CN117881798A - 检测kdm1a失活用于诊断内分泌紊乱 - Google Patents

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I·波尔多
F·沙瑟卢
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Montreal University Medical Center
Paris Thackeray, University of
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Assistance Publique Hopitaux de Paris APHP
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Abstract

本发明结果显示KDM1A是在产生激素的腺体中GIP受体以及可能来自G蛋白偶联受体家族的其他受体的组织特异性表达的关键表观遗传调节因子，其改变导致发展出在位激素受体的异常过表达或异位激素受体的表达，这导致类固醇生成异常。他们还证明，KDM1A不表达可能是引发异常细胞增殖的起始事件，这导致肾上腺以及可能在其他内分泌组织(尤其是肾上腺)中发展出组织病变。因此，本发明提出检测受试者基因组中KDM1A表达的改变，以便诊断出对内分泌疾病和/或内分泌增生的遗传易感性。另一方面，目前的结果表明，胰腺中的生理性在位GIP受体表达也可能受到KDM1A的表观遗传调节。KDM1A抑制剂可以在药理学上靶向该表达，从而治疗患有糖尿病和其他代谢性疾病的患者。

Description

检测KDM1A失活用于诊断内分泌紊乱
背景技术
原发性双侧肾上腺大结节增生(PBMAH)是一种生长速度非常缓慢的肾上腺良性病变。这种增生是在有皮质醇过量的临床症状的患者中诊断出来的，通常是在成年后期——通常是在一生中五十多或六十多岁的时候。
还有一些患者的疾病诊断，在临床上并无明显的皮质醇增多症表型，但是在腹部CT扫描中偶然发现肾上腺增大。在普通人群中，有0.4-5％可观察到肾上腺偶发瘤，10-15％的病例为双侧(主要对应于PBMAH)。事实上，普通人群中PBMAH的确切患病率尚不清楚，而且患病率取决于诊断标准。
PBMAH可能是造成垂体促肾上腺皮质激素依赖性皮质醇过多和库欣综合征的原因1。这些双侧偶发瘤中有约35％被诊断为库欣综合征。在PBMAH患者中库欣综合征通常是轻微且隐匿的，即使可能会遇到严重的形式。
库欣综合征可导致多种症状，包括向心性肥胖、高血压、心血管疾病、神经精神疾病、骨质疏松症、葡萄糖不耐受或糖尿病。这些后果会导致生活质量严重受损，如果不及时治疗，还会导致死亡率增加。一些研究表明，尽管治愈了皮质醇过多的情况，但仍然存在显著的发病率，并且即使在治愈的患者中，由于长期暴露于皮质醇过多的后果，寿命也会缩短(Clayton RN等人，201635，Drougat等人，201536)。
因此，有必要确定减少皮质醇过量持续时间的策略。考虑到库欣综合征的罕见性以及非专科医生筛查和诊断的困难，库欣综合征的早期诊断非常具有挑战性。
因此，在这种情况下，迫切需要找到诊断工具，以便能够在库欣综合征患者以不可逆转的方式暴露于过量皮质醇之前检测出患有库欣综合征的患者。
有人认为，库欣综合征在某些情况下是由基因改变引发的，这可以有助于更早地诊断这些患者。例如，研究表明，cAMP/蛋白激酶A(PKA)信号传导通路的作用物(actor)或引起遗传性家族性肿瘤综合征的基因(包括腺瘤性息肉病大肠杆菌基因(APC)、menin(MEN1)和延胡索酸水合酶(FH))可以有利于或负责发展出PBMAH，但这些病例非常罕见。此外，ARMC5(含有犰狳重复序列的蛋白5)基因突变已被确定为散发性或家族性PBMAH的常见原因。结合迄今为止报告的所有ARMC5研究，在明显散发性的PBMAH患者中约25-35％总共鉴定出29种生殖系和32种体细胞致病性突变(Drougat等人，201536)。
PBMAH中ARMC5的失活遵循导致遗传性肿瘤综合征的肿瘤抑制基因的“二击(two-hit)”模型。就ARMC5而言，该模型表明，肾上腺皮质的细胞在生殖系ARMC5突变之后继发失去控制，导致发展出结节性增生。
尽管第一个被发现频繁参与PBMAH的基因是ARMC5，但仅在约三分之一的PBMAH患者中观察到ARMC5生殖系和继发性体细胞(secondary somatic)失活突变2。换句话说，三分之二的PBMAH成人病例的病因仍未得到解释。
在大部分PBMAH患者中，皮质醇过量是由肾上腺病变中几种G蛋白偶联受体(GPCR)的异常(异位或过度)表达引起的，这种在单侧腺瘤患者中比较少见3。PBMAH中葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体(GIPR)的异位表达可能与逆皮质醇节律相关，即空腹早晨血浆皮质醇浓度较低，进食后血浆皮质醇浓度增加4,5。餐后皮质醇分泌的增加是由GIP诱导的，GIP是一种由肠道K细胞在口服摄入脂质、碳水化合物或蛋白质后产生的肠促胰岛素。异位GIPR的激活与cAMP信号传导功能耦合，引发了肾上腺细胞增殖和过量类固醇产生。导致肾上腺皮质组织中异位GIPR表达的分子事件尚不清楚。最近报告称，在两名GIP依赖性库欣综合征患者的皮质醇分泌腺瘤中，存在包含GIPR位点的体细胞19q13.32微重复与其他染色体区域发生重排8。然而，PBMAH中异位GIPR表达的分子发病机制仍有待阐明。
如果GIP依赖性库欣综合征患者的PBMAH也是遗传起源，那么这些疾病的致病基因仍有待确定。
因此，迫切需要更好地了解GIP依赖性库欣病患者发展出PBMAH的分子机制，从而找出可以解释这些疾病病因的易感遗传因素。
了解此类遗传易感因素将有助于早期诊断PBMAH以及可能与之相关的GIP依赖性库欣综合征。这将有助于防止因长期暴露于皮质醇过量的环境中而导致的严重后果，因此可以转化为有效的治疗和预防方案。
更一般地说，因此需要额外的努力来确定可靠的诊断标记物以识别内分泌肿瘤的遗传易感性，以及确定可靠的标记物用于预测其是否会进展为更严重的疾病。
具体实施方式
为了鉴定遗传易感性因素，本发明人对来自17名患有家族性或散发性GIP依赖性库欣综合征伴PBMAH的患者的血液和肾上腺DNA进行了详尽的测序和拷贝数分析，使用25名患有库欣综合征伴PBMAH且没有食物诱导皮质醇分泌的患者作为对照。通过这样做，他们发现家族性和散发性的GIP依赖性PBMAH伴库欣综合征是一种遗传性疾病，100％的病例都是由赖氨酸去甲基化酶1A(KDM1A)的生殖系失活突变和在肾上腺病变处的第二个KDM1A基因座的系统性杂合缺失引起的。更准确地说，他们在所有17名的GIP依赖性PBMAH伴库欣综合征中鉴定出了KDM1A基因的生殖系杂合截短或移码突变，在受影响患者的肾上腺病变中鉴定出携带KDM1A基因座的1号染色体短臂的复发性缺失(recurrent deletion)。对照组受试者均未表现出任何KDM1A生殖系或体细胞改变。对72名患有垂体生长激素细胞肿瘤的患者进行了研究，没有受试者表现出任何KDM1A致病性变异。然而，通过RT-qPCR定量，21例表现出KDM1A基因座的体细胞缺失和在体细胞中GIPR表达升高，表明该基因可能与该疾病的发病机制有关。
KDM1A编码组蛋白赖氨酸去甲基化酶，属于此类蛋白质的一个更大家族7。组蛋白尾部受到共价修饰，其影响染色质结构和调节因子的募集，从而改变转录。赖氨酸残基的甲基化可能与转录的激活或抑制有关23。KDM1A通过使溶素(lysin)4(H3K4me)上的组蛋白H3去甲基化来抑制转录，溶素4是通常与激活基因转录相关的组蛋白标记23,24。此外，KDM1A还被证明会影响参与肿瘤发生的非组蛋白蛋白(如p53、RB1和STAT3)的甲基化7。这两种机制在GIP依赖性库欣综合征伴PBMAH的发病机制中都很重要。在KDM1A功能丧失之后继发的持续组蛋白甲基化可以导致异常的转录激活，以及KDM1A与致癌蛋白相互作用的缺失，从而导致细胞周期失调，进而是肾上腺肿瘤发生。KDM1A已被描述为参与垂体器官发生过程中的细胞谱系决定和分化(Wang等人，200745)和胰腺内分泌细胞分化(Vinckier等人，202046)进一步展示了其在内分泌疾病发病机制中的含义，但没有证据表明其在肾上腺发育或垂体和胰腺病理学中的特定作用。
本发明人已经证明，用siRNA以及通过使用CRISPR/Cas9技术进行体外药理抑制或沉默KDM1A，导致人肾上腺皮质细胞中GIPR转录物和蛋白质增加。靶向外显子组测序没有检测到已知参与肾上腺肿瘤发生的基因中任何其他分子事件。因此，KDM1A功能的丧失似乎足以诱导内分泌组织，特别是肾上腺细胞中GIPR的表达异常。
类固醇生成可以由在正常束状带细胞中表达水平不显著的异位受体的表达驱动，异位受体如GIPR、β-肾上腺素能受体(b-AR)、加压素(V2-V3-加压素受体)、血清素(5-HT7受体)、胰高血糖素(GCGR)和可能的血管紧张素II(AT1R)的受体。它还可能是由于在位受体的表达增加或在位受体与类固醇生成的偶联增加所致，在位受体如加压素(V1-加压素受体)、LH/人绒毛膜促性腺激素(LHCGR)或血清素(5-HT4受体)的受体37。
具体地，本发明人提出，KDM1A是产生激素的腺体中GIP受体以及可能来自G蛋白偶联受体家族的其他受体的组织特异性表达的关键表观遗传调节因子，KDM1A的改变导致发展出在位激素受体的异常过表达或异位激素受体的表达，这导致类固醇生成异常。他们还证明，KDM1A不表达可能是引发异常细胞增殖的起始事件，这导致肾上腺以及可能在其他内分泌组织(尤其是肾上腺)中发展出组织病变。这些发现使得能够对受影响患者的亲属进行基因检测和咨询，以便更早发现这些疾病并避免过度暴露于异常水平的激素。
因此，本发明人提出检测受试者基因组中的这些遗传异常(突变和LOH)，以便诊断内分泌疾病和/或内分泌增生的遗传易感性。此外，他们建议通过基因疗法恢复KDM1A基因的表达来治疗GIP依赖性PBMAH伴库欣综合征患者。
定义
“内分泌疾病”在本文中是指由于内分泌组织产生过多激素(类固醇或肽)而导致的任何疾病或病症。这种内分泌疾病可能是由于内分泌组织中在位激素受体的过表达，或者是由于内分泌组织中激素受体的异位异常表达所致。内分泌组织是例如甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、胰腺、肠和垂体。
内分泌疾病可能伴随内分泌组织的增殖事件和增生，其中激素受体的过表达或异位表达发生。例如，肾上腺组织中GIPR的异位表达可以促进PBMAH发展。因此，本文中的“内分泌疾病”涵盖内分泌组织病变，包括肾上腺增生、肾上腺髓质脂肪瘤等。具体地，本发明的方法能够诊断(或预测易感性)病症，包括(但不限于)：库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生和肾上腺髓质脂肪瘤。在本发明的上下文中，内分泌疾病优选不影响垂体，因为发明人已证明患有具有GIPR异位表达的生长激素垂体腺瘤的患者没有显示出在KDM1A基因中的任何无效突变。具体地，通过本发明的方法诊断的内分泌疾病优选不是垂体腺瘤或相关疾病。
“激素受体”在本文中是指GIP受体LH/hCG受体、β-肾上腺素能受体、1型血管紧张素II受体、胰高血糖素受体、血清素能受体、加压素受体和参与激素产生的其他GPCR(ElGorayeb EJE 201537中综述)。
例如，这种内分泌疾病是由于肾上腺中GIPR的过表达或异位表达，这一方面可以导致皮质醇的过度产生，从而导致库欣综合征的发作。皮质醇是一种由肾上腺产生的类固醇激素。当释放到血液中时，皮质醇可以作用于身体的许多不同部位，可以帮助身体应对压力或危险，增加身体的葡萄糖代谢，控制血压并减少炎症。
如本文所用，表述“生物样本”是指含有来自受试者的基因组DNA或mRNA或蛋白质的任何样本。所述样本DNA可以包含在所述研究对象的实体组织(例如，来自肾上腺切除术的肾上腺组织活检)、体液和/或排泄物中。所述流体是，例如口腔拭子、精子、血液、血清、血浆或尿液。在优选的实施方案中，生物样本是所述受试者的血液样本、骨髓或脾或皮肤活检、或任何其他细胞。事实上，这样的血液样本可以通过从受试者采集完全无害的血液来获得，因此允许非侵入性诊断。本发明方法中使用的血液样本优选通过常见的红细胞裂解方法去除大部分(如果不是全部)红细胞。对剩余的血细胞进行检测，这些血细胞是白细胞(例如，中性粒细胞、单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性粒细胞等)和血小板。
如本文所用，术语“受试者”是指任何哺乳动物，优选人类。所述受试者可以是当前健康的个体。然而，本发明的方法尤其适用于检测易发展出内分泌疾病(包括但不限于库欣综合征或内分泌病变)的受试者，例如，因为该受试者属于至少有一名成员患有此类疾病的家族。在这种情况下，本发明的方法能够确认所述受试者将发展出此类疾病或易患此类疾病。例如，所述对象的至少一个亲人(兄弟、姐妹、母亲、父亲、祖母、祖父等)携带本发明的KDM1A突变。
“同源性”在本文中是指所定义的序列编码相同的蛋白质，但是由于密码子简并性，它们不完全相同，而是具有序列相似性。语法形式上的“序列相似性”是指所述核酸序列之间的同一性程度或对应性。在优选的实施方案中，待通过本发明的方法检测的同源基因组区域具有与SEQ ID NO:1(对应于NG_047129.1的KDM1A基因的DNA)或SEQ ID NO:2(对应于NM_001009999.3的KDM1A基因的mRNA，编码对应于NP_001009999.1的SEQ ID NO:3的蛋白质)具有至少80％同一性，优选90％同一性，更优选95％同一性的核苷酸序列。
出于本发明的目的，两个核酸序列之间的“同一性百分比”意指在两个序列之间进行最佳比对后获得的相同核苷酸的百分比。该百分比纯粹是统计性的，两个序列之间的差异在其整个长度上是随机分布的。传统上，两个核酸之间的序列比较是通过将这些序列最佳比对后比较这些序列来进行的，所述比较通过片段或通过“比较窗口”进行，以便鉴定和比较序列相似性的局部区域。除了手动比对之外，还可以通过Needleman和Wunsch的整体同源算法(1970)[J.Mol.Biol.48:443]来产生用于比较的序列的最佳比对。同一性百分比的计算方法是确定两个序列之间核苷酸或氨基酸残基相同的相同位置的数量，将该相同位置的数量除以位置总数，将所得结果乘以100从而以获得这两个序列之间的同一性百分比。例如，可以使用网站ebi.ac.uk上可用的needle程序，所使用的参数是默认给出的参数(特别是对于参数“空位开放”：10和“空位延伸”：0.5；选择的矩阵例如是程序提出的“BLOSUM 62”矩阵)，待比较的两个序列之间的同一性百分比由程序直接计算。
“无效突变”在本文中涵盖导致KDM1A蛋白表达缺乏或降低的基因水平的任何突变、或导致KDM1A蛋白活性异常或降低的蛋白水平的任何突变。无效突变对应于在SEQ IDNO:1的原始核酸序列或SEQ ID NO:3的蛋白质序列中的序列中的任何修饰。这些突变包括小规模突变或大规模突变。小规模突变是指影响基因中一个或几个核苷酸的突变，包括点突变、DNA中一个或多个额外核苷酸的插入或缺失。点突变可以是沉默突变、错义突变和无义突变。基因组结构中的大规模突变，如基因重复、缺失或突变，其作用是将之前分离的DNA片段并置，可能将分离的基因聚集在一起形成功能不同的融合基因。这些最后的突变包括染色体易位、间质缺失、染色体倒位和杂合性丧失。在蛋白质水平上，这些突变可以是改变酶活性或者导致异常截短的适时突变(punctual mutation)。
KDM1A编码SEQ ID NO:3的组蛋白赖氨酸去甲基化酶，属于此类蛋白质的一个更大家族7。组蛋白尾部受到共价修饰，影响染色质结构和调节因子的募集，从而改变转录。赖氨酸残基的甲基化可以与转录的激活或抑制有关23。KDM1A通过使溶素4(H3K4me)上的组蛋白H3去甲基化来抑制转录，溶素4是通常与激活基因转录相关的组蛋白标记23,24。
本发明的无效突变优选导致KDM1A蛋白不表达或表达截短的KDM1A蛋白，所述截短的蛋白失去了其组蛋白去甲基化酶功能，更准确地说，失去了其将在溶素4上组蛋白H3去甲基化的能力。它还可能导致非功能性酶的表达，即失去组蛋白去甲基化酶功能的酶。
与来自健康受试者的正常对照样本(血液或内分泌组织样本)相比，本发明涵盖的DNA无效突变优选影响SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的表达水平和/或活性。它们降低了所有组织(如果是生殖系)，特别是内分泌组织(如果是体细胞)中正常表达的KDM1A的数量，或者产生截短的蛋白质或非功能性的蛋白质。检测突变存在的典型技术可能是包括限制性片段长度多态性、杂交技术、DNA测序、核酸外切酶抗性、微测序、使用ddNTP的固相延伸、使用ddNTP的溶液延伸、寡核苷酸连接测定法、检测单核苷酸多态性的方法(如动态等位基因特异性杂交)、连接链反应、小型测序、DNA“芯片”、等位基因特异性寡核苷酸杂交与单标记或双标记探针与PCR或分子信标(beacon)的合并等。
有利地，通过PCR和测序、SNP阵列或CGH检测KDM1A基因的cDNA或DNA上的改变，所有这些技术对于技术人员来说是公知的。
在分子生物学和生物信息学中，SNP阵列是一种用于检测群体内多态性的DNA微阵列。SNP阵列的基本原理与DNA微阵列相同。它们是DNA杂交、荧光显微镜和固体表面DNA捕获的融合。SNP阵列的三个必需部分是：i)包含固定的核酸序列或靶标的阵列；ii)一种或多种标记的等位基因特异性寡核苷酸(ASO)探针；和iii)记录和解释杂交信号的检测系统。
比较基因组杂交(CGH)是一种筛选样本遗传改变的分子细胞遗传学方法。该方法基于荧光目标DNA(通常是荧光素(FITC))和正常DNA(通常是罗丹明或德克萨斯红)与正常人中期制备物的杂交。使用落射荧光显微镜和定量图像分析，可以检测增益/损失与对照DNA的荧光比率的区域差异，用于识别基因组中的异常区域。
具体地，可以通过PCR(以下列出引物)来表征本发明中提出的KDM1A基因的存在。
如本文所用，多肽的“表达不足”或“表达降低”发生在基因的转录和/或翻译受到突变影响，导致生物样本中的表达水平低于用于评估表达的测定标准误差，优选至少比所述基因的正常表达水平低20％，优选至少比所述基因的正常表达水平低50％，最优选至少比所述基因的正常表达水平低100％。换句话说，如果通过常规手段(例如，通过蛋白质印迹)检测到的蛋白质的量比对照样本中相同蛋白质的量低至少20％，优选至少50％，优选至少90％，则检测到KDM1A蛋白质的表达降低。
因此，本发明的方法可以包括将来自受试者的生物样本中KDM1A基因的表达水平与其在对照中的表达水平(即，正常表达水平)进行比较。与正常表达水平相比，受试者生物样本中所述基因的表达水平显著较低表明患者可能患有内分泌疾病。
如本文所用，“对照”优选对应于包含来自健康受试者或来自未患有内分泌疾病的受试者的细胞的对照样本。更优选地，所述对照样本对应于健康受试者的外周血白细胞(PBL)或粒细胞或血小板或任何其他种类的细胞，例如内分泌组织的细胞。基因的“正常”表达水平对应于所述对照样本中所述基因的表达水平。而且，蛋白质的“正常”活性或表达对应于所述对照样本中所述蛋白质的活性或表达。
KDM1A蛋白的表达可以通过任何常规手段来检测，例如通过蛋白印迹、酶免疫测定法(EIA)、放射免疫测定法(RIA)和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
KDM1A蛋白的功能可以通过任何常规方法检测，例如，通过评价其使溶素4上的组蛋白H3去甲基化的能力。
多克隆抗体可以通过用靶蛋白(KDM1A)或其片段(例如，KDM1A蛋白的至少10或15个氨基酸)免疫合适的动物(如小鼠、兔或山羊)进行制备。可以通过标准技术(如使用固定多肽的ELISA)随时间监测免疫动物中的抗体滴度。在免疫后的适当时间，例如当特异性抗体滴度最高时，可以从动物获得产生抗体的细胞，用于通过标准技术制备单克隆抗体(mAb)，如最初由KOHLER和MILSTEIN描述的杂交瘤技术、人B细胞杂交瘤技术、EBV-杂交瘤技术或三体技术。产生杂交瘤的技术是公知的。产生所需单克隆抗体的杂交瘤细胞可以通过筛选在杂交瘤培养物上清液中结合感兴趣多肽的抗体来检测，例如使用标准ELISA。
在本发明的上下文中，如果抗体对肽的亲和常数Ka(其是解离常数的倒数，即1/Kd)高于106M-1，优选高于107M-1，更优选高于109M-1，则称所述抗体“识别”或“结合”所述具有限定序列的肽。此外，在本发明的上下文中，如果抗体对所述肽的亲和常数Ka高于106M-1，优选高于107M-1，更优选高于109M-1，抗体对所有其他肽的亲和常数Ka低于104M-1，则称所述抗体“特异性结合”或“特异性识别”所述肽。
如本文所用，“引物”指可以与靶基因组区域的5'或3'区域(分别是正链和负链，或反之亦然)特异性杂交或退火的分离的核酸分子。一般而言，引物的长度为约10至30个核苷酸，在包含长度为约50至200个核苷酸区域的两端退火。在合适条件下并使用合适试剂，此类引物允许扩增包含引物侧翼的核苷酸序列的核酸分子。由于引物必须成对使用，因此通常被称为“引物对”或“引物组”。
如本文所用，“探针”是能够与感兴趣的(例如，SEQ ID NO:1的)基因组区域特异性杂交的分子。它们可用于突出生物样本中所述基因组区域的存在。这些探针可包含至少一种非天然核苷酸，例如肽核酸(PNA)、具有磷酸基团的肽核酸(PHONA)、桥接核酸或锁核酸(BNA或LNA)和吗啉代核酸。非天然核苷酸还包括化学修饰的核酸或核酸类似物，如甲基膦酸酯型DNA或RNA、硫代磷酸酯型DNA或RNA、氨基磷酸酯型DNA或RNA以及2'-O-甲基型DNA或RNA。
对于某些用途，本发明的探针和引物可以用可检测标记直接或间接标记。这种标记可以是任何类型，取决于要进行的实验。这种标记可以是放射性同位素(如32P、33P、35S、3H或125I)或非放射性实体，其选自配体(如生物素、亲和素或链霉亲和素)、双加氧配基、半抗原、着色剂和发光剂(如辐射发光剂、化学发光剂、生物发光剂、荧光剂或磷光剂)。优选地，使用6-羧基荧光素(FAM)和四甲基罗丹明(TAMRA)。未标记的多核苷酸序列也可以直接用作探针或引物，例如在基于PCR的方法中(例如，在定量PCR中)。
当限定分子不与其靶基因组区域以外的任何其他基因组区域杂交时，观察到“特异性杂交”。优选地，它在高严谨条件下与其靶区域杂交，即，当选择温度和离子强度条件以允许两个互补DNA片段之间杂交时。作为说明，高严谨条件可以如下。DNA-DNA或DNA-RNA杂交分两步进行：(1)在磷酸盐缓冲液(20mM，pH 7.5)中在42℃预杂交3小时，所述磷酸盐缓冲液含有5*SSC(1*SSC相当于0.15M NaCl+0.015M柠檬酸钠溶液)、50％甲酰胺、7％十二烷基硫酸钠(SDS)、10*丹哈特(Denhardt)、5％硫酸葡聚糖和1％鲑鱼精子DNA；(2)在取决于探针大小的温度下实际杂交20小时(即对于大小>100个核苷酸的探针而言为42℃)，随后在2*SSC+2％ SDS中在20℃下洗涤两次，每次20分钟，然后再在0.1*SSC+0.1％ SDS中于20℃下洗涤1次20分钟。对于大小>100个核苷酸的探针，最后在0.1*SSC+0.1％ SDS中于60℃进行洗涤30分钟。根据Sambrook等人,1989的教导，本领域技术人员将针对更大或更小尺寸的寡核苷酸调整上文针对限定大小的多核苷酸描述的高严谨杂交条件。
当使用与靶标区域周围的5'或3'区域特异性杂交的引物时，观察到靶区域(例如，SEQ ID NO:1的)的“特异性扩增”。当使用在感兴趣的基因组区域内特异性杂交的引物时，也可以观察到这种特异性扩增。
本文中使用的术语“体外”和“体外”是等同的，是指使用从通常的宿主生物(如动物或人)中分离出来的生物成分(例如，细胞或细胞群)进行的研究或实验。可以进一步纯化、培养或直接分析此类分离的细胞以评估本发明的突变的存在。例如，这些实验可以简化为在实验室材料(例如管、烧瓶、孔、微量离心管等)中进行实践。相反，术语“体内”是指对整个活生物体进行的研究。
在本发明的范围内，“核酸”是指mRNA、基因组DNA或源自mRNA的cDNA。
如本文所用，术语“试剂盒”是指用于递送材料的任何系统。在反应测定法的背景下，它包括允许储存、从一个位置到另一个位置运输或递送反应试剂(例如，在适当容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持材料(例如，缓冲液、执行该测定法的书面说明)的系统。例如，试剂盒包括一个或多个包含相关反应试剂和/或支持材料的附件(例如，盒子)。如本文所用，术语“分装式试剂盒”是指包含两个或更多个单独容器的递送系统，每个容器包含总试剂盒组分的一部分。容器可以一起或分开递送至预期的接受者。例如，第一个容器可以包含用于测定的酶，而第二个容器包含寡核苷酸。术语“分装式试剂盒(fragmented kit)”旨在涵盖受《联邦食品、药品和化妆品法》第520(e)条管制的含有特定分析试剂(ASR)的试剂盒，但并不限于此。事实上，任何包含两个或更多个单独容器(每个容器包含总试剂盒组分的一部分)的递送系统都包括在术语“分装式试剂盒”中。相反，“组合试剂盒”是指在单个容器中包含反应测定的所有组分的递送系统(例如，在单个盒子中容纳每种期望的组分)。术语“试剂盒”包括分装式试剂盒和组合试剂盒。
预测内分泌疾病易感性的方法
研究发现，肾上腺组织中组蛋白去甲基化酶KDM1A蛋白功能丧失导致GIPR在肾上腺中异位表达。从未证实GIP受体和任何其他GPCR的组织特异性表达的这种表观遗传调控。
更准确地说，本发明人在此表明，生殖组织和内分泌组织中KDM1A基因表达的缺乏或减少会引发GPCR的异常过度或在位表达，涉及不同内分泌疾病(如伴有PBMAH的GIP依赖性库欣综合征)。因此，他们建议利用KDM1A蛋白表达和/或活性的缺乏或降低作为遗传易感性标记物，对其进行分析以在家族筛查中提高对内分泌疾病的早期诊断。
因此，在第一个方面，本发明涉及一种用于在需要其的受试者中鉴定对内分泌疾病的遗传易感性的体外方法，所述方法包括分析来自所述受试者的生物样本的步骤，以检测所述样本中KDM1A基因的生殖系无效突变的存在和/或KDM1A蛋白的异常表达或活性。
更具体地，该方法可以包括以下步骤：
(i)检测所述受试者的生物样本中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的KDM1A基因或其片段中是否存在生殖系无效突变，和/或
(ii)在所述受试者的生物样本中，例如通过蛋白质印迹检测具有SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的异常表达或活性。
如果在KDM1A基因或其片段中检测到杂合生殖系无效突变，或者如果检测到KDM1A蛋白的异常表达或活性，则这表明受试者易患有内分泌疾病，例如库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生或肾上腺髓质脂肪瘤。
在本发明的方法中，术语“生物样本”、“受试者”、“无效突变”和“片段”如上文所定义。所述方法可以涉及如上定义的引物、探针和抗体，以及任何上述技术。
优选地，所述生物样本是血液样本。
SEQ ID NO:1的基因组区域位于1号染色体上，更准确地说位于1号染色体的短臂上。该基因组区域包括KDM1A基因。在优选的实施方案中，本发明方法的分析步骤在受试者的整个基因组DNA上进行，例如通过在用探针捕获感兴趣区域后使用下一代测序。该方法检测到的突变是单核苷酸变异(SNV)、插入/缺失(INDEL)或拷贝数变异(CNV)。在更优选的实施方案中，该分析在1号染色体上进行，甚至更优选在1号染色体的短臂上进行。
在一个优选的实施方案中，在本发明的方法中检测到的KDM1A基因中的生殖系无效突变导致了选自以下的突变：缺失、插入、点突变(如影响剪接位点的突变)、截短突变、移码突变、错义突变和无义突变。
如下文实施例所示，发明人在十名患有PBMAH和GIP依赖性库欣综合征的患者中鉴定出了5个生殖系移码突变、5个生殖系无义突变和1个生殖系剪接突变(图2)。
在优选的实施方案中，KDM1A基因中的所述生殖系无效突变选自：c.1848dupG、c.352-1G>A、c.1309G>T、c.1737_1738insGA、c.2361T>G、c.2441_2445del、c.952C>T、c.811C>T和c.386delA。所述生殖系突变还可以是部分或整个KDM1A基因座的缺失。
在优选的实施方案中，所述KDM1A基因中的生殖系无效突变是整个KDM1A基因座的缺失，其发生在1号染色体的至少一个等位基因上，优选仅发生在1号染色体的一个等位基因上。
优选地，当非内分泌组织样本(如血液样本)中突变的等位基因之间的NGS比率为50％时，鉴定本发明存在生殖系无效突变。
在优选的实施方案中，所述生殖系无效突变导致选自以下的蛋白质突变：(p.Val617GlyfsTer9)、p.(Val617is)、p.Glu437、p(Tyr787Ter)、p.(Gln317)、p.(Asn129fs)、(p.Gln815AspfsTer14)、(p.Asp580GlufsTer11)、(p.Gln318Ter)、(p.Asn129ThrfsTer80)和p.(Arg271Ter)。
可以在任何含有细胞的生物样本中检测到这些生殖系突变，所述细胞包括来自待测受试者的基因组DNA或mRNA或蛋白质。优选地，所述生物样本是血液样本。
旨在检测可能损害或降低KDM1A蛋白表达的杂合生殖系无效突变的分析步骤优选在血液样本中进行。
为了在本发明的方法中有用，无效突变是杂合的就足够了，即仅在1号染色体的两个等位基因之一上发现。
在一个具体实施方案中，待检测的无效突变包括在以下：缺失、插入和点突变，如影响剪接位点的突变、错义突变和无义突变，优选错义突变和无义突变。
所述缺失或插入优选导致KDM1A蛋白不表达或导致KDM1A蛋白表达不足、或导致截短的或无功能的KDM1A蛋白表达，所述截短的或无功能的蛋白已失去其组蛋白去甲基化酶功能。
所述错义突变优选位于编码KDM1A蛋白的开放阅读框中。
所述无义突变优选导致在编码KDM1A蛋白的开放阅读框中引入终止突变。
优选地，所述突变是截短突变或移码突变，其损害KDM1A的赖氨酸去甲基酶活性，更准确地说，损害其使溶素4上的组蛋白H3去甲基化的能力。
为了实施本发明的方法，检测SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因组区域的片段中是否存在无效突变就足够了。所述片段可以含有例如SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的至少10个，更优选至少20个，甚至更优选至少30个连续核苷酸。
本发明的无效突变可以通过分析KDM1A基因或其片段的DNA结构来检测，例如通过细胞遗传学技术，如比较基因组杂交阵列，或使用SNP微阵列的虚拟核型分析，通过下一代测序或通过定量分析PCR。
在以下的示例中，在通过探针(Agilent Sureselect XT方法)捕获感兴趣区域后，使用新一代测序(Ilumina方法)对KDM1A基因进行分析。通过该方法检测到的突变是单核苷酸变异(SNV)、插入/缺失(INDEL)或拷贝数变异(CNV)。已鉴定的异常通过2种技术进行确认：用于SNV/INDEL的PCR和Sanger测序，以及用于CNV的定量PCR(qPCR)。优选地，因此NGS将用于本发明的步骤ii)中(任选地通过PCR确认)。
根据本发明人获得的结果，如之前公开的KDM1A蛋白不表达或表达不足、或者截短的或无功能的KDM1A蛋白表达可能与内分泌疾病相关。
可替选地，因此可以通过分析所述生物样本中KDM1A基因的mRNA的水平和结构来检测本发明的无效突变。与SEQ ID NO:2的mRNA相比，受试者的生物样本中所述基因的mRNA的水平显著较低，或者所述基因的mRNA的显著较短，表明患者可能发展出内分泌疾病。在本发明的该实施方案中，本发明的方法因此需要分析SEQ ID NO:2的mRNA转录物、或如上文定义KDM1A基因的mRNA前体或其片段的表达。
这种分析可以通过从受试者的生物样本制备mRNA/cDNA，将mRNA/cDNA与参考多核苷酸杂交来进行。制备的mRNA/cDNA可用于杂交或扩增测定法，包括但不限于Southern或Northern分析、聚合酶链反应分析(如定量PCR(TAQMAN))和探针阵列(如GENECHIPTM DNA阵列(AFFYMETRIX))或RNA测序。对从KDM1A基因转录的mRNA表达水平的分析可以涉及核酸扩增的方法，例如通过RT-PCR、连接酶链式反应、自我维持序列复制、转录扩增系统、Q-β复制酶、滚环复制或任何其他核酸扩增方法，然后使用本领域技术人员公知的技术检测扩增的分子。
如前所述，KDM1A基因的突变可能引发KDM1A蛋白不表达或表达不足，或者引发截短或无功能蛋白的表达。在本发明的优选实施方案中，本发明的方法因此需要分析SEQ IDNO:3的KDM1A蛋白的表达。在这种情况下，通过分析从KDM1A基因翻译的蛋白质的表达水平来检测本发明的无效突变的存在。这种分析可以使用以下进行：抗体(例如，放射性标记的、发色团标记的、荧光团标记的或酶标记的抗体)、抗体衍生物(例如，与底物或与蛋白质或配体缀合的抗体)、或蛋白/配体对的蛋白(例如，生物素-链霉亲和素)或特异性识别KDM1A蛋白(SEQ ID NO:3)的抗体片段(例如，单链抗体、分离的抗体高变结构域等)。所述分析可以涉及本领域技术人员公知的多种技术，包括(但不限于)酶免疫测定(EIA)、放射免疫测定(RIA)、蛋白印迹分析和酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
在一个实施方案中，本发明的方法检测由以下导致的异常表达或活性：由于SEQID NO:3的KDM1A蛋白表达比对照样本降低，或由于截短的非功能性KDM1A蛋白的表达或由于存在另一种影响KDM1A酶活性的无效突变。
如果受试者由于存在无效突变而具有较低的KDM1A基因表达，或者如果受试者表达表现出较低组蛋白去甲基酶活性的突变KDM1A蛋白，则可以在肾上腺中诱导G蛋白受体的异常表达细胞，引发增生和/或异常类固醇生成。
可替选地，本发明的无效突变可以通过测量受试受试者的生物样本中KDM1A蛋白的组蛋白去甲基化酶活性，更准确地是其使溶素4上的组蛋白H3去甲基化的能力来进行检测。如果与对照样本相比该活性降低，则受试者被诊断为易患内分泌疾病，例如库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生或肾上腺髓质脂肪瘤。
优选地，本发明的方法使用SEQ ID NO:4-5的引物。
内分泌疾病的诊断方法
如上所述，当在受试者的血液样本中进行评估时，KDM1A基因的表达和/或KDM1A蛋白的活性改变表示所述受试者将来易患内分泌疾病。一旦其中一个内分泌组织(例如，肾上腺组织)发生第二个突变，就可能发展出这种内分泌疾病。
在第二个方面，本发明因此涉及在需要其的受试者中早期诊断内分泌疾病的体外方法，所述方法包括以下步骤：
-在所述受试者的第一个生物样本中检测KDM1A基因或其片段中杂合生殖系无效突变的存在，或检测KDM1A蛋白的异常表达和/或活性，
和
-检测同一受试者的内分泌组织标本中KDM1A基因或其片段中是否存在另一无效突变。
在优选的实施方案中，所述第一生物样本是血液或任何含有生殖系DNA的样本。
所述内分泌组织的标本，例如通过活检或治疗手术后获得。
在血液样本中检测到KDM1A基因的一个等位基因上的生殖系无效突变，以及在内分泌组织的细胞中检测到影响KDM1A的另一个等位基因的体细胞无效突变，表示受试者正在发展出内分泌疾病，例如库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生或肾上腺髓质脂肪瘤。
此外，检测到受试者血液样本中KDM1A蛋白的异常低水平或活性降低，以及检测到影响内分泌组织细胞中KDM1A基因的一个等位基因的体细胞无效突变，表示受试者正在发展出内分泌疾病，例如库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生或肾上腺髓质脂肪瘤。
两种突变(生殖系突变和体细胞突变)可以相同或不同。通常，这两种突变独立发生，因此是不同的。
还可能通过检测一个内分泌组织中KDM1A基因的两个等位基因的双突变来直接诊断患有内分泌疾病。
可替选地，内分泌疾病的早期诊断可以在受试者的单个样本(即内分泌组织的标本)上通过以下获得：
-检测所述组织中KDM1A基因的两个等位基因上存在无效突变，
或者
-检测所述组织中KDM1A蛋白的异常低表达和/或活性降低。
以上公开的用于本发明的易感性预测方法的所有技术，经过必要的修改，都适用于本发明的诊断方法。
具体地，KDM1A基因中的生殖系或体细胞无效突变可以分别见于表示KDM1A基因的DNA和mRNA的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中。它们可以通过本领域已知的任何分子技术来检测，以及特别地，在通过探针捕获感兴趣的区域后使用下一代测序。在更优选的实施方案中，该分析在1号染色体上进行，甚至更优选在1号染色体的短臂上进行。
另外，KDM1A蛋白的表达可以通过，例如蛋白质印迹检测SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的表达水平来测量。酶的活性可以通过任何常规方法检测。
DNA突变优选选自：c.1848dupG、c.352-1G>A、c.1309G>T、c.1737_1738insGA、c.2361T>G、c.2441_2445del、c.952C>T、c.811C>T和c.386delA。它可以是部分或整个KDM1A基因座的缺失。
本发明涵盖的DNA无效突变优选影响SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的表达水平和/或活性。它们降低了所有组织以及特别是内分泌组织中正常表达的KDM1A的数量，或者产生截短的蛋白质或非功能性的蛋白质。例如，它们诱导选自以下的蛋白质突变：(p.Val617GlyfsTer9)、p.(Val617is)、p.Glu437、p(Tyr787Ter)、p.(Gln317)、p.(Asn129fs)、(p.Gln815AspfsTer14)、(p.Asp580GlufsTer11)、(p.Gln318Ter)、(p.Asn129ThrfsTer80)和p.(Arg271Ter)。
在内分泌组织的样本中存在所述无效突变或检测到SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的异常低表达和/或活性降低表示所述受试者正在发展为或可能非常快就会发展为内分泌疾病，例如库欣综合征、与库欣综合征相关的PBMAH、肾上腺增生或肾上腺髓质脂肪瘤。
具体地，如果所述内分泌组织中突变等位基因的NGS比率高于50％，则将诊断为患有所述内分泌疾病。
优选地，本发明的诊断方法使用SEQ ID NO:4-5的引物。
内分泌疾病的方法
此类生殖系无效突变的存在和/或活性降低表明受试受试者正在发展为内分泌疾病或处于正在发展为内分泌疾病的过程中。因此，本发明的方法能够非常早地诊断正在发展为内分泌疾病。
一旦诊断出这种疾病，就可以根据本发明人的发现进行适当的治疗。
具体地，使用基因疗法至少在内分泌组织中恢复KDM1A蛋白的正常表达可能很有意义。这种基因疗法可以基于通过任何常规载体在内分泌组织细胞中局部递送和表达正常KDM1A基因。在优选的实施方案中，该载体将是编码KDM1A基因的复制缺陷型重组病毒，其置于允许其表达的调节元件的控制下。
更通常地，所述“载体”将是任何能够有利于基因转移至内分泌细胞的载剂。优选地，载体将核酸转运至细胞，其降解程度相对于不存在载体时的降解程度降低。一般而言，可用于本发明的载体包括，但不限于质粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他载剂，其已通过插入或掺入KDM1A核酸序列进行操作。病毒载体是优选类型的载体，包括但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒；慢病毒；巨细胞病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒，如逆转录病毒。人们可以容易地使用未命名但本领域已知的其他载体。优选地，所述病毒应当是有缺陷的病毒。术语“有缺陷的病毒”表示不能在靶细胞中复制的病毒。一般而言，本发明上下文中使用的缺陷病毒的基因组因此至少缺乏所述病毒在受感染细胞中复制所需的序列。这些区域可以被去除(全部或部分)，或者变得无功能，或者被其他序列、特别是被重组核酸替换。优选地，缺陷病毒仍然保留封装病毒颗粒所需的其基因组序列。
本发明的载体将包含在药物组合物中。该组合物还含有药学上可接受的赋形剂。
术语“药学上可接受的赋形剂”在本文中是指可用于制备通常安全、无毒且理想的药物组合物的赋形剂，包括兽医用途以及人药学用途可接受的赋形剂。这些赋形剂可以是固体、液体、半固体，或者在气雾剂组合物的情况下可以是气体。
也可以将文献中特别是Ghorayeb等人37中提出的任何其他合适治疗施用于患者。特别地，在可测量和确定皮质醇过量之前，还可能考虑，例如通过手术从诊断的受试者中去除患病的内分泌组织(即，发生体细胞无效突变的内分泌组织)。
引物和探针
在一个具体方面，本申请涉及可用于上述方法的引物或探针，以便特异性检测在KDM1A基因中或在其片段中无效突变的存在，或KDM1A基因的表达水平。
在此方面，本发明涉及可以特异性扩增如上文定义的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因组区域或其片段的引物的用途。这些引物优选含有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段的18至30个连续核苷酸。优选地，这些引物含有18至30个核苷酸(总计)。
有用的引物(允许扩增SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的片段以对其进行定量)的示例是SEQ ID NO:4-5。这些序列在以下和所附的列表中给出。
SEQ ID NO:4 CAGCCGATTCCACGACTCTT
SEQ ID NO:5 CTCAGCAGAGCACCATGCA
此外，本发明涉及可以与如上定义的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因组区域或其片段特异性杂交的探针。在优选的实施方案中，这些探针包含SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其片段的至少15个、优选至少20个、更优选至少30个连续核苷酸。在更优选的实施方案中，可用作根据本发明的探针的分子具有15个核苷酸、优选20个核苷酸的总最小大小。在甚至更优选的实施方案中，这些分子包含15至40个核苷酸(总计)。
本发明的探针可以以多种方式进行。最通用的方法包括将从生物样本中提取的核酸分子固定在支持物(如硝基纤维素、尼龙或聚苯乙烯)上，在明确的条件下将固定的靶核酸与探针一起孵育。杂交后，除去过量的探针，使用合适方法检测形成的杂合分子(测量与探针连接的放射性、荧光或酶活性)。
根据另一实施方案，本发明的探针可以用作捕获探针。在这种情况下，将探针固定在支持物上，用于通过特异性杂交捕获从待测生物样本获得的靶核酸。然后使用称为“检测探针”的第二个探针检测靶核酸，该探针标记有易于检测的元件。
本发明涉及这些探针或引物在用于分析、检测、鉴定或测定具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的基因组区域或其片段中的用途，以便在需要其的受试者中鉴定内分泌疾病的遗传易感性或诊断内分泌疾病，例如在上文公开的方法中。
在本发明的方法中，还可能使用可以特异性检测SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的任何抗体。
例如，可能使用识别SEQ ID NO:3的第50至150个氨基酸的抗体Ab29195(Abcam)，即：GPGAVGERTP RKKEPPRASP PGGLAEPPGS AGPQAGPTVV PGSATPMETG IAETPEGRRTSRRKRAKVEY REMDESLANL SEDEYYSEEE RNAKAEKEKK(SEQ ID NO:16)。
试剂盒
另一方面，本发明涉及包含至少一个如上定义的引物、一个探针或一个抗体的试剂盒的用途，以及其用于在需要其的受试者中鉴定对内分泌疾病的遗传易感性或诊断内分泌疾病中的用途，例如在以上公开的方法中。
在优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含至少两个特异性扩增具有序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸或其片段的引物，和/或至少一个特异性杂交具有序列SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的核酸的探针。
优选地，所述引物/探针具有上述序列(SEQ ID NO:4-5)。
可替选地，本发明的试剂盒可以含有特异性识别KDM1A蛋白(SEQ ID NO:3或SEQID NO:16的表位)的多克隆或单克隆抗体。
在更优选的实施方案中，本发明的试剂盒包含所述引物、探针和抗体的任意组合。
本试剂盒还可以包括一个或多个试剂、缓冲液、杂交介质、核酸、引物、核苷酸、探针、分子量标记物、酶、固体支持物、数据库、用于计算分配顺序的计算机程序和/或一次性实验室设备(如多孔板)，以方便实施本方法。本试剂盒中可以包含的酶包括核苷酸聚合酶等。固体支持物可以包括珠等，而分子量标记物可以包括可缀合标记物，例如生物素和链霉亲和素等。
在一个实施方案中，本试剂盒还包含用于实施本发明的方法的说明书。可以通过有形介质以任何可理解的形式提供指令，例如打印在纸上、计算机可读介质等上。
治疗糖尿病的方法
此外，本发明人提出，在胰腺(内分泌胰腺的α、β和δ细胞)和其他组织中的生理性在位的GIP受体表达也可以受到KDM1A表观遗传调节。在这种情况下，这种表达可以在药理学上被靶向，以改变胰岛素或胰高血糖素的分泌，尤其是在患有糖尿病和其他代谢疾病的患者中。
研究表明，在人中诱导的多能干细胞中用shRNA敲低KDM1A基因，促进此类干细胞分化为产生胰岛素的细胞(Yang等人，Stem Cell Research&Therapy202043)。因此，KDM1A在β细胞稳态中发挥着重要作用。GIP受体在分泌胰岛素的胰腺β细胞中生理表达。
此外，本发明人在此表明，对人胰腺β细胞中KDM1A进行药理抑制和沉默实际上增加了GIPR转录物(图3D)，证明了在生理表达受体的组织中KDMA1在调节GIPR表达中的作用。
因此，建议抑制KDM1A以增强胰腺β细胞和α细胞对GIP的敏感性，从而为治疗胰岛素或胰高血糖素分泌改变的代谢紊乱开辟新的治疗途径。这种方法得到了以下事实的支持：源自杂交胰高血糖素样肽1(GLP-1)、GIP和胰高血糖素序列的单分子双重激动剂或三激动剂在动物模型中证明可以协同减少肥胖和降低高血糖(Finan等人，Nat Med 201539)和人体试验(Frias等人，Cell Metabolism201740)。
本文提出通过表观遗传调节GIP受体表达，在药理学上抑制KDM1A以增加患有胰岛素或胰高血糖素分泌改变的代谢紊乱(例如，患有糖尿病)的患者的胰岛素或胰高血糖素分泌。
特别是，KDM1A抑制剂将作为糖尿病的新辅助治疗，从而增加胰腺α和β细胞中GIP受体的表达，改善内源性餐后胰岛素或胰高血糖素分泌，或α和β细胞存活。
KDM1A拮抗剂是本领域已知的。例如，它们描述在在Hamamoto等人，Nature RevCancer 20157，Karakaidos等人，Cancers 201941；Fang Journal of Hematology&Oncol201942。所有这些拮抗剂均包含于此。例如，它们可以选自：IMG-7289(Bomedemstat)、反苯环丙明(TCP)、SP-2577(seclidemstat)、INCB059872、CC-90011、GSK2879552、ORY-1001(iadademstat)、TAK-418和ORY-2001(Vadifemstat)，其目前正在临床研究中用于癌症治疗(Hamamoto等人，20157；Fang等人，201942)。还可以使用天然或合成的化学药物，如阿博林宁、去甲乌药碱、卡瓦内酮、雷洛昔芬、非诺多泮或Song Y等人，2022 44中提出的任何抑制剂。这些药物将优选口服施用，例如作为片剂或液体组合物。
可以使用任何其他KDM1A拮抗剂，只要它可以有效地进入α-或β-胰腺细胞，在本文中可以抑制至少50％的KDM1A活性或表达。
具体地，KDM1A拮抗剂可以是将α或β胰腺细胞中KDM1A酶活性减少至少50％的化学化合物或阻断抗体(或其片段或适体)。
或者，siRNA或其他反义核酸可以用于将胰腺细胞中KDM1A基因表达抑制至少50％。这些基因表达的抑制剂是例如，反义RNA分子和反义DNA分子，通过与其结合来直接阻断mRNA的翻译，从而阻止蛋白质翻译或增加mRNA降解，从而降低蛋白质(例如，KDM1A蛋白)的水平，以及由此而来的其在靶细胞中的活性。可以使用至少约15个碱基且与编码靶向KDM1A蛋白的mRNA转录物序列的独特区域互补的反义寡核苷酸。
它们可以例如，通过常规磷酸二酯技术合成，通过例如静脉内注射或输注施用于患者。本领域公知使用反义技术特异性抑制公知序列的基因的基因表达的方法(例如，参见美国专利6,566,135；6,566,131；6,365,354；6,410,323；6,107,091；6,046,321；和5,981,732)。
核酶还可以用作本发明中使用的基因表达的抑制剂。核酶是能够催化RNA特异性切割的酶RNA分子。核酶作用机制涉及核酶分子与互补靶RNA的序列特异性杂交，然后进行核酸内切切割。因此，特异性且有效地催化mRNA序列的核酸内切切割的工程化发夹或锤头基序核酶分子在本发明的范围内是有用的。任何潜在RNA靶标内的特定核酶切割位点最初通过扫描靶分子中的核酶切割位点来鉴定，这些位点通常包括以下序列：GUA、GUU和GUC。一旦鉴定，可以评价在约15至20个核糖核苷酸之间的短RNA序列(对应于含有切割位点的靶基因区域)的预测的结构特征(如二级结构)，其可以导致寡核苷酸序列不合适。候选靶点的适用性也可以通过测试它们与互补寡核苷酸杂交的可及性来评估，例如使用核糖核酸酶保护测定法。
因此，本发明靶向KDM1A拮抗剂(如化学或肽化合物、或KDM1A反义核酸或核酶)，用于治疗患有胰岛素或胰高血糖素分泌改变的代谢紊乱(如糖尿病)的患者，以增强对GIP的接受性从而改善内源性胰岛素或胰高血糖素分泌。这些拮抗剂将优选口服或全身施用，例如通过片剂或液体制剂。
其还针对KDM1A拮抗剂(如化学化合物或KDM1A反义核酸)在制备旨在用于治疗患有胰岛素或胰高血糖素分泌改变的代谢紊乱(如糖尿病)的患者的药物中的用途。
在本发明的上下文中有用的示例性siRNA描述如下(SEQ ID NO:12-15)。它们中的任何一个都可以用于本发明的药物中。
本发明的反义寡核苷酸siRNA和核酶可以与载体联合递送。在其最广泛的意义上，“载体”是能够促进反义寡核苷酸siRNA或核酶核酸转移至胰腺细胞的任何载剂，优选表达靶向KDM1A蛋白的细胞。优选地，载体将核酸转运至细胞，其降解相对于不存在载体时的降解程度降低。一般而言，可用于本发明的载体包括，但不限于质粒、噬菌粒、病毒、源自病毒或细菌来源的其他载剂，其已通过插入或掺入反义寡核苷酸siRNA或核酶核酸序列进行操作。病毒载体是优选类型的载体并且包括，但不限于来自以下病毒的核酸序列：逆转录病毒，如莫洛尼鼠白血病病毒、哈维鼠肉瘤病毒、鼠乳腺肿瘤病毒和劳斯肉瘤病毒；腺病毒；慢病毒；巨细胞病毒；腺相关病毒；SV40型病毒；多瘤病毒；爱泼斯坦-巴尔病毒；乳头状瘤病毒；疱疹病毒；痘苗病毒；脊髓灰质炎病毒；和RNA病毒，如逆转录病毒。人们可以容易地使用未命名但本领域已知的其他载体。优选地，所述病毒应当是有缺陷的病毒。术语“有缺陷的病毒”表示不能在靶细胞中复制的病毒。一般而言，本发明上下文中使用的缺陷病毒的基因组因此至少缺少所述病毒在受感染细胞中复制所需的序列。这些区域可以被去除(全部或部分)，或者变得无功能，或者被其他序列、特别是被重组核酸替换。优选地，缺陷病毒仍然保留封装病毒颗粒所需的其基因组序列。
本发明的优势在于将现有的KDM1A抑制剂和将开发的KDM1A抑制剂的用途扩展到全新领域——表观遗传调节GPCR的组织特异性表达，包括但不限于GIP受体在胰腺中的在位表达。
在一个具体实施方案中，将化学抑制剂与核酸抑制剂组合以增强本发明组合物的治疗效果是有利的。
实施例
尽管这里已经参考特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，这些实施方案仅说明了本发明的原理和应用。因此，应当理解，在不脱离由所附权利要求限定的本发明的精神和范围的情况下，可以对说明性实施方案进行多种修改，也可以设计其他安排。
1.方法
研究监督
PBMAH患者签署了基因分析的书面知情同意书。该研究得到了所有当地伦理委员会的批准。没有异位GIP受体表达的PBMAH患者的组织样本获自巴黎-萨克雷生物资源中心(Centre de Ressources Biologiques Paris-Saclay,BRIF:BB-0033-00089,BicetreHospital,AP-HP)。
患者
该研究包括因GIP依赖性库欣综合征而接受肾上腺切除术的患者的肾上腺样本。这个国际组织采集包括来自法国、比利时和加拿大的六个内分泌中心的肾上腺样本。GIP依赖性库欣综合征根据规范标准(standard criteria)进行诊断，其显示皮质醇增多症1合并早晨(空腹)血浆皮质醇低和促肾上腺皮质激素浓度低以及进餐(或其他测试，包括GIP输注)引起的血浆皮质醇浓度增加。还包括来自Bicêtre医院因明显或亚临床库欣综合征(但没有证据表明食物依赖性皮质醇产生)而接受肾上腺切除术的患者的PBMAH的对照样本。
基因分型和基因拷贝数分析
采用苯酚-氯仿-异戊醇提取法从肾上腺样本中提取DNA。使用NucleoSpin DNAFFPE XS试剂盒(Macherey-Nagel)从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中提取DNA，或使用自动化QIAsymphony平台(Qiagen)或Flexigene DNA试剂盒(Qiagen)从血液白细胞中提取DNA。
全基因组测序。根据供应商的建议，使用UltraTM II DNA文库制备试剂盒获得无PCR文库。DNA无PCR文库在Illumina NovaSeq上以150bp成对端运行进行测序。使用Burrows-WheelerAligner工具将序列读数映射到人类基因组hg38。获得了49×的平均覆盖率。使用GATK单倍型识别(caller)GVCF工具(用于组成型DNA为V 3.7)和MuTect工具(用于体细胞DNA为V 2.0)(均来自Broad institute,Cambridge,MA,USA)进行变异调用和注释。在gnomAD或1000基因组计划数据库中，将次要等位基因频率大于2％的变异排除在外。将全基因组测序数据进一步过滤，以保留蛋白质损伤变体(无义、错义、移码、插入缺失和剪接变体)。
如前所述进行全外显子组测序6。所有编码外显子均使用SureSelect XT HumanAll Exon(Agilent Technologies)捕获。在Illumina HiSeq 4000上进行成对端100bp读取进行测序。读取比对(与人类基因组hg19比对)、变异调用和注释是通过基于Burrows-Wheeler Aligner、SAMtools、Annovar和自定义注释脚本的流水线完成的。获得了100×的平均覆盖率。在1000个基因组计划数据库、6500NHLBI EVS(http://evs.gs.washington.edu/EVS)、gnomAD中的次要等位基因频率超过1％的变异，以及在我们的内部数据库(包含约2000个样本)中在超过30个样本中出现的变异都被排除在外。全外显子组测序数据被进一步过滤以保留蛋白质损伤变体。
如果有一组涉及肾上腺疾病的基因(包括ARMC5、PRKACA、PRKACB、PRKAR1A、GNAS、MEN1和FH)，则靶向下一代测序进一步用于对所有患者的体细胞DNA和生殖系DNA进行高分辨率测序。该组还包括参与人类肿瘤发生的赖氨酸去甲基化酶家族的成员KDM1A、KDM3A、JMJD2A、JMJD2B、JMJD3、KDM6A和KDM5B7。使用UltraTMII FSDNA Library制备试剂盒用户Illumina(NEB Inc.)在Biomek Span8工作站(Beckman)上自动化制备全基因组文库。使用在Biomek 4000工作站(Beckman)利用SureSelect XT定制试剂盒(Agilent)自动化进行富集。在/>IlluminaTM测序仪上对23名患者分批进行2×150bp的成对端测序。使用Annovar和SNPeff 4.0完成读取比对(与人类基因组hg19比对)、变异调用和注释。获得286×的平均覆盖率。为了研究基于靶向下一代测序数据的基因组拷贝数改变(CNA)，使用内部Python(V2.7)脚本来比较患者样本与对照样本的覆盖深度。
使用180K或400K寡核苷酸阵列(Agilent Technologies)基于寡核苷酸的阵列比较基因组杂交分析(阵列-CGH)用于分析基因组失衡。将肾上腺样本中的DNA与性别匹配的献血者DNA进行比较。根据制造商的方案进行杂交。在Agilent微阵列扫描仪上扫描载玻片。使用CytoGenomics软件4.0.3.12(Agilent Technologies)进行图像处理和数据分析。使用ADM2算法进行统计分析。如果在至少15Kb和35Kb(分别用于180K和400K阵列)中能够有3个或更多寡核苷酸跨度(spanning)能确定的拷贝数改变，且未在基因组变异数据库中发现，则认为拷贝数改变是显著的(http://projects.tcag.ca/cgi-bin/variation/gbrowse/hg19)。用于分析基因内容的基因组浏览器是hg19、Build37(http://genome.ucsc.edu/)。
人肾上腺皮质H295R细胞的细胞培养物。
H295R细胞在DMEM/Ham'sF-12培养基中培养，其中补充有2mM谷氨酰胺、100IU/mL青霉素、100μg/mL链霉素、10％胎牛血清、20mM HEPES以及胰岛素(1μM)、转铁蛋白(5.8mg/ml)和硒(60nM)的混合物。还使用了人胰腺β细胞EndoC-βH1。它们的培养如Ravassard P.等人所述38。
KDM1A的抑制
将细胞与0.5μM GSK-LSD1(一种不可逆的KDM1A抑制剂，Sigma-Aldrich)一起孵育10天。
使用以下siRNA用于遗传抑制。
si-RNA J-009223-05 GGAAGUUGUCAUUCAGUUA SEQ ID NO:12
si-RNA J-009223-06 CCACCGAGUUCACAGUUAU SEQ ID NO:13
si-RNA J-009223-07 CAUAAGUGACGAUGUGAUU SEQ ID NO:14
si-RNA J-009223-08 CUAUAAAGCUCCAAUACUG SEQ ID NO:15
siRNA的转染方案如下进行。简而言之，将H295R细胞在无血清Optimem培养基(Life Technologies)中培养2小时，然后与Lipofectamine RNAiMAX(2μL/孔)和靶向KDM1A的100nM siRNA或Scrambled siRNA(Horizon)一起孵育6小时。在接种后的1天和3天进行两次迭代转染。使用逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定所研究基因的表达水平。
基因水平的测量
从细胞培养物和组织中提取RNA的方案和RT-qPCR方案如下：采用苯酚-氯仿-异戊醇提取法从冰冻肾上腺样本中提取DNA。使用NucleoSpin DNA FFPE XS试剂盒(Macherey-Nagel)从福尔马林固定石蜡包埋(FFPE)样本中提取DNA，或使用自动化QIAsymphony平台(Qiagen)或Flexigene DNA试剂盒(Qiagen)从血液白细胞中提取DNA。根据制造商的说明，使用TRIzol试剂从组织或细胞中提取总RNA。在DNAse I(New England Biolabs)处理后，使用高容量cDNA逆转录试剂盒(Life Technologies)对1μg总RNA进行逆转录。使用PowerGreen PCR Master Mix(Life Technologies)或TaqMan基因表达测定法(LifeTechnologies，参考号4331182和4448489)通过RT-qPCR在QS6实时PCR系统(LifeTechnologies)上运行分析样本。标准曲线是通过使用线性化pGEMT-easy质粒(Promega)的系列稀释液生成的，其中扩增子之前已进行克隆和测序。感兴趣基因的相对表达表示为感兴趣基因的阿托摩尔与管家基因的阿托摩尔的比率。
引物和Taqman探针如下所示：
这些引物公开为SEQ ID NO:4-11。
蛋白质水平的测量
用TissueLyser(Qiagen)获得肾上腺蛋白提取物。蛋白质印迹分析的详细内容如下：用Tissuelyser(Qiagen)获得肾上腺蛋白提取物。对10微克蛋白质进行SDS-PAGE处理，以检测KDM1A蛋白质和α-微管蛋白，用于进行上样标准化。在7％丙烯酰胺/双丙烯酰胺分离胶和4％丙烯酰胺/双丙烯酰胺浓缩胶上进行迁移，以80V进行10分钟，以150V进行1小时。在硝酸纤维素膜上进行转移。使用含3％乳的0.1％ TBS-T缓冲液进行抗体的封闭和稀释。使用(Li-Cor)测定荧光信号强度。使用Image Studio1.1软件(Li-COR)分析数据。以下给出了抗体来源和稀释度。
免疫细胞荧光
使细胞在包含玻璃盖玻片(直径14毫米)的24孔板上生长。24小时后，如上所述转染靶向KDM1A的siRNA或Scramble siRNA(100nM)。简而言之，用4％多聚甲醛固定细胞，用在PBS中稀释的0.2％ Triton X100溶液透化10分钟。然后，将细胞与单克隆兔抗GIPR抗体(USbiological)在4℃下孵育过夜，然后与抗兔Alexa 555偶联二抗(Life Technologie)孵育60分钟。使用0.5μg/mL DAPI(4',6'-二脒基-2-苯基吲哚)对细胞核进行反染色，使用ProLong Gold封固剂(Life Technologie)将盖玻片封固在载玻片上。
荧光解分辨显微镜
使用Mono Q Imaging Retiga 2000R Fast 1394相机(Q Imaging Inc.)以100×物镜(1.4NA)使用自动直立BX61显微镜(Olympus)观察和采集细胞。使用Image Pro PlusAMS(Media Cybernetics Inc)执行解分辨过程：对z系列聚焦平面进行数字成像，并使用3D盲迭代算法(Image Pro Plus AMS)进行解分辨，以生成高分辨率图像。
通过高通量显微镜自动定量GOPR荧光
使用自动化ArrayScan VTI成像和分析平台(Thermo Fisher Scientific)采集每个通道的连续图像(20×-0.40NA镜头)。TargetActivation算法(v.4)用于检测和量化GIPR荧光，如下所示。DAPI荧光用于寻找焦点，通过GIPR荧光依次采集，以生成单独的图像文件。识别核区域的DAPI染色(通道1)用于定义二元核掩模(mask)。通过使用几个渐进的形态学过滤器，将细胞核簇、有丝分裂细胞和凋亡细胞从总细胞群(总主要对象)中剔除。为了量化主要选定对象的细胞质中存在的GIPR荧光(通道2)的量，将该核掩模放大以覆盖细胞质区域。从放大的掩模中减去核掩模，形成了覆盖细胞质区域的二元细胞质新掩模。使用自动截断阈值来特异性选择表达GIPR的细胞(二次选择对象，即转染细胞)。最后使用细胞质掩模来检测、选择和量化最终转染细胞群(n>40,000)中GIPR的平均荧光。对图像和掩膜进行系统的目视检查，以确保准确性。
统计分析
数据表示为平均值±SEM。通过非参数分析组间差异
Mann-Whitney检验、参数非配对t检验或Kruskal-Wallis检验，然后是Dunn后检验(Prism 9、GraphPad软件)。p值小于0.05，被认为是统计学显著的。
2.结果
临床表现
对17位患有伴有PBMAH的明显GIP依赖性库欣综合征并接受单侧或双侧肾上腺切除术治疗的患者进行了研究(表1)。
表1：患有GIP依赖性PBMAH和库欣综合征患者的特征。
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3名患者来自两个无关的患有GIP依赖性库欣综合征的家族(图1)，9名患者明显为散发病例。家族1的两名成员(索引病例：患者#1和他的一级女性表亲，未进行研究)患有GIP依赖性库欣综合征。家族病史还包括多例多发性骨髓瘤、意义不明的单克隆丙种球蛋白病(MGUS)、35岁时的直肠癌和80岁时诊断出的支气管神经内分泌肿瘤(图1)。家族2的两名成员(患者#2和#3)患有GIP依赖性库欣综合征(图1)。3号患者患有髓质脂肪瘤，伴有左肾上腺组织增生；她的家族中没有报告有其他瘤形成。
在这九个明显的散发性病例中，有七个是之前公布的8–15。4号患者有一个女儿在婴儿期患有颅咽管瘤，她的一位一级女性表亲因肾上腺肿块而接受了单侧肾上腺切除术(没有更多详细信息)。9号患者的两个PBMAH腺体内都有多个髓质脂肪瘤病灶12。10号患者在42岁时患有乳腺癌，11号患者的母亲和姐妹患有乳腺癌。12号患者的一个兄弟患有霍奇金淋巴瘤。
16名因亚临床或临床肾上腺皮质激素依赖性库欣综合征而接受单侧或双侧肾上腺切除术的PBMAH患者(没有食物依赖性皮质醇产生的证据)被列为对照组。其中两人是ARMC5突变的家族的成员，其患有β-肾上腺素能/加压素反应性库欣综合征，但未证实有食物依赖性的皮质醇分泌16,17。其他PBMAH对照明显是散发性病例。
肾上腺病变中染色体1p的杂合性丢失
Array-CGH和靶向NGS用于绘制来自患有GIP依赖性库欣综合征患者的所有12个PBMAH样本中DNA拷贝数变化。在这些样本中检测到低拷贝数改变。然而，除两个样本外，所有样本中均发现了1号染色体短臂中的复发性缺失。尽管array-CGH未检测到患者#9和#12的肾上腺样本中存在1号染色体缺失，但靶向NGS在其中一名患者(患者#12)的1p36.12中发现了微缺失。
KDM1A的生殖系失活突变
对来自家族1的索引患者的肾上腺病变和生殖系DNA进行全基因组测序(图1A)，发现影响69个候选基因编码序列的突变在所有3个样本中都很常见。将全基因组测序分析与反复出现的1p缺失交叉，指出了三个候选基因。特别是，鉴定出杂合生殖系移码突变，导致位于1p36.12的KDM1A外显子16(NM_001009999.3)中过早出现终止密码子(图2)。gnomAD和1000个基因组计划数据库中均未报告该突变。与此同时，对来自明显散发病例#9的生殖系DNA进行全外显子组测序，发现KDM1A的外显子6中存在杂合生殖系无义突变(图2)。
使用靶向下一代DNA测序对其余PBMAH GIP依赖性库欣综合征患者的DNA进行系统分析，鉴定出所有肾上腺增生样本中都有KDM1A突变，包括5个移码突变、5个无义突变和1个剪接突变(图2)。根据ACMG分类，所有突变均被认为是致病性的，并且在gnomAD和1000个基因组计划数据库中均未报告。这些突变的存在在10名患者的生殖系DNA中得到证实(图2)。最后，在这些患者中没有鉴定出ARMC5基因、或其他已知的与肾上腺肿瘤相关的基因、或其他组蛋白去甲基化酶基因的致病性突变。
表2显示了患有GIP依赖性库欣综合征和PBMAH患者中检测到的生殖系KDM1A突变。
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对照样本的靶向外显子组测序未发现KDM1A中的致病性变异，也未发现在任何这些样本中1p36.12的拷贝数变化(未显示)。该分析在5个对照样本(31％)中鉴定出ARMC5突变。蛋白质印迹分析表明，来自GIP依赖性库欣综合征患者的肾上腺病变样本中KDM1A蛋白不表达(未显示)，而在对照中检测到KDM1A蛋白。因此，KDM1A的生殖系突变与1p杂合性缺失相结合，导致患有肾上腺病变的患者中KDM1A的功能丧失。
KDM1A功能丧失会导致在人肾上腺皮质和胰腺β细胞中GIP受体表达。
对人肾上腺皮质H295R细胞的体外研究证实了失去KDM1A对GIPR表达的功能影响(图3)。通过RT-qPCR进行定量，GSK-LSD1(一种KDM1A的选择性并且不可逆抑制剂)治疗导致H295R细胞中GIPR表达增加。为了进一步研究KDM1A在蛋白质水平上对GIPR表达的影响，在KDM1A沉默(siRNA)和GSK-LSD1药理学抑制后，通过自动高通量显微镜分析GIPR表达。与未处理的细胞相比，两种抑制均诱导H295R细胞中GIPR蛋白的表达显著增加(分析的细胞数>40000，p<0.001)。最后，为了研究KDM1A是否也调节生理GIPR表达，通过RT-qPCR对人胰腺β细胞EndoC-βH1中的GIPR转录物进行了定量。EndoC-βH1细胞中的KDM1A沉默和伴随的GSK-LSD1的药理学抑制导致GIPR表达增加(图3的图片D)。
3.讨论
在两个患有PBMAH和GIP依赖性库欣综合征的家族中，检测到在赖氨酸去甲基化酶KDM1A中有生殖系失活突变。在所有患有散发性GIP依赖性库欣综合征并伴有PBMAH的患者中均鉴定出这种致病性生殖系KDM1A基因改变，表明该疾病存在共同的遗传机制。在所有患有肾上腺病变的患者中第二个KDM1A基因座的缺失进一步支持了这一点。所有报告的KDM1A突变均为截短或移码突变，在gnomAD和1000个基因组计划数据库中均未报告。值得注意的是，KDM1A的pLI评分等于1，反映出该基因对蛋白质截短变异的耐受性非常低18。最后，对照受试者中没有人携带KDM1A生殖系和体细胞改变。
本文提出了KDM1A失活的二击情景，与肿瘤发生的抑癌基因模型一致19。这种发病机制类似于在1型多发性内分泌肿瘤20,21和ARMC5突变相关的PBMAH发展2中观察到的肾上腺肿瘤形成。在任何这些GIP依赖性PBMAH患者中或文献22中均未检测到ARMC5突变；同样，ARMC5突变阳性对照病例均未携带KDM1A突变。因此，ARMC5和KDM1A基因的基因改变似乎是导致PBMAH的分子致病机制相互排斥的驱动事件。此外，正如之前报告的8，发展出表达GIPR的肾上腺瘤可以是由体细胞19q13微重复和染色体重排导致，并且具有不同的分子发病机制。这些染色体重排通过将GIPR基因与顺式作用调节序列并置，产生了一种新的基因组环境，从而允许其在肾上腺中表达8。
与ARMC5突变相关的肾上腺疾病2类似，KDM1A的逐步失活与肾上腺肿块的隐匿性发病相关，诊断PBMAH和GIP依赖性库欣综合征的中位年龄为44岁。根据这一思路，对家族1中四名未受临床影响的KDM1A突变携带者进行筛查后，未发现他们在更年轻时出现过任何生化异常(未显示)。
KDM1A编码组蛋白赖氨酸去甲基化酶，属于此类蛋白质的一个更大家族7。组蛋白尾部受到共价修饰，影响染色质结构和调节因子的募集，从而改变转录。赖氨酸残基的甲基化可能与转录的激活或抑制有关23。KDM1A通过使溶素4(H3K4me)上的组蛋白H3去甲基化来抑制转录，溶素4是通常与激活基因转录相关的组蛋白标记23,24。此外，KDM1A还被证明会影响参与肿瘤发生的非组蛋白蛋白(如p53、RB1和STAT3)的甲基化7。这两种机制在GIP依赖性库欣综合征伴PBMAH的发病机制中都具有重要意义。在KDM1A功能丧失之后继发的持续组蛋白甲基化可以导致异常的转录激活，以及KDM1A与致癌蛋白相互作用的缺失，从而导致细胞周期失调，进而是肾上腺肿瘤发生。在体外用siRNA尽显药理上抑制或沉默KDM1A，导致人肾上腺皮质细胞中GIPR转录物和蛋白质增加。靶向外显子组测序没有检测到已知参与肾上腺肿瘤发生的基因中的任何其他分子事件。因此，KDM1A功能的丧失似乎足以诱导肾上腺细胞中GIPR的异常表达。在两个病例(患者#3和#9)中，肾上腺增生包括脂肪瘤组织病灶和造血区域，KDM1A失活在具有复杂组织学结构的肾上腺病变的发展中具有潜在作用。有趣的是，据报告KDM1A是造血分化的关键表观遗传调节因子，参与成血管细胞的造血承诺(commitment)25。
Wei等人报告称生殖系KDM1A突变是家族性或早发性多发性骨髓瘤的罕见原因26。有趣的是，携带KDM1A突变的家族1的一些成员患有多发性骨髓瘤或MGUS。这一观察证实了KDM1A作为生殖系多发性骨髓瘤易感基因的作用。此外，在肺癌、结直肠癌或乳腺癌以及急性髓系白血病中也发现了体细胞KDM1A的改变27–31。本研究中的几位患者或其亲属中发展出此类癌症表明KDM1A破坏对肿瘤发展具有更普遍的影响。据报告，神经内分泌肿瘤和生长激素垂体腺瘤中也有GIPR表达，并且与DNA高甲基化有关32,33。由于DNA甲基化和组蛋白甲基化密不可分地交织在一起34，KDM1A和其他去甲基化酶基因似乎成为可能参与内分泌肿瘤发生的新候选基因。最后，在人胰腺β细胞中对KDM1A的药理抑制和沉默增加了GIPR转录物，证明了KDMA1在生理表达受体的组织中在调节GIPR表达中的作用。因此，KDM1A的药理学靶向可以增强胰腺β细胞(也可以是α细胞)对GIP的敏感性，从而为治疗胰岛素或胰高血糖素分泌改变的代谢紊乱开辟新的治疗途径。
总之，这里证明了生殖系失活KDM1A突变可以作为患有GIP依赖性库欣综合征的PBMAH的遗传易感性。体细胞失去KDM1A基因座的杂合性代表肾上腺疾病发生的先决条件。因此，具有异常GIPR表达的PBMAH是一种遗传病。因此，鉴定出GIP依赖性PBMAH伴库欣综合征应该导致对亲属进行生化和遗传筛查。
附图说明
图1描述了在以下示例中研究的患有家族性PBMAH和GIP依赖性库欣综合征患者的家族谱系。
图A显示了家族1的家族谱系，其中两名成员患有GIP依赖性库欣综合征伴原发性双侧肾上腺大结节增生(PBMAH，以平直线表示)，5名成员患有多发性骨髓瘤或意义未明的单克隆丙种球蛋白病(以虚线表示)。患者III.10是患者#1(表1)。图B显示了家族2的家族谱系，其中两名成员患有GIP依赖性库欣综合征伴有PBMAH(以平直线表示)。患者II.1和I.1是患者#2和#3(参见表1)。圆形代表女性，方形代表男性家族成员。半阴影符号表示携带杂合KDM1A突变的成员，白色符号表示具有野生型KDM1A基因的成员，灰色符号表示未研究的成员。划掉的符号代表已故的个人。
图2显示在患有GIP依赖性PBMAH和库欣综合征的患者中在生殖系(A)和散发性肾上腺(B)中KDM1A的改变。此外，还显示了通过阵列-CGH鉴定的含有KDM1A基因座的1p染色体中的杂合性丢失(下线)。在患者#9和#12中，通过阵列CGH未检测到在1p中杂合性丢失，但NGS未发现在患者#12中的KDM1A基因座的体细胞微缺失。
图3公开了肾上腺皮质H295R细胞中功能性KDM1A抑制的体外研究结果。图片A显示了0.5μM GSK-LSD1在H295R细胞中对KDM1A的药理学抑制作用。通过RT-qPCR定量GIPR信使RNA水平。KDM1A的功能性抑制导致GIPR表达在三天和七天时间点显著增加(p＝0.0069和p＝0.0082)。图片B显示用将H295R细胞用0.5μM GSK-LSD1处理7天并用KDM1A siRNA两次迭代转染后，对KDM1A表达的RT-qPCR定量。在siRNA转染后观察到显著降低(p<0.0001)。图片C显示，如免疫荧光所观察到的，KDM1A siRNA转染和伴随的药理学抑制7天导致显著的GIPR表达。使用自动高通量显微镜对H295R细胞细胞质中GIPR蛋白表达的诱导进行定量。转染和处理的H295R细胞呈现出蛋白质表达的增加(p<0.0001，分析的细胞数>40 000)。图片D显示了通过RT-qPCR定量在人胰腺β细胞EndoC-βH1中通过siRNA沉默KDM1A和使用GSK-LSD1药理学抑制GIPR信使RNA水平的结果。经过3天和7天处理后，KDM1A抑制导致GIPR转录物显著增加(p＝0.0113，p＝0.0027)。
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序列表
<110> 巴黎-萨克雷大学
国家健康科学研究所
法国公立援助医院
蒙特利尔大学
<120> 检测KDM1A失活用于诊断内分泌紊乱
<130> B380952PCT D41390
<150> EP21305694.8
<151> 2021-05-26
<150> EP21305771.4
<151> 2021-06-07
<160> 16
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 71249
<212> DNA
<213> 智人
<400> 1
catctattgg tcacctgata ctttagggga aggtaacttt gtttaatata atatgtaata 60
ttgattaggt tttggactct gtatagttag acattaattt tttatttatt attattttat 120
tttatttttg agacaaggtc tcactgtgtt gcccaggttg gagtgcagtg gtgtgattgt 180
ggctcactga agcctccaac tcctgggctc aagtgatcct cctgcctcag cctcctgagt 240
agctaagact acaggcatgt gccactatgc ccagctaatt aaaaaaaaaa attatttttt 300
tagagacaag gtcttgctat attgcccagg ctggtctcaa actcctagcc tcaagcaatt 360
ctccctcctg gagacattaa cttttattat tttattttat ttatttattt tcttttttga 420
gacagactct cactctgctg cccaggctgg agtgcactgg taccatcttg gctccctgca 480
acctctgcct cccaggttca agcgattttc ctgccttagc ctcccaagta gttgggatta 540
caggcacgca ccaccacacc cacctaattt ttgtattttt agtggagaca gggtttcacc 600
atgttggtca ggctggtctc gaactcctga cctcaaatga tctgcccacc tcggcctccc 660
aaagtgctgg gattacaggt gtgagtcccc gtgcccagtg aagacatcag cttttaaaaa 720
atgctagcca ggcacggtgg ctcacgcctg taatcccagc actttgggag gctgaggcgg 780
gtggaccacc ccagaccaga ctggccaaca tggtgaaacc ccgtctctac caaaaataca 840
aaaattagcc aggcgtggtt gcgggcgcct gtcatctcag ctactcggga ggctgaggca 900
ggagaattgc tggaacccag gaggcagagg ttgcagtgag ccgagatcgc gccactgcac 960
tccagcctgg gcgacaacag taagactcct tctcaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1020
aaaaaagcat acattgctat agtaattcca cttttgggta ttcccaaaga attgaaagca 1080
gagtcttgaa gagatatttg tagaccaatg ttcacagcag cattattcac aatagccaaa 1140
atgtggaagt aacccaagtg tccatccaca gatgaatgga taataaaatg ttatatacac 1200
gcaatattac cagccttaaa aaggaaggaa attctaacat gttacaacat agatgaacct 1260
tgaggacatt aagctaagtg aaataagtca gtcacaaaaa aaaaacaaat accgtatgat 1320
tccacttaca tgagctatct acaatagtca aattcataga ggcaaagagt agaatggtgg 1380
ctgccagggt ctggaaggag gggcaaatgt agtcattgtt taatgtatac agaattttgc 1440
aagatgaaaa taattctgga gattgtttat gcaacaatgt gaatgcatct aacactacta 1500
aacagtatac tcaaaatggt taggatcata aattttatgt tatgtgtatt ttatcacaat 1560
aaaaacatct gatatgaatt agttatttct ggggaaaaaa cgggtaagtg ccaccacatc 1620
tggctaattt ttgtattttt agtagagacg gggtttcacc attgttggcc aggctggtct 1680
cctattcctg aactcaggtg atccacccgc ctcggccacc caaagtgctg ggattacagg 1740
catgagccac cacacccggc caggaattct ttatgtaaaa atatcagttt tagtggctgt 1800
gatattccaa tatagaatca tgccttgcta ggaccatgcc tcactgaacg atgggataca 1860
ttctgagaaa agcgccatta ggcaatttca ttgttgtgtg aacatcatag agcatactta 1920
acacaaacct aaatggtata gcctactaca cacctaggct atatggtata gtgtattgtt 1980
aataggctac aaacctgtat ggcatgttac tgtactgaat actgtagcaa ttctgtctaa 2040
acatagaaaa ggtagaaaag gtatggtaaa aatgtgttat ataattttat gggaacacta 2100
tctcatatgc agtctgttgt tgatggaaac attgttatgc ggtgtatgat tgtatcaaat 2160
tggttaccac ttgttggggc tttttaaaat ttttattgtt ttagagacag ggtcttgctc 2220
tgttgcccag gctggagtgc agtggcgtga ccatagctca ctgtagcctt aaactcctgg 2280
gctcaagcaa tccttccacc tcggcttccc aaaatgctgg cattacagat gcaagtcact 2340
gtgcctggcc tttgttgggt ttttaggtta gttctccttt atcgtcatta cgtataacct 2400
gagatacaca gtgttgaagt taaatctgta cacatactga atctttccct agaatgcttt 2460
cctgaaagta gaattacttg gtcaaagggt atgtatgttt ttaacatcta atttcaagtt 2520
ttatcaaact attaaatgtg caaacaagtc agatagaact acaggattta aaacaagctc 2580
caatccactg cctcacctct ttccaccgtc aagttccaag ccttagagac aaccaattcc 2640
aactttttta gctgtttctt ctgtatttac cttgatattt ctaaatagta tgcttatatt 2700
attttttgat ttctcaattt tgacattatg tattttatat atatatatat atatatatat 2760
atatatatat atatatatat atatatatat atatatactt tttttgagac ggagtctcgc 2820
tctgtcgccc aggctggagt gcagcggcgc gatctcggct cactgctacc tccgcctcct 2880
gggttcacgc cattctcctg cctcggcctc cgagtagctg ggactacagg cgcccgccac 2940
catgcccggc cagttttttt gtatttttag tagagacggg gtttcaccgt gttagccacg 3000
acggtcttga tctcctgacc tcgtgatctg cccgcctcgg cctcccaaag tgctgggatt 3060
acaggcatga gccaccgcgc ctggccaaca ttatgtatta tatttttatg gtgaaaaata 3120
atttagctcc caagcagcac ctcccccaac aacctcccta cttccctaaa tccttaaaac 3180
cttctcatct ttctccccac aaactttctt ttttctccat tctcttaatg taattctatc 3240
actttggtta aaacaatatt cactgctcgg cggggcgcgg tggctcacac ctgtaatccc 3300
tgcactttgg gaggccgagg tgggaggatc acttgaggtc aggagttgga gacaagccta 3360
gccaacatgg cgaaaccctg tttctactaa aaatacaaaa attagccagg catggtggca 3420
cacgcctgta atcccagcta ctggggaggc tgaggcagga gaatcgcttg aacttgggag 3480
gcagaggttg cattgagtca agattgcacc cctgcactcc agcctgggca acagagcaag 3540
actctgtctc aaaaaaaaaa agaagaaaca aacaaacaaa agaacagaaa aaataaataa 3600
aacaatattc actgcttacg tttttatggt catgttaata cagttcacag ctgagccata 3660
tgttgtacta tgattatatt ttctttcttt ttcttttctc ttttttttta gaaacgcagt 3720
ttcactatgt tgctcaggct ggacttgaat gaactcctag gctcaagtga ttctcccacc 3780
tcagtctctc gagcagctgg tactacaagt gcgtgccacg ccactcggat acattttctt 3840
tcttgcatag cttttacttt ttttcctttc tacatttgat tgcctttttg tctgtttgct 3900
tagtttttta caaaaaacaa ctttactgaa gtactacagt tacataaaac atacctgttt 3960
tacatggata gttcatagag ttttgacaaa tatatacacc tatgtaacca tcaccctaat 4020
caagatataa aacatttcca tcacccccag caagttcttt cttgttcttt tgcagtcaac 4080
ccccgacccc catctcaggc aagggctgat tggagcctat tactggagat tagttttacc 4140
agttcttgaa cttcatgtaa atggaataat tttttgacaa tttcacttcg aagagacaga 4200
ctattaaaaa gacaattgtt tgtgtaataa gtacacgcat gctaaaagta cacgacctgt 4260
tccagttttg ggttagcaag ggattcctcg aaaaattaaa agaataaacc gctactatca 4320
ttattagaaa gaattaacct ggagtagaaa gaggtgttat gtggatgggg atgggggaca 4380
tgaaggatgg gggacatggg ggatggggga catgggggat gggagaagcg caagacatgg 4440
agtgcgaatg aggttggggt ccagccagaa ggaaaagcat gaacaaaggc ttggagacaa 4500
gagcaattcc gtctggactc aaacctggat ttcgtaactt gtctccattt tactaccatc 4560
gaaactgctg tgctctccaa gttttttgcc cagtccaagc agggcaatta tgaataagta 4620
agacgctcta ccaacatatt tcagtgtttt cccccattag actgtaagtt ctttgaaagc 4680
tagaacttca taatgtaacc cttgttacgt agtaggcaag cattaataaa tactggttga 4740
attaacgaat aattgggtga gtgaatgaac gaacgcacgc atgcaaaccc gaaagtccct 4800
ggaggaaatg gtcaccttcg gaggtttagt ctggcccaga agccctaaga ccacggactg 4860
tgccaggtcc cactccaaac gccggggaga cgctctaggc aagctacacg ttctttgctg 4920
cggtgccact ctagccgcga gaacgccgct ctatggctgc gggggagggg cggggctcgt 4980
gggtgtctcc gacccttttt gtcccggcgc ggcgggagcg cgcttggcgc gtgcgtacgc 5040
gacggcggtt ggcggcgcgc gggcagcgtg aagcgaggcg aggcaaggct tttcggaccc 5100
acggagcgac agagcgagcg gcccctacgg ccgtcggcgg cccggcggcc cgagatgtta 5160
tctgggaaga aggcggcagc cgcggcggcg gcggctgcag cggcagcaac cgggacggag 5220
gctggccctg ggacagcagg cggctccgag aacgggtctg aggtggccgc gcagcccgcg 5280
ggcctgtcgg gcccagccga ggtcgggccg ggggcggtgg gggagcgcac accccgcaag 5340
aaagagcctc cgcgggcctc gccccccggg ggcctggcgg aaccgccggg gtccgcaggg 5400
cctcaggccg gccctactgt cgtgcctggg tctgcgaccc ccatggaaac tggaatagca 5460
gagactccgg aggggcgtcg gaccagccgg cgcaagcggg cgaaggtaag gctcgaccct 5520
tccctcaaac gacaccgcct ggtgccgagc ttccccgagg cttctccgcc ctcccccgcc 5580
gccgccgggt cttgggccct gcgaccactc agacctcccc ttgtatcgct gcgcacgcca 5640
cgtcccctct agctggacgg gtggggtgag aaaggaaaag tctttgccgg tgttgactgc 5700
ggtctttgtg ctgggtcccg agcgacgtgg gaaggggcat cgatgattgc tgggaggggt 5760
attttattcc ttaggtcttt cttgcacacc ttttcatttt cttgactgga aaatggctcc 5820
ctgacgtggg gttacggttg gcgttcttgg agacctcact tgtttgttca cagataggtc 5880
tggaagctgt tgggcgatat tgatggcgtt tcagctgggt gcacgagggg gctgtaggtt 5940
gatgctgaag aaatcgcctt agccggggag atgaaaagaa agggtcgttt ttgcttttgt 6000
ttttgtttga gcaaaaccct gctgtgtggt aggagttcta gtcttttttt ttttcttttt 6060
taaaatcctc tcagcgatct tttggcgcag aattttgcag atgaggaagc tgctgattga 6120
gagagcaaat aatagtcaaa atgcaaatat atgggaagaa aagatttgac tccaaacagt 6180
atatacagac agtgactgcc tcaaatgtct gtgtcctaga tgctatattc agcgtgtcac 6240
caacattact tttttttgtt gttgttaaat atcaacgggc aggtattgct agccctattt 6300
taggaatgag taaactgagg cacacaattt aagcaacttg cctaaagtca caaagctaaa 6360
taagtgatgg aagtggaatg taattcccac attcatgttg ttacagggta tcatcagccc 6420
ttgaaacaaa ggaccacatg ggacactgtg tgcagggcac tggggcagta ttagggcgca 6480
gactttagac ttgggccttt tctggagatt taatggtcgg tctagttgga aaaaacaacc 6540
tggatatata tgtgcgtgta gtcaacattt aaataaaaat ttgcagatta tataatttat 6600
gcctgaaaaa attgtctaca taatttttaa gtgggaatac caagtcagtg tgtatgggga 6660
gcttcttgag atgagtatta cccagtctga gagctctcat atttatctgc ctacttgagc 6720
caactctcta aagtataacc agtgctggat gaaagaccgt tttggaggca agactttctg 6780
gagcttttac caaagcatgg gttagaaaag cacagaggtt ggtgacacca gccctcagaa 6840
atgaaataaa gggcagaagt caagagtgtt attttacgat ttcaatagac aggtggccag 6900
aagccacgta taagatgttt ttaaaaacag atttattggc tgggcacagt ggctcactcc 6960
tgtaatccct gcactttggg aggccaaggc gggtggatca cctgtggtca ggagttcgag 7020
accagcctgg ccaacatgat gaaacccccg tctctactaa aaatacaaaa aattagccgg 7080
gcgtggtggc gggcgcctgt aatcccagct actccggagg ctgagttagg gagaattgct 7140
tgaacccggg aggcagaggt tgcagtgagc ccagatcgtg ccactgcact tcagcctggg 7200
caacaagagc gaaactgtct aaaagcaaac aaaaaaacag gcttattggg ataatgcatg 7260
tataataata ttcaccattt taaaatgtat gattcagtgg tttttagcat atttacaaga 7320
ttgtacagcc aacaccacaa ttgattttag aaccttttca tcatccccaa agacatctgt 7380
atcattagca gtcactcccc agtcctccct acccccagtc cctggcaacc actaatctac 7440
tctttgtcta tggatttgtc tattctgaac attttatata aaatcttatg tagccttttg 7500
tatttggctt tagcatgttt tcagggttca ttcacgttgt agtgctttca ttcagtactt 7560
gataactctt tatggctgaa taatattcca ttgtatggat ataccaaatt tggtttaccc 7620
attcatcatt tgacgcacat tggggtttgt ttccaagtct tggctatttt acataatgct 7680
gctgtgaaca ttaatgtaca gtttattttg tgaatatgtt ttcagttctc tttgggtgtg 7740
ggcctaggaa ttcctgggtt ttatgttaat tctaggtttt acttttgagg tatagccaaa 7800
cagtttccca tagcagctgc accattttac attcccatta gtaaatatat gagggttcca 7860
gtttctccaa tgttcttctt cgtttttttt tttttgttgt tgttgttttt gagatggggt 7920
ttcgcttttg ttgcccaggc tggagtgcag tggcatgacc tcggctcact gcaacatccg 7980
cctccaaggt tcaagtgatt ctcctgcctc agcctcccga gtagctggga ttataggcat 8040
gcaccaccat gcccggctaa ctttgtattg tgtttttagt agagatgggg tttctccatg 8100
ttggtcaggc tgtttcaaac tcctgacctc aaggtgatct gcccacctcg gcctcccaaa 8160
gtgctgggat tacaggcatg agccactgcg cctggccttc ttcttctttt tttttttttt 8220
tttttttttt gctgagacag tctctctctg tcaccaccca ggctggagtg cagtgatgtg 8280
atctcggctt actacagcct cctcctcctg ggttcaagcg attctcctgc cttagccagc 8340
cgagtagctg ggattacagg cacctgccac cacctctggc cagtttttgt atttttagta 8400
gagacagggt ttcaccatgt tggccaggat ggtcttaaac tcctggcctc aagccatcca 8460
cccacatcgg cctcccaaag tgctgggatt acaggtggag ccaccttgtt gagcctccat 8520
atccttcttg acatttaata ttgtttgtct tttactgtag ccatcctatt gggggtaaag 8580
tggtatctca ttgtggtttt gatatgcagt tccctaatga ctaatgatgt tgggcatctt 8640
ttcatgtgtt tattagccat ttttatattt ttgttgaaat gactattcaa atccttggct 8700
catttttaaa aattgagttg tcttcatcat tttctagtaa gagttcttta catattctgg 8760
ttacggaaat ttgtgatttt gatgagatcc aatttattct tttgctccct ttacttctgg 8820
tgttatatct aataaaccat tgccttatcc aatgtcacga ggatttactc ctatgttttc 8880
ttctaagagt tttttagttt tagctcttgc atttatgtcg atgatctttt ctcagttaat 8940
ttttgtatat ggtgtgaggt aggggttcag tttcattatt ttgcatgttg tcccagcaca 9000
gtttattgaa gactattctt tctctcagcg aatagttggc accctcattg attaactata 9060
aatctaagag tttatttctg gactctcaac tctattccat tgatctatta tatatttccg 9120
tccattccag taccacacta tcctgattac tttagtttca taataaattt tgaaattagg 9180
aagtgttcct caactttgtt cttcttttgc aagattattt tggctgttct gaatgctttg 9240
catttccata tgaattttag gaccagcttg tcagtttctg caaaaagggc tgctgggatt 9300
ctgattgtga ttgtgttgaa tctgcagatt gtaagtttgg ggcacactat tagattttac 9360
tgttattttt taagctatct cctacaagaa agatttcttt ttttagctaa ctgattaatt 9420
ttttggaggc aggttctcac tctgtcaccc atgctggagt gcagtggctc aatcatagct 9480
cactgcagcc tcaacctccc aggctcaagt gatgctctta tctcagcctc ctgagtagct 9540
gggactacag ctgtacacaa ccatgcctgg ctaatttttt attttttgta gaaatggctt 9600
ctccctgtgt tgccccagct ggcctcgaac ttctgggctc aatcattcct cctgcctcag 9660
cctcccaaag ggctgagatt acagacatga gccacctcac ccaaccaaga tttttttctt 9720
tgtaattctc ctgtgtttat tttaactcat cttacttacc ctgtttttta atcccccatt 9780
gtaattagct cttaaacttt caggaaaaaa attagttatg tgtttgtttg gggcagcaac 9840
tactaggaag ctagcaacta tccagtcttg ggatccagag gaaacagact ttagaggata 9900
gagtatccat ttaaggaata aaaagcaagc tgaggccagt atagataggc catgcttcag 9960
tagttcttca gtgtatgcaa ggaaaaaagt gcatgtattt tatgacttgg gagcttatcc 10020
agttttgagg actgtacttt aacaaaatta tatcattaca taattaaaat tatgtttagg 10080
gtattggaag gagttcatgt aattgagtgt ccctgaagct tcagtttcat tagtttcaga 10140
ataaattcac ttttgggcat gtgtatgcta aaattatggc aaaatattta aggttttaaa 10200
ttggtaaatt gggttggaac ttcacgaaca ccatactcct ttaggaatgg tggccttgag 10260
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attaatcatg catttatgac tgcttcaaat tatctgagcc tattattact tccatgctat 24660
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ttggagtaat agtttatatc atatttttta tccccctttt ctagtactgt gcctaccacc 66540
taagtctgtt gcataattac tcaccggatg ggtgactgaa gacagtcctg ggcttggagg 66600
ggcctgggat ggctaaaagg gatgtagtca ttgtcatgga gctatccaag gtagtcaagg 66660
ttaagaattc tgtgccaaag taaagcgatg cttaataatt cccttttatt agcaagatct 66720
gaaattatat cttcagaact gctgtatttt gccaggttag aagcagtgag gtgcctgaga 66780
atcttacttc actctagtct gccagctcct actggctggt gtctggcgac aaagagttct 66840
gtatgctgtt tcagaaacat aatctgtctc ttcgcatttg aatggtactg cgtgtgtctt 66900
gtcatcagat ttcagagcac caggaataag gtggggcctg ataaggaagt ttttgaggaa 66960
agtctgtagg aaaaccctag aattatcctt tctgtttccc cagctccaat actgttggca 67020
ctagtggcag gagaagctgc tggtatcatg gaaaacataa gtgacgatgt gattgttggc 67080
cgatgcctgg ccattctcaa agggattttt ggtagcagtg cagtacctca ggtaagtagg 67140
taggtggggc aaggagggat ctagggttca gactcaacca gggtttaatg tatttgcagc 67200
atgttcttgg tcaggacagt ttaagctaga attgaggtct gtgcttttac atgaataatt 67260
aatgtttgga gttcatggcc taagcgtggg gttcagaaaa ccccccagga caagagctgg 67320
ggagtctgaa ggctgctagc tgcatttctc ctccggcttt agagtcacac cagatccctg 67380
acattttaga caaaatggcc aaactccagt gagtatctcc gggaagtttt cagagaacct 67440
cttggtactt tttcgtgttc tttgaaatac tttaaccctt taggattcct ttgaagggaa 67500
ggatattgtg aatttataaa agagaataaa ggccaagccc tgtgtagatc tctggattca 67560
tagacaggaa ggcaacatgg aggggcatcc ttcctgtctg aagtcctttt gtccatgtgt 67620
gttttaaagc aggcattcat cacttgatca ctggctctca catgttgccc ctctttctct 67680
tcacttgcat ctccacccac cactgctttt ccacctttca aggattgatt tgtgcttggt 67740
gtctcgtaat gacttttgct cctggttttt cttttagccc aaagaaactg tggtgtctcg 67800
ttggcgtgct gatccctggg ctcggggctc ttattcctat gttgctgcag gatcatctgg 67860
aaatgactat gatttaatgg ctcagccaat cactcctggc ccctcgattc caggtgcccc 67920
acaggtgaga agctggcaaa ctatctgggc ttatttggga agaggccagg atctcatgat 67980
gtccctgatt tttttttttt ttttcagatt ttagtcattc catcttcgga ccctttcaga 68040
taaccaagag cagagttaaa aggatgggca gcatttctga tttctcataa tttggttttg 68100
taaatctagg cagtctacat tcagaatgga ggagtccaga gtataagtca aataacattt 68160
ttccttattc aggttttctc cctaaaaaac aaaaccattt ttaattgcac ttccattttg 68220
taatggctca taggattgct gtaaggtctc aattactagg ggcttccagg gcatttctga 68280
gaaataaccc tgggtccttg tctagaccct tatgccagac cccactccaa agagcggtaa 68340
gaattcctta gtgtcatagc ccagacctgc tgagctgcga ggcttaagtg tccctgatca 68400
ccaaatgtcc tgtgcttcag ggtagcgagg ctccctccca gaaggtagtt atacatgagg 68460
gaaggacgct ttacaactgg gtatctaaac tgatgagaac acatgttaag catcacttta 68520
ggactgagcc taggtagagt tttattgtct catttctact tgtcaattct gggaaagtgc 68580
ctactgataa gggagactct tcgatagaat gatgaatagt aattgggggg gtcagccttt 68640
aaaaaggtca acagcaattt aagtacttag caatttaagt acaagaataa aggtatatgt 68700
gcagcctgcc aattttctct ttttccccta aaatagccga ttccacgact cttctttgcg 68760
ggagaacata cgatccgtaa ctacccagcc acagtgcatg gtgctctgct gagtgggctg 68820
cgagaagcgg gaagaattgc agaccagttt ttgggggcca tgtatacgct gcctcgccag 68880
gccacaccag gtgttcctgc acagcagtcc ccaagcatgt gagacagatg cattctaagg 68940
gaagaggccc atgtgcctgt ttctgccatg taaggaaggc tcttctagca atactagatc 69000
ccactgagaa aatccaccct ggcatctggg ctcctgatca gctgatggag ctcctgattt 69060
gacaaaggag cttgcctcct ttgaatgacc tagagcacag ggaggaactt gtccattagt 69120
ttggaattgt gttcttcgta aagactgagg caagcaagtg ctgtgaaata acatcatctt 69180
agtcccttgg tgtgtggggt ttttgttttt tttttatatt ttgagaataa aacttcatat 69240
aaaattggcc ctctcttttg ttcctttgag ttggagttac atacaagatg ggggcattac 69300
tcctttggaa atgccaagtt tatcctatgg caatagtaat acatgttttc tccatgttta 69360
aataaggaag aagatgttca tataaaagag aaaaatggtt tgatcaggtc agaagataag 69420
gtaggggggc cggtcctgta gaagcagtgg acttcctggt cagtcggact aggcttcctc 69480
acttgggtgg gggtggagtg tggtggtgtg ccaagaacat ggttattagg aaactttgga 69540
tgcactttca agatagaaca caaaagagct gaaacaaagt ctgagccttt gggagaccag 69600
tctgccttta ttcctgattc cctccatggg tatgtgctaa aacttcccaa ttctactaaa 69660
ggtggtggtg tacattttgg gaagcgcact acataggatc aagggcttag gtaacagctg 69720
gtttaacaga ttgccacaaa cttagtggct cttaaaaaaa cagaaatcta ttcgaaagtt 69780
ctggaagctt aaagtctaaa atgggtacac agggctgcat tcattacaga ggctctcaga 69840
gcagggagga tcagttcatt tccttgctct tttcagcttc taggtgtggg aaggctcgtg 69900
gctccttcct ccatcctcag agcacataac tccagtttct gcttccatca tcacattgcc 69960
ttctcctgta gtcaaatctt ttgtctctct cttaaaagga tactacctgt gattacattt 70020
aaggcccacc tggatcatct aggatgttct gcctcatccc agcatcctta tctgcaaagt 70080
cccttttgcc atataagatg ataaaaacat gttacatgct ggttccttcc caggggctcc 70140
tgactgactg acagatagat gataaacact gttactgcaa atccaagtaa tgtcccttaa 70200
atgtggtttt attctttctt actgtgagtt aagggacatc attatatata ttggtgatct 70260
gactggaaga tgaaaacgga gaaggctttt ccccccctag tcttagaatt cgtggcagta 70320
atggaaagaa tctgcacacc aggatcaggg cagttaatgt ttccagtcct tgcagtatca 70380
gtaattggtt aggtaaaata cccaatttta agtattacac aatgaaataa ataaatatac 70440
tagagctgcg ccaacgcata gaagacagat gatacacagg gatgacattg acaaaactgg 70500
catcacagac tcgcacagag tatacggaaa cgagggagct ttattggtta catattgtac 70560
tgcagagcca acagagagca ttcgcgccag aggatacatg cagacaggca gctccaatga 70620
tacacatgca cccaaggagc cctgagccac tgctttgccc tggtttccag cgacaggttc 70680
tggcctcctt ggtcccatgc ttggagctgc tgcacctaga ctctaagggg caggggtgag 70740
agagaccaga gcacctgcct gagcaagtag gtgtggacca acaggctgcc cccaacaaag 70800
gggcctataa tgcaataaca gtttatttga gggctacttt cttagccctc tcaatcttta 70860
aaatacaaaa aaatagactt tattctctta aaaatacatt ccattcagta tatgttctga 70920
gctgggaagc agcaggaaaa tagggcccct ttcctatgat cctatggttg tgaggctttg 70980
aggagaaccc tgctccccac tcggggtatt caaaaaataa tccctaaaag cagctctttc 71040
caaagcaatc ttgtcagaga aataacaaaa cctcataaca aggtagccag ggacccagcc 71100
tctgggtccc cattccttta ttgggaagtg gtagcacttg gcactgaccc actaaatata 71160
aagaactaaa actgccccag gacgacaagt ccaagaacac tatagtgccc cctgcatccc 71220
gaacactcca ctgacggggg ttatttatg 71249
<210> 2
<211> 3085
<212> DNA
<213> 智人
<400> 2
ggcgcgtgcg tacgcgacgg cggttggcgg cgcgcgggca gcgtgaagcg aggcgaggca 60
aggcttttcg gacccacgga gcgacagagc gagcggcccc tacggccgtc ggcggcccgg 120
cggcccgaga tgttatctgg gaagaaggcg gcagccgcgg cggcggcggc tgcagcggca 180
gcaaccggga cggaggctgg ccctgggaca gcaggcggct ccgagaacgg gtctgaggtg 240
gccgcgcagc ccgcgggcct gtcgggccca gccgaggtcg ggccgggggc ggtgggggag 300
cgcacacccc gcaagaaaga gcctccgcgg gcctcgcccc ccgggggcct ggcggaaccg 360
ccggggtccg cagggcctca ggccggccct actgtcgtgc ctgggtctgc gacccccatg 420
gaaactggaa tagcagagac tccggagggg cgtcggacca gccggcgcaa gcgggcgaag 480
gtagagtaca gagagatgga tgaaagcttg gccaacctct cagaagatga gtattattca 540
gaagaagaga gaaatgccaa agcagagaag gaaaagaagc ttcccccacc accccctcaa 600
gccccacctg aggaagaaaa tgaaagtgag cctgaagaac catcggggca agcaggagga 660
cttcaagacg acagttctgg agggtatgga gacggccaag catcaggtgt ggagggcgca 720
gctttccaga gccgacttcc tcatgaccgg atgacttctc aagaagcagc ctgttttcca 780
gatattatca gtggaccaca acagacccag aaggtttttc ttttcattag aaaccgcaca 840
ctgcagttgt ggttggataa tccaaagatt cagctgacat ttgaggctac tctccaacaa 900
ttagaagcac cttataacag tgatactgtg cttgtccacc gagttcacag ttatttagag 960
cgtcatggtc ttatcaactt cggcatctat aagaggataa aacccctacc aactaaaaag 1020
acaggaaagg taattattat aggctctggg gtctcaggct tggcagcagc tcgacagtta 1080
caaagttttg gaatggatgt cacacttttg gaagccaggg atcgtgtggg tggacgagtt 1140
gccacatttc gcaaaggaaa ctatgtagct gatcttggag ccatggtggt aacaggtctt 1200
ggagggaatc ctatggctgt ggtcagcaaa caagtaaata tggaactggc caagatcaag 1260
caaaaatgcc cactttatga agccaacgga caagctgaca ctgtcaaggt tcctaaagag 1320
aaagatgaaa tggtagagca agagtttaac cggttgctag aagctacatc ttaccttagt 1380
catcaactag acttcaatgt cctcaataat aagcctgtgt cccttggcca ggcattggaa 1440
gttgtcattc agttacaaga gaagcatgtc aaagatgagc agattgaaca ttggaagaag 1500
atagtgaaaa ctcaggaaga attgaaagaa cttcttaata agatggtaaa tttgaaagag 1560
aaaattaaag aactccatca gcaatacaaa gaagcatctg aagtaaagcc acccagagat 1620
attactgccg agttcttagt gaaaagcaaa cacagggatc tgaccgccct atgcaaggaa 1680
tatgatgaat tagctgaaac acaaggaaag ctagaagaaa aacttcagga gttggaagcg 1740
aatcccccaa gtgatgtata tctctcatca agagacagac aaatacttga ttggcatttt 1800
gcaaatcttg aatttgctaa tgccacacct ctctcaactc tctcccttaa gcactgggat 1860
caggatgatg actttgagtt cactggcagc cacctgacag taaggaatgg ctactcgtgt 1920
gtgcctgtgg ctttagcaga aggcctagac attaaactga atacagcagt gcgacaggtt 1980
cgctacacgg cttcaggatg tgaagtgata gctgtgaata cccgctccac gagtcaaacc 2040
tttatttata aatgcgacgc agttctctgt acccttcccc tgggtgtgct gaagcagcag 2100
ccaccagccg ttcagtttgt gccacctctc cctgagtgga aaacatctgc agtccaaagg 2160
atgggatttg gcaaccttaa caaggtggtg ttgtgttttg atcgggtgtt ctgggatcca 2220
agtgtcaatt tgttcgggca tgttggcagt acgactgcca gcaggggtga gctcttcctc 2280
ttctggaacc tctataaagc tccaatactg ttggcactag tggcaggaga agctgctggt 2340
atcatggaaa acataagtga cgatgtgatt gttggccgat gcctggccat tctcaaaggg 2400
atttttggta gcagtgcagt acctcagccc aaagaaactg tggtgtctcg ttggcgtgct 2460
gatccctggg ctcggggctc ttattcctat gttgctgcag gatcatctgg aaatgactat 2520
gatttaatgg ctcagccaat cactcctggc ccctcgattc caggtgcccc acagccgatt 2580
ccacgactct tctttgcggg agaacatacg atccgtaact acccagccac agtgcatggt 2640
gctctgctga gtgggctgcg agaagcggga agaattgcag accagttttt gggggccatg 2700
tatacgctgc ctcgccaggc cacaccaggt gttcctgcac agcagtcccc aagcatgtga 2760
gacagatgca ttctaaggga agaggcccat gtgcctgttt ctgccatgta aggaaggctc 2820
ttctagcaat actagatccc actgagaaaa tccaccctgg catctgggct cctgatcagc 2880
tgatggagct cctgatttga caaaggagct tgcctccttt gaatgaccta gagcacaggg 2940
aggaacttgt ccattagttt ggaattgtgt tcttcgtaaa gactgaggca agcaagtgct 3000
gtgaaataac atcatcttag tcccttggtg tgtggggttt ttgttttttt tttatatttt 3060
gagaataaaa cttcatataa aattg 3085
<210> 3
<211> 876
<212> PRT
<213> 智人
<400> 3
Met Leu Ser Gly Lys Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Thr Gly Thr Glu Ala Gly Pro Gly Thr Ala Gly Gly Ser Glu
20 25 30
Asn Gly Ser Glu Val Ala Ala Gln Pro Ala Gly Leu Ser Gly Pro Ala
35 40 45
Glu Val Gly Pro Gly Ala Val Gly Glu Arg Thr Pro Arg Lys Lys Glu
50 55 60
Pro Pro Arg Ala Ser Pro Pro Gly Gly Leu Ala Glu Pro Pro Gly Ser
65 70 75 80
Ala Gly Pro Gln Ala Gly Pro Thr Val Val Pro Gly Ser Ala Thr Pro
85 90 95
Met Glu Thr Gly Ile Ala Glu Thr Pro Glu Gly Arg Arg Thr Ser Arg
100 105 110
Arg Lys Arg Ala Lys Val Glu Tyr Arg Glu Met Asp Glu Ser Leu Ala
115 120 125
Asn Leu Ser Glu Asp Glu Tyr Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Asn Ala Lys
130 135 140
Ala Glu Lys Glu Lys Lys Leu Pro Pro Pro Pro Pro Gln Ala Pro Pro
145 150 155 160
Glu Glu Glu Asn Glu Ser Glu Pro Glu Glu Pro Ser Gly Gln Ala Gly
165 170 175
Gly Leu Gln Asp Asp Ser Ser Gly Gly Tyr Gly Asp Gly Gln Ala Ser
180 185 190
Gly Val Glu Gly Ala Ala Phe Gln Ser Arg Leu Pro His Asp Arg Met
195 200 205
Thr Ser Gln Glu Ala Ala Cys Phe Pro Asp Ile Ile Ser Gly Pro Gln
210 215 220
Gln Thr Gln Lys Val Phe Leu Phe Ile Arg Asn Arg Thr Leu Gln Leu
225 230 235 240
Trp Leu Asp Asn Pro Lys Ile Gln Leu Thr Phe Glu Ala Thr Leu Gln
245 250 255
Gln Leu Glu Ala Pro Tyr Asn Ser Asp Thr Val Leu Val His Arg Val
260 265 270
His Ser Tyr Leu Glu Arg His Gly Leu Ile Asn Phe Gly Ile Tyr Lys
275 280 285
Arg Ile Lys Pro Leu Pro Thr Lys Lys Thr Gly Lys Val Ile Ile Ile
290 295 300
Gly Ser Gly Val Ser Gly Leu Ala Ala Ala Arg Gln Leu Gln Ser Phe
305 310 315 320
Gly Met Asp Val Thr Leu Leu Glu Ala Arg Asp Arg Val Gly Gly Arg
325 330 335
Val Ala Thr Phe Arg Lys Gly Asn Tyr Val Ala Asp Leu Gly Ala Met
340 345 350
Val Val Thr Gly Leu Gly Gly Asn Pro Met Ala Val Val Ser Lys Gln
355 360 365
Val Asn Met Glu Leu Ala Lys Ile Lys Gln Lys Cys Pro Leu Tyr Glu
370 375 380
Ala Asn Gly Gln Ala Asp Thr Val Lys Val Pro Lys Glu Lys Asp Glu
385 390 395 400
Met Val Glu Gln Glu Phe Asn Arg Leu Leu Glu Ala Thr Ser Tyr Leu
405 410 415
Ser His Gln Leu Asp Phe Asn Val Leu Asn Asn Lys Pro Val Ser Leu
420 425 430
Gly Gln Ala Leu Glu Val Val Ile Gln Leu Gln Glu Lys His Val Lys
435 440 445
Asp Glu Gln Ile Glu His Trp Lys Lys Ile Val Lys Thr Gln Glu Glu
450 455 460
Leu Lys Glu Leu Leu Asn Lys Met Val Asn Leu Lys Glu Lys Ile Lys
465 470 475 480
Glu Leu His Gln Gln Tyr Lys Glu Ala Ser Glu Val Lys Pro Pro Arg
485 490 495
Asp Ile Thr Ala Glu Phe Leu Val Lys Ser Lys His Arg Asp Leu Thr
500 505 510
Ala Leu Cys Lys Glu Tyr Asp Glu Leu Ala Glu Thr Gln Gly Lys Leu
515 520 525
Glu Glu Lys Leu Gln Glu Leu Glu Ala Asn Pro Pro Ser Asp Val Tyr
530 535 540
Leu Ser Ser Arg Asp Arg Gln Ile Leu Asp Trp His Phe Ala Asn Leu
545 550 555 560
Glu Phe Ala Asn Ala Thr Pro Leu Ser Thr Leu Ser Leu Lys His Trp
565 570 575
Asp Gln Asp Asp Asp Phe Glu Phe Thr Gly Ser His Leu Thr Val Arg
580 585 590
Asn Gly Tyr Ser Cys Val Pro Val Ala Leu Ala Glu Gly Leu Asp Ile
595 600 605
Lys Leu Asn Thr Ala Val Arg Gln Val Arg Tyr Thr Ala Ser Gly Cys
610 615 620
Glu Val Ile Ala Val Asn Thr Arg Ser Thr Ser Gln Thr Phe Ile Tyr
625 630 635 640
Lys Cys Asp Ala Val Leu Cys Thr Leu Pro Leu Gly Val Leu Lys Gln
645 650 655
Gln Pro Pro Ala Val Gln Phe Val Pro Pro Leu Pro Glu Trp Lys Thr
660 665 670
Ser Ala Val Gln Arg Met Gly Phe Gly Asn Leu Asn Lys Val Val Leu
675 680 685
Cys Phe Asp Arg Val Phe Trp Asp Pro Ser Val Asn Leu Phe Gly His
690 695 700
Val Gly Ser Thr Thr Ala Ser Arg Gly Glu Leu Phe Leu Phe Trp Asn
705 710 715 720
Leu Tyr Lys Ala Pro Ile Leu Leu Ala Leu Val Ala Gly Glu Ala Ala
725 730 735
Gly Ile Met Glu Asn Ile Ser Asp Asp Val Ile Val Gly Arg Cys Leu
740 745 750
Ala Ile Leu Lys Gly Ile Phe Gly Ser Ser Ala Val Pro Gln Pro Lys
755 760 765
Glu Thr Val Val Ser Arg Trp Arg Ala Asp Pro Trp Ala Arg Gly Ser
770 775 780
Tyr Ser Tyr Val Ala Ala Gly Ser Ser Gly Asn Asp Tyr Asp Leu Met
785 790 795 800
Ala Gln Pro Ile Thr Pro Gly Pro Ser Ile Pro Gly Ala Pro Gln Pro
805 810 815
Ile Pro Arg Leu Phe Phe Ala Gly Glu His Thr Ile Arg Asn Tyr Pro
820 825 830
Ala Thr Val His Gly Ala Leu Leu Ser Gly Leu Arg Glu Ala Gly Arg
835 840 845
Ile Ala Asp Gln Phe Leu Gly Ala Met Tyr Thr Leu Pro Arg Gln Ala
850 855 860
Thr Pro Gly Val Pro Ala Gln Gln Ser Pro Ser Met
865 870 875
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KDM1A正向引物
<400> 4
cagccgattc cacgactctt 20
<210> 5
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> KDM1A反向引物
<400> 5
ctcagcagag caccatgca 19
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GIPR的正向引物
<400> 6
ccctgggtga tcgtcaggta 20
<210> 7
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GIPR的反向引物
<400> 7
gaggaaatta ttcaagatgg tcatgag 27
<210> 8
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β肌动蛋白的正向引物
<400> 8
gcatgggtca gaaggattcc t 21
<210> 9
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> β肌动蛋白的反向引物
<400> 9
acacgcagct cattgtagaa gg 22
<210> 10
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH的正向引物
<400> 10
tcaccaccaa ctgcttagc 19
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> GAPDH的反向引物
<400> 11
ggcatggact gtggtcatga g 21
<210> 12
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> si-RNA J-009223-05
<400> 12
ggaaguuguc auucaguua 19
<210> 13
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> si-RNA J-009223-06
<400> 13
ccaccgaguu cacaguuau 19
<210> 14
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> si-RNA J-009223-07
<400> 14
cauaagugac gaugugauu 19
<210> 15
<211> 19
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> si-RNA J-009223-08
<400> 15
cuauaaagcu ccaauacug 19
<210> 16
<211> 100
<212> PRT
<213> 智人
<220>
<221> MISC_FEATURE
<223> 抗体Ab29195识别的KDMIIA蛋白的部分
<400> 16
Gly Pro Gly Ala Val Gly Glu Arg Thr Pro Arg Lys Lys Glu Pro Pro
1 5 10 15
Arg Ala Ser Pro Pro Gly Gly Leu Ala Glu Pro Pro Gly Ser Ala Gly
20 25 30
Pro Gln Ala Gly Pro Thr Val Val Pro Gly Ser Ala Thr Pro Met Glu
35 40 45
Thr Gly Ile Ala Glu Thr Pro Glu Gly Arg Arg Thr Ser Arg Arg Lys
50 55 60
Arg Ala Lys Val Glu Tyr Arg Glu Met Asp Glu Ser Leu Ala Asn Leu
65 70 75 80
Ser Glu Asp Glu Tyr Tyr Ser Glu Glu Glu Arg Asn Ala Lys Ala Glu
85 90 95
Lys Glu Lys Lys
100

Claims (16)

1.一种用于鉴定需要其的受试者对内分泌疾病的遗传易感性的体外方法，所述方法包括分析来自所述受试者的生物样本的步骤，以检测所述样本中存在KDM1A基因的生殖系无效突变和/或KDM1A蛋白的异常表达或活性。
2.根据权利要求1所述的体外方法，其包括以下步骤：
(i)检测所述受试者的生物样本中具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的KDM1A基因或其片段中是否存在生殖系无效突变，和/或
(ii)检测在所述受试者的生物样本中具有SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的异常表达或活性，
其中在所述具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2的KDM1A基因或其片段中检测到生殖系无效突变，或者在所述样本中检测到KDM1A蛋白的异常低表达或活性降低，表示所述受试者易于发展出内分泌疾病。
3.根据权利要求1或2所述的体外方法，其中所述异常低表达或活性降低是由于与对照样本相比KDM1A蛋白的表达降低，或者是由于截短的非功能性KDM1A蛋白表达，或者是由于影响KDM1A酶活性的杂合无效突变的存在。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的体外方法，其中所述生物样本是血液样本。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述KDM1A基因中的生殖系无效突变选自：缺失、插入、点突变如影响剪接位点的突变、截短突变、移码突变、错义突变和无义突变。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的体外方法，其中所述KDM1A基因中的所述无效突变选自：c.1848dupG、c.352-1G>A、c.1309G>T、c.1737_1738insGA、c.2361T>G、c.2441_2445del、c.952C>T、c.811C>T和c.386delA。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的体外方法，其中所述KDM1A基因中的所述无效突变是在1号染色体的至少一个等位基因上检测到的KDM1A基因座缺失。
8.一种在需要其的受试者中早期诊断内分泌疾病的体外方法，所述方法包括以下检测步骤：
-在所述受试者的血液样本中检测KDM1A基因或其片段中生殖系无效突变的存在，或检测KDM1A蛋白的异常表达和/或活性，
和
-同一受试者的内分泌组织标本中KDM1A基因或其片段中另一无效突变的存在。
9.一种在需要其的受试者中早期诊断内分泌疾病的体外方法，所述方法包括以下步骤：
-检测所述受试者的内分泌组织标本中KDM1A基因的两个等位基因上存在无效突变，
或者
-检测所述受试者的内分泌组织标本中KDM1A蛋白的异常低表达和/或活性降低。
10.根据权利要求8和9所述的体外方法，其中所述无效突变见于SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:2中，优选选自：c.1848dupG、c.352-1G>A、c.1309G>T、c.1737_1738insGA、c.2361T>G、c.2441_2445del、c.952C>T、c.811C>T和c.386delA。
11.根据权利要求8至10所述的体外方法，其中存在所述无效突变或异常低表达和/或活性降低表示所述受试者正在发展为内分泌疾病。
12.根据权利要求9至11所述的体外方法，其中如果所述内分泌组织中突变等位基因的NGS比率高于50％，则表示存在所述无效突变。
13.根据权利要求8至12中任一项所述的体外方法，其使用SEQ ID NO:4-5的引物。
14.包含SEQ ID NO:4-5的引物、或特异性识别SEQ ID NO:3的KDM1A蛋白的抗体的试剂盒在权利要求1至13所述的方法中的用途。
15.KDM1A表达或活性的抑制剂用于治疗患有与胰岛素或胰高血糖素分泌改变相关的代谢紊乱的用途，如糖尿病的患者。
16.根据权利要求15所述用途的抑制剂，其中所述抑制剂是siRNA，优选是选自SEQ IDNO:12-15的siRNA或天然或合成的化学药物，如IMG-7289(Bomedemstat)、反苯环丙明(TCP)、SP-2577(seclidemstat)、INCB059872、CC-90011、GSK2879552、ORY-1001(iadademstat)、TAK-418、ORY-2001(Vadifemstat)、阿博林宁、去甲乌药碱、卡瓦内酮、雷洛昔芬或非诺多泮。
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