KR101040652B1 - Ｔｍ４ｓｆ5의 암전이 기능을 저해하는 물질의 스크리닝 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 암전이 억제물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 더욱 자세하게는, 테트라스파닌(Tetraspanin) 단백질의 한 종류인 TM4SF5 [Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5] 단백질을 발현하는 종양 세포에 후보물질로 처리한 다음, 상기 TM4SF5 단백질 및 인테그린(integrin)과의 결합을 촉진하는 물질을 암전이 저해제로 결정하는 방법에 관한 것이다.

TM4SF5 단백질, 인테그린α2, , EC loop(Extracellular loop), 암전이

Description

ＴＭ４ＳＦ5의 암전이 기능을 저해하는 물질의 스크리닝 방법 {Method for Screening Chemicals Inhibiting a Metastasis function of TM4SF5}

본 발명은 암전이 저해 물질의 스크리닝 방법에 관한 것으로, 특히, TM4SF5에 의한 종양의 전이를 저해하는 물질의 스크린방법에 관한 것이다.

종양특이항원으로 알려진 상기 TM4SF1(L6)는 직장암, 폐암, 유방암 그리고 난소암 등에서 높게 발현되어 있는 것으로 알려져 있고, TM4SF1(L6)와 상동성을 갖는 단백질인 TM4SF5(L6H) 역시 췌장암, 폐암, 위암, 직장암, 그리고 간암 등 여러 암세포에서 높게 발현된다고 당업계에 보고되어 있다 (Muller-Pillasch, F., et al ., Gene 208:25, 1998; Pascual-Le Tallec, L. et al ., J Clin Endocrinol Metab 87:501, 2002). 그리고, TM4SF1(L6)에 비해서 TM4SF5의 mRNA의 수준은 위암 조직에선 정상조직 대비하여 발현이 통계적 의미가 있게 증가되지 않은 경우가 있다 (Kaneko, R et al., Am J Gastroenterol . 96(12):3457, 2001).

이러한 연구들에 기초하여, 최근 미국특허 US 6,350,581 B1에서 TM4SF5가 신 규 발암유전자로서 등록되었고(TUAN으로 표기), 본 발명자들에 의해서 Cos7 섬유아세포에 TM4SF5를 인위적으로 발현시킨 결과 액틴구조의 재구성과 초점 부착(focal adhesion)의 재생이 인테그린 α2와 FAK의 아미노산 타이로신 925번의 인산화를 통해 일어난다는 것과 이러한 현상은 세포성장인자들을 포함하는 세럼(serum)에 의해 저해, 조절된다는 연구결과를 보고한바 있다(S.Y Lee, et al . Exp Cell Res 312:2983, 2006). 또한, 상기 TM4SF5는 간암조직, 간암세포주 또는 위암세포에서 높게 발현되는 사실이 보고되어 있다(S-A Lee, et al., J Clin Invest ., 118(4):1354-1366, 2008; S Choi et al., BBA - Mol Cell Res ., 1783(8):1632-1641).

하지만, 종양의 전이에 있어서의 TM4SF5의 분자적 기전은 상세히 알려져 있지 않고 있는 실정이다. 즉, 분자적 수준에서의 암전이와 관련한 TM4SF5 단백질의 기능 및 그 증거는 생화학적, 세포생물학적으로 구체적으로 알려져 있지 않고 있다.

이에 본 발명자들은, 간암 세포주에서의 TM4SF5 단백질이 콜라겐 I 환경에서 integrin a2에 의한 세포의 펴짐(spreading) 및 이동과정을 부정적으로(negative) 조절하는데, 이는 TM4SF5의 EC2 부분과 integrin a2 간의 물리적 결합에 의한 것임을 관찰하고, 종양의 전이과정에 있어서 TM4SF5 단백질이 integrin 수용체와의 상호협동에 의해서 기능한다는 점을 발견하고 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 TM4SF5에 의한 종양의 전이를 저해하는 물질의 스크리닝 방법을 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 방법에 의해 스크린된 종양 전이 저해 물질을 함유하는 암전이 억제용 조성물을 제공하는데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은

(a) TM4SF5 (Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5) 단백질을 발현하는 종양세포에 암전이 억제 후보물질을 처리하는 공정; 및

(b) 후보물질로 처리하지 않은 경우와 비교하여, TM4SF5 단백질 및 인테그린 과의 결합을 조절 하는 경우의 후보물질을 암전이 저해제로 선택하는 공정을 포함하는, 암전이 저해제 스크리닝 방법을 제공한다.

이 때, 상기 결합의 위치는 TM4SF5 단백질의 EC2(extracelullar loop 2) 도메인 영역이고, 인테그린은 인테그린 α2가 바람직하다.

또한, 본 발명은 TM4SF5 단백질의 EC2(extracelullar loop 2) 도메인 영역과 인테그린 α2의 결합을 촉진하는 물질을 함유하는 암전이 억제용 조성물을 제공한다. 상기 물질은 펩타이드 등의 생리활성물질뿐만 아니라 화학물질을 포함한다.

본 발명은 종양 전이에 있어서의 TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 상호작용과 관련된 분자적 기전에 기초한 종양 전이 저해물질 스크리닝 방법으로서, 종양의 전이에 대해 길항작용을 하는 치료 및 예방목적의 물질을 스크린하는데 유용하다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, TM4SF5 단백질을 발현하는 종양세포에 대하여, 상기 TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합에 따른 다양한 세포생물학적 및 생화학적 현상에 기초한, 종양 전이 저해물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.

본 발명은 테트라스파닌(Tetraspanin)(혹은 테트라스판)의 한 종류인 TM4SF5 [Four Transmembrane L6 Superfamily member 5)]단백질을 발현하는 종양에 관한 것이다.

본 발명에 있어서, 용어 "TM4SF5 단백질"이란 Four Transmembrane L6 Superfamily member 5로(또는 'L6H'라고도 함), 세포막을 네 번 통과하는 막수용체 그룹인 테트라스패닌 (tetraspanin), 테트라스판 (tetraspan) 혹은 Transmembrane 4 Super Family (TM4SF) 에 속하는 한 종류이며, 상기 TM4SF (transmembrane 4 superfamily) 단백질들은 세포막을 네 번 통과하는 서로 유사한 구조로 이루어져 있다. 이는 생화학적으로 transmembrane domain (막횡단영역)으로 추정되는 네 개의 소수성(hydrophobic) 부위를 포함하는 구조를 공유하고 있는데, 특히 이들 중 TM4SF5를 포함하는 Four-Transmembrane L6 Superfamily (L6, TM4SF5, L6D, IL-TMP 포함)는 테트라스파닌 들 중 생화학적 기능은 잘 알려지지 않았다.

본 발명의 상기 TM4SF5 단백질은, 바람직한 일 예로서 서열번호 1로 표시되는 폴리뉴클레오티드로부터 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드의 발현을 통해 수득할 수 있다.

상기 종양 단백질 TM4SF5(Transmembrane 4 L6 family member 5)는 비수용성의 단백질로서 세포막을 통과하는 4개의 영역과 세포밖에 존재하는 2개의 고리구조와 세포질에 존재하는 2개의 말단구조를 가지고 있고, 췌장암, 폐암, 위암, 직장암, 간암 등 여러 암세포에서 높게 발현된다고 알려져 있다(Muller-Pillasch, F., et al ., Gene 208:25, 1998; Pascual-Le Tallec, L. et al ., J Clin Endocrinol Metab 87:501, 2002).

본 발명은 TM4SF5 단백질을 발현하는 종양 세포(암세포)의 전이와 관련된 것이다.

단층을 이루는 상피세포의 구조적 견고성은 상기 integrin 단백질에 의한 세포외 기질과의 결합과 E-cadherin에 의한 세포간의 접촉에 의해 유지된다. 이렇게 연결된 단층조직의 와해는 세포-세포간의 접촉이 소실됨에 따라 상피 세포-중배엽 세포로의 전이과정 (EMT, epithelial-mesenchymal transition)을 유도하고 일차적인 종양 세포체로부터 종양세포들이 파종되게 한다. 일 예로, TM4SF 단백질의 일 예인 TM4SF5 단백질 역시 세포의 형태를 변화시켜 상피 세포-중배엽 세포로의 전이 (EMT)를 유도하고 이는 다층으로 성장하여 접촉 생장저지 현상을 소실하게 된다.

종양세포의 전이과정은 기저부로부터의 탈피와 주변 기질을 통한 이동/침윤을 포함하는데, 세포의 integrin에 의한 세포외 기질로의 부착과정이 이러한 세포의 이동과 침습능력에 중요한 역할을 하게된다. 전이능을 가지는 암세포는 다양한 세포외 기질, 수용성 인자들 그리고 주위 인접해 있는 세포들로 이루어진 기질부위로 이동, 침윤하게 되는데, 이 과정에서 세포는 주변 미세환경과의 교류를 통해 세포의 생존, 증식, 이동 그리고 침윤능을 증가시킨다. 주변 미세환경과 교류하는 종양세포의 능력은 종양의 전이과정에 중요한 기능을 하며, 이는 종양세포 표면의 막수용체 단백질이 세포외 기질을 인식함으로써 이루어진다.

종양 세포의 전이와 관련하여, TM4SF 단백질들은 세포표면에서 세포부착에 관여하는 단백질들과 복합체를 형성하여 함께 그 생물학적 기능을 수행한다. 즉, TM4SF 단백질들은 인테그린(integrin) 같은 세포부착 분자들과 복합체를 형성하여 거대한 테트라스핀-웹(tetraspni-web)을 이루어, 세포의 부착, 증식 그리고 이동 같은 다양한 생물학적 기능에 기여한다.

인테그린(Integrin)은 세포부착에 관련된 수용체 집단으로, 다양한 세포내 신호전달 분자의 활성화, 액틴 필라멘트의 재구성 그리고 세포 이동과 침윤을 조절한다. 세포가 부착됨에 있어서, FAK 단백질은 397번의 타이로신 잔기에 autophophorylation이 되고 integrin의 세포내 cytoplasmic tail 부위에 FAK, paxillin, p130Cas, c-Src, Rho GTPase 등의 다양한 focal adhesion 분자들이 모여들어 integrin이 매개하는 세포증식, 침윤 등의 세포기능에 중요한 역할을 하게 된다. 이러한 세포기능에 있어서의 integrin의 역할은 성장인자 신호전달에 의해서도 영향을 받는다고 알려져 있다. 그러나 integrin과 TM4SF5 단백질들 간의 상호교류에 대해서는 거의 알려져 있지 않다

본 발명은 TM4SF5 단백질과 integrin 간, 특히 integrin α2와의 상호작용에 관한 것이다.

TM4SFs(tetraspanins) 단백질은 인테그린(integrin)과 상호 협동하여 세포의 부착과 이동에 있어 그 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. Tetraspanin 단백질들은 생합성 되는 동안 intra- 그리고 inter-molecular interaction을 통해 세포 표면에서‘tetrasanin-enriched microdomain(TERM)'를 형성한다. 이처럼, 그들은 integrin과 복합체를 형성함으로써 세포부착, 증식 그리고 운동성에 있어서 그 기능을 수행한다.

본 발명자들은 TM4SF와 유사한 구조를 가지는 Four-Transmembrane L6 Superfamily의 한 종류인 TM4SF5와 integrin간의 물리적인 결합이 상기 integrin 의 기능을 방해하여 그의 기질인 콜라겐 I 환경에서의 세포 펴짐을 저해하는 것을 확인하였고, 특히, TM4SF5와 integrin α2의 결합에 따른 세포 펴짐을 저해현상을 다양한 실험을 통해 확인하였다. 본 발명은 이러한 사실에 기초하고 있고, 본 발명 의 일 실시예에서는 간암 세포주에서 TM4SF5가 콜라겐 I의 주요 수용체인 integrin α2β1과 결합하는 것을 증명하였다.

TM4SF5는 integrin의 주요 하위조절 분자인 FAK을 조절하고, FAK/RhoGAP/RhoA 복합체를 형성하여 RhoA를 불활성화시킴으로써 세포의 형태를 길게 변화시킨다. 따라서, TM4SF5는 integrin들과 협동하고 integrin에 의해 매개되는 신호전달 체계와도 상호작용한다고 볼 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 이러한 결합이 integrin α2의 세포 안쪽에 존재하는 도메인과 TM4SF5와의 결합이 아님을 X4C2 chimera를 이용하여 증명하였다.

본 발명의 TM4SF5 단백질은 EC2 [EC loop(extracellular loop) 2] 도메인에 의한 integrin α2와의 물리적인 결합을 통해 세포의 퍼짐(spreading) 및 이동 등에 관한 기능을 조절한다.

TM4SF5의 EC2 도메인 영역에는 두 개의 시스테인 아미노산 잔기가 있고, integrin α2의 세포밖 부분과 접점을 이루어 integrin α2가 기능하는데 필요한 부분을 저해한다. 즉, EC2 도메인의 N-terminal 부분에 대한 13개의 펩타이드가 TM4SF5와 integrin α2 간의 결합을 저해한다.

다시 말해, integrin α2의 결합기질이 되는 콜라겐 I에서의 integrin α2의 기능을 TM4SF5가 저해하는 데, integrin α2β1의 발현 수준과 무관하게, EC2 도메인의 N-terminal 부분에 대한 13개의 펩타이드가 TM4SF5와 integrin α2β1간의 결합을 저해한다.

결국, 간암 등의 종양 세포주에서 TM4SF5 단백질은 콜라겐 I 환경에서 integrin α2에 의한 세포의 펴짐 그리고 이동과정을 부정적으로(negative) 조절하는데, 이는 TM4SF5의 EC2 부분과 integrin α2 간의 물리적 결합에 의한 것이다.

TM4SF5와 integrin a2간의 물리적 결합을 억제할 수 있는 펩타이드는 TM4SF5 단백질의 EC2 영역의 일부로서, 대표적인 아미노산 서열을 서열번호 3(MNGEWGYHFEDTA)으로 표시하였다. 이는 서열번호 2로 표시되는 TM4SF5 단백질의 아미노산 중 120번부터 132번 위치에 존재하는 아미노산에 해당하는 것이다.

본 발명의 일 실시예에 의하면, TM4SF5의 EC2 도메인 영역에 상응하는, 합성된 13개의 MNG 펩타이드(서열번호 3)를 처리함에 따라 이러한 TM4SF5에 의한 콜라겐 I에서의 세포 펴짐 저해는 회복되므로, 이 펩타이드는 integrin α2와 TM4SF5간의 상호연락에 있어서 슈도 바인딩 파트너로서 기능할 수 있음을 시사한다.

그리고, TM4SF5 단백질의 EC2 도메인의 N-terminal 부분에 해당하는 상기 13개의 펩타이드가 TM4SF5와 integrin α2 간의 결합을 조절하므로, 이 서열은 추후 TM4SF 단백질을 발현하는 종양 관련 연구에 있어서 주요한 타겟(Target)이 될 수 있음을 시사한다.

상기와 같은 TM4SF5 단백질과 integrin α2간의 상호작용에 대한 사실 발견에 기초하여, 본 발명은

TM4SF5 (Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5) 단백질을 발현하는 종양세포에 암전이 억제 후보물질을 처리하는 공정; 및

후보물질로 처리하지 않은 경우와 비교하여, TM4SF5 단백질 및 인테그린과의 결합을 조절하는 경우의 후보물질을 암전이 저해제로 선택하는 것을 포함하는 종양 전이(암전이) 저해제(억제제)의 스크리닝 방법을 제공한다. 특히, TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합을 촉진하는 경우의 후보물질을 암전이 저해제로 선택하는 것이 바람직하다.

바람직한 일 예로서, 이하의 공정에 따라 상기 방법을 실시할 수 있다.

(i) TM4SF5 (Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5)] 단백질을 발현하는 종양세포를 준비하는 공정;

(ii) 상기 준비된 종양세포를 콜라겐 I의 기질위에 두고, 종양 전이 저해제에 대한 후보물질을 처리하는 공정;

(iii) 상기 후보물질을 처리한 경우와 후보물질로 처리하지 않은 경우에 있어서, TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합 정도를 비교하는 공정; 및

(iv) 상기 비교 결과, TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합이 촉진되는 경우의 후보물질을 암전이 저해제로 선택하는 공정.

본 발명에서 사용하는 "종양 전이 또는 암전이(metastasis)"는 종양(암) 세포가 1차적으로 종양이 형성된 조직 혹은 생체기관으로부터 멀리 떨어진 다른 조직 및 기관으로 확산되는 과정을 의미한다. 본 명세서에서 상기 용어는 전이 과정을 통하여 발생되는 암을 또한 포함한다.

본 발명에서 사용되는 테트라스파닌 단백질 중, 바람직하게는 서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드로부터 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 발현하는 종양 세포를 배양한다. 상기 서열번호 2로 표시되는 폴리펩타이드를 발현하는 암세포는 TM4SF5 단백질을 발현하는 세포주로서, 일 구체예로서 상피세포에서 TM4SF5가 지속적으로 발현되는 SNU449 간암 세포주(KCLB No.00449)를 수립하고, 이를 배지에서 배양함으로써 실시할 수 있다. 상기 SNU449 세포 대신 SNU398세포(KCLB No.00398)를 사용해도 무방하다.

서열번호 1로 표시되는 뉴클레오티드로부터 폴리펩타이드를 발현하는 암세포로서는, 예를 들면 췌장암세포, 위암세포, 간암세포, 대장암세포, 뇌암세포, 또는 폐암세포 또는 인위적으로 제조한 암세포 등을 들 수 있지만, TM4SF5 종양 단백질을 발현하는 세포라면 어느 것이든 사용가능하다. 상기의 「인위적으로 제조한 암세포」로서는, 예를 들면 유전자 조작을 포함하는 클론 기술에 의해 TM4SF5 종양 단백질을 발현하는 세포를 들 수 있다.

본 발명의 방법은, 이어서 상기 공정에서 배양된 세포에 암전이 저해제 후보물질로 처리하는 단계를 포함한다. 본 발명의 스크리닝 방법에서, 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 암전이 저해제로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 펩타이드, 단백질, 항체, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다. 바람직하게는, TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합을 조절할 것이라 예상되는 화합물들을 처리한다.

마지막으로, 상기 후보물질로 처리하지 않은 경우와 비교하여, 상기 처리한 화합물이 TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합을 조절하는, 바람직하게는 촉진시 키는 물질을 암전이 저해제로 결정한다. 특히, TM4SF5 단백질의 EC2 도메인과 인테그린 α2의 결합을 촉진시키는 물질을 선택하는 것이 바람직하다. 상기 EC2 도메인의 N-terminal 부분에 대한 13개의 펩타이드 및 integrin α2 간의 결합 정도를 확인함으로써 암전이 저해제를 스크리닝할 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서 상기 물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.

예를 들면, TM4SF5 단백질과 시험대상물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), TM4SF5 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.

또 다른 관점에서, 본 발명은

TM4SF5 단백질이 발현하는 종양세포에 대하여, TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합 촉진제를 유효성분으로 함유하는 암전이 억제용 조성물에 관한 것이다. 구체적인 설명은 상기 설명한 바와 같다. 상기 촉진제는 펩타이드 등의 생리활성물질뿐만 아니라 화학물질을 포함한다.

상기 TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합 촉진제는 상기 스크리닝 방법에 의하여 스크린된 암전이 저해제와 일응 동일한 물질일 수 있다.

본 발명의 스크리닝 방법을 통해 얻은 물질은 암전이 저해제 후보물질이 될 수 있다. 이와 같은 암전이 저해제 후보물질은 이후의 암전이 저해제 개발과정에서 선도물질(leading compound)로서 작용하게 되며, 선도물질이 인테그린 α2와의 상호작용에 의한 TM4SF5 단백질의 암전이 기능 저해효과를 나타낼 수 있도록 그 구조를 변형시키고 최적화함으로써, 새로운 암전이 저해제를 개발할 수 있다.

본 발명의 상기 TM4SF5 단백질 및 인테그린 α2의 결합 촉진제, 즉, 암전이 저해제를 유효 성분으로 함유하는 조성물은 상기 유효 성분 이외에 약제학적으로 적합하고 생리학적으로 허용되는 보조제를 사용하여 제조될 수 있으며, 상기 보조제로는 부형제, 붕해제, 감미제, 결합제, 피복제, 팽창제, 윤활제, 활택제 또는 향미제 등의 가용화제를 사용할 수 있다.

본 발명의 상기 촉진제를 유효 성분으로 함유하는 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효 성분 이외에 추가로 약제학적으로 허용 가능한 담체를 1종 이상 포함하여 약제학적 조성물로 바람직하게 제제화할 수 있다.

액상 용액으로 제제화되는 조성물에 있어서 허용 가능한 약제학적 담체로는, 멸균 및 생체에 적합한 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 알부민 주사용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 및 이들 성분 중 1성분 이상을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액, 정균제 등 다른 통상의 첨가제를 첨가할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 더 나아가 해당분야의 적절한 방법으로 Remington's PharmaceuticalScience, Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바

람직하게 제제화할 수 있다.

본 발명의 조성물의 약제 제제 형태는 과립제, 산제, 피복정, 정제, 캡슐제,좌제, 시럽, 즙, 현탁제, 유제, 점적제 또는 주사 가능한 액제 및 활성 화합물의 서방출형 제제 등이 될 수 있다.

본 발명의 조성물은 정맥내, 동맥내, 복강내, 근육내, 동맥내, 복강내, 흉골

내, 경피, 비측내, 흡입, 국소, 직장, 경구, 안구내 또는 피내 경로를 통해 통상적인 방식으로 투여할 수 있다. 투여량은 암전이를 저해하는 효과를 이루는데 요구되는양을 의미한다. 따라서, 질환의 종류, 질환의 중증도, 조성물에 함유된 유효 성분 및 다른 성분의 종류 및 함량, 제형의 종류 및 환자의 연령, 체중, 일반 건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료 기간, 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자에 따라 조절될 수 있다. 성인의 경우, 상기 조성물을 1일 1회 내지 수회 투여시 0.1ng/kg~10㎎/kg의 용량으로 투여하는 것이 바람직하다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시 예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

특히, 하기 실시예에서는 간암 세포주만을 사용하고 있으나, 이 밖에도 췌장암세포, 위암세포, 간암세포, 대장암세포, 뇌암세포, 유방암세포, 전립선암세포, 자궁암세포, 식도암, 방광암, 또는 폐암세포 등의 인간 유래의 다양한 종류의 암조직 및 암세포주를 사용할 수 있는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1 : TM4SF5 를 발현하는 종양세포 배양

TM4SF5 (GenBank No.: NM-003963)가 지속적이고 안정적으로 발현되는 세포주를 수립하기 위해, 사람의 간암세포인 SNU449 세포(KCLB No.00449)에 대조군 벡터인 pLNCX(Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA)와 TM4SF5가 들어가 있는 pLNCX를 가진 레트로바이러스를 감염시켰다.

TM4SF5 발현 레트로바이러스를 만들기 위해, 플라스미드 pLNCX에 Huh7(JCRB No.0403) 세포의 cDNA 풀(pool)로부터 PCR방법을 통하여 얻은 Hind III/ Cla I 제한효소 제작체(construct)로 cDNA를 삽입한 후, PT67 세포 (ATCC CRL-12284)에 트랜스펙션하여 안정적으로 TM4SF5를 발현하는 세포를 얻어 배양함으로써 TM4SF5를 발현하는 레트로바이러스를 제작하였다 (Experimental Cell Research, 2006, 312:2983-2999). 이하, 상기 대조군 벡터를 삽입한 SNU449 세포는 SNU449Cp(또는 Cp)로 표기하고, TM4SF5를 발현시킨 SNU449 세포는 SNU449Tp(또는 Tp)로 표기한다.

TM4SF5 발현 레트로바이러스를 SNU449 세포에 감염 시킨 후 형성된 세포군집들을 모두 모은 세포주 (SNU449Cp 및 SNU449Tp)와 단일 세포군집을 분리하여 수립한 세포주 (TM4SF5가 발현되는 T3, T7, T11 및 T16 세포)를 수립하였다.

이 세포주들에 대하여 10% FBS, 0.25 μg/ml 젠타마이신(gentamycin)을 첨가한 다음, 200μg/ml의 G418이 첨가되거나 그렇지 않은 RPMI-1640 배지에서 5% CO₂ 및 37℃ 의 배양기로 배양하여 사용하였다.

실시예 2 : TM4SF5 를 발현하는 종양세포의 암전이능 분석

(1) Transwell 을 이용한 세포의 이동성 ( migration )과 침윤성 ( invasion ) 분석

Boyden chambers를 변형한 transwell chamber 24 well plates(Costar, Cambridge, MA)를 사용하였다.

주촉성 이동 (haptotactic mugration) 분석을 위해, 콜라겐 I 과 피브로넥틴 (10 mg/ml)으로 polycarbonate filter(8 μm porosity)를 코팅하거나, 아래의 챔버의 배지에 포함하였다. 주화성 이동 (chemotactic migration) 분석을 위해 아래의 챔버를 10% FBS/RPMI-1640 배지를 포함하고, 위의 챔버에는 5 X 10⁴ cell을 넣어 배양하였다. 또, 침윤성을 분석하기 위해 filter 위의 챔버를 12 mg/ml 농도의 Matrigel을 각 well 당 80 ml를 넣어 코팅한 후, 총 5 X 10⁵ cells/200 ml 의 농도 의 세포를 각 well에 넣어 48 시간 동안 배양하였다.

위 쪽 챔버에 남아있는 세포를 면봉으로 잘 닦아 낸 후, filter 아래 부분으로 이동된 세포를 Diff-Quick 용액으로 고정, 염색하여 광학현미경으로 관찰, 기록하였다. 무작위로 선정된 5 곳의 필드에서 세포수를 세어 그 평균값과 표준 편차 값을 나타내었다.

그 결과, 콜라겐 I에 대한 주촉성 이동을 분석한 결과, SNU449Tp 세포는 전혀 이동되지 않았고(도 12), SNU449Tp 세포의 주화성 이동은 SNU449Cp 세포에 비해 현저하게 이동성이 좋은 것으로 나타났다 (도 13).

(2) Time lapse live cell 분석

SNU449 세포를 glass chamber에 올려 온도와 CO₂ 가 공급되는 세포배양 챔버가 장착된 현미경으로 살아 있는 세포를 관찰, 기록하였다. 10분 간격으로 18시간동안 CCD 카메라로 촬영하여 얻어진 이미지를 비디오로 기록한 후 MetaMorph image 소프트웨어를 이용하여 세포를 추적하여 이동 궤도와 거리, 속도를 분석하였다.

그 결과, SNU449Tp 세포가 더 지속적으로 움직이면서 긴 거리를 이동하는 것을 관찰하였고(도 14), 그 속도 또한 SNU449Cp 세포에 비해 2배 가량 높은 것으로 분석되었다 (도 15). 따라서 TM4SF5는 콜라겐 I에 대한 주촉성 이동을 저해적으로 조절하는 반면, 주화성 이동은 촉진하는 것을 알 수 있었다.

(3) 3D collagen I을 이용한 세포의 침윤성 분석

세포의 침윤성을 분석하기 위해 Cytodex-3 microcarrier bead를 이용하였다. 세포를 bead에 부착하여 배양한 후 콜라겐 젤에 포매하여 37℃ 에서 배양한 후 시간이 경과함에 따라 세포가 콜라겐 젤 속으로 침윤하는 현상을 광학현미경으로 관찰하였다. 또, 세포의 침윤성을 분석하기 위해 앞서 언급한 Boyden chamber를 변형한 transwell chamber 24 well plates의 insert에 matrigel을 넣어 37℃에서 굳힌 뒤, 앞에서 언급된 방법대로 세포를 배양하여 24시간 후 insert 위쪽 membrane을 면봉으로 잘 닦아내고 아래 챔버로 침윤된 세포를 염색하여 관찰하였다.

Bead에 흡착된 세포를 serum이 포함된 배양액 (20% FBS/RPMI-1640)으로 젤 구조내에 심고, 표기된 시간동안 관찰한 결과, SNU449Tp 세포는 이틀째 되는 시점부터 세포외 기질로 자라나오는 모습을 볼 수 있었고, 3 일째에는 현저히 많은 세포들이 밖으로 자라 나오는 모습이 관찰되었다(도 18).

SNU449Tp 세포가 위 챔버로부터 세포가 3차원적 젤 구조를 뚫어 아래 챔버로 옮겨 나온 것을 사진 찍고, 그 세포수를 헤아려 침윤성으로 확인하였다(도 19, 그래프 안쪽 그림) Matrigel을 통과해 침윤한 세포의 모습을 위상차 현미경으로 관찰, 기록하고, 무작위로 선택된 5 장의 사진에서 침윤된 세포의 수를 세어 그래프로 나타냈다(도 19). 즉, 이러한 TM4SF5에 의한 침윤성의 증가는 세포외 기질 복합체인 Matrigel을 통해서도 나타났다.

(4) MMPs ( matrix metalloproteinase ) 프로모터 활성 분석 및 Zymography 분 석

분비된 MMPs의 기질 분해 활성을 측정하기 위해 gelatin zymography를 수행하였다. MMPs의 기질이 되는 gelatin을 SDS-PAGE의 running gel에 첨가한 후 reducing 조건에서 전기영동한 다음 1% Triton X-100 완충용액에서 재변성시킨 후 효소 반응 완충용액 (10 mM CaCl₂, 0.15 M NaCl와 50 mM Tris-HCL, pH 7.5 )으로 37℃에서 18시간 반응시켰다. 이후 0.5% Coomassie brilliant blue R250으로 3`시간 염색시킨 다음 10% acetic acid, 30% methanol에서 투명한 밴드가 나타날 때까지 탈색하였다

MMPs의 활성을 zymography로 분석한 결과, SNU449Cp에 비해 TM4SF5가 발현되는 SNU449Tp 세포주에서 MMP2와 MMP9의 활성이 높게 나타났다 (도 21)

그리고, pGL3-human MMP2 또는 MMP9, pBabe-β-galactosidase 및 myc-(His)₆-TM4SF5를 세포에 주입하여 24 시간동안 발현시켰다. 아무것도 삽입되어 있지 않은 대조군 벡터를 총 DNA 주입량을 맞추기 위해 사용되었으며, luciferase 활성을 루미노미터를 이용하여 측정하고 그 값은 β-galactosidase 활성을 측정함으로써 보정되었다.

모세포인 SNU449 세포주에 MMP-luciferase, β-galactosidase, 그리고 다양한 양의 myc-(His)₆-TM4SF5를 트렌스펙션하여 luciferase assay를 수행하고, β-galactosidase assay로 그 값을 보정한 결과, TM4SF5는 MMP9의 전사활성을 증가시 키는 것으로 나타났으나 MMP2는 그렇지 않은 것으로 관찰되었고(도 22), SNU449 세포의 클론들로부터 얻어진 세포 용해물을 이용하여 MMP9 과 a-tubulin의 발현을 western blot으로 분석한 결과, MMP9의 단백질 발현도 같이 증가되는 것으로 나타났다(도 23).

추가로, 게다가 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포로부터 얻어진 배양농축액을 이용하여 항체어레이 분석을 하였다. SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포로부터 얻어진 배양농축액을 TIMP1 과 TIMP2가 포함된 다양한 항체들이 포함된 RayBiotech^® 항체 어레이를 이용하여 분비된 사이토카인들의 수준을 측정하였다.

그 결과, 도 24에 나타난 바와 같이, MMP2와 MMP9의 저해분자인 tissue inhibitors of metalloprotease 1 과 2 (TIMP1 그리고 TIMP2)의 분비량이 SNU449Tp 세포에서 현저하게 적은 것으로 나타났다. 그러나 다른 사이토카인들의 분비량은 변화가 없었다.

이러한 결과들로부터, TM4SF5의 발현이 MMP2의 활성을 증가시키는 것은 전사후의 과정에서의 증가이며, MMP9 활성의 증가는 전사수준과 전사 후의 수준에서의 증가로 인한 것으로 생각된다.

(5) 동물 모델에서의 암세포의 전이능 분석

서울대학교 전임상 실험실의 동물사육지침에 따라 4주간 사육한 후, 모든 마우스들을 희생하여 폐 전이를 분석하였다.

SNU449 세포를 10⁷ cells/100`ml의 농도로 RPMI-1640 배지에 부유하여 누드마우스의 꼬리정맥에 정맥`주사하고, 모든 누드 마우스는 암세포 주입 후 4주 뒤에 희생하여 폐`조직을 적출하였다. 폐에 전이된 종양 덩어리를 육안으로 확인, 그 숫자를 세고 그 무게를 측정하였다. 고정된 조직을 hematoxylin and eosin 염색을 시행하였다.

그 결과, SNU449Tp 세포가 주입된 마우스의 폐 조직은 SNU449Cp 세포가 주입된 마우스의 폐에 비해 3 ~4 배 가량 더 큰 것으로 관찰되었다(도 26 및 27). 도 26에서 마우스로부터 적출된 폐 조직은 크기에서 차이점을 나타냈고, 육안으로 확인 가능한 종양 덩어리를 화살표로 표시하였다. 도 27에서는 마우스로부터 적출한 폐의 무게를 측정하고, 표면의 종양 덩어리의 수를 세었다

그리고, 폐 조직을 파라핀에 침수하여 H & E 염색을 시행하여 100배 배율의 현미경으로 관찰한 결과, SNU449Tp 세포가 주입된 마우스의 폐의 표면에서 육안으로 종양 덩어리들을 관찰할 수 있었는데(도 28) 이는 전이된 세포 덩어리로 보였다.

한편, SNU449Cp와 SNU449Tp 세포를 10⁷ cells/100 ml의 농도로 누드 마우스의 간에 직접 주사하고, 서울대학교 전임상 실험실의 동물사육지침에 따라 사육하며 생존율을 분석한 결과, SNU449Tp 세포가 간에 직접 주입된 마우스는 주사 평균 33일만에 죽는 반면, 대조군 SNU449Cp 세포가 간에 주사된 마우스는 건강한 삶을 보여주는 효과를 확인하였다(도 29).

실시예 3 : TM4SF5 와 인테그린 α2의 상호작용 분석 I- 기질( substrate ) 의존성

(1) 다양한 세포외기질에 있어서의 세포퍼짐(spreading) 현상

각기 다른 세포외 기질 환경에서 TM4SF5의 발현에 따른 세포의 특징을 이해하기 위해 TM4SF5가 발현되지 않는 SNU449Cp 세포와 TM4SF5가 발현되는 SNU449Tp 세포를 다양한 세포외 기질로 코팅된 배양접시에 올려두었다.

SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포를 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN) 또는 콜라겐 I (Coll I)으로 미리 코팅한 배양접시에 올려, serum이 포함되지 않은 배양액으로 2 시간 동안 배양한 후, 세포의 모습을 사진으로 기록하였다.

그 결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이, 라미닌 상에서는 SNU449Cp 와 Tp 세포의 부착 및 펴짐 상태는 별다른 차이점이 없었으나, 피브로넥틴과 콜라겐상에서는 차이점을 관찰할 수 있었는데, SNU449Cp 세포에 비해서 SNU449Tp 세포는 피브로넥틴에서 세포의 퍼짐 현상이 좋게 나타났고, 콜라겐 I 상에서는 세포가 펴지는데 있어서 제약을 받는 것으로 나타났다.

(2) integrin α2와의 상호작용

상기 실시예 3의 결과로부터, SNU449Tp 세포의 펴짐 현상이 어떻게 저해되는지 조사하기 위하여, 먼저, SNU449Tp 세포에서 TM4SF5와 integrin α2의 위치를 면 역염색법으로 분석하였다.

SNU449Tp 세포를 10% FBS/RPMI-1640 배지로 미리 코팅한 커버글라스 위에 올린 후, 24 시간 동안 배양하고, TM4SF5 (빨간색)와 integrin α2 (초록색) 으로 이중-형광면역염색법을 수행하였다. 그 결과, 도 3과 같이, integrin α2와 TM4SF5 단백질은 세포의 가장자리를 따라 같이 위치하는 것으로 나타났다.

다음으로, integrin α2와 TM4SF5간의 면역침강법을 수행하기 위해 MNG 펩타이드를 처리하거나 하지 않은 세포의 단백질 혼합물을 이용하였다. 또 SNU449Tp 세포주에 세포안의 부분은 integrin α2이고, 세포막을 통과하는 부분과 세포밖의 부분은 α4인 X4C2 chimera를 발현시킨 세포의 단백질 혼합물을 이용하여 앞서 설명된 방법에의해 면역침강법을 수행하였다.

그 결과, integrin α2와 그의 결합짝인 β1 integrin이 TM4SF5와 함께 면역침강되는 것으로 나타났다 (도 4).

이러한 결과들로부터, integrin α2와 TM4SF5의 물리적인 결합은 integrin α2의 기능을 방해하여 그의 기질인 콜라겐 I 환경에서의 세포 펴짐을 저해하는 것을 알 수 있다.

실시예 4 : TM4SF5 와 인테그린 α2의 상호작용 분석 II - 결합 위치 확인

(1) MNG 펩타이드 준비

MNG 펩타이드는 사람의 TM4SF5의 세포밖 도메인인 EC2(extracellular loop 2)에 해당하는 ¹²⁰MNGEWGYHFEDTA¹³²로 구성된 13개의 펩타이드이다. 이는 사람의 TM4SF5의 아미노산 120번부터 132번에 해당한다. 상기 펩타이드의 합성, 정제 및 분석은 A& Pep사에서 수행되었고 질량분석은 voyager DE-STR MALDI-TOF Mass를 통해 1557 달톤으로 분석되었다. 이렇게 준비된 펩타이드는 6 μM 또는 표기된 농도로 배양세포에 직접 처리하여 24`시간 동안 배양하였다.

(2) MNG 펩타이드 처리 결과

상기에서 준비한, MNG 펩타이드 (6 μM의 농도로 24시간)를 처리하거나 그렇지 않은 세포를 콜라겐 I이 코팅된 커버글라스위 또는 배양접시에 올려 2 시간 동안 배양하였다. 그리고, 커버글라스 위에 올려진 세포는 위상차 현미경으로 관찰하거나, 그림에 표기된 항체로 면역염색하거나, phalloidin으로 액틴을 염색하여 형광현미경으로 관찰하였다.

그 결과, SNU449Cp 세포는 잘 펴지고 전형적인 세포모양을 형성하였고. 이와 더불어 pY³⁹⁷FAK, pY⁹²⁵FAK, 그리고 pY¹¹⁸ paxillin이 focal adhesion 부분에서 잘 활성화되어 나타나고 액틴의 강한 섬유상의 구조도 잘 갖추어져 나타났으나(도 5, 첫줄), SNU449Tp 세포는 이러한 focal adhesion 의 활성이 보이지 않고 매우 제한적인 세포모습을 갖추고 있는 것을 관찰하였다 (도 5, 셋째줄). 즉, MNG 펩타이드는 SNU449Cp 세포의 부착과 퍼짐에는 어떤 영향도 주지 않는 반면, SNU449Tp 세포는 콜라겐 I 상에서 MNG를 처리하였더니 완전히 제 모습을 갖추어 잘 펴지는 것을 관 찰되었다 (도 5의 둘째 및 넷째줄 및 도 11).

다음으로, 전체 세포 용해물을 준비하여 그림에 표기된 항체로 western blot을 수행하거나, integrin α2로 면역침강법을 수행한 후, TM4SF5에 대한 항체로 western blot을 수행하였다.

그 결과, FAK과 paxillin은 SNU449Cp 세포와 비교하여 SNU449Tp 세포에서 덜 활성화됨을 관찰하였다 (도 6의 첫째 및 셋째줄). 그리고, 이와 마찬가지로 FAK과 paxillin의 인산화도 SNU449Cp 세포 수준으로 복구되는 것을 보았다 (도 6의 둘째 및 넷째줄). 따라서 TM4SF5는 integrin α2와 물리적으로 결합함으로써 integrin α2에 의한 세포내 신호활성화을 저해하는 것을 확인할 수 있었다. 게다가 면역형광염색법을 통해서 상기 MNG 펩타이드의 처리에 의해 integrin α2와 TM4SF5 단백질간의 결합이 와해되는 것을 확인하였다(도 7).

커버글라스 위에 올려진 세포를 TM4SF5 (빨간색) 와 integrin α2 (초록색)으로 이중-형광면역염색한 결과, SNU449Tp 세포에서 이 두 단백질은 따로 분리되어 염색되었는데, TM4SF5 단백질은 세포의 가장자리와 핵 주변에 위치하는 반면, integrin α2는 focal adhesion 부분과 fibrillar adhesion 부분에 위치하는 것으로 나타났다 (도 8).

SNU449Tp 세포에 MNG 펩타이드를 처리한 후 유속세포분석기로 세포표면의 integrin α2 발현을 조사한 결과, 세포 표면의 integrin α2를 FACS 분석을 통해 조사한 결과, MNG 펩타이드에를 처리하지 않은 경우와 비교하여 더 많은 세포표면 의 integrin α2가 관찰되었다 (도 9).

한편, SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 X4C2 chimera (세포 안쪽 부분은 integrin α2이고 세포막을 통과하는 부분과 세포 밖의 부분은 α4로 구성되어 있는 chimera)를 주입하여 48 시간 동안 배양한 후 단백질 혼합물을 얻어 normal IgG 와 integrin α2 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 후 TM4SF5 항체로 western blot을 수행한 결과, TM4SFS5와 integrin α2의 상호결합은 integrin α2의 세포 안에 존재하는 부분과의 결합이 아닌 것으로 나타났다. 즉, 세포 안의 꼬리부분만 integrin α2인 chimera를 발현시켜 이 둘의 결합을 분석한 결과 TM4SF5와 결합하지 못하는 것을 보았다 (도 10). 이러한 결과들로 보아, TM4SF5의 EC2를 포함하는 세포밖 부분이 integrin α2와의 결합을 통해 integrin α2의 기능저해에 관여함을 알 수 있었다.

그리고, Time-lapse live imaging으로 MNG 펩타이드가 처리되지 않은 혹은 처리된 (6 μM의 농도로 24시간) SNU449Tp 세포를 collagen I이 코팅된 slide chamber위 에 올려 놓은 후, 표기된 시간동안 관찰, image를 촬영하였다.

그 결과, SNU449Tp 세포가 collagen I위에서 잘 퍼지지 못하는 현상이 MNG 펩타이드 처리에 의해 퍼짐현상 (spreading)이 가속화되는 것을 확인하였다.(도 11)

실시예 5 : TM4SF5 단백질에서 MNG 펩타이드의 기능

(1) TM4SF5에 의한 이동성에 있어서 MNG 펩타이드의 효과

MNG 펩타이드를 처리하지 않은 세포를 준비하여 transwell을 이용해 이동성을 측정하였다. 그림에 표기된 세포외 기질 (10 μg/ml )로 filter를 코팅하거나, serum이 없는 배지와 함께 아래 챔버를 채웠다. 위 챔버의 세포들이 16시간 동안 아래 챔버의 세포외기질 향한 이동성을 관찰하였다.

그 결과, 콜라겐 I에 대한 이동성이 MNG 펩타이드에 의해 회복되는 것으로 나타났고(도 16, 왼쪽), 대조군인 SNU449Cp 세포는 MNG 펩타이드에 의해 어떠한 영향도 받지 않는 것으로 나타났다. 그리고, 피브로넥틴에 대한 주촉성 이동은 SNU449Cp에 비해 SNU449Tp 세포의 이동성이 더 좋게 나타났지만 MNG 펩타이드의 작용에 상관없는 것으로 나타났다 (도 16, 오른쪽). 이로서 MNG 펩타이드의 효과는 TM4SF5와 integrin a2간의 상호작용에 특이적인 것으로 생각된다.

한편, 앞서 설명한 대로 MNG 펩타이드를 처리하거나 하지않은 세포를 준비하여 transwell을 이용해 이동성을 측정하되, serum이 포함된 배양액을 아래의 챔버를 채웠다. 위 챔버의 세포들이 24시간 동안 아래 챔버의 serum 및 세포외기질을 향한 이동성을 관찰하였다.

그 결과, 콜라겐 또는 피브로넥틴으로 코팅된 필터를 이용한 주화성 이동에서는 SNU449Tp 세포의 이동이 더 잘 이루어지는 것으로 나타났다 (도 17, 위). 그러나 MNG 펩타이드의 처리는 주화성 이동에는 영향주지 못하는 것으로 나타났다 (도 17, 아래).

(2) MNG 펩타이드와 침윤성

MNG 펩타이드를 처리한 세포의 침윤성을 조사하기 위해 3차원적 콜라겐 I을 재료 및 방법에 설명한 대로 이용하여 3차원적 젤 구조를 만들었다. 대조 혹은 MNG 펩타이드를 처리한 세포를 serum이 포함된 배양액 (20% FBS/RPMI-1640)으로 젤 구조내에 심고, 표기된 시간동안 관찰하였다.

그 결과, SNU449Tp 세포가 Bead 표면으로부터 세포가 증식하여 자라나와, 3차원적 젤 구조를 뚫어 나오는 침윤성으로 확인하였고, 상기 SNU449Tp 세포의 높은 침윤성은 MNG 펩타이드를 처리함에 따라 더 촉진되는 것으로 관찰되었다 (도 20)

(3) MNG 펩타이드와 MMPs의 활성

다음으로 MNG 펩타이드가 MMPs의 활성 역시 조절하는지 조사하였다. MNG 펩타이드를 처리 또는 처리하지 않은 세포의 배양농축액을 이용하여 재료 및 방법에서 설명한 대로 젤라틴 zymography를 수행하여 MMP2 와 MMP9의 활성을 조사하였다.

그 결과, MNG 펩타이드는 MMP9의 활성을 농도의존적으로 증가시킴을 관찰되었다(도 25).

도 1은 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포를 피브로넥틴 (FN), 라미닌 (LN) 또는 콜라겐 I (Coll I) 기질에서 배양 후의 세포 사진이다.

도 2는 각 세포들에 대하여, 사람의 인테그린 서브유닛들 및 α-튜블린의 발현을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이다.

도 3은 SNU449Tp 세포에 대한 이중-형광면역염색법 결과이다.

도 4는 SNU449Tp 세포에 대하여 면역침강법 실시 후의 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 5는 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 대하여, 도면에 표기된 항체로 면역염색하거나, 팔로이딘(phalloidin)으로 액틴을 염색하여 형광현미경으로 관찰한 결과이다.

도 6 및 도 7은 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 대한 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 8은 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 대한, 이중-형광면역염색법 결과이다.

도 9는 SNU449Tp 세포에 MNG를 처리한 후, 유속세포분석기에 의한 결과 그래프이다.

도 10은 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 대하여, 정상 IgG(normal IgG)와 인테그린α2 항체를 이용하여 면역침강법을 수행한 후의 웨스턴 블럿 분석 결과이다.

도 11은 MNG 펩타이드 처리 유무에 따른 SNU449Tp 세포의 Time-lapse live imaging 사진이다.

도 12 및 도 13은 혈청(serum) 유무에 따른, MNG 펩타이드를 처리하지 않은 세포의 이동성 관찰 결과이다.

도 14 및 도 15는 Time-lapse live imaging 방법에 따라, 각각의 세포의 위치 추적(도 14) 및 속도(도 15)를 분석한 결과이다.

도 16 및 도 17은 혈청(serum) 유무 및 MNG 펩타이드 처리 유무에 따른 세포의 이동성 관찰 결과이다.

도 18 및 도 19는 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에 대하여, 각각 3차원적 콜라겐 I 기질 및 3차원적 매트리젤 (Matrigel)에 있어서의 시간에 따른 침윤성 결과 사진과 침윤된 세포수 그래프이다.

도 20은 MNG 펩타이드를 처리한 세포에 대한, 콜라겐 I 기질에 있어서의 시간에 따른 침윤성 결과이다.

도 21은 SNU449 세포의 MMP2 와 MMP9의 활성을 지모그래피(zymography)로 분석한 결과이다.

도 22는 각 세포에 대하여 루시퍼라아제 분석(luciferase assay)을 수행한 결과 그래프이다.

도 23은 SNU449 세포에 있어서 MMP9 과 α-튜블린의 발현을 웨스턴 블럿으로 분석한 결과이다.

도 24는 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포에서 RayBiotech^® 항체 어레이를 이용하여, 분비된 사이토카인들의 수준을 측정한 결과이다.

도 25는 MNG 펩타이드 처리에 따른 MMP2 와 MMP9의 활성의 zymography 분석 결과이다.

도 26은 마우스로부터 적출된 폐 조직의 종양을 확인한 사진이다.

도 27은 마우스로부터 적출한 폐의 무게 측정 및 표면의 종양 덩어리의 계수결과이다.

도 28은 폐 조직을 파라핀에 침수하여 H & E 염색을 시행한 후, 100배 배율의 현미경으로 관찰한 결과이다.

도 29는 SNU449Cp 세포와 SNU449Tp 세포가 주입된 마우스에 대하여 생존율을 분석한 결과이다.

<110> Seoul National University Industry Foundation <120> Method for Screening Chemicals Inhibiting a Metastasis function of TM4SFs <130> P08-B137 <160> 3 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 708 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 actcaccgcc tgtccttcct gacacctcac catgtgtacg ggaaaatgtg cccgctgtgt 60 ggggctctcc ctcattaccc tctgcctcgt ctgcattgtg gccaacgccc tcctgctggt 120 acctaatggg gagacctcct ggaccaacac caaccatctc agcttgcaag tctggctcat 180 gggcggcttc attggcgggg gcctaatggt actgtgtccg gggattgcag ccgttcgggc 240 agggggcaag ggctgctgtg gtgctgggtg ctgtggaaac cgctgcagga tgctgcgctc 300 ggtcttctcc tcggcgttcg gggtgcttgg tgccatctac tgcctctcgg tgtctggagc 360 tgggctccga aatggaccca gatgcttaat gaacggcgag tggggctacc acttcgaaga 420 caccgcggga gcttacttgc tcaaccgcac tctatgggat cggtgcgagg cgccccctcg 480 cgtggtcccc tggaatgtga cgctcttctc gctgctggtg gccgcctcct gcctggagat 540 agtactgtgt gggatccagc tggtgaacgc gaccattggt gtcttctgcg gcgattgcag 600 gaaaaaacag gacacacctc actgaggctc cactgaccgc cgggttacac ctgctccttc 660 ctggacgctc actcccttgc tcgctagaat aaactgcttt gcgctctc 708 <210> 2 <211> 197 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2 Met Cys Thr Gly Lys Cys Ala Arg Cys Val Gly Leu Ser Leu Ile Thr 1 5 10 15 Leu Cys Leu Val Cys Ile Val Ala Asn Ala Leu Leu Leu Val Pro Asn 20 25 30 Gly Glu Thr Ser Trp Thr Asn Thr Asn His Leu Ser Leu Gln Val Trp 35 40 45 Leu Met Gly Gly Phe Ile Gly Gly Gly Leu Met Val Leu Cys Pro Gly 50 55 60 Ile Ala Ala Val Arg Ala Gly Gly Lys Gly Cys Cys Gly Ala Gly Cys 65 70 75 80 Cys Gly Asn Arg Cys Arg Met Leu Arg Ser Val Phe Ser Ser Ala Phe 85 90 95 Gly Val Leu Gly Ala Ile Tyr Cys Leu Ser Val Ser Gly Ala Gly Leu 100 105 110 Arg Asn Gly Pro Arg Cys Leu Met Asn Gly Glu Trp Gly Tyr His Phe 115 120 125 Glu Asp Thr Ala Gly Ala Tyr Leu Leu Asn Arg Thr Leu Trp Asp Arg 130 135 140 Cys Glu Ala Pro Pro Arg Val Val Pro Trp Asn Val Thr Leu Phe Ser 145 150 155 160 Leu Leu Val Ala Ala Ser Cys Leu Glu Ile Val Leu Cys Gly Ile Gln 165 170 175 Leu Val Asn Ala Thr Ile Gly Val Phe Cys Gly Asp Cys Arg Lys Lys 180 185 190 Gln Asp Thr Pro His 195 <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> the peptide consising of EC2 in TM4SF5 <400> 3 Met Asn Gly Glu Trp Gly Tyr His Phe Glu Asp Thr Ala 1 5 10

Claims (12)

1. (a) TM4SF5 (Four-Transmembrane L6 Superfamily member 5) 단백질을 발현하는 종양세포를 콜라겐 I 기질에 두고 암전이 억제 후보물질을 처리하는 공정; 및

   (b) 후보물질로 처리하지 않은 경우와 비교하여, TM4SF5 단백질의 EC2 (extracellular loop 2) 도메인 영역 및 인테그린 α2와의 결합을 촉진하는 경우의 후보물질을 암전이 저해제로 선택하는 공정을 포함하는, 암전이 저해제 스크리닝 방법.
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3. 제1항에 있어서, 상기 TM4SF5 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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7. 제1항에 있어서, 상기 EC2(extracelullar loop 2) 도메인은 서열번호 3의 아미노산 서열로 표시되는 폴리펩티드인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
8. 제1항에 있어서, 상기 종양세포는 췌장암, 위암, 간암, 대장암, 뇌암, 유방암, 갑상선암, 방광암, 식도암, 자궁암, 및 폐암으로 구성된 군에서 유래된 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
9. 제8항에 있어서, 상기 종양세포는 간암 유래인 것을 특징으로 하는 스크리닝 방법.
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