위한 조직 샘플로부터의 mRNA의 단리 방법에 대해서는 알려져 있는데, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al ., 2002, Short Protocols in Molecular Biology]을 참조하라. 파라핀 매립 조직으로부터의 mRNA의 단리 방법에 대해서는 예를 들어 문헌 [De Andres et al ., 1995, BioTechniques 18:42044]에 논의되어 있다. 예를 들어 파라핀 블록(Paraffin Block) RNA 단리 키트 (암비온, 인크.(Ambion, Inc.) 사, 텍사스 오스틴 소재)를 포함하여, RNA 단리 키트들이 상업적으로 입수가능하다.

단리된 RNA는 cDNA로 전환되거나, 및/또는 예를 들어 서열분석 또는 혼성화 분석에 의해 증폭, 확인 및 정량될 수 있다. 유전자 발현의 양을 측정하기 위한 다른 방법으로는 예를 들어 노던 블러팅 (문헌 [Brown, 2001 May, Curr Protoc Immunol, Chapter 10:Unit 10.12]; [Parker & Barnes, 1999, Methods in Molecular Biology 106:247-283]), 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) (문헌 [Nygaard et al . 2009, Front Biosci. 14:552-69]; [Weis et al ., 1992, Trends in Genetics 8:263-64]), RNAse 보호 검정 (문헌 [Emery, 1999, Methods Mol Biol . 362:343-8]; [Hod, 1992 Biotechniques 13:852-54]), 대규모 병렬 서명 서열분석(massively parallel signature sequencing) (MPSS) (문헌 [Kutlu, 2009, BMC Med Genomics ., 2:3]; [Brenner, 2000, Nature Biotechnol. 18: 1021]), 유전자 발현의 직렬 분석(Serial Analysis) (SAGE) (문헌 [Boon 2009, PLoS ONE. 4:e5134]; [Velculescu, 1995, Science 270:368-9, 371]), 및 DNA 또는 RNA 이중체에 결합할 수 있는 항체의 사용, RNA-매개 어닐링(annealing), 선택, 및 결찰 (RASL) 검정 (문헌 [Yeakley, 2002, Nat Biotechnol; 20:353-8]), cDNA 매개 어닐링, 선택, 연장, 및 결찰 (DASL) 검정 (문헌 [Abramovitz, 2008, Biotechniques, 44:417-423]; [Fan, 2004, Genome Research 14:878-85]), 마이크로어레이 기술 (문헌 [Ravo et al., 2008, Lab Invest, 88:430-40]; [Schena, 1996, Proc . Natl . Acad . Sci . USA, 93: 106-149]), 예를 들어 인사이트 마이크로어레이(Incyte's microarray) 기술 또는 어피메트릭스 젠칩(Affymetrix's GenChip) 기술; 또는 454 라이프 사이언시즈, 인크.(Life Sciences, Inc.) 사 (코네티컷 브랜포드 소재)에 의해 개발된 고처리량 서열분석 기술 (문헌 [Marguilies, 2005, Nature, 437:376-80]이 포함된다.

한 실시양태에서, 선택된 바이오마커 유전자들의 양적 발현은 규칙 1의 5종 바이오마커 각각에 대하여 구입가능한 특이적 택맨(TAQMAN)® 유전자 발현 검정을 포함하여, 어플라이드 바이오시스템즈(APPLIED BIOSYSTEMS) 사에 구입가능한 것들과 같은 시중의 시약들을 사용하여 분석될 수 있다. 예시적인 택맨® 유전자 발현 검정을 하기에 목록화하였다. 이들은 하기에 기술되는 실시예 2에서 사용되었다.

DASL

양적 유전자 발현을 측정하기 위한 DASL 검정법에는 비오티닐화 프라이머를 사용한 총 RNA의 cDNA로의 전환이 포함된다. 비오티닐화된 DNA가 스트렙타비딘 고체 지지체에 결합된 후, cDNA 중 그의 표적 서열에 대한 검정 올리고뉴클레오티드의 어닐링이 이어진다. 일반적으로 유전자 당 3 내지 10개 표적 부위로, 주어진 표적 부위에 대하여 올리고뉴클레오티드 쌍이 어닐링된다. 상류의 어닐링된 올리고뉴클레오티드는 연장되어 하류의 상응 뉴클레오티드에 결찰됨으로써 PCR 주형을 생성시키고, 그것은 예를 들어 범용 PCR 프라이머를 사용하여 증폭된다. 예컨대 표지된 프라이머의 도입에 의해 표지된 PCR 생성물이 고체 지지체 어레이상의 포획 서열에 혼성화된 후, 각 비드에 대하여 형광 강도가 측정된다.

유전자 당 1-3개의 프로브 군을 포함하는 1536개까지의 유전자에 대한 완전 맞춤형 설계 DASL 검정 패널들은 물론, 암과 연관되어 있는 502개의 유전자를 표적으로 하는 일련의 프로브 군들을 포함하는 표준 DASL 인간 암 패널이 일루미나, 인크.(Illumina, Inc.) 사 (캘리포니아 샌디에고 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다.

매스어레이

매스어레이(MassARRAY) 시스템은 RNA를 단리하여 cDNA로 역전사하는 데에 사용된다. cDNA는 증폭되어, 탈인산화되고, 프라이머를 사용하여 연장된 후, MALDI-TOF 질량 분광측정법을 통한 양적 분석을 위하여 칩 어레이(chip array)상에 배치된다. 매스어레이 분석을 수행하기 위한 하드웨어 및 소프트웨어는 세퀘놈, 인크. (Sequenom, Inc.) 사 (캘리포니아 샌디에고 소재)로부터 상업적으로 입수가능하다.

SAGE

SAGE에서는, 각각 RNA 전사체 내의 고유 위치에 상응하는 약 10-14개 염기쌍의 다수의 서열 태그들이 서로 연결되어 다수 태그의 서열들을 동시에 서열분석하여 확인하기 위한 연장된 분자를 형성시킨다. 전사체의 발현 패턴은 주어진 태그의 풍부도를 측정하고, 그 태그에 상응하는 유전자를 확인하는 것에 의해 정량될 수 있다. 예컨대 I-SAGE 키트 (인비트로겐(Invitrogen) 사, 캘리포니아 칼스배드 소재)를 포함하여, SAGE를 수행하기 위한 키트는 물론, SAGE 데이터를 분석하기 위한 소프트웨어가 상업적으로 입수가능하다. SAGE 데이터는 예를 들어 인터넷을 통하여 접근가능한 SAGEmap 데이터베이스를 검색하는 데에 사용될 수 있다.

유전적 프로그래밍

바람직한 실시양태에서는, 대상체의 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성을 표시해주는 예후 유전자 프로파일 및 예후 규칙에 사용하기 위한 충분한 예측력을 가지는 바이오마커 유전자들의 군을 확인하기 위하여 유전자 발현 데이터를 분석하는 데에, 유전적 프로그래밍이 사용된다.

유전적 프로그래밍은 사용자에 의해 규정되는 임무를 수행할 수 있는 컴퓨터 알고리즘을 개발하는 데에 생물학적 진화의 원리를 사용하는 인공 지능/기계 학습 기술이다 (예를 들어 문헌 [Banzhaf et al ., 1998, Genetic Programming : An Introduction : On the Automatic Evolution of Computer Programs and Its Applications]; [Koza, J.R., 1992, Genetic Programming : On the Programming of Computers by Means of Natural Selection, MIT Press] 참조).

유전적 프로그래밍은 프로그램 군집의 "자연선택"을 수행하는 각 프로그램의 적합성 측정을 사용하여 반복적인 방식으로 그것을 진화시키는 것에 의해 원하는 임무를 수행하도록, 일련의 컴퓨터 프로그램들을 최적화한다. 본 발명의 실시양태에서, 상기 임무는 환자에서 암의 재발을 예측하는 데에 유용한 하나 이상의 예후 규칙을 생성시키는 것이었으며, 적합성의 척도 또는 "적합성 함수"는 종양 조직 샘플을 재발 또는 비-재발을 겪게 될 환자에 속하는 것으로 올바르게 분류하는 주어진 컴퓨터 프로그램의 능력이었다.

컴퓨터 프로그램 군집의 진화는 다양한 공지의 방법으로 수행될 수 있다. 보편적인 한 가지 방법은 한 프로그램의 노드(node)가 군집에 존재하는 또 다른 프로그램으로부터의 노드와 교환되는 교차(crossover) 전략을 사용한다. 컴퓨터 프로그램을 진화시키는 또 다른 방법은 프로그램에 속하는 노드 또는 그 노드에 포함되어 있는 정보가 군집의 어떠한 다른 프로그램에도 영향을 주지 않고 교체되는 돌연변이에 의한다. 이러한 방법들은 단독으로, 또는 프로그램들간 프로그래밍 요소의 구성 성분의 교환을 수반하는 다른 방법과 함께 사용될 수 있다. 각 진화 라운드 후, 군집의 각 컴퓨터 프로그램은 적합성 척도를 사용한 시험에 적용된다.

하기 실시예에 기술되어 있는 바와 같이, 유전적 프로그래밍 시스템은 표적 질환 및 건강 조직 모두의 알려져 있는 샘플로부터 취한 유전자 발현 데이터와 함께 제공되어, 결장직장암의 재발/비-재발과 같은 표적 질환 종류에 대한 단정적인 IF-THEN 항목을 도출하는 데에 사용될 수 있다. 실시양태에서, 단정적인 IF-THEN 항목은 종양 조직에서의 다양한 유전자의 발현량을 환자에서의 암 재발 가능성에 관련시키는 수학식이다. 도출되는 규칙은 올바르게 분류된 샘플의 수가 후보 규칙의 적합성 척도인 훈련용 샘플 세트를 사용하여 개발된다.

적합성 척도는 더 적은 거짓 양성 오류를 생성시키는 규칙에 더 무게를 두도록, 또는 더 적은 거짓 "음성" 오류를 생성시키는 규칙에 더 신뢰를 부여하도록, 달라질 수 있다. 적합성 척도는 유전적 프로그래밍 시스템 자체에 대해서는 외부적이나 원하는 목표를 더 잘 반영하는 다른 이유로 달라질 수도 있다. 예를 들어, 한 실시양태에서는, 선택된 종양 조직으로부터 방출되어 혈류를 통해 전신적으로 신체에 진입하는 것으로 알려져 있는 단백질과 같이, 특정 종류의 단백질을 코딩하는 유전자만을 도입하는 규칙을 생성시키는 것이 바람직할 수 있다.

일단 예후 규칙이 개발되고 나면, 규칙은 미지의 샘플을 표준화하는 그의 능력을 평가하기 위하여 시험 샘플 세트에 대하여 점검된다. 각 적합성 평가 라운드 후, 최고 성능의 프로그램들이 다음 라운드에서의 추가 진화용으로 유지된다. 다음 진화 반복을 위한 컴퓨터 프로그램 군집을 선택하는 데에는 다양한 방법들이 사용될 수 있다. 한 실시양태에서는, 예컨대 교차(crossover)를 사용하여 2종의 최적합 프로그램들이 서로 "교류(mated)"된 후, 자손 프로그램이 적합성 평가에 따른 최소 적합성 프로그램을 대체하여 다음 진화 라운드를 위한 프로그램 군집에 첨가된다. 추가적인 진화의 반복 및 적합성 시험은 사전-선택된 기준에 따라 적합한 효용을 가지는 하나 이상의 예후 규칙이 수득될 때까지, 또는 추가적인 적합성의 향상이 관찰되지 않을 때까지 계속될 수 있다.

유전적 프로그래밍의 주목할만한 장점은 종종 예상치 않은 방식으로 변수들을 조합하는 것에 의해, 높은 예측력을 보유하는 알고리즘을 생성시키는 데에 다수의 변수 및 연산자를 이용하는 그의 능력이다. 다른 모델링 기술들에 대비한 추가적인 장점은 예를 들어 계층적 클러스터 분석(hierarchical cluster analysis)을 사용하는 경우에 필요할 수 있는 바와 같은 연구중인 질환에 상당히 중요한 것으로 생각되는 생물학적 과정과의 연관성을 기초로 하는 선택 유전자의 검토분석이 필요할 수 있는 어떠한 연산자의 입력 없이도, 저절로 예후 규칙이 생성될 수 있다는 것이다.

어느 분석 방법이나 그러하듯이, 차선의 조건이 존재할 경우, 유전적 프로그래밍의 효용은 훼손될 수 있다. 예를 들어, 이상적으로는 큰 데이터 세트가 대규모 훈련용 및 시험용 세트로 분할하는 데에 가용하다. 그러나, 많은 경우에서 입력 데이터의 총량은 적은데, 유전적 프로그래밍 시스템이 잠재적으로 가용한 대부분의 일반적인 분류 개념을 학습할 수 없음을 의미한다. 마찬가지로, 소규모 시험은 학습된 개념의 일반성의 아주 철저한 평가는 허용하지 않는다. 이러한 경우, 유전적 프로그래밍으로부터 수득되는 결과를 평가하기 위한 것으로써, 유전적 프로그래밍 시스템 자체에는 외부적인 공지의 방법들이 존재한다. 예를 들어, n-중 교차 확인(n-fold cross validation)이 적은 데이터 세트를 극복하는 데에 사용될 수 있다. 숙련자라면, 전체 범위의 공지의 확인 방법들 중에서 선택할 수 있을 것이다.

다양한 유전적 프로그래밍 기술들이 본 발명을 실시하는 데에 사용될 수 있다. 예를 들어, 유전적 프로그래밍은 미국 특허 번호 6,327,582에 기술되어 있는 기술에 따라 수행될 수 있다.

기타 분석 방법

일단 고도의 예측력을 가지는 예후 바이오마커 유전자 세트가 확인되고 나면, 유전적 프로그래밍이 아닌 다른 분석 방법들이 예후 바이오마커 유전자들의 상대적인 발현 수준을 암 재발 및/또는 비-재발에 관련시키는 하나 이상의 예후 규칙을 생성시키는 데에 사용될 수 있다는 것을 알고 있을 것이다. 예를 들어, 공지의 회귀 및 기타 패턴 인식 기술들이 예측성 규칙을 생성시키는 데에 사용될 수 있다. CART 분석, 지지 벡터 머신, 및 선형 또는 비-선형 판별 분석 등과 같은 지도 학습 기술들이 일단 예후 바이오마커 유전자들이 알려지고 난 후 예후 규칙을 개발하는 데에 유용하다.

예후 규칙

환자에서 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 가능성을 예측하기 위한 예후 규칙은 하기의 실시예에서 확인되며, 확인된 예후 바이오마커 유전자들의 분석에 의해서도 생성될 수 있다. 예후 규칙은 일반적으로 바이오마커 유전자 발현의 양을 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 위험성에 관련시키는 부울 식(Boolean expression)이다.

환자의 결장직장암 재발 가능성은 환자의 측정된 바이오마커 유전자 발현 수준을 예후 규칙에 적용함으로써 예측된다. 일 예에서, 컴퓨터화된 시스템은 유전자 발현 값을 수용하기 위한 입력 모듈; 유전자 발현 값을 예후 규칙에 적용하여 규칙에 따른 위험성 예측을 계산하기 위한 분석 모듈; 및 규칙에 의해 계산되어 생성되는 재발 및/또는 비-재발의 위험성 예측을 예컨대 디스플레이 또는 다른 전달 기작에 의해 사용자에게 전달하기 위한 출력 모듈을 포함한다. 또 다른 예에서는, 2종 이상의 규칙이 분석 모듈에 적용될 수도 있다.

도구, 키트 , 시스템 및 예후 유전자 프로파일

본 발명은 결장직장암 환자에서의 재발 및/또는 비-재발 위험성에 대한 중요한 바이오마커로 확인된 유전자 군을 제공한다. 이러한 예후 바이오마커 유전자들은 상기 표 1에 목록화되어 있다. 대표적인 환자 샘플에서의 이러한 예후 바이오마커 유전자들의 양적 발현의 수학적 분석에 의해 유도되는 예후 유전자 프로파일 및 예후 규칙은 개별 환자의 해당 예후 바이오마커 유전자들의 발현 수준으로부터 그 환자가 결장직장암의 높은 재발 및/또는 비-재발 위험성을 가지고 있는 군집에 속할 가능성의 예측을 측정하기 위한 검정 방법, 시스템, 도구, 시약, 소프트웨어, 장치 등에, 그리고 예측된 예후에 기초한 결장직장암 환자의 합리적인 치료에 적용된다.

대표적인 도구에는 예를 들어 예후 바이오마커 유전자, 유전자 프로파일, 및 특정 예후 규칙의 유전자의 발현량을 측정하도록 적합화된 검정 시스템, 예컨대 마이크로어레이, 혼성화, 증폭, PCR, DASL, SAGE, 및 유사 검정 시스템은 물론, 환자에서 결장직장암의 재발 또는 비-재발을 예측하기 위한 장치, 시스템 또는 방법에 사용되는 키트, 칩, 카드, 다중-웰 검정 플레이트, 프로브, 프라이머, 데이터 저장 시스템, 소프트웨어 프로그램, 컴퓨터 시스템 등이 포함된다.

1종 이상 예후 바이오마커 유전자의 발현 수준을 증폭 및 검출하기 위하여, 핵산 프로브 및/또는 프라이머의 패널이 설계된다. 그와 같은 프로브에는 예를 들어 단리된 유전자 mRNA, cDNA, 및 이들의 일부, 유전자 발현 수준의 정량 측정에 유용한 증폭된 핵산이 포함된다. 그와 같은 프라이머에는 원하는 앰플리콘에 측접하며 유전자 발현을 정량하기 위하여 원하는 유전자 또는 유전자의 일부를 증폭하는 데에 유용한 핵산이 포함된다.

혼성화 플레이트, 칩 또는 카드와 같은 검정용 기판은 대상체로부터 수득된 샘플에서 확인된 바이오마커 유전자의 발현을 증폭하고/거나 확인하고/거나 서열분석함으로써 정량하는 프라이머 쌍 및/또는 프로브가 포함되도록 적합화 및 설계된다.

키트에는 본 발명 예후 규칙 중의 그의 존재로 인하여 결장직장암 재발과 연관되는 확인된 바이오마커 유전자의 발현 수준을 정량하는 데에 유용한 시약 및 도구가 포함되는데, 예를 들어 표 1에 목록화되어 있는 바이오마커 유전자들의 발현을 정량하도록 설계된 핵산 프로브 및/또는 프라이머들이 포함된다.

도구, 키트 및 시스템에는 또한 예측되는 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성을 계산하는 예후 규칙을 저장하고 적용하도록 적합화된 컴퓨터 시스템, 소프트웨어 및 모듈이 포함된다. 컴퓨터 시스템은 예를 들어 양적인 바이오마커 유전자 발현 데이터를 수용하기 위한 입력 모듈, 예후 규칙 및 바이오마커 유전자 발현 수준을 적용하여 규칙의 수학적 결과를 계산하기 위한 분석 모듈, 및 예측 위험성 결과를 제공하기 위한 출력 모듈이 포함될 수 있다.

치료 또는 예방 방법

본 발명은 환자에서의 결장직장암 재발 및/또는 비-재발 위험성의 예측 방법을 포함한다. 일반적으로, 상기 방법은 환자의 샘플로부터 표 1에 목록화되어 있는 확인된 예후 유전자 프로파일 중 유전자의 발현 수준을 정량적으로 측정하는 것, 측정된 발현 값을 예후 규칙에 적용하는 것, 및 유전자 발현 수준을 예후 규칙에 따라 해석함으로써 환자의 결장직장암 재발 위험성을 측정하는 것을 포함한다. 치료 요법은 환자의 유전자 발현 데이터를 예후 규칙에 적용한 결과에 의해 확인되는 바와 같은 환자 예후에 따라 개인화된다. 일 예로써, 환자 샘플의 분석이 재발 가능성을 나타내는 경우에는, 더 공격적인 항암 요법이 적용된다.

실시예

하기의 비-제한적인 실시예에 기술되어 있는 구체적인 실시양태들을 참조하게 되면, 본 발명이 용이하게 이해 및 실시될 수 있다. 하기의 실시예에는, 일련의 발현된 예측 유전자들을 선택하는 데에 이용되는 다양한 검정들이 기술되어 있다. 구체적으로는, cDNA-매개의 어닐링, 선택, 연장, 및 결찰 (DASL) 검정, 및 역전사효소 폴리머라제 연쇄 반응 (RT-PCR) 검정이 기술되어 있다. 그러나, 본 발명의 다양한 실시양태가 DASL 및 RT-PCR로 제한되는 것은 아니며, 오히려 어떠한 적합한 게놈 물질 선택 검정도 포함할 수 있다.

실시예 1: DASL 법을 사용한 단계 I/ II 결장직장 1차 선암종 조직의 유전자 발현 프로파일 생성

단계 I 및 단계 II 결장직장암에 걸린 145명의 환자로부터 (104명 결장, 41명 직장), 치료 수술 과정에서 기록용 포르말린-고정된 파라핀-매립 (FFPE) 1차 선암종 조직을 수득하였다. 모든 환자들이 수술-후 36개월 (mo) 이내에 재발되거나 (R) (n=67; 51명 단계 II), 또는 ≥36 mo 동안 비-재발이 확인되는 것 (NR) (n=78; 56명 단계 II) 중 어느 하나였으며; 아무도 네오아주반트 또는 아주반트 요법을 받지 않았다. R 상태, 1차 재발까지의 시간, 우 대 좌-측 종양 등에 의해 환자를 계층화한 다음, 무작위로 훈련용 세트 (T세트) (n=73; 34R, 39NR) 또는 확인 세트 (V세트) (n=72; 33R, 39NR)로 할당하였다.

맞춤형 512개 유전자 패널을 사용하여, DASL 검정 (일루미나 사, 캘리포니아 샌디에고 소재) (문헌 [Abramovitz, 2008, Biotechniques, 44:417-423]; [Fan et al ., 2004, Genome Research 14:878-85])에 의해, 훈련용 세트 종양 유전자 발현을 정량하였다. R 및 NR 군들 사이에 차별적인 발현 수준을 나타내는 관심 유전자를 확인하고, 인터넷을 통하여 가용한 U.C.S.C. 게놈 브라우저에 목록화되어 있는 바와 같은 인간 게놈상의 참조 서열 위치, 그리고 인터넷을 통하여 가용한 진뱅크(GenBank) 사에서 입수되는 대표적인 핵산 서열과 함께 표 2에 나타내었다. 확인되는 바와 같은 U.C.S.C. 브라우저 및 진뱅크 사의 서열들은 본원에 참조로 포함된다.

RT - PCR 법을 사용한 단계 I/ II 결장직장 1차 선암종 조직의 유전자 발현 프로파일 생성

DASL법의 대안으로써 또는 그에 더하여, RT-PCR법을 사용하여 유전자 발현 프로파일이 생성될 수 있다. 예를 들어, 1개의 미국 (미네소타 로체스터; n=45) 및 2개 별도의 유럽 (러시아 연방 모스크바)의 장소에서 60명의 결장암 (AJCC pT1-4 pN0 cM0) 및 14명의 직장암 (AJCC pT2-3 pN0 cM0) 환자에 대하여, 치료 의도의 최초 수술 절제 (R0)에서 수득된 칠십사개 (74개)의 기록용이며 임상 주석이 달린 포르말린-고정 파라핀 매립 (FFPE) 1차 암종 조직을 회수하였다. 아무도 네오아주반트 또는 아주반트 요법을 받지 않았다. 각 경우에 대하여 그 장소의 직원에 의한 의료 기록 열람에 의해 삼십육 (36)-개월 R 및 NR 상태를 확인하였다. 모든 환자에 대하여 사전고지 동의서를 입수하였다.

재발 상태, 1차 재발까지의 시간, 결장암 대 직장암, R- 대 L-측 결장, 및 조직 공급원에 의한 계층화 후, 74 사례를 무작위로 훈련용 세트 (n=37; 16R, 21NR) 및 동일한 크기의 시험용 세트 (n=37; 16R, 21NR)로 분할하였다.

맞춤형의 집중식 마이크로어레이(custom focussed microarray)를 구성하기 위하여, 맞춤형 384-웰 택맨® 저밀도 어레이 (어플라이드 바이오시스템즈(Applied Biosystems) 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 사용하는 RT-PCR에 의해, 종양 유전자 발현을 평가하였다. 그것이 하기의 기준들 중 하나 이상을 충족하는지에 기초하여, 417개 암-연관 유전자의 패널을 어레이용으로 예비-선택하였다: (1) 종양생성, 종양 진행 또는 전이와 연관됨; (2) 세포 주기 진행, 혈관형성, 생존 또는 아폽토시스의 핵심 조절 단백질을 코딩함; (3) CRC의 개시 및 진행에 관련됨; (4) CRC의 예후인 것으로 보고되어 있음; (5) CRC 화학요법에 대한 종양 반응을 예보하거나 거기에 영향을 줌; (6) 정상 및 악성 CRC 조직 사이에 차별적으로 발현됨.

NCBI 엔트레즈(Entrez) 뉴클레오티드 데이터베이스를 통하여 접근한 각 유전자 및 공통서열에 대하여 적절한 mRNA 참조 서열 (REFSEQ) 접근 번호를 확인하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 사에서 RT-PCR 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 앰플리콘 크기는 최소한으로 유지하여, 대부분이 길이 100 염기 미만이었다.

각 사례에 대하여, 독립적인 위장관 병리학자에 의한 H&E 염색 슬라이드상 FFPE 악성 조직의 확인 및 위치지정 후, 별도의 유리 슬라이드에 고정된 상응 미염색 종양 조직을 1회용 스캘펄(scalpel)을 사용하여 무-RNAse 미세원심분리 튜브로 긁어내었다. 크실렌 중에서 조직을 탈-파라핀화한 후, RNA를 추출하고, 리커버올(RecoverAll)™ 총 핵산 단리 키트 (어플라이드 바이오시스템즈/암비온 사, 텍사스 오스틴 소재)를 사용하여 정제하였다. 나노드롭(Nanodrop) 1000 UV/Vis 분광광도측정기를 사용하여 260/280 nm의 UV 흡수비를 측정함으로써, RNA 용액의 순도 및 양을 측정하였다. 프라이머로서 무작위 육량체를 사용하는 고성능 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 사)를 사용하여, 최소 100 ng의 RNA를 단일 가닥 cDNA로 전사하였다. cDNA는 즉시 RT-PCR에 사용하거나, -80℃에서 저장하였다.

택맨® 맞춤형 어레이 384-웰 미세유동 카드(microfluidic card) (어플라이드 바이오시스템즈 사)를 사용하여, 실시간 PCR을 통한 유전자 발현을 검정하였다. 48 웰 당 100 μl의 cDNA (1 ng/μl)를 카드에 적용한 후, 7900HT 속성 실시간 PCR 시스템을 사용하여 2반복으로 모든 검정을 수행하였다. 출력 데이터는 증폭 곡선에서 0.2로 설정된 일정한 역치, 즉 주기 역치 (Ct)에 도달하는 데에 요구되는 PCR 주기의 수로 나타내었다. 5종의 가계 (HK) 유전자를 사용하여 데이터를 표준화함으로써, 각 검정에서의 RNA 완전성 및 양의 잠재적인 기술적 변이성 및 편차에 대하여 보정하였다. 선택된 5종의 HK 유전자 (B2M, GUSB, POLR2L, PSMB6, UBC)는 CRC 및 다른 조직에서 상시 발현되는 것으로 잘 알려져 있는 9종의 후보 유전자들 중 최소 수준의 발현 변이성을 나타내었다. 개별 유전자 발현 복제물의 각 쌍을 일치도에 대하여 검사하고, 각각에 대하여 상관 계수를 생성시켰다. 복제물들을 평균하고, 5종 HK 유전자들의 평균 (Ave. 5HK Ct)으로부터 각 규칙 유전자에 대한 Ct (RG Ct)를 차감함으로써, 생성 데이터를 표준화하였다. Ct 값은 2를 밑으로 하는 대수로 나타내었기 때문에, 역대수를 취함으로써 데이터를 선형화하고, 결과를 100배로 확대하였다. 이에 따라, 데이터의 최종 형태는 하기였다:

유전자 발현 값 = 2^{( Ave . 5 HK Ct - RG Ct )} × 100.

연구 전체에 있어서, 추출된 RNA 및 RT-PCR 결과의 허용을 위한 최소한의 기준은 하기였다: (1) RNA 농도: ≥ 10 ng/μl; (2) RNA는 ≥ 1.8의 260/280 nm 비를 가질 필요가 있음; (3) 5종 HK 유전자의 평균 발현: ≤ 32.0 Ct; 및 (4) 모든 개별 Ct 값: ≤ 35.

실시예 2: 유전적 프로그래밍을 통한, 결장직장암 재발의 위험성을 측정하기 위한 규칙의 생성

바이오마커 유전자들의 발현 수준에 기초하는 예후 규칙을 진화시키기 위하여, 훈련용 세트 유전자 발현 데이터의 연속 유전적 프로그래밍(GP) 분석을 사용하여, 실시예 1에서 확인된 예후 바이오마커 유전자들을 분석하였다. 하기에 나타낸 이러한 규칙들은 확인 데이터 세트에서 결장직장암 환자가 재발 또는 비-재발을 겪게될지 여부를 예측하는 데에 유용하였다.

확인된 예후 바이오마커 유전자들의 유전적 프로그래밍 분석에서는, 표 2 유전자들의 다양한 조합을 포함한 잠재적 규칙들의 군집을 무작위로 생성시킴으로써, 일련의 후보 규칙들을 산출하였다. 다음에, 각 후보 규칙을 적합성에 대하여 시험하였다.

"재발" 대 "비-재발"로 올바르게 분류된 종양 조직 샘플의 수가 후보 규칙에 있어서의 적합성의 척도로 사용되었다. 또 다른 예에서는, 민감성과 특이성의 합계, 또는 양성 예측가능성, 음성 예측가능성 등의 합계가 적합성의 척도로 이용된다. 또 다른 예에서는, 수용체 작용제 곡선 (ROC)의 곡선하 면적 (AUC)이 적합성의 척도로 사용된다. 충분히 높은 적합성을 가지는 것으로 판단된 후보 규칙이 발견된 경우, 유전적 프로그래밍을 종료하고, 최적합성 후보를 예후 규칙으로 선택하였다. 죵료 기준이 충족되지 않은 경우에는, 최고 적합성을 가지는 후보 규칙들을 교류시켜 새로운 자손 후보 규칙들의 군집을 생성시키고, 더 낮은 적합성을 가지는 것으로 밝혀진 후보 규칙을 폐기하였다.

종료 기준이 충족되어 적합한 적합성을 가지는 하나 이상의 규칙이 발견될 때까지, 유전적 프로그래밍 방법의 추가적인 반복을 수행하였다. 표 2 유전자들의 연속적인 GP 분석 후, 입력 데이터가 재발을 예측하는 예후 서명 규칙을 산출하였다 (표 3 참조).

실시예 3: 재발을 예측하기 위한 예후 GP 규칙의 사용

표 3의 규칙을 사용하여 결장직장암 환자에서 재발을 예측하였다. 미국 2개 장소 및 유럽 2개 장소에서, 86명의 단계 I/II (pT1-4 pN0 M0) 결장암 환자 및 29명의 단계 I (pT1-2, pN0 M0) 직장암 환자에 대하여, 치료 의도의 최초 수술 절제에서 수득된 기록용 포르말린-고정 파라핀-매립 1차 선암종 조직 (저장 중앙값 7년; 4-15년 범위)을 회수하였다. 이들 장소 및 샘플들은 실시예 1 및 2에 대하여 상기한 바와 같이 분자 시험을 생성시키는 데에 사용되었던 샘플들과는 다른 것이었다.

수득된 샘플에는 수술 36개월 이내에 종양이 재발되었던 (R) 환자로부터의 것들 (n=46), 및 수술 후 36개월 이상 동안 비-재발로 확인된 (NR) 환자로부터의 것들 (n=69)이 포함되었다. 어느 환자도 네오아주반트 또는 아주반트 요법을 받지 않았다.

이들 샘플에서, 어플라이드 바이오시스템즈 사로부터 입수된 맞춤형 384-웰 택맨® 저밀도 어레이를 사용하여, 그리고 일련의 엄격한 품질 조절 파라미터들을 충족시킨 RNA를 사용하여, qRT-PCR에 의해 종양 유전자 발현을 평가하였다. 문제의 5개 유전자 각각의 택맨® 검정 번호 및 프로브 길이를 하기 표 4에 나타내었다:

이와 같은 환자 데이터 세트 (V세트)에서 규칙 1의 예측 민감성 및 특이성을 분석하고, 결장직장암에 대하여 현행 국립 종합 암 네트워트 (NCCN)를 사용하여 수득된 것과 비교하였다. 단계 I/II CRC (n=115)의 경우, 상기 양분 규칙은 70%의 민감성 및 55%의 특이성으로 32/46명의 R 및 38/69명의 NR V세트 환자를 올바르게 분류하였다. 양성 예측 값 (PPV) 51%, 음성 예측 값 (NPV) 73%, 및 상대적 위험도 (HR) 2.06 (95% CI: 1.1 내지 3.86; p=0.020)으로써, '고위험'으로 간주된 환자들은 '저위험'으로 표지된 환자들에 비해 36개월 이내에 상당히 더 높은 재발 가능성을 가졌다.

반면, NCCN 지침 (버젼 1.2011)은 72%의 민감성 및 42%의 특이성, 45%의 양성 예측 값 및 69%의 음성 예측 값을 가짐으로써, 본 군집에서만큼 잘 36-개월 재발 대 비-재발을 구별할 수 없었다. 위험도 비는 1.38 (95% CI: 0.73-2.53, p=0.315)이었다. 분자 시험의 특이성은 NCCN에서의 것에 비해 상당히 더 컸다 (p=0.05).

단계 I 직장암 환자의 경우 (n=29; 13명 재발), 분자 시험의 예후 정확도는 NCCN 지침 (16/29)의 55% 특이성 (16/29)을 능가하는 79%의 특이성 (23/29)을 나타내었다.

본 실시예에서, 예후 바이오마커 유전자들로부터 유도된 예후 규칙이 FFPE 종양 조직에서의 유전자 발현 수준의 유전적 프로그래밍 분석에 의한 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 측정에 중요하며, 3년 이내의 재발에 대하여 고위험성 대 저위험성인 초기 단계 CRC 환자를 현행 NCCN 지침에 비해 더 우수하게 구별할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 4: 재발을 예측하기 위한 예후 GP 규칙의 사용

상기한 바와 같이, 유전적 프로그래밍을 사용하여 예후 바이오마커 유전자들을 확인하고 (실시예 1), 결장직장암 재발의 위험성을 측정하기 위한 예후 규칙을 생성시켰다 (실시예 2 및 3). 표 2에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 발현 수준이 결장직장암 재발에 대하여 고도로 예측성이었기 때문에, 비-GP 분석 방법을 사용하여서도 이들 예후 바이오마커 유전자들의 발현에 기초하는 예후 규칙이 생성될 수 있다는 가설을 세웠다.

다른 분석 방법들의 유용성을 입증하는 것으로써, 분류 및 회귀 나무 (CART) 알고리즘 (문헌 [Freund et al . 1999, The alternating decision tree learning algorithm])을 사용하여, 표 2에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 발현으로부터 유도되는 예후 규칙이 생성될 수 있다.

다양한 분석 기술들에 의해 생성되는 예후 규칙에서의 상기 예후 바이오마커 유전자들의 용도를 추가적으로 입증하는 것으로써, 표 2에 목록화되어 있는 유전자들에 대한 발현 데이터, 및 공지의 재발 및 비-재발 시험 데이터를 사용하여 (예를 들어 문헌 [Mocellin et al . 2003 Ann Surg Oncol. 2006 13: 1113-1122] 참조) 지지 벡터 머신이 생성될 수 있다. 계수 및 벡터들에 의해 생성되는 지지 벡터 머신 (SVM)은 분류기구(classifier)의 확실성을 시험하기 위한 훈련용 데이터 (T세트)에서의 4-중 교차확인을 수행하는 데에 사용된다. 분류기구를 3중으로 훈련시킨 후, 네 번째에 정확도가 시험된다. 분석은 단일 정확도 (%) 및 총 정확도 (4반복에 걸친 평균) (%)로 기록된다. SVM에 의해 개발된 규칙을 사용한 확인 세트 (V세트)의 시험은 기록되는 정확도 (%)를 산출한다.

다양한 분석 기술들에 의해 생성되는 예후 규칙에서의 상기 예후 바이오마커 유전자들의 용도를 추가적으로 입증하는 것으로써, 표 2에 목록화되어 있는 유전자들에 대한 양적 발현 데이터 및 공지의 재발 및 비-재발 시험 데이터를 사용하여 (예를 들어 문헌 [Mocellin et al . 2003 Ann Surg Oncol. 2006 13: 1113-1122] 참조) 지지 벡터 머신이 생성될 수 있다. 계수 및 벡터들에 의해 생성되는 지지 벡터 머신은 분류기구의 확실성을 시험하기 위한 훈련용 데이터 (T세트)에서의 4-중 교차-확인을 수행하는 데에 사용된다. 분류기구를 3중으로 훈련시킨 후, 네 번째에 정확도가 시험된다.

표 2에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 고도의 예측력을 추가 입증하는 것으로써, 선형 판별 분석을 사용하여 (예를 들어 문헌 [Marchevsky et al., 2004 JMD, Vol. 6]: [1Estevez et al ., 2004, Eur Clin Nutr 58:449-455] 참조) 표 2에 목록화되어 있는 유전자들의 양적 발현에 기초하여 결장직장암 재발의 가능성을 예측하는 예후 규칙이 생성된다.

선형 판별 (LD) 분석은 샘플을 2개의 군으로 분류하는 데에 각 유전자의 개별 측정치 및 모든 유전자 조합의 계산된 측정치 모두를 사용한다. 각 유전자에 대하여, 군 1 및 군 2 군의 평균 및 표준 편차로부터 비중이 유도된다. 모든 유전자에 비중을 곱하고, 이들 값의 합계가 집합적인 판별 점수로 이어진다. 다음에, 이와 같은 판별 점수는 군 1 및 군 2 군의 집합적 중심값에 비교된다. 이러한 중심값은 각각 모든 군 1 및 군 2 샘플들의 평균이다. 이에 따라, 각 유전자는 전체 예측에 기여한다. 이와 같은 기여는 그 유전자에 대한 군 1과 군 2 샘플들 사이의 상대적인 거리가 클 경우 큰 양 또는 음의 수이며, 상대적인 거리가 작을 경우 작은 수인 비중에 따라 달라진다. 각 미지 샘플에 대한 판별 점수 및 중심값은 미지 샘플이 어느 군에 속하는지에 관하여 0 내지 1 사이의 가능성을 계산하는 데에 사용될 수 있다.

본 발명의 또 다른 실시양태에서는, 표 1에 목록화되어 있는 것들 이외의 유전자들이 유전자 발현 프로파일을 생성시키는 데에 이용된다.

실시예 5: RT - PCR 법을 사용한 단계 I/ II 결장직장 1차 선암종 조직의 유전자 발현 프로파일의 생성

1개의 미국 (미네소타 로체스터; n=45) 및 2개 별도의 유럽 (러시아 연방 모스크바)의 장소에서 60명의 결장암 (AJCC pT1-4 pN0 cM0) 및 14명의 직장암 (AJCC pT2-3 pN0 cM0) 환자에 대하여, 치료 의도의 최초 수술 절제 (R0)에서 수득된 칠십사개 (74개)의 기록용이며 임상 주석이 달린 포르말린-고정 파라핀 매립 (FFPE) 1차 암종 조직을 회수하였다. 아무도 네오아주반트 또는 아주반트 요법을 받지 않았다. 각 경우에 대하여 그 장소의 직원에 의한 의료 기록 열람에 의해 삼십육 (36)-개월 R 및 NR 상태를 확인하였다. 모든 환자에 대하여 사전고지 동의서를 입수하였다.

재발 상태, 1차 재발까지의 시간, 결장암 대 직장암, R- 대 L-측 결장, 및 조직 공급원에 의한 계층화 후, 74 사례를 무작위로 훈련용 세트 (n=37; 16R, 21NR) 및 동일한 크기의 시험용 세트 (n=37; 16R, 21NR)로 분할하였다.

맞춤형의 집중식 마이크로어레이를 구성하기 위하여, 맞춤형 384-웰 택맨® 저밀도 어레이 (어플라이드 바이오시스템즈 사, 캘리포니아 포스터 시티 소재)를 사용하는 RT-PCR에 의해, 종양 유전자 발현을 평가하였다. 그것이 하기의 기준들 중 하나 이상을 충족하는지에 기초하여, 417개 암-연관 유전자의 패널을 어레이용으로 예비-선택하였다: (1) 종양생성, 종양 진행 또는 전이와 연관됨; (2) 세포 주기 진행, 혈관형성, 생존 또는 아폽토시스의 핵심 조절 단백질을 코딩함; (3) CRC의 개시 및 진행에 관련됨; (4) CRC의 예후인 것으로 보고되어 있음; (5) CRC 화학요법에 대한 종양 반응을 예보하거나 거기에 영향을 줌; (6) 정상 및 악성 CRC 조직 사이에 차별적으로 발현됨.

NCBI 엔트레즈 뉴클레오티드 데이터베이스를 통하여 접근한 각 유전자 및 공통서열에 대하여 적절한 mRNA 참조 서열 (REFSEQ) 접근 번호를 확인하였다. 어플라이드 바이오시스템즈 사에서 RT-PCR 프라이머 및 프로브를 설계하였다. 앰플리콘 크기는 최소한으로 유지하여, 대부분이 길이 100 염기 미만이었다.

각 사례에 대하여, 독립적인 위장관 병리학자에 의한 H&E 염색 슬라이드상 FFPE 악성 조직의 확인 및 위치지정 후, 별도의 유리 슬라이드에 고정된 상응 미염색 종양 조직을 1회용 스캘펄을 사용하여 무-RNAse 미세원심분리 튜브로 긁어내었다. 크실렌 중에서 조직을 탈-파라핀화한 후, RNA를 추출하고, 리커버올™ 총 핵산 단리 키트 (어플라이드 바이오시스템즈/암비온 사, 텍사스 오스틴 소재)를 사용하여 정제하였다. 나노드롭 1000 UV/Vis 분광광도측정기를 사용하여 260/280 nm의 UV 흡수비를 측정함으로써, RNA 용액의 순도 및 양을 측정하였다. 프라이머로서 무작위 육량체를 사용하는 고성능 cDNA 역전사 키트 (어플라이드 바이오시스템즈 사)를 사용하여, 최소 100 ng의 RNA를 단일 가닥 cDNA로 전사하였다. cDNA는 즉시 RT-PCR에 사용하거나, -80℃에서 저장하였다.

택맨® 맞춤형 어레이 384-웰 미세유동 카드 (어플라이드 바이오시스템즈 사)를 사용하여, 실시간 PCR을 통한 유전자 발현을 검정하였다. 48 웰 당 100 μl의 cDNA (1 ng/μl)를 카드에 적용한 후, 7900HT 속성 실시간 PCR 시스템을 사용하여 2반복으로 모든 검정을 수행하였다. 출력 데이터는 증폭 곡선에서 0.2로 설정된 일정한 역치, 즉 주기 역치 (Ct)에 도달하는 데에 요구되는 PCR 주기의 수로 나타내었다. 5종의 가계 (HK) 유전자를 사용하여 데이터를 표준화함으로써, 각 검정에서의 RNA 완전성 및 양의 잠재적인 기술적 변이성 및 편차에 대하여 보정하였다. 선택된 5종의 HK 유전자 (B2M, GUSB, POLR2L, PSMB6, UBC)는 CRC 및 다른 조직에서 상시 발현되는 것으로 잘 알려져 있는 9종의 후보 유전자들 중 최소 수준의 발현 변이성을 나타내었다. 개별 유전자 발현 복제물의 각 쌍을 일치도에 대하여 검사하고, 각각에 대하여 상관 계수를 생성시켰다. 복제물들을 평균하고, 5종 HK 유전자들의 평균 (Ave. 5HK Ct)으로부터 각 규칙 유전자에 대한 Ct (RG Ct)를 차감함으로써, 생성 데이터를 표준화하였다. Ct 값은 2를 밑으로 하는 대수로 나타내었기 때문에, 역대수를 취함으로써 데이터를 선형화하고, 결과를 100배로 확대하였다. 이에 따라, 데이터의 최종 형태는 하기였다:

유전자 발현 값 = 2^{( Ave . 5 HK Ct - RG Ct )} × 100.

연구 전체에 있어서, 추출된 RNA 및 RT-PCR 결과의 허용을 위한 최소한의 기준은 하기였다: (1) RNA 농도: ≥ 10 ng/μl; (2) RNA는 ≥ 1.8의 260/280 nm 비를 가질 필요가 있음; (3) 5종 HK 유전자의 평균 발현: ≤ 32.0 Ct; 및 (4) 모든 개별 Ct 값: ≤ 35.

본원에서 기술되는 RT-PCR 검정에 의해 R 및 NR 군들 사이에 차별적인 발현 수준을 나타내는 관심 유전자를 확인하고, 인터넷을 통하여 가용한 U.C.S.C. 게놈 브라우저에 목록화되어 있는 바와 같은 인간 게놈상의 참조 서열 위치, 그리고 인터넷을 통하여 가용한 진뱅크 사에서 입수되는 대표적인 핵산 서열과 함께 표 5에 나타내었다. 확인되는 바와 같은 U.C.S.C. 브라우저 및 진뱅크 사의 서열들은 본원에 참조로 포함된다.

실시예 6: 유전적 프로그래밍을 통한, 결장직장암 재발의 위험성을 측정하기 위한 규칙의 생성

바이오마커 유전자들의 발현 수준에 기초하는 예후 규칙을 진화시키기 위하여, 훈련용 세트 유전자 발현 데이터의 연속 유전적 프로그래밍(GP) 분석을 사용하여, 실시예 5에서 확인된 예후 바이오마커 유전자들을 분석하였다. 하기에 나타낸 이러한 규칙들은 확인 데이터 세트에서 결장직장암 환자가 재발 또는 비-재발을 겪게될지 여부를 예측하는 데에 유용하였다.

확인된 예후 바이오마커 유전자들의 유전적 프로그래밍 분석에서는, 표 5 유전자들의 다양한 조합을 포함한 잠재적 규칙들의 군집을 무작위로 생성시킴으로써, 일련의 후보 규칙들을 산출하였다. 다음에, 각 후보 규칙을 적합성에 대하여 시험하였다.

"재발" 대 "비-재발"로 올바르게 분류된 종양 조직 샘플의 수가 후보 규칙에 있어서의 적합성의 척도로 사용되었다. 충분히 높은 적합성을 가지는 것으로 판단된 후보 규칙이 발견된 경우, 유전적 프로그래밍을 종료하고, 최적합성 후보를 예후 규칙으로 선택하였다. 죵료 기준이 충족되지 않은 경우에는, 최고 적합성을 가지는 후보 규칙들을 교류시켜 새로운 자손 후보 규칙들의 군집을 생성시키고, 더 낮은 적합성을 가지는 것으로 밝혀진 후보 규칙을 폐기하였다.

종료 기준이 충족되어 적합한 적합성을 가지는 하나 이상의 규칙이 발견될 때까지, 유전적 프로그래밍 방법의 추가적인 반복을 수행하였다. 표 5 유전자들의 연속적인 GP 분석 후, 입력 데이터가 재발을 예측하는 예후 서명 규칙을 산출하였다 (표 6 참조).

실시예 7: 재발을 예측하기 위한 예후 GP 규칙의 사용

표 6의 규칙을 사용하여 결장직장암 환자에서 재발을 예측하였다. 미국 2개 장소 및 유럽 2개 장소에서, 86명의 단계 I/II (pT1-4 pN0 M0) 결장암 환자 및 29명의 단계 I (pT1-2, pN0 M0) 직장암 환자에 대하여, 치료 의도의 최초 수술 절제에서 수득된 기록용 포르말린-고정 파라핀-매립 1차 선암종 조직 (저장 중앙값 7년; 4-15년 범위)을 회수하였다. 이들 장소 및 샘플들은 실시예 5 및 6에 대하여 상기한 바와 같이 분자 시험을 생성시키는 데에 사용되었던 샘플들과는 다른 것이었다.

수득된 샘플에는 수술 36개월 이내에 종양이 재발되었던 (R) 환자로부터의 것들 (n=46), 및 수술 후 36개월 이상 동안 비-재발로 확인된 (NR) 환자로부터의 것들 (n=69)이 포함되었다. 어느 환자도 네오아주반트 또는 아주반트 요법을 받지 않았다.

이들 샘플에서, 어플라이드 바이오시스템즈 사로부터 입수된 맞춤형 384-웰 택맨® 저밀도 어레이를 사용하여, 그리고 일련의 엄격한 품질 조절 파라미터들을 충족시킨 RNA를 사용하여, qRT-PCR에 의해 종양 유전자 발현을 평가하였다. 문제의 23개 유전자 각각의 택맨® 검정 번호 및 프로브 길이를 하기 표 7에 나타내었다:

이와 같은 환자 데이터 세트 (V세트)에서 규칙 1 내지 8의 예측 민감성 및 특이성을 분석하고, 결장직장암에 대하여 현행 국립 종합 암 네트워트 (NCCN) 지침을 사용하여 수득된 것과 비교하였다. 단계 I/II CRC (n=115)의 경우, 상기 양분 규칙은 70%의 민감성 및 55%의 특이성으로 32/46명의 R 및 38/69명의 NR V세트 환자를 올바르게 분류하였다. 양성 예측 값 (PPV) 51%, 음성 예측 값 (NPV) 73%, 및 상대적 위험도 (HR) 2.06 (95% CI: 1.1 내지 3.86; p=0.020)으로써, '고위험'으로 간주된 환자들은 '저위험'으로 표지된 환자들에 비해 36개월 이내에 상당히 더 높은 재발 가능성을 가졌다.

반면, NCCN 지침 (버젼 1.2011)은 72%의 민감성 및 42%의 특이성, 45%의 양성 예측 값 및 69%의 음성 예측 값으로써, 이와 같은 군집에서 36-개월 재발 대 비-재발을 구별할 수 없었다. 위험도 비는 1.38 (95% CI: 0.73-2.53, p=0.315)이었다. 분자 시험의 특이성은 NCCN에서의 것에 비해 상당히 더 컸다 (p=0.05).

단계 I 직장암 환자의 경우 (n=29; 13명 재발), 분자 시험의 예후 정확도는 NCCN 지침의 55% 특이성 (16/29)을 능가하는 79%의 특이성 (23/29)을 나타내었다.

본 실시예에서, 예후 바이오마커 유전자들로부터 유도된 예후 규칙이 FFPE 종양 조직에서의 유전자 발현 수준의 유전적 프로그래밍 분석에 의한 결장직장암 재발 및/또는 비-재발의 측정에 중요하며, 3년 이내의 재발에 대하여 고위험성 대 저위험성인 초기 단계 CRC 환자를 현행 NCCN 지침에 비해 더 우수하게 구별할 수 있는 것으로 확인되었다.

실시예 8: 재발을 예측하기 위한 예후 GP 규칙의 사용

상기한 바와 같이, 유전적 프로그래밍을 사용하여 예후 바이오마커 유전자들을 확인하고 (실시예 5), 결장직장암 재발의 위험성을 측정하기 위한 예후 규칙을 생성시켰다 (실시예 6 및 7). 표 5에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 발현 수준이 결장직장암 재발에 대하여 고도로 예측성이었기 때문에, 비-GP 분석 방법을 사용하여서도 이들 예후 바이오마커 유전자들의 발현에 기초하는 예후 규칙이 생성될 수 있다는 가설을 세웠다.

다른 분석 방법들의 유용성을 입증하는 것으로써, 분류 및 회귀 나무 (CART) 알고리즘 (문헌 [Freund et al . 1999, The alternating decision tree learning algorithm])을 사용하여, 표 5에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 발현으로부터 유도되는 예후 규칙이 생성될 수 있다.

다양한 분석 기술들에 의해 생성되는 예후 규칙에서의 상기 예후 바이오마커 유전자들의 용도를 추가적으로 입증하는 것으로써, 표 5에 목록화되어 있는 유전자들에 대한 발현 데이터, 및 공지의 재발 및 비-재발 시험 데이터를 사용하여 (예를 들어 문헌 [Mocellin et al . 2003 Ann Surg Oncol. 2006 13: 1113-1122] 참조) 지지 벡터 머신이 생성될 수 있다. 계수 및 벡터들에 의해 생성되는 지지 벡터 머신 (SVM)은 분류기구의 확실성을 시험하기 위한 훈련용 데이터 (T세트)에서의 4-중 교차확인을 수행하는 데에 사용된다. 분류기구를 3중으로 훈련시킨 후, 네 번째에 정확도가 시험된다. 분석은 단일 정확도 (%) 및 총 정확도 (4반복에 걸친 평균) (%)로 기록된다. SVM에 의해 개발된 규칙을 사용한 확인 세트 (V세트)의 시험은 기록되는 정확도 (%)를 산출한다.

다양한 분석 기술들에 의해 생성되는 예후 규칙에서의 상기 예후 바이오마커 유전자들의 용도를 추가적으로 입증하는 것으로써, 표 5에 목록화되어 있는 유전자들에 대한 양적 발현 데이터 및 공지의 재발 및 비-재발 시험 데이터를 사용하여 (예를 들어 문헌 [Mocellin et al . 2003 Ann Surg Oncol. 2006 13: 1113-1122] 참조) 지지 벡터 머신이 생성될 수 있다. 계수 및 벡터들에 의해 생성되는 지지 벡터 머신은 분류기구의 확실성을 시험하기 위한 훈련용 데이터 (T세트)에서의 4-중 교차-확인을 수행하는 데에 사용된다. 분류기구를 3중으로 훈련시킨 후, 네 번째에 정확도가 시험된다.

표 5에 목록화되어 있는 예후 바이오마커 유전자들의 고도의 예측력을 추가 입증하는 것으로써, 선형 판별 분석을 사용하여 (예를 들어 문헌 [Marchevsky et al., 2004 JMD, Vol. 6]: [1Estevez et al ., 2004, Eur Clin Nutr 58:449-455] 참조) 표 5에 목록화되어 있는 유전자들의 양적 발현에 기초하여 결장직장암 재발의 가능성을 예측하는 예후 규칙이 생성된다.

선형 판별 (LD) 분석은 샘플을 2개의 군으로 분류하는 데에 각 유전자의 개별 측정치 및 모든 유전자 조합의 계산된 측정치 모두를 사용한다. 각 유전자에 대하여, 군 1 및 군 2 군의 평균 및 표준 편차로부터 비중이 유도된다. 모든 유전자에 비중을 곱하고, 이들 값의 합계가 집합적인 판별 점수로 이어진다. 다음에, 이와 같은 판별 점수는 군 1 및 군 2 군의 집합적 중심값에 비교된다. 이러한 중심값은 각각 모든 군 1 및 군 2 샘플들의 평균이다. 이에 따라, 각 유전자는 전체 예측에 기여한다. 이와 같은 기여는 그 유전자에 대한 군 1과 군 2 샘플들 사이의 상대적인 거리가 클 경우 큰 양 또는 음의 수이며, 상대적인 거리가 작을 경우 작은 수인 비중에 따라 달라진다. 각 미지 샘플에 대한 판별 점수 및 중심값은 미지 샘플이 어느 군에 속하는지에 관하여 0 내지 1 사이의 가능성을 계산하는 데에 사용될 수 있다.

상세한 설명에서 본 발명의 많은 특징 및 장점들이 드러났으므로, 첨부된 청구범위로써 본 발명의 진정한 기술사상 및 영역에 속하는 그와 같은 본 발명의 모든 특징 및 장점들을 포괄하고자 한다. 또한, 수많은 변형 및 변종들이 업계 숙련자에게 쉽게 떠오르게 될 것이므로, 본 발명을 예시 및 기술된 정확한 구성 및 작용으로 제한하는 것은 바람직하지 않으며, 그에 따라 모든 적합한 변형 및 등가물들은 본 발명의 영역에 속하는 것으로 재분류될 수 있다.

[서열 목록]

SEQUENCE LISTING <110> Worzel, William P <120> PROGNOSTIC SIGNATURE FOR COLORECTAL CANCER RECURRENCE <130> 42609.21501 <150> US 61/433,798 <151> 2011-01-18 <160> 23 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3435 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 acagcaacta tgaaataatc gtagtatgag aggcagagat cggggcgaga caatggggat 60 gtgggcgcgg gagccccgtt ccggcttagc agcacctccc agccccgcag aataaaaccg 120 atcgcgcccc ctccgcgcgc gccctccccc gagtgcggag cgggaggagg cggcggcggc 180 cgaggaggag gaggaggagg ccccggagga ggaggcgttg gaggtcgagg cggaggcgga 240 ggaggaggag gccgaggcgc cggaggaggc cgaggcgccg gagcaggagg aggccggccg 300 gaggcggcat gagacgagcg tggcggccgc ggctgctcgg ggccgcgctg gttgcccatt 360 gacagcggcg tctgcagctc gcttcaagat ggccgcttgg ctcgcattca ttttctgctg 420 aacgactttt aactttcatt gtcttttccg cccgcttcga tcgcctcgcg ccggctgctc 480 tttccgggat tttttatcaa gcagaaatgc atcgaacaac gagaatcaag atcactgagc 540 taaatcccca cctgatgtgt gtgctttgtg gagggtactt cattgatgcc acaaccataa 600 tagaatgtct acattccttc tgtaaaacgt gtattgttcg 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gggccgccca cccgctcccg gtgcagcggc 60 ctccgcgccg ggttttggcg cctcccgcgg gcgcccccct cctcacggcg agcgctgcca 120 cgtcagacga agggcgcagc gagcgtcctg atccttccgc ccggacgctc aggacagcgg 180 cccgctgctc ataagactcg gccttagaac cccagtatca gcagaaggac attttaggac 240 gggacttggg tgactctagg gcactggttt tctttccaga gagcggaaca ggcgaggaaa 300 agtagtccct tctcggcgat tctgcggagg gatctccgtg gggcggtgaa cgccgatgat 360 tatataagga cgcgccgggt gtggcacagc tagttccgtc gcagccggga tttgggtcgc 420 agttcttgtt tgtggatcgc tgtgatcgtc acttgacaat gcagatcttc gtgaagactc 480 tgactggtaa gaccatcacc ctcgaggttg agcccagtga caccatcgag aatgtcaagg 540 caaagatcca agataaggaa ggcatccctc ctgaccagca gaggctgatc tttgctggaa 600 aacagctgga agatgggcgc accctgtctg actacaacat ccagaaagag tccaccctgc 660 acctggtgct ccgtctcaga ggtgggatgc aaatcttcgt gaagacactc actggcaaga 720 ccatcaccct tgaggtcgag cccagtgaca ccatcgagaa cgtcaaagca aagatccagg 780 acaaggaagg cattcctcct gaccagcaga ggttgatctt tgccggaaag cagctggaag 840 atgggcgcac cctgtctgac tacaacatcc agaaagagtc taccctgcac ctggtgctcc 900 gtctcagagg tgggatgcag atcttcgtga agaccctgac tggtaagacc atcaccctcg 960 aggtggagcc cagtgacacc atcgagaatg tcaaggcaaa gatccaagat aaggaaggca 1020 ttccttctga tcagcagagg ttgatctttg ccggaaaaca gctggaagat ggtcgtaccc 1080 tgtctgacta caacatccag aaagagtcca ccttgcacct ggtactccgt ctcagaggtg 1140 ggatgcaaat cttcgtgaag acactcactg gcaagaccat cacccttgag gtcgagccca 1200 gtgacactat cgagaacgtc aaagcaaaga tccaagacaa ggaaggcatt cctcctgacc 1260 agcagaggtt gatctttgcc ggaaagcagc tggaagatgg gcgcaccctg tctgactaca 1320 acatccagaa agagtctacc ctgcacctgg tgctccgtct cagaggtggg atgcagatct 1380 tcgtgaagac cctgactggt aagaccatca ctctcgaagt ggagccgagt gacaccattg 1440 agaatgtcaa ggcaaagatc caagacaagg aaggcatccc tcctgaccag cagaggttga 1500 tctttgccgg aaaacagctg gaagatggtc gtaccctgtc tgactacaac atccagaaag 1560 agtccacctt gcacctggtg ctccgtctca gaggtgggat gcagatcttc gtgaagaccc 1620 tgactggtaa gaccatcact ctcgaggtgg agccgagtga caccattgag aatgtcaagg 1680 caaagatcca agacaaggaa ggcatccctc ctgaccagca gaggttgatc 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tgttgcattc 2580 ccaaaaaaaa aaaa 2594

Claims (19)

1. 결장직장암 재발과 상관된 예후 유전자 프로파일의 양적 발현에 대하여 환자 샘플을 분석하도록 적합화된 검정 시스템이며, 상기 프로파일은 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열의 발현을 포함하는 것인, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 검정 시스템.
2. 제1항에 있어서, 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열의 양적 발현을 분석하도록 적합화된 검정 시스템.
3. 제1항에 있어서, 서열 6 내지 23의 핵산 서열 중 하나 이상의 발현을 양적으로 분석하도록 추가로 적합화된 검정 시스템.
4. 제1항에 따른 검정 시스템을 포함하는 장치.
5. 환자의 샘플로부터 수득된 유전자 발현 데이터를 하기의 예후 규칙에 적용하도록 설계된 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 분석 시스템:
   [(((서열 1 / 서열 3) × 서열 5) - ((서열 2 / 서열 4) × 서열 3)) ≥ -4.4777]일 경우, 재발함.
6. 제5항에 따른 분석 시스템을 포함하는 장치.
7. 제6항에 따른 검정 시스템 및 제5항에 따른 분석 시스템을 포함하는 장치.
8. 환자의 샘플로부터 수득된 유전자 발현 데이터를 하기의 예후 규칙에 적용하도록 설계된 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 분석 시스템:
   규칙이 서열 1-23을 사용할 경우, 재발함.
9. a) 적어도 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열 각각의 코딩 서열을 나타내는 단리 및 정제된 폴리뉴클레오티드;
   b) 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열 각각의 단리된 RNA, cDNA 또는 gDNA 분자;
   c) a) 또는 b)의 상보체 또는 일부;
   d) a), b) 또는 c)를 증폭하도록 설계된 증폭 프로브; 또는
   e) a), b) 또는 c)의 발현을 분석하도록 설계된 혼성화 프로브
   를 포함하며, 결장직장암 재발의 위험성을 측정하도록 적합화된 장치 또는 키트.
10. 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열을 함유하는 예후 결장직장암 유전자 프로파일 발현의 양적 분석에 적합화된 프로브를 포함하는 매트릭스.
11. 제10항에 따른 매트릭스를 포함하는 결장직장암 예후 핵산 마이크로어레이.
12. a) 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열을 함유하는 예후 결장직장암 유전자 프로파일의 각 유전자에 대한 환자의 측정된 발현 수준을 제5항에 따른 분석 시스템에 제공하는 단계;
    b) 환자의 측정된 유전자 발현 수준을 분석 시스템의 규칙에 적용하는 단계; 및
    c) 규칙에 적용된 환자의 유전자 발현 수준의 분석 결과가 -4.4777 이상일 경우, 환자에서 비교적 높은 결장직장암 재발 위험성을 예측하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 결장직장암 재발 위험성의 예측 방법.
13. 환자의 샘플로부터 수득된 양적 유전자 발현 데이터를 서열 1, 2, 3, 4 및 5의 핵산 서열 전체 또는 그의 하위세트로 구성되는 결장직장암 예후 유전자 프로파일로부터 유도된 예후 규칙에 적용하도록 설계된 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 분석 시스템.
14. a) 서열 1, 2, 3, 4 및 5, 또는 유도된 규칙의 하위세트의 핵산 서열을 함유하는 예후 결장직장암 유전자 프로파일의 각 유전자에 대한 환자의 측정된 발현 수준을 제13항에 따른 분석 시스템에 제공하는 단계;
    b) 환자의 측정된 유전자 발현 수준을 분석 시스템의 규칙에 적용하는 단계; 및
    c) 규칙에 적용된 환자의 유전자 발현 수준의 분석 결과가 -4.4777 이상일 경우, 환자에서 비교적 높은 결장직장암 재발 위험성을 예측하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 결장직장암 재발 위험성의 예측 방법.
15. 결장직장암 재발과 상관된 예후 유전자 프로파일의 양적 발현에 대하여 환자 샘플을 분석하도록 적합화된 검정 시스템이며, 상기 프로파일은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열의 발현을 포함하는 것인, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 검정 시스템.
16. 제15항에 있어서, 환자의 샘플로부터 수득된 유전자 발현 데이터를 하기를 포함하는 하나 이상의 예후 규칙에 적용하도록 설계된 컴퓨터 소프트웨어를 포함하는, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하도록 적합화된 검정 시스템:
    1. [(((서열 1 / 서열 3) * 서열 5) - ((서열 2 / 서열 4) * 서열 3)) ≥ -4.4777]일 경우, 재발함;
    2. [((서열 6 * 서열 1) * (서열 4 / 서열 18))] >= 90.169556일 경우, 재발함;
    3. [((서열 14 / 서열 8) * (서열 6 / 서열 3))] >= 0.087297일 경우, 재발함;
    4. [((서열 6 / 서열 19) * (서열 4 / 서열 10))] >= 7.500713일 경우, 재발함;
    5. [((서열 6 / 서열 2) * (서열 4 / 서열 10))] >= 14.345780일 경우, 재발함;
    6. [(서열 7 / (서열 18 * (서열 8 / 서열 14)))] >= 0.049082일 경우, 재발함;
    7. [((서열 6 / 서열 3) * (서열 1 / 서열 14))] >= 0.305097일 경우, 재발함; 및
    8. [((서열 6 * 서열 4) * (서열 14 / 서열 18))] >= 110.769318일 경우, 재발함.
17. a) 적어도 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열 각각의 코딩 서열을 나타내는 단리 및 정제된 폴리뉴클레오티드;
    b) 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열 각각의 단리된 RNA, cDNA 또는 gDNA 분자;
    c) a) 또는 b)의 상보체 또는 일부;
    d) a), b) 또는 c)를 증폭하도록 설계된 증폭 프로브; 또는
    e) a), b) 또는 c)의 발현을 분석하도록 설계된 혼성화 프로브
    를 포함하며, 결장직장암 재발의 위험성을 측정하도록 적합화된 장치.
18. a) 적어도 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열 각각의 코딩 서열을 나타내는 단리 및 정제된 폴리뉴클레오티드;
    b) 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열 각각의 단리된 RNA, cDNA 또는 gDNA 분자;
    c) a) 또는 b)의 상보체 또는 일부;
    d) a), b) 또는 c)를 증폭하도록 설계된 증폭 프로브; 또는
    e) a), b) 또는 c)의 발현을 분석하도록 설계된 혼성화 프로브
    를 포함하며, 결장직장암 재발의 위험성을 측정하도록 적합화된 키트.
19. a) 결장직장암 재발과 상관된 예후 유전자 프로파일의 양적 발현에 대하여 환자 샘플을 분석하도록 적합화된 분석 시스템이며, 상기 프로파일은 서열 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 10, 14, 18 및 19의 핵산 서열의 발현을 포함하는 것인, 환자에서 결장직장암의 재발 및/또는 비-재발을 예측하기 위한 분석 시스템을 제공하는 단계;
    b) 환자의 측정된 유전자 발현 수준을 하기를 포함하는 하나 이상의 예후 규칙에 적용하는 단계:
    1. [(((서열 1 / 서열 3) * 서열 5) - ((서열 2 / 서열 4) * 서열 3)) ≥ -4.4777]일 경우, 재발함;
    2. [((서열 6 * 서열 1) * (서열 4 / 서열 18))] >= 90.169556일 경우, 재발함;
    3. [((서열 14 / 서열 8) * (서열 6 / 서열 3))] >= 0.087297일 경우, 재발함;
    4. [((서열 6 / 서열 19) * (서열 4 / 서열 10))] >= 7.500713일 경우, 재발함;
    5. [((서열 6 / 서열 2) * (서열 4 / 서열 10))] >= 14.345780일 경우, 재발함;
    6. [(서열 7 / (서열 18 * (서열 8 / 서열 14)))] >= 0.049082일 경우, 재발함;
    7. [((서열 6 / 서열 3) * (서열 1 / 서열 14))] >= 0.305097일 경우, 재발함; 및
    8. [((서열 6 * 서열 4) * (서열 14 / 서열 18))] >= 110.769318일 경우, 재발함; 및
    c) 적용된 하나 이상의 예후 규칙에 대한 반응으로 환자에서 결장직장암 재발의 위험성을 예측하는 단계
    를 포함하는, 환자에서의 결장직장암 재발 위험성의 예측 방법.

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