CN103403187A - 结肠直肠癌复发的预后特征 - Google Patents

结肠直肠癌复发的预后特征 Download PDF

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Abstract

一种对预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发有用的分析系统。所述分析系统适合用于对患者样本的预后基因谱的定量表达进行的分析，所述预后基因谱与结肠直肠癌复发相关。所述谱包括SEQ ID NOS：1、2、3、4和5的核酸序列的表达。

Description

结肠直肠癌复发的预后特征
相关申请的交叉引用
本申请要求2011年1月18日提交的、题为“结肠直肠癌复发的5-基因预后特征”、序列号为61/433,798的临时美国专利申请的优先权，将其全部公开内容引入本文作为参考。
发明领域
本发明一般地涉及诊断测试。更具体地，本发明涉及与结肠直肠癌相关的特征（signature）的诊断测试。
发明背景
在美国，结肠直肠癌是第三种最常见的诊断癌症，每年确诊的有约15万例，并且也是与癌症相关的死亡的第三大诱因。单独通过外科手术治疗淋巴结阴性结肠直肠癌的患者中有四分之一被认为“治愈”，但在五年内将会经历复发。目前，使用美国国家综合癌症网络（National ComprehensiveCancer Network，NCCN）临床实践指南来预测结肠直肠癌患者复发的风险。需要用于确定处于癌症复发的较高风险的患者的改进技术，以通过比NCCN指南所提供的更好的风险预测来实现更好的治疗计划和患者结局。
概述
前述需求在很大程度上通过本发明来满足，其中，在一个方面中公开了诊断测试，该诊断测试在一定程度上改进了结肠直肠癌复发的预测。
本发明提供了对预测患者中结肠直肠癌复发和/或不复发的可能性有用的预后生物标记基因。特别地，通过遗传编程分析确定了在预测结肠直肠癌复发和不复发中重要的特异性基因。这些预后生物标记基因为使用监督式学习技术生成预后规则（算法）提供了基础。将所生成的预后规则例如通过机器可读软件应用于预测个体受试者中结肠直肠癌复发和/或不复发的风险性，所述机器可读软件包括预后规则。
基于确定的预后生物标记基因BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA的表达水平的示例性预后规则使用在监督式学习模式中的遗传编程生成。该规则和可以通过随后应用各种监督式学习技术例如遗传编程、CART分析、支持向量机和线性判别分析由这些确定的预后生物标记基因生成的其他规则为预测结肠直肠癌患者的癌症复发和不复发的风险提供了有用的工具。
本发明提供了系统、工具、试剂盒、核酸阵列、矩阵、软件、计算机程序等，其适于利用预后生物标记基因（BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA）和/或本发明的预后规则（或多种规则）来预测受试者的结肠直肠癌复发和/或不复发的风险。例如，系统、分析、试剂盒或表面可以包括所公开的生物标记基因、扩增探针、杂交探针、分析试剂、数据收集、计算和输出模块、计算机软件、机器可读介质等中的一种或多种，其适于和/或设计用于将受试者的确定的基因表达水平应用于预后规则（或多种规则）并生成结肠直肠癌复发和/或不复发的风险评估。
本发明进一步提供了用于预测结肠直肠癌复发和/或不复发的风险，所述方法包括：确定从患者获得的样本中预后生物标记基因（BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA）的基因表达的量，以及将生物标记基因表达的确定的量应用于预后规则以确定此种风险。所述预后规则可以是在以下实施例中确定的规则，或者可以通过对被分类为表现复发或不复发的结肠直肠癌患者样本群体中的生物标记基因BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA的表达进行监督式学习分析来生成。用于预测复发或不复发的风险的优选规则是以下所示的规则1：如果[(((BMI 1/H3F3B)X VEGFA)-((ETV6/RPS10)X H3F3B))≥-4.4777]，那么复发。
因此，相当广泛地概括了本发明的某些实施方案，以便在此更好地理解其详述部分，以及以便更好地体会本发明对于现有技术的贡献。当然还有以下将描述的本发明的另外的实施方案并且所述的实施方案将形成所附权利要求的主题。
在这方面，在详细解释本发明的至少一个实施方案之前，应当理解的是本发明的应用不限于结构的细节以及在以下的说明书中记载的或在附图中示出的组件的排列。本发明能够实现除了所描述的以外的实施方案，并且能够以多种方式实践和实施。而且，应当理解的是，本文使用的短语和术语，以及文摘是出于描述的目的，并且不应被认为是限制性的。
因此，本领域技术人员将理解，本公开所基于的构思可以容易地用作设计用于实现本发明的一些目的的其它结构、方法和系统的基础。因此，重要的是权利要求被认为包括这样的等同结构，只要其不脱离本发明的精神和范围。
附图的简要说明
图1是显示了根据预后规则1在实施例2中预测具有结肠直肠癌复发的高风险或低风险的患者样本在3年内无复发的患者的比例的图。
图2是显示了以上图1中所示的相同患者样本的存活曲线的图，但使用NCCN指南来预测结肠直肠癌复发的高风险或低风险。
详述
定义
除非另外指明，本发明使用分子生物学和相关领域的常规技术。这样的技术在文献中进行了描述，所述文献包括，例如教科书，如Sambrook等人，2001,Molecular Cloning：A Laboratory Manual和Ausubel等人，2002,Short Protocols in Molecular Biology,(2002)。将本文所提到的所有专利、专利申请和出版物的全部内容明确引入本文作为参考。
除非另外限定，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的技术人员通常所理解的相同的含义。虽然与本文所描述的类似或等同的任何方法和材料可以用于本发明的实践或测试，但描述了优选的方法和材料。出于本发明的目的，以下的术语定义如下。
本文中使用的冠词“一个/一种（a）”和“一个/一种（an）”是指一个或一个以上（即至少一个）冠词的受词。通过举例的方式，“一个元素”意思是一个或多个元素。
如本文使用的术语“患者样本”是指可以从患者或受试者获得并且对其生物标记基因表达进行分析的样本。患者样本可以包括生物流体、组织活检等。在一个优选的实施方案中，样本是组织样本，例如肿瘤组织并且可以是新鲜的、冷冻的和/或存档的（archival）石蜡包埋组织。
如本文所使用的术语“基因”是指细胞基因组的任何和所有离散的编码区，以及相关的非编码和调控区。所述基因也旨在表示开放阅读框架，所述开放阅读框架编码在表达调控中涉及的特异性多肽、内含子以及邻近的5′和3′非编码核苷酸序列。在这方面，所述基因可以进一步包括控制信号或异源控制信号，所述控制信号例如与给定基因自然相关的启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号。DNA序列可以是cDNA或基因组DNA或其片段。
“预后基因谱”是指核酸序列的组合，其定量表达水平可以用于预后规则以预测患者癌症复发和/或不复发的风险。本文确定的预后基因谱包括在以下实施例中确定的以下生物标记基因的组合：BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA。
本发明的“预后标记基因”是指以下的基因：BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10、VEGFA、AKT1、ARAF、ARHGDIB、B2M、CD82、DIABLO、FGFR4、GUSB、HMOX1、ITGB1、MAPK14、MAX、MMP2、NFKB1、POLR2L、PSMB6、PTK2和UBC。
“预后规则”是指将从结肠直肠癌患者获得的样本中的预后生物标记基因的定量表达与癌症复发和/或不复发的风险相关联的一组一种或多种数学表达式或算法。
如应用于由表1的预后生物标记基因生成的预后规则的“监督式学习”是指应用于一组数据的多种数学学习技术，在所述数据中限定结局，例如复发和不复发，并且从提供的实例中分析学习。监督式学习技术包括，例如遗传编程、CART分析，支持向量机和线性判别分析等。
“复发”是指在治疗的36个月内，患者又患上结肠直肠癌。
“不复发”是指在治疗后至少36个月证实患者的结肠直肠癌不存在。
“核酸微阵列”是指可杂交的核酸阵列元素例如多核苷酸探针的有序排列，其通常定位于基质上并且能够通过非共价结合相互作用结合互补序列的样本。
肽“片段”或“部分”是指包含另一个肽的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续的氨基酸残基的肽。
基因或多核苷酸“片段”或“部分”是指包含另一个多核苷酸的序列的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、125、150、175、200或250个连续的核酸残基的核酸分子。
就核酸序列而言所使用的术语“互补物”是指其序列与第二个核酸序列的序列互补并因此能够杂交到第二个序列的多核苷酸。
“探针”是指识别和能够通过非共价（例如氢键）相互作用杂交到多核苷酸靶序列的寡核苷酸或其类似物。探针的长度通常为至少8个核苷酸但小于基因的全长。探针可以使用可检测标记和/或淬灭剂分子来修饰。
术语“分离的”和/或“纯化的”是指与组分分离的物质，所述组分在物质的自然状态下通常伴随所述物质。例如，如本文所使用的“分离的多核苷酸”是指已经从序列中纯化的多核苷酸，所述序列在自然存在状态下位于所述多核苷酸的侧面，例如已经从通常与DNA片段相邻的序列中去除的所述DNA片段。
短语“特异地杂交到”等是指在严格条件下，当特定的核苷酸序列以复杂的混合物，例如总细胞DNA或RNA或者其混合的多核苷酸提取物存在时，分子仅与所述序列结合、成双链或杂交。
生物标记物的确定
如在以下的实施例中描述的，通过遗传编程分析，将特定的预后生物标记基因确定为：在从表现出癌症复发的患者和未表现出复发的患者中获得的样本之间单独地或与其它基因组合表现出显著的差异表达。特别地，以下的五个生物标记基因的表达水平被确定为在预测结肠直肠癌复发中特别有用：BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA。
如在以下实施例中描述的，可以对这五个显著的生物标记基因的表达水平做进一步的分析以生成将这些基因的组合的定量表达（预后基因谱）应用于预测结肠直肠癌复发和/或不复发的预后规则。对于预测结肠直肠癌复发有用的预后基因谱包括在以下实施例中确定的生物标记基因的组合：BMI1、ETV6、H3F3B、RPS10和VEGFA。
可以使用多种模式识别技术和相关分析，例如遗传编程、线性回归、逻辑回归、人工神经网络、支持向量机（SVM）、聚类模型、CART分析等，由确定的预后生物标记基因生成预后规则。在优选的实施方案中，使用生物标记基因的遗传编程分析来生成预后规则。所产生的预后规则是将预后生物标记基因的定量表达与结肠直肠癌复发和/或不复发的风险相关联的数学表达式（算法）。如在以下实施例中所述的使用遗传编程生成的示例性预后规则是以下优选的规则：
如果[(((BMI1/H3F3B)*VEGFA)–((ETV6/RPS10)*H3F3B))≥-4.4777]，那么复发。
“管家基因”的表达可以用作分析中的对照。这样的管家基因包括，例如GAPDH、β-肌动蛋白、S9核糖体、泛素、α-微管蛋白、18S rRNA、GUS、HPRT、B2M、TBP、CYC、HuPO、PGK、HuTfR、G6PDH（Blanquicett等人,2002,Anal Biochem,303:209-14）；RPLP0、GAPD、HPRT1、B2M、POLR2A、RPS14、MAN1B1、ACTB、MTR（Dydensborg等人,2006,Am JPhysiol Gastrointest Liver Physiol,290:G1067-74）；以及HPRT、ADA、TAF2、POLR2L、CETN2、ACTB、UBE2D2、PSMB6、CAPN2、TXNRD1、SDHA、GUS、CYCC、PMM1、AGPATI、HDAC10、B2M（Rubie等人,2005,Mol CellProbes,19:101-9）。
基因表达分析
可以通过各种已知方法，例如通过确定样本中例如组织样本中由基因表达生成的mRNA、cDNA或蛋白质的量来定量分析基因表达。用于从组织样本中分离mRNA从而进一步分析的方法是已知的，例如参见Ausubel等人,2002,Short Protocols in Molecular Biology。用于从石蜡包埋的组织中分离mRNA的方法例如在De Andres等人，1995,BioTechniques 18:42044中进行了讨论。RNA分离试剂盒可商购获得，所述试剂盒包括例如ParaffinBlock RNA Isolations Kits（Ambion,Inc.,Austin,TX）。
例如，分离的RNA可以被转化为cDNA和/或扩增、确定以及通过测序或通过杂交分析进行定量。用于确定基因表达的量的其他方法包括，例如RNA印迹法（Brown,2001 May,Curr Protoc Immunol.,Chapter 10:Unit10.12;Parker&Barnes,1999,Methods in Molecular Biology 106:247-283）、逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）（Nygaard等人，2009,Front Biosci.14:552-69;Weis等人，1992,Trends in Genetics 8:263-64）、RNA酶保护分析（Emery,1999,Methods Mol Biol.362:343-8;Hod,1992 Biotechniques 13:852-54）、大规模平行签名测序（MPSS）（Kutlu,2009,BMC Med Genomics.,2:3;Brenner,2000,Nature Biotechnol.18:1021）、基因表达的系列分析（SAGE）（Boon 2009,PLoSONE.4:e5134;Velculescu,1995,Science 270:368-9,371），以及能够结合到DNA或RNA双链体的抗体的使用、RNA介导的退火、选择和连接（RASL）分析（Yeakley,2002,Nat Biotechnol;20:353-8）、cDNA介导的退火、选择、延伸和连接（DASL）分析（Abramovitz,2008,Biotechniques,44:417-423;Fan,2004,Genome Research 14:878-85）、微阵列技术（Ravo等人,2008,Lab Invest,88:430-40;Schena,1996,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:106-149），例如Incyte的微阵列技术或Affymetrix的GenChip技术；或者由454 Life Sciences,Inc.开发的高通量测序技术（Branford,CT）（Marguilies,2005,Nature,437:376-80）。
在一个实施方案中，可以使用市售试剂，例如可从APPLIEDBIOSYSTEMS获得的那些试剂来分析所选择的生物标记基因的定量表达，所述试剂包括特异性TaqMan
Figure BDA00003722529800071
基因表达分析，其可用于规则1的5个生物标记物中的每一个。示例性的TAQMAN基因表达分析在以下列出。这些试剂在实施例2中使用，描述如下。
表1
SEQ ID 生物标记物 分析编号 扩增子长度
1 BMI1 Hs00180411_m1 105个核苷酸
2 ETV6 Hs01045742_m1 75个核苷酸
3 H3F3B Hs00855159_g1 83个核苷酸
4 RPS10 Hs01652367_gH 108个核苷酸
5 VEGFA Hs00900055_m1 59个核苷酸
DASL
用于确定定量基因表达的DASL分析方法包括使用生物素化的引物将总RNA转化为cDNA。在cDNA中，将生物素化的DNA连接于链霉亲和素固态载体，然后将分析寡核苷酸退火至它们的靶序列。将寡核苷酸对退火到给定的靶位点，通常每个基因使用3到10个靶位点。将上游退火的寡核苷酸延伸并连接到下游相应的核苷酸，从而建立PCR模板，所述PCR模板例如使用通用PCR引物扩增。将例如通过掺入标记引物而标记的PCR产物杂交于固体载体阵列上的捕获序列，并且测量每个珠的荧光强度。
针对高达1536个基因的包含1-3个探针组每基因的完全定制设计的DASL分析板，以及包含一组靶向与癌症相关的502个基因的探针组的标准DASL人类癌症板可商购得自Illumina,Inc.（San Diego,CA）。
MassARRAY
使用MassARRAY系统来分离RNA并将其逆转录为cDNA。使所述的cDNA扩增、去磷酸化、使用引物延伸以及置于芯片阵列上以通过MALDI-TOF质谱分析法定量分析。用于进行MassARRAY分析的硬件和软件可商购得自Sequenom,Inc.（San Diego,CA）。
SAGE
在SAGE中，约10-14个碱基对的多序列标签连接在一起从而形成用于同时测序、确定多标签的序列的延伸的分子，所述多序列标签在RNA转录物内各自对应于独特的位置。转录物的表达模式可以通过确定给定标签的丰度以及确定对应于该标签的基因来定量。用于进行SAGE的试剂盒以及用于分析SAGE数据的软件可商购获得，所述试剂盒包括例如I-SAGEKit（Invitrogen,Carlsbad,CA）。SAGE数据可以用于搜索例如通过因特网获得的SAGEmap数据库。
遗传编程
在一个优选的实施方案中，遗传编程用于分析基因表达数据从而确定对于在预后基因谱和在预后规则的使用中具有足够预测功效的一组生物标记基因，所述预后基因谱和预后规则指示受试者的结肠直肠癌复发和/或不复发的风险。
遗传编程是使用生物进化的原理来开发计算机算法的一种人工智能/机器学习技术，所述计算机算法能够完成使用者限定的任务（参见，例如Banzhaf等人，1998,Genetic Programming:An Introduction:On the AutomaticEvolution of Computer Programs and Its Applications;Koza,J.R.,1992,GeneticProgramming:On the Programming of Computers by Means of Natural Selection,MIT Press）。
遗传编程使用进行程序群体“自然选择”的每个程序的适应度（fitness）测量值，通过以迭代的方式进化一组计算机程序来优化所述计算机程序以执行需要的任务。在本发明的一个实施方案中，所述任务是生成在预测患者癌症复发中有用的一种或多种预后规则，并且所述适应度测量值或者“适应度函数”是给定计算机程序正确地将肿瘤组织样本分类为属于会经历复发或者不复发的患者的能力。
可以以多种已知的方法来实现计算机程序群体的进化。一种常见的方法使用了交叉策略，其中一个程序的节点与来自存在于群体中的另一个程序的节点互换。用于进化计算机程序的另一种方法是通过突变，其中在不影响群体中任何其它程序的情况下替换属于程序的节点或者包含在节点中的信息。与其它方法一样，这些方法可以单独地或者一起使用，所述其它方法涉及在程序之间交换编程元件的组件块。在每一轮进化中使用适应度测量值使群体中的每个计算机程序接受测试。
如在以下实施例中所描述的，遗传编程系统可以具有取自靶疾病和健康组织两者的已知样本的基因表达数据，并且可以用于针对靶向的疾病类别例如结肠直肠癌的复发/不复发进化谓语从句“如果-那么”（IF-THEN）。在一个实施方案中，谓语从句“如果-那么”是将肿瘤组织中各种基因的表达量与患者中癌症复发的可能性相关联的数学表达式。使用样本的训练集开发了进化的规则，所述样本的训练集的正确分类的样本的数量是候选规则的适应度测量值。
可以改变适应度测量值以便给予规则的权重更多，产生更少的假阳性误差，或者通过给予产生更少的假“阴性”误差的规则更多的可信度（credit）。也可以出于其他原因来改变适应度测量值，所述其他原因是遗传编程系统自身以外的原因，但更好地反映需要的目标。例如，在一个实施方案中其可能期望产生仅掺入编码特定种类的蛋白质的基因，所述蛋白质如已知从选择的肿瘤组织中逃逸并通过血流系统性地进入身体的蛋白质。
一旦开发了预后规则，针对样本的测试集检查该规则以评价其推广到未知样本的能力。在每轮适应度评估之后，保存最好的执行程序用于在下一轮中进一步进化。多种方法可以用于选择计算机程序群体以用于接下来的进化迭代。在一个实施方案中，使用例如交叉使两个最适合的程序彼此“配对”，并且将子程序添加到程序群体中用于下一轮进化，根据适应度评估替代最不适合的程序。另外的进化迭代和适应度测试可以继续，直到根据预选择的标准获得适合功用的一种或多种预后规则，或者直到观察到适应度没有进一步改进。
遗传编程的显著优点在于其通常通过以出乎意料的方式组合变量，利用多变量和运算符以产生具有较高预测功效的算法的能力。遗传编程相对于其它模型技术的另外的优点在于，在没有任何运算符输入的情况下，可以同时产生预后规则，所述运算符输入需要，例如，筛选基于与认为对于正在研究的疾病具有意义的生物方法的相关性而选择的基因，因为当使用例如分层聚类分析时可能是必要的。
与任何分析方法一样，如果存在次最优条件，遗传编程的功用可以被损害。例如，理想地，大数据集可用于分割为大训练集和测试集。然而在多数情况下，输入数据的总量小，意味着遗传编程系统可能不学习潜在可用的最一般的分类概念。类似地，小测试不允许对学习的概念的普遍性进行非常彻底的评估。在这些情况下，具有用于评价从遗传编程系统自身以外的遗传编程中获得的结果的已知方法。例如n倍交叉验证可以用于处理小数据集。本领域技术人员将能够从已知验证方法的全部范围中选择。
多种遗传编程技术可以用于实践本发明。例如可以根据第6,327,582号美国专利中描述的技术来实施遗传编程。
其它分析方法
应当认识到，一旦确定了具有高预测功效的一组预后生物标记基因，除了遗传编程以外的分析方法可以用于生成将预后生物标记基因的相对表达水平与癌症复发和/或不复发相关联的一种或多种预后规则。例如，已知的回归和其他模式识别技术可以用于生成预测规则。只要预后生物标记基因是已知的，监督式学习技术，例如CART分析、支持向量机和线性或非线性判别分析等对于开发预后规则是有用的。
预后规则
用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的可能性的预后规则在以下实施例中进行了确定并且也可以通过确定的预后生物标记基因的分析来生成。预后规则通常是将生物标记基因的表达量与结肠直肠癌复发和/或不复发的风险相关联的布尔表达式。
患者的结肠直肠癌复发的可能性通过将患者的确定的生物标记基因表达的水平应用于预后规则来预测。在一个实例中，计算机化系统包括：输入模块，用于接收基因表达值；分析模块，用于将基因表达值应用于预后规则和根据规则计算风险预测；以及输出模块，用于将产生的通过规则计算的复发和/或不复发的风险预测例如通过显示器或其他通信机制传输给使用者。在另一个实例中，可以将两个或多个规则应用于分析模块。
工具、试剂盒、系统和预后基因谱
本发明提供了被确定为对结肠直肠癌患者复发和/或不复发的风险重要的生物标记物的基因的组。这些预后生物标记基因列于上表1中。将通过示例性患者样本中的这些预后生物标记基因的定量表达的数学分析生成的预后基因谱和预后规则应用于分析方法、系统、工具、试剂、软件、装置等，从而由个体患者的这些预后生物标记基因的表达水平确定该患者属于具有结肠直肠癌复发和/或不复发的高风险群体的可能性的预测，并且基于预测的预后将所述预后基因谱和预后规则应用于结肠直肠癌患者的合理治疗。
代表性的工具包括，例如分析系统，所述分析系统适合于确定预后生物标记基因、基因谱、以及特异性预后规则的基因的表达量，例如微阵列、杂交、扩增、PCR、DASL、SAGE；和类似的分析系统以及在用于预测患者的结肠直肠癌复发或不复发的装置、系统或方法中使用的试剂盒、芯片、卡片、多孔分析板、探针、引物、数据储存系统、软件程序、计算机系统等。
核酸探针和/或引物的板被设计为扩增和检测一种或多种预后生物标记基因的表达水平。这样的探针包括，例如，对基因表达水平的定量测定有用的分离的基因mRNA、cDNA及其部分、扩增的核酸。这样的引物包括位于期望的扩增子侧面并且对扩增用于定量基因表达的期望的基因或基因的部分有用的核酸。
分析基质，例如杂交板、芯片或卡片被改变和设计为包括扩增和/或确定和/或测序的引物对和/或探针并由此定量得自受试者的样本中确定的生物标记基因的表达。
试剂盒包括试剂和在定量确定的生物标记基因的表达水平中有用的工具，所述确定的生物标记基因由于它们在本发明的预后规则中的存在而与结肠直肠癌复发相关联，并且包括，例如设计用于定量表1中列出的生物标记基因的表达的核酸探针和/或引物。
工具、试剂盒和系统还包括适合于储存和应用预后规则以计算结肠直肠癌复发和/或不复发的预测的风险的计算机系统、软件和模块。计算机系统可以包括，例如，输入模块，用于接收定量的生物标记基因的表达数据；分析模块，将预后规则和生物标记基因表达水平应用于计算规则的数学结局；以及输出模块，用于提供预测的风险结局。
治疗或预防的方法
本发明包括用于预测患者的结肠直肠癌复发和/或不复发的风险的方法。一般来讲，该方法包括：由患者的样本定量测定表1中列出的经确定的预后基因谱的基因表达水平；将测定的表达值应用于预后规则；和根据预后规则解释基因表达水平以确定患者的结肠直肠癌复发的风险。如通过将患者的基因表达数据应用于预后规则的结局所确定的，对患者的预后进行个性化的治疗方案。在一个实例中，当患者样本的分析指示复发的可能性时，应用了更积极的抗癌方案。
实施例
参考以下非限制性实施例中描述的具体实施方案可以容易地理解和实践本发明。在以下实施例中将各种分析描述为用于选择一组表达的预测基因。特别地，描述了cDNA介导的，退火、选择、延伸和连接（DASL）分析和逆转录酶聚合酶链反应（RT-PCR）分析。然而，本发明的各种实施方案不限于DASL和RT-PCR，而是可以包括任何适合的基因组物质的选择分析。
实施例1:使用DASL方法生成I/II期结肠直肠原发性腺癌组织的基因表达谱
在根治性手术过程中，从145例患有I期或II期结肠直肠癌的患者（结肠癌104例，直肠癌41例）获取存档的福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的原发性腺癌组织。手术后，所有患者到36个月复发（R）（n=67；II期51例）或者在≥36个月时被证实未复发（NR）（n=78；II期56例）；没有患者接受新辅助疗法或辅助疗法。通过R状态、到第一次复发的时间、右侧vs左侧肿瘤等对患者进行分层，然后随机分配到训练集（TSet）（n=73;34R,39NR）或者验证集（VSet）（n=72;33R,39NR）。
训练集肿瘤基因表达通过DASL分析（Illumina,San Diego,CA）（Abramovitz,2008,Biotechniques,44:417-423;Fan等人,2004,GenomeResearch 14:878-85），使用定制的512基因板进行定量。对在R和NR组之间表现差异表达水平的感兴趣的基因进行了确定并且与位于人类基因组上的参考序列一起显示于表2中，所述参考序列如在通过因特网可获得的U.C.S.C.基因组浏览器（browser）中列出的以及从通过因特网可获得的基因库（GenBank）中获得的代表性核酸序列。在此将所确定的U.C.S.C.Browser和GenBank中的序列引入作为参考。
使用RT-PCR方法生成I/II期结肠直肠原发性腺癌组织的基因表达谱
供选择地或者除了DASL方法以外，可以使用RT-PCR方法生成基因表达谱。例如，对于来自1个美国地点（罗切斯特MN;n=45）和2个独立的欧洲地点（莫斯科，俄罗斯联邦）的60例结肠癌（AJCC pT1-4 pN0cM0）患者和14例直肠癌（AJCC pT2-3 pN0 cM0）患者，取回在具有根治性目的的初始外科手术切除时获得的七十四（74）个存档的、临床注释的、福尔马林固定的、石蜡包埋（FFPE）的原发性腺癌组织（R0）。没有患者接受新辅助疗法或辅助疗法。对于每例患者，通过由现场人员评估的医学记录来证实三十六（36）个月R和NR状态。获得所有患者的知情同意。
在通过复发状态、到第一次复发的时间、结肠癌与直肠癌、R-侧与L-侧结肠以及组织来源分层之后，将74例患者随机分配到训练集（n=37;16R,21NR）和规模相同的测试集（n=37;16R,21NR）。
为了构建定制的集中微阵列，使用定制的384孔TaqMan
Figure BDA00003722529800131
低密度阵列（Low Density Arrays）（Applied Biosystems,Foster City,CA），通过RT-PCR评估了肿瘤基因表达。基于417个癌症相关基因符合以下标准中的一个或多个而针对阵列预选择了所述417个癌症相关基因的板：（1）与肿瘤发生、肿瘤进展或转移相关；（2）编码细胞周期进展、血管生成、存活或细胞凋亡中关键的调控蛋白；（3）涉及CRC的开始和进展；（4）报告为对CRC具有预后性；（5）预测或影响对CRC化疗的肿瘤反应；（6）在正常和恶性的CRC组织之间差异表达。
针对通过NCBI Entrez核苷酸数据库访问的每个基因和共有序列，确定了合适的mRNA参考序列（REFSEQ）登录号。RT-PCR引物和探针通过Applied Biosystems设计。扩增子的大小保持最小，并且大多数的长度小于100个碱基。
对于每个病例，在独立的胃肠病理学家验证FFPE恶性组织并将其定位于H&E染色载玻片上之后，使用一次性解剖刀将固定于独立的载玻片的相应未染色肿瘤组织刮除到不含RNA酶的微量离心管中。用二甲苯将组织脱蜡并且使用RecoverAllTM总核酸分离试剂盒（Total Nucleic AcidIsolation Kit）（Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX）提取并纯化RNA。RNA溶液的纯度和量通过使用Nanodrop 1000 UV/Vis分光光度计测量260/280nm处的UV吸收比来确定。使用高性能cDNA逆转录试剂盒（HighCapacity cDNA Reverse Transcription Kit）（Applied Biosystems），采用随机六聚体作为引物，将至少100ng的RNA转录为单链cDNA。cDNA立即用于进行RT-PCR或者将其储存在-80℃下。
使用TaqMan
Figure BDA00003722529800141
定制阵列384孔微流体卡（custom array 384-wellmicrofluidic cards）（Applied Biosytems），通过实时PCR分析了基因表达。在将100μl cDNA（1ng/μl）每48个孔施加到卡上之后，使用7900HT快速实时PCR系统（Fast Real-Time PCR System）一式两份地进行所有的分析。输出数据为达到在扩增曲线上设置为0.2的恒定阈值所需要的PCR循环数，即循环阈值（Ct）。使用5个管家（HK）基因将数据归一化从而校正潜在的技术可变性和在每个分析中的RNA完整性以及量的偏差。在众所周知的在CRC和其他组织中构成性（constitutively）表达的9个候选基因中，选择的5个HK基因（B2M、GUSB、POLR2L、PSMB6、UBC）显示了最低水平的表达可变性。对每对个体基因表达复制数的一致性进行了检查并且生成了各自的相关系数。对复制数求平均值并且通过从5HK基因的平均值（Ave.5HK Ct）中减去每个规则基因的Ct（RG Ct）使所产生的数据归一化。由于Ct值被表示为底数为2的对数，因此通过取反对数使数据线性化，并且结果被扩大100倍。因此，数据的最终形式为：
基因表达值=2(Ave.5HK Ct-RG Ct)×100。
在整个研究中，以下是接受提取的RNA和RT-PCR结果的最低标准：（1）RNA浓度：≥10ng/μl；（2）要求RNA的260/280比≥1.8；（3）5个HK基因的平均表达：≤32.0Ct；以及（4）所有个体Ct值：≤35。
表2
Figure BDA00003722529800142
Figure BDA00003722529800151
实施例2：用于经遗传编程确定结肠直肠癌复发风险的规则的生成
基于生物标记基因的表达水平，使用训练集基因表达数据的连续遗传编程（GP）分析对实施例1中确定的预后生物标记基因进行了分析，以用于进化预后规则。以下显示的这些规则在预测验证数据集中的结肠直肠癌患者是否会经历复发或不复发中是有用的。
在确定的预后生物标记基因的遗传编程分析中随机生成了包括表2基因的多种组合的潜在规则群体，从而产生一组候选规则。然后，对每个候选规则的适应度进行了测试。
正确分类为“复发”与“不复发”的肿瘤组织样本的数量用作候选规则的适应度测量值。在另一个实例中，灵敏度和特异性的总和或者阳性可预测性、阴性可预测性等的总和被用作适应度的度量。在另一个实例中，受试者工作曲线（ROC）的曲线下面积（AUC）被用作适应度的度量。如果发现判定为具有足够高适应度的候选规则，则终止遗传编程，并且将最适合的候选者选择作为预后规则。如果不符合终止标准，则对具有最高适应度的候选规则进行配对以产生新的后代候选规则群体，并且丢弃发现具有较低适应度的候选规则。
进行遗传编程方法的另外的迭代直到符合终止标准并且发现合适适应度的一种或多种规则。在表2的基因的连续GP分析之后，输入数据产生预测复发的预后特征规则（参见表3）。
表3
Figure BDA00003722529800161
实施例3：预后GP规则用于预测复发的用途
将表3的规则用于预测结肠直肠癌患者的复发。对于来自2个美国地点和2个欧洲地点的86例I/II期（pT1-4 pN0 M0）结肠癌患者和29例I期（pT1-2,pN0 M0）直肠癌患者，取回在具有根治性目的初始手术切除时获得的存档福尔马林固定、石蜡包埋的原发性腺癌组织（中值储存7年，范围4-15年）。这些地点和样本与如以上实施例1和2所描述的用于生成分子测试的那些样本不同。
所获得的样本包括那些来自在手术36个月内具有肿瘤复发（R）的患者（n=46）和那些来自在手术后至少36个月证实不复发（NR）的患者（n=69）。没有患者接受新辅助疗法或辅助疗法。
使用得自APPLIED BIOSYSTEMS的定制384孔TAQMAN
Figure BDA00003722529800163
低密度阵列并且使用符合一套严格质量控制参数的RNA，通过qRT-PCR评估了这些样本中肿瘤基因的表达。5个查询基因中的每一个的TAQMAN
Figure BDA00003722529800164
分析数量和探针长度显示在以下表4中：
表4
Figure BDA00003722529800162
对于结肠直肠癌，在该患者数据集（VSet）中分析了规则1的预测灵敏度和特异性并且与使用当前的美国国家综合癌症网络（NCCN）所获得的预测灵敏度和特异性进行比较。对于I/II期CRC（n=115），二歧规则（dichotomous rule）正确地对具有70%灵敏度和55%特异性的32/46R和38/69NR VSet患者进行了分类。那些被认为“高风险”的患者在36个月内比那些标记为“低风险”的患者具有显著更高的复发概率，且阳性预测值（PPV）为51%、阴性预测值（NPV）为73%以及相对危险度（HR）为2.06（95%CI:1.1至3.86；p=0.020）。
相比之下，在具有72%灵敏度和42%特异性，阳性预测值为45%和阴性预测值为69%的该群体中，NCCN指南（1.2011版）不能区分36个月复发与不复发。风险比（hazard ratio）为1.38（95%CI:0.73-2.53,p=0.315）。分子测试的特异性显著高于NCCN的特异性（p=0.05）。
对于I期直肠癌患者（n=29，13例复发），分子测试的预后准确度显示79%特异性（23/29），超过了NCCN指南的55%特异性（16/29）。
在该实施例中，预后规则衍生自预后生物标记基因，所述生物标记基因确定为在FFPE肿瘤组织中对通过基因表达水平的遗传编程分析来确定结肠直肠癌复发和/或不复发是重要的，与目前的NCCN指南相比，能够更好的区分在3年内处于复发的高风险与低风险的早期CRC患者。
实施例4：用于预测复发的预后GP规则的用途。
如上所述，使用遗传编程来确定预后生物标记基因（实施例1）并且来生成用于确定结肠直肠癌复发的风险的预后规则（实施例2和3）。由于在表2中列出的预后生物标记基因的表达水平对结肠直肠癌复发具有高度预测性，我们假设基于这些预后生物标记基因的表达，预后规则也可以使用非GP分析方法来生成。
为了证实其他分析方法的有用性，也可以使用分类和回归树（Classification and Regression Tree，CART）算法（Freund等人1999,Thealternating decision tree learning algorithm）来生成由表2中列出的生物标记基因的表达得到的预后规则。
为了进一步证实预后生物标记基因在通过多种分析技术生成的预后规则中的用途，可以使用表2中列出的基因的表达数据和已知复发和不复发的Tset数据来生成支持向量机（参见，例如Mocellin等人2003 Ann Surg Oncol.200613:1113-1122）。通过系数和向量生成的支持向量机用于对训练集（Tset）进行4倍交叉验证分析从而测试分类器的稳健性。使分类器在3倍上进行训练并且对第四个测试准确度。以单精度（%）和总精度（4倍平均值）（%）报告分析。使用由SVM发展的规则测试验证集（Vset）产生了报告的精度（%）。
为了进一步证明预后生物标记基因在通过多种分析技术产生的预后规则中的用途，可以使用表2中列出的基因的定量表达数据和已知的复发和不复发的Tset数据生成支持向量机（参见，例如Mocellin等人2003 Ann SurgOncol.2006 13:1113-1122）。通过系数和向量生成的支持向量机用于对训练集（Tset）进行4倍交叉验证分析从而测试分类器的稳健性。使分类器在3倍上进行训练并且对第四个测试准确度。
为了进一步证实表2中列出的预后生物标记基因的高度预测功效，使用线性判别分析（参见，例如Marchevsky等人,2004 JMD,Vol.6:1Estévez等人，2004,Eur Clin Nutr 58:449-455）生成了基于表2中列出的基因的定量表达来预测结肠直肠癌复发的可能性的预后规则。
线性判别（LD）分析使用每个基因的个体测量值和基因的所有组合的计算的测量值两者来将样本分类为两组。对于每个基因，从第1组和第2组两组的平均值和标准偏差中得到权重。每个基因乘以权重并且这些值的总和得到共同的判别评分。然后，针对第1组和第2组两组的共同形心（centroid）比较该判别评分。这些形心分别是所有第1组和第2组样本的平均值。因此，每个基因对总体预测都有贡献。这种贡献取决于权重，如果对于该基因来说第1组和第2组样本之间的相对距离大，则所述权重是大的正数或负数，并且如果相对距离小，则所述权重是小数目。对于每个未知样本的判别评分和形心值可以用于计算零和一之间的概率作为未知样本所属的那一组。
在本发明另一个实施方案中，除了表1中列出的那些之外的基因用于生成基因表达谱。
实施例5：使用RT-PCR方法生成I/II期结肠直肠原发性腺癌组织的基因表达谱。
对于来自1个美国地点（罗切斯特MN;n=45）和2个独立的欧洲地点（莫斯科，俄罗斯联邦）的60例结肠癌（AJCC pT1-4 pN0 cM0）患者和14例直肠癌（AJCC pT2-3 pN0 cM0）患者，取回在具有根治性目的的初始外科手术切除时获得的七十四（74）个存档的、临床注释的、福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）的原发性腺癌组织（R0）。没有患者接受新辅助疗法或辅助疗法。对于每例患者，通过由现场人员评估的医学记录来证实三十六（36）个月的R和NR状态。获得所有患者的知情同意。
在通过复发状态、到第一次复发的时间、结肠癌与直肠癌、R-侧结肠与L-侧结肠以及组织来源分层之后，将74例患者随机分配到训练集（n=37;16R,21NR）和规模相同的测试集（n=37;16R,21NR）中。
为了构建定制的集中微阵列，使用定制的384孔TaqMan
Figure BDA00003722529800191
低密度阵列（Low Density Arrays）（Applied Biosystems,Foster City,CA），通过RT-PCR评估了肿瘤基因表达。对于阵列，基于417个癌症相关基因符合以下标准中的一个或多个而针对阵列预选择了所述417个癌症相关基因的板：（1）与肿瘤发生、肿瘤进展或转移相关；（2）编码细胞周期进展、血管生成、存活或细胞凋亡中关键的调控蛋白；（3）涉及到CRC的开始和进展；（4）报告为对CRC具有预后性；（5）预测或影响对CRC化疗的肿瘤反应；（6）在正常和恶性的CRC组织之间差异表达。
针对通过NCBI Entrez核苷酸数据库访问的每个基因和共有序列，确定了合适的mRNA参考序列（REFSEQ）登录号。RT-PCR引物和探针通过Applied Biosystems设计。扩增子的大小保持最小，并且大多数的长度小于100个碱基。
对于每个病例，在独立的胃肠病理学家验证FFPE恶性组织并将其定位于H&E染色载玻片上之后，使用一次性解剖刀将固定于独立的载玻片的相应未染色肿瘤组织刮除到不含RNA酶的微量离心管中。用二甲苯将组织脱蜡并且使用RecoverAllTM总核酸分离试剂盒（Total Nucleic AcidIsolation Kit）（Applied Biosystems/Ambion,Austin,TX）提取并纯化RNA。RNA溶液的纯度和量通过使用Nanodrop 1000 UV/Vis分光光度计测量260/280nm处的UV吸收比来确定。使用高性能cDNA逆转录试剂盒（Applied Biosystems），使用随机六聚体作为引物，将至少100ng的RNA转录为单链cDNA。cDNA立即用于进行RT-PCR或者将其储存在-80℃下。
使用TaqMan
Figure BDA00003722529800192
定制阵列384孔微流体卡（custom array 384-wellmicrofluidic cards）（Applied Biosytems），通过实时PCR分析了基因表达。在将100μl cDNA（1ng/μl）每48个孔施加到卡上之后，使用7900HT快速实时PCR系统（Fast Real-Time PCR System）一式两份地进行所有的分析。输出数据为达到在扩增曲线上设置为0.2的恒定阈值所需要的PCR循环数，即循环阈值（Ct）。使用5个管家（HK）基因将数据归一化从而校正潜在的技术可变性和在每个分析中的RNA完整性以及量的偏差。在众所周知的在CRC和其他组织中构成性表达的9个候选基因中，选择的5个HK基因（B2M、GUSB、POLR2L、PSMB6、UBC）显示了最低水平的表达可变性。对每对个体基因表达复制数的一致性进行了检查并且生成了各自的相关系数。对复制数求平均值并且通过从5HK基因的平均值（Ave.5HK Ct）中减去每个规则基因的Ct（RG Ct）使所产生的数据归一化。由于Ct值被表示为底数为2的对数，因此通过取反对数使数据线性化，并且结果被扩大100倍。因此，数据的最终形式为：
基因表达值=2(Ave.5HK Ct-RG Ct)×100。
在整个研究中，以下是接受提取的RNA和RT-PCR结果的最低标准：（1）RNA浓度：≥10ng/μl；（2）要求RNA的260/280比≥1.8；（3）5个HK基因的平均表达：≤32.0Ct；以及（4）所有个体Ct值：≤35。
通过本文所描述的RT-PCT分析确定了在R和NR组之间表现差异表达水平的感兴趣基因并且与位于人类基因组上的参考序列一起显示于表5中，所述参考序列如在通过因特网可获得的U.C.S.C.基因组浏览器（browser）中列出的以及从通过因特网可获得的基因库（GenBank）中获得的代表性核酸序列。在此将所确定的U.C.S.C.Browser和GenBank中的序列引入作为参考。
表5
Figure BDA00003722529800201
Figure BDA00003722529800211
实施例6：通过遗传编程生成用于确定结肠直肠癌复发的风险的规则。
基于生物标记基因的表达水平，使用训练集基因表达数据的连续遗传编程（GP）分析对实施例5中确定的预后生物标记基因进行了分析，以用于进化预后规则。以下显示的这些规则在预测验证数据集中结肠直肠癌患者是否会经历复发或不复发中是有用的。
在确定的预后生物标记基因的遗传编程分析中随机生成了包括表5基因的多种组合的潜在规则群体，从而产生一组候选规则。然后，对每个候选规则的适应度进行了测试。
正确分类为“复发”与“不复发”的肿瘤组织样本的数量用作候选规则的适应度测量值。如果发现判定为具有足够高适应度的候选规则，则终止遗传编程，并且将最适合的候选者选择作为预后规则。如果不符合终止标准，则对具有最高适应度的候选规则进行配对以产生新的后代候选规则群体，并且丢弃发现具有较低适应度的候选规则。
进行遗传编程方法的另外的迭代直到符合终止标准并且发现合适适应度的一种或多种规则。在表5的基因的连续GP分析之后，输入数据产生预测复发的预后特征规则（参见表6）。
表6
Figure BDA00003722529800221
Figure BDA00003722529800231
实施例7：用于预测复发的预后GP规则的用途
将表6的规则用于预测结肠直肠癌患者的复发。对于来自2个美国地点和2个欧洲地点的86例I/II期（pT1-4 pN0 M0）结肠癌患者和29例I期（pT1-2,pN0 M0）直肠癌患者，取回在具有根治性目的最初手术切除时获得的存档福尔马林固定、石蜡包埋的原发性腺癌组织（中值储存7年，范围4-15年）。这些地点和样本与如以上实施例5和6所描述的用于生成分子测试的那些样本不同。
所获得的样本包括那些来自在手术36个月内具有肿瘤复发（R）的患者（n=46）和那些来自在手术后至少36个月证实不复发（NR）的患者（n=69）。没有患者接受新辅助疗法或辅助疗法。
使用得自APPLIED BIOSYSTEMS的定制384孔TAQMAN
Figure BDA00003722529800233
低密度阵列并且使用符合一套严格质量控制参数的RNA，通过qRT-PCR评估了这些样本中肿瘤基因的表达。23个查询基因中的每一个的TAQMAN
Figure BDA00003722529800234
分析数量和探针长度显示在以下表7中：
表7
Figure BDA00003722529800232
对于结肠直肠癌，在该患者数据集（VSet）中分析了规则1至8的预测灵敏度和特异性并且与使用当前的美国国家综合癌症网络（NCCN）所获得的预测灵敏度和特异性进行比较。对于I/II期CRC（n=115），二歧规则正确地对具有70%灵敏度和55%特异性的32/46 R和38/69 NR VSet患者进行了分类。那些被认为‘高风险’的患者在36个月内比那些标记为‘低风险’的患者具有显著较高的复发概率，且阳性预测值（PPV）为51%、阴性预测值（NPV）为73%以及相对危险度（HR）为2.06（95%CI:1.1至3.86；p=0.020）。
相比之下，在具有72%灵敏度和42%特异性，阳性预测值为45%和阴性预测值为69%的该群体中，NCCN指南（1.2011版）不能区分36个月复发与不复发。风险比为1.38（95%CI:0.73-2.53,p=0.315）。分子测试的特异性显著高于NCCN的特异性（p=0.05）。
对于I期直肠癌患者（n=29，13例复发），分子测试的预后准确度显示79%特异性（23/29），超过了NCCN指南的55%特异性（16/29）。
在该实施例中，预后规则衍生自生物标记基因，所述生物标记基因确定为在FFPE肿瘤组织中对通过基因表达水平的遗传编程分析来确定结肠直肠癌复发和/或不复发是重要的，与目前的NCCN指南相比，能够更好的区分在3年内处于复发的高风险与低风险的早期CRC患者。
实施例8：用于预测复发的预后GP规则的用途
如上所述，使用遗传编程来确定预后生物标记基因（实施例5）并且来生成用于确定结肠直肠癌复发的风险的预后规则（实施例6和7）。由于在表5中列出的预后生物标记基因的表达水平对结肠直肠癌复发具有高度预测性，我们假设基于这些预后生物标记基因的表达，预后规则也可以使用非GP分析方法来生成。
为了证实其他分析方法的有用性，也可以使用分类和回归树（Classification and Regression Tree，CART）算法（Freund等人1999,Thealternating decision tree learning algorithm）来生成由表5中列出的生物标记基因的表达得到的预后规则。
为了进一步证实预后生物标记基因在通过多种分析技术生成的预后规则中的用途，可以使用表5中列出的基因的表达数据和已知复发和不复发的Tset数据来生成支持向量机（参见，例如Mocellin等人2003 Ann Surg Oncol.2006 13:1113-1122）。通过系数和向量生成的支持向量机（SVM）用于对训练集（Tset）进行4倍交叉验证分析从而测试分类器的稳健性。使分类器在3倍上进行训练并且对第四个测试准确度。以单精度（%）和总精度（4倍平均值）（%）报告分析。使用由SVM发展的规则测试验证集（Vset）产生了报告精度（%）。
为了进一步证实预后生物标记基因在通过多种分析技术产生的预后规则中的用途，可以使用表5中列出的基因的定量表达数据和已知复发和不复发的Tset数据生成支持向量机（参见，例如Mocellin等人2003 Ann SurgOncol.2006 13:1113-1122）。通过系数和向量生成的支持向量机用于对训练集（Tset）进行4倍交叉验证分析从而测试分类器的稳健性。使分类器在3倍上进行训练并且对第四个测试准确度。
为了进一步证实表5中列出的预后生物标记基因的高度预测功效，使用线性判别分析（参见，例如Marchevsky等人,2004 JMD,Vol.6:1Estévez等人，2004,Eur Clin Nutr 58:449-455）生成了基于表5中列出的基因的定量表达来预测结肠直肠癌复发的可能性的预后规则。
线性判别（LD）分析使用每个基因的个体测量值和基因的所有组合的计算的测量值两者来将样本分类为两组。对于每个基因，从第1组和第2组两组的平均值和标准偏差中得到权重。每个基因乘以权重并且这些值的总和得到共同的判别评分。然后，针对第1组和第2组两组的共同形心比较该判别评分。这些形心分别是所有第1组和第2组样本的平均值。因此，每个基因对总体预测都有贡献。这种贡献取决于权重，如果对于该基因来说第1组和第2组样本之间的相对距离大，则所述权重是大的正数或负数，并且如果相对距离小，则所述权重是小数目。对于每个未知样本的判别评分和形心值可以用于计算零和一之间的概率作为未知样本所属的那一组。
从详细的说明书中可以明显看出本发明的许多特征和优点，因此所附的权利要求意图涵盖落入本发明的真实精神和范围之内的本发明的所有这样的特征和优点。此外，由于许多修改和改变对于本领域技术人员来说很容易进行，因此不期望将本发明限制在所示出和描述的精确的结构和操作中，因此，所有适合的修改和等同物将落入本发明的范围内。
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Claims (19)

1.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的分析系统，所述分析系统适合用于对患者样本的预后基因谱的定量表达进行分析，所述预后基因谱与结肠直肠癌复发相关，所述谱包括SEQ ID NOS：1、2、3、4和5的核酸序列的表达。
2.根据权利要求1所述的分析系统，所述系统适合用于分析SEQ IDNOS：1、2、3、4和5的核酸序列的定量表达。
3.根据权利要求1所述的分析系统，所述系统还适合用于定量分析SEQ ID NOS：6至23中的至少一个核酸序列的表达。
4.一种装置，所述装置包括权利要求1所述的分析系统。
5.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的分析系统，所述分析系统包括：计算机软件，所述计算机软件被设计用于将从患者的样本获得的基因表达数据应用于预后规则：如果[(((SEQ ID NO 1/SEQ IDNO 3)X SEQ ID NO 5)-((SEQ ID NO 2/SEQ ID NO 4)X SEQ ID NO 3))≥-4.4777]，那么复发。
6.一种装置，所述装置包括权利要求5所述的分析系统。
7.一种装置，所述装置包括权利要求6所述的分析系统和权利要求5所述的分析系统。
8.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的分析系统，所述分析系统包括：计算机软件，所述计算机软件被设计用于将从患者的样本获得的基因表达数据应用于预后规则：如果规则使用SEQ IDS1-23，那么复发。
9.一种装置或试剂盒，包括：
a）经分离和纯化的多核苷酸，所述多核苷酸至少代表SEQ ID NOS：1、2、3、4和5中每一个核酸序列的编码序列；
b）SEQ ID NOS：1、2、3、4和5中每一个核酸序列的经分离的RNA、cDNA、或gDNA分子；
c）a）或b）的互补物或部分；
d）设计用于扩增a）、b）或c）的扩增探针；或者
e）设计用于分析a）、b）或c）的表达的杂交探针；并且
其中，所述装置或试剂盒适合用于测定结肠直肠癌复发的风险。
10.一种基质，所述基质包含探针，所述探针适合用于预后结肠直肠癌基因谱的表达的定量分析，所述基因谱包含SEQ ID NOS：1、2、3、4和5的核酸序列。
11.一种结肠直肠癌预后核酸微阵列，所述微阵列包括权利要求10所述的基质。
12.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发风险的方法，所述方法包括：
a）向权利要求5所述的分析系统提供患者的预后结肠直肠癌基因谱中每一个基因的确定的表达水平，所述基因谱含有SEQ ID NOS：1、2、3、4和5的核酸序列；
b）将患者的确定的基因表达水平应用于分析系统中的规则；和
c）如果应用于规则的患者的基因表达水平的分析结果大于或等于-4.4777，则预测患者结肠直肠癌复发的风险相对较高。
13.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的分析系统，所述分析系统包括：计算机软件，所述计算机软件被设计用于将从患者的样本获得的定量基因表达数据应用于预后规则，所述预后规则得自结肠直肠癌预后基因谱，所述预后基因谱由SEQ ID NOS：1、2、3、4和5的核酸序列的全部或子集组成。
14.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发风险的方法，所述方法包括：
a）向权利要求13所述的分析系统提供患者的预后结肠直肠癌基因谱中每一个基因的确定的表达水平，所述基因谱含有SEQ ID NOS：1、2、3、4和5或者衍生规则的子集的核酸序列；
b）将患者的确定的基因表达水平应用于分析系统中的规则；和
c）如果应用于规则的患者的基因表达水平的分析结果大于或等于-4.4777，则预测患者结肠直肠癌复发的风险相对较高。
15.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发和/或不复发的分析系统，所述系统适合用于对患者样本的预后基因谱的定量表达进行分析，所述预后基因谱与结肠直肠癌复发相关，所述谱包括SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19的核酸序列的表达。
16.根据权利要求15所述的分析系统，所述分析系统适合用于预测患者结肠直肠癌的复发和/或不复发，所述分析系统包括计算机软件，所述计算机软件被设计用于将从患者的样本获得的基因表达数据应用于一种或多种预后规则，所述预后规则包括：
1如果[(((SEQ ID 1/SEQ ID 3)*SEQ ID 5)-((SEQ ID 2/SEQ ID 4)*SEQ ID 3))≥-4.4777]那么复发；
2如果[((SEQ ID 6*SEQ ID 1)*(SEQ ID 4/SEQ ID 18))]>=90.169556那么复发；
3如果[((SEQ ID 14/SEQ ID 8)*(SEQ ID 6/SEQ ID 3))]>=0.087297那么复发；
4如果[((SEQ ID 6/SEQ ID 19)*(SEQ ID 4/SEQ ID 10))]>=7.500713那么复发；
5如果[((SEQ ID 6/SEQ ID 2)*(SEQ ID 4/SEQ ID 10))]>=14.345780那么复发；
6如果[(SEQ ID 7/(SEQ ID 18*(SEQ ID 8/SEQ ID 14)))]>=0.049082那么复发；
7如果[((SEQ ID 6/SEQ ID 3)*(SEQ ID 1/SEQ ID 14))]>=0.305097那么复发；和
8如果[((SEQ ID 6*SEQ ID 4)*(SEQ ID 14/SEQ ID 18))]>=110.769318那么复发。
17.一种装置，所述装置包括：
a）经分离和纯化的多核苷酸，所述多核苷酸至少代表SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19中每一个核酸序列的编码序列；
b）SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19中每一个核酸序列的经分离的RNA、cDNA、或gDNA分子；
c）a）或b）的互补物或部分；
d）设计用于扩增a）、b）或c）的扩增探针；或者
e）设计用于分析a）、b）或c）的表达的杂交探针；并且
其中，所述装置适合用于测定结肠直肠癌复发的风险。
18.一种试剂盒，所述试剂盒包括：
a）经分离和纯化的多核苷酸，所述多核苷酸至少表示SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19中每一个核酸序列的编码序列；
b）SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19中每一个核酸序列的经分离的RNA、cDNA、或gDNA分子；
c）a）或b）的互补物或部分；
d）设计用于扩增a）、b）或c）的扩增探针；或者
e）设计用于分析a）、b）或c）的表达的杂交探针；并且
其中，所述试剂盒适合用于测定结肠直肠癌复发的风险。
19.一种用于预测患者中的结肠直肠癌复发风险的方法，所述方法包括：
a）提供分析系统，从而预测患者中结肠直肠癌的复发和/或不复发，所述分析系统适合用于对患者样本的预后基因谱的定量表达进行分析，所述预后基因表达谱与结肠直肠癌复发相关，所述谱包括SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、10、14、18和19的核酸序列的表达；
b）将患者的确定的基因表达水平应用于一种或多种预后规则；所述预后规则包括：
1如果[(((SEQ ID 1/SEQ ID 3)*SEQ ID 5)-((SEQ ID 2/SEQ ID 4)*SEQ ID 3))≥-4.4777]那么复发；
2如果[((SEQ ID 6*SEQ ID 1)*(SEQ ID 4/SEQ ID 18))]>=90.169556那么复发；
3如果[((SEQ ID 14/SEQ ID 8)*(SEQ ID 6/SEQ ID 3))]>=0.087297那么复发；
4如果[((SEQ ID 6/SEQ ID 19)*(SEQ ID 4/SEQ ID 10))]>=7.500713那么复发；
5如果[((SEQ ID 6/SEQ ID 2)*(SEQ ID 4/SEQ ID 10))]>=14.345780那么复发；
6如果[(SEQ ID 7/(SEQ ID 18*(SEQ ID 8/SEQ ID 14)))]>=0.049082那么复发；
7如果[((SEQ ID6/SEQ ID 3)*(SEQ ID 1/SEQ ID 14))]>=0.305097那么复发；和
8如果[((SEQ ID 6*SEQ ID 4)*(SEQ ID 14/SEQ ID 18))]>=110.769318那么复发；以及
c）根据应用的一种或多种预后规则，预测患者中的结肠直肠癌复发的风险。
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