KR20180015238A - 시스템들 및 방법들 - Google Patents

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Abstract

세포와 같은 생물체를 포함하는 액적들, 수중유 에멀젼에서의 수성 액적들을 처리하기 위한 도구들, 카트리지이 설명된다. 일 실시예에서, 이러한 처리 방법은: 유체 내에 복수의 개체들을 제공하는 것; 유체로부터 액적을 마련하는 것; 액적이 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함하는지 아니면 액적이 개체를 포함하지 않는지 여부를 결정하는 것; 결정의 결과에 따라 액적을 분류하는 것; 및 분류된 액적을 저장소로 분배하는 것을 포함하고, 분배하는 것은: 분배를 위해 분류된 액적을 확인하는 것; 유체의 제1 유체 흐름 경로로부터 분류된 액적을 추출하는 것으로서, 분류된 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달함으로써 수행되는, 추출하는 것; 및 제2 유체 흐름 경로에 압력을 인가함으로써 분류된 액적을 제2 유체 흐름 경로로부터 저장소로 배출하는 것을 포함한다. 바람직한 실시예들에서, 액적 내용물들은 개별 액적의 내용물들이 분류되고, 선택적으로 분배되고, 추후 처리 또는 분석을 위해, 또는 후속 사용을 위해, 예를 들어 발효 등에 사용될 수 있도록, 추적된다.

Description

시스템들 및 방법들
본 발명은 일반적으로 하나 이상의 개체, 특히 생물체를 포함하는 액적(droplet)을 제공하는 시스템 및 방법에 관한 것이다.
본 명세서는 전형적으로 계면활성제로 안정화된, 유중수(water-in-oil)에 관한 미세 액적을 포함하는 에멀전들에 관련된다. 하나 이상의 생물 세포 또는 입자와 같은 하나 이상의 생물체가 각각의 액적에 혼입될 수 있으며, 이후 예를 들어 생물학적 분석을 수행하기 위해 액적 내에서 실험들이 수행될 수 있다. 미세 액적들은 초당 수천을 초과하는 속도로 잠재적으로 생성 및 처리될 수 있다.
전형적으로, 오일 조성물은 불소 및/또는 미네랄 오일, 바람직하게는 계면 활성제, 예를 들어 약 0.5 내지 5 % vol/vol를 포함한다. 불소 오일이 미세 액적에 산소를 운반하기에 좋기 때문에, 불소 오일의 사용은 미세 액적이 살아있는 물질을 함유할 때 특히 유리하다. 계면 활성제는 중합체 또는 소분자일 수 있다; 예를 들어 KrytoxTM 또는 폴리에틸렌 글리콜(PEG)과 같은 퍼플루오로에테르들(perfluoroethers)의 블록 공중합체들(block co-polymers)로부터 유도된 계면 활성제가 사용될 수 있다. 미세 액적 내의 물질 또는 분석물은 예를 들어 세포, DNA, 단백질, 펩타이드, 비드들(beads), 입자들, 결정들, 미셀들(micelles), 거대 분자들, 효소 분석을 위한 물질, 세포소기관들(organelles), 포유류 세포(mammalian cell), 효모 세포, 조류 세포 또는 세균, 바이러스, 프리온 등의 세포와 같은 유기체 등을 포함할 수 있다. 전형적으로, 액적은 더 큰 (또는 더 작을 수 있지만) 1 내지 120 ㎛의 범위의 직경을 가지며, 나노리터(nanolitres) 내지 펨토리터(femtolitres)의 범위의 체적을 제공할 수 있다.
미세유체 장치 상의 집적된 능동 요소들은 개별 액적들을 제어하는데 사용될 수 있다 - 예를 들어, WO2009/050512에 기술된 바와 같이, 마이크로 액적들의 내용물을 연속 스트림으로 통합함으로써 온-칩 추출을 가능하게 하는 기술이 있다. 미세 액적의 다른 일반적인 배경 선행 기술은 RainDance Technologies Inc.의 명칭으로 특허/출원된, 예를 들어 WO2008/063227에서 찾을 수 있다. 단일 세포 또는 입자 분류(sorting)가 예를 들어 US2008/0053205과 같은 선행 기술; "Encapsulation of single cells on a microfluidic device integrating droplet generation with fluorescence-activated droplet sorting" 라는 제목의 논문(Biomed Microdevices 2013, 15(3):553-60); "Analyzing Cancer at Single Cell Resolution with Droplet Technology"라는 제목의 기고글(RainDance Technologies, URL: http://raindancetech.com/rdt/wp-content/uploads/2012/05/ poster_analyzing_cancer_with_droplet_technology.pdf)로부터 알려져 있다.
비록 이 기술들은 유용하지만, 확장될 수 있다. 예를 들어 약물 저항성과 관련된 것들과 같은 매우 드문 생물체들 또는 개체들에서의 생물학적 거동을 진단하는 것과 관련된 어려운 문제가 있다. 다른 과제는 단일클론성(monoconality)을 보장하는 것이다: 약물 규제 기관들은 종종 생물 약제들 및 기타 화학 또는 생화학적 개체들이 단일의 생존 가능한 개체 또는 개체들의 특정 조합으로부터 성장할 것을 요구한다. 이것은, 예를 들어, 단일 세포 또는 다수의 실질적으로 동일한 생존 가능한 세포들로부터 유래하는 세포 집단을 증식하는 것이 세포 집단 전체에 걸친 단일클론성의 높은 확률을 보장하기 때문이다. 또 다른 과제는 생산 수율이 높은 발효를 위한 세포들의 그룹을 선택하는 것과 관련된다.
이러한 문제들을 해결하는데 사용될 수 있는 기술이 필요하다.
본 발명의 제1 측면에 따르면, 하나 이상의 개체들을 포함하는 액적을 제공하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 유체 내 복수의 개체들을 제공하는 것; 상기 유체로부터 액적을 마련하는 것; 상기 액적이 상기 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함하는지 아니면 상기 액적이 상기 개체를 포함하지 않는지 여부를 결정하는 것; 상기 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하는 것; 및 상기 분류된 액적을 저장소로 분배하는 것을 포함하고, 상기 분배하는 것은, 상기 분류하는 것 이후: 상기 분류된 액적을 포함하는 유체에 대한 유체 흐름 경로를 선택하는 것; 및 상기 선택된 경로로부터 상기 분류된 액적을 배출하는 것을 포함한다.
본 발명자들은 단일 액적, 예를 들어 (약 1천 또는 수천 피코 리터 이하의 체적의) 피코액적에서 단일 개체 또는 개체들의 정의된 단일 조합을 얻는 확률이, 이 방법의 실시예들을 사용하여 증가될 수 있음을 깨달았다. 상기 방법에서의 마련, 결정/분류 및 분배 단계들 각각은 단일 액적 내의 하나 이상의 타겟 개체를 얻는 소정의 확률을 갖는다. 이들 단계들을 조합함으로써, 상기 방법은 99.9%보다 높은 확률, 특히 99.99%보다 높은 확률로 단일 액적에서 상기 개체들의 단일 타겟 개체 또는 개체들의 단일 타겟 조합을 얻는 것을 허용한다. 예를 들어, 이것은 포아송 통계를 사용한 캡슐화 (후술함), 교차점에서의 분류, 및 분배 지점에서의 분류/선택(각각 90% 이상 선택)의 3단계의 선택으로 달성될 수 있다. 유사한 방식으로, 상기 방법의 실시예들은 큰 집단으로부터 매우 희소한 타겟 액적들을 추출하는 것을 용이하게 한다.
명세서 전체에 걸쳐 참조가 개체들의 단일 (타겟) 조합에 대해 이루어졌으나, 이는 정의된 수의 실질적으로 동일한 개체들(예를 들어 정의된 수의 세포 유형) 또는 정의된 범위 내의 실질적으로 동일한 개체들의 수, 또는 정의된 수(구체적이거나 범위 내의 수)의 제1 개체들(예를 들어, 정의된 수의 제1 세포 유형) 및 정의된 수(구체적이거나 범위 내의 수)의 제2 또는 추가 개체들(예를 들어, 정의된 수의 제2 또는 추가 세포 유형)을 포함할 수 있다. 따라서, 액적 내의 타겟 개체 또는 개체들은, 예를 들어: 정의된 수(1 이상)의 A 타입의 개체들; 정의된 수(1 이상)의 A 타입의 개체들 및 정의된 수(1 이상)의 B 타입의 개체들; 정의된 수(1 이상)의 3개 이상의 타입들의 각각의 개체들일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은, 분배를 위해 상기 분류된 액적을 확인하는 것; 상기 유체의 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 분류된 액적을 추출하는 것으로서, 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달함으로써 수행되는, 추출하는 것; 및 상기 제2 유체 흐름 경로에 압력을 인가함으로써 상기 분류된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로부터 상기 저장소로 배출하는 것을 포함한다.
본 방법의 일 바람직한 실시예에서, 상기 전달하는 것은 상기 분류된 액적이 상기 제1 유체 흐름 경로의 부분에 있는 동안 분배를 위해 상기 분류된 액적에 압력을 인가하는 것을 포함하고, 이후 상기 분류된 액적이 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달되고 상기 분류된 액적이 배출되는 것을 포함한다. 실시예들에서, (유중수) 에멀젼은 흐름 경로의 공유된 영역을 통해 제1 유체 흐름 경로를 따라 유동하고, 이후 제1 흐름 경로를 따라 계속되거나 또는 공유된 흐름 경로에 또는 하나의 흐름 경로 가해진 양의 및/또는 음의 (흡입) 압력에 의해 제2 흐름 경로로 전환될 수 있다. 따라서, 실시예들에서, 분배는 선택적으로 그러나 바람직하게는 경로를 선택하기 위한 액적 선택/분류 메커니즘과 관련하여 공유된 흐름 영역을 갖는 분기형(branched) 또는 T-접합 채널 배열을 채택할 수 있다.
이 접근법은, 실시예들에서, 이전에 이미 분류된 액적의 추가 분류 단계를 허용할 수 있다. 따라서, 제2 분류 단계 전에 액적(droplet)이 검출될 수 있고 선택적으로 그 구성 성분이 분석될 수 있다. 분류된 액적의 검출 및/또는 분석은 제1 유체 흐름 경로의 공유된 흐름 경로 및 압력이 인가될 수 있는 경로에서 수행될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 액적은 공유된 흐름 경로 이전에 검출 및/또는 분석될 수 있다. 바람직한 실시예에서, 액적이 배출될 수 있는 제2 유체 흐름 경로는 제1 및 제2 (또는 추가) 출력 채널들을 포함할 수 있다. 제2 출력 채널의 압력은 (예를 들어, 제2 출력 채널에 연결된 펌프를 사용하여) 감소될 수 있다. 분류된 액적의 검출 및/또는 분석에 응답하여 제1 유체 흐름 경로에 있는 동안, 전술한 바와 같이, 분류된 액적에 압력을 가함으로써 제1 출력 채널을 통해 액적이 분배될 수 있다. 이는 분류된 액적이 펌프를 사용하여 제2 출력 채널로 추출되지 않는 것을 보장할 수 있다. 만일 액적이 제2 출력 채널로부터 분배되어야 하는 경우, 예를 들어, 액적이 관심 대상이 아닌 경우, 압력이 가해지지 않을 수 있고, 그에 따라 펌프는 액적을 제2 출력 채널로 흡입한다. 관심이 있는 액적인지 여부를 결정하기 위한 액적 분석은 액적 내의 정의된 수의 타겟 개체들에 대한 분석 및/또는 액적 내 개체 또는 개체들의 특성(예를 들어, 형광 수준, 전도도, 및 다른 물리적 또는 화학적 특성들)에 대한 분석을 포함할 수 있다. 그러한 채널 네트워크의 일 실시예가 아래에서 더욱 설명될 것이다.
본 방법의 다른 바람직한 실시예에서, 상기 분배하는 것은, 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달하는 것, 및 이후 상기 제2 유체 흐름 경로에 압력을 인가하여 상기 액적을 배출하는 것을 포함한다. 이는 제1 유체 흐름 경로 내의 다른 액적들의 흐름이 단지 제2 유체 흐름 경로에서의 압력의 인가로 인해 중단되지 않을 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 그러나, 대안적으로, 이러한 유형의 분배는 후술되는 바와 같은 "디커플링 유닛"을 이용하여, 원하지 않는 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 폐기물 경로로 이동 시키거나, 액적이 필요하지 않을 때, 제1 흐름 경로로부터 분배되는 액적을, 예를 들어 제1 흐름 경로의 밸브를 닫고 제1 흐름 경로의 단부에서 노즐 등으로부터 액적이 배출되도록 에멀전에 압력을 가하는 것에 의해 달성될 수 있다.
제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 액적을 전달하는데 사용되는 장치의 실시예들는 이하에서 더 설명될 것이다; 예를 들어 후술하는 바와 같은 회전 유닛, 병진 유닛 또는 디커플링 유닛이 사용될 수 있다. 액적이 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달되는지 여부는, 액적이 이송 유닛으로 인입되기 전에 및/또는 액적이 이송 유닛 내에 있는 동안 결정될 수 있다. 액적이 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달되는지 여부에 관한 결정은 정의된 수의 타겟 개체들 및/또는 액적 내의 개체 또는 개체들의 특성(예를 들어, 형광 레벨, 전도성 및 기타 물리적 또는 화학적 특성)에 추가로 의존할 수 있다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 추출하는 것은 상기 분류된 액적이 정의된 수의 상기 개체들을 포함하는 경우 및/또는 상기 분류된 액적이 정의된 특성을 갖는 개체를 포함하는 경우에만, 상기 분류된 액적을 추출하는 것을 포함한다. 그에 의해 상기 정의된 수의 개체들은 정의된 범위 내에 있을 수 있다. 정의된 특성은, 예를 들어, 물리적 특성(예를 들어, 형광 레벨 또는 기타 물리적 특성) 및/또는 화학적 특성일 수 있다.
이것은 예를 들어 추가의 분석 및/또는 성장을 위해 저장소 내로 방출될 타겟 개체 또는 개체들을 포함하는 액적들의 수율이 증가될 수 있기 때문에 바람직할 수 있다. 전술한 바와 같이, 타겟 개체인 개체는 정의된 특성을 갖는 개체를 포함할 수 있으며, 물리적 특성 및/또는 화학적 특성 및/또는 정의된 수의 개체들을 포함하는 액적과 같은 정의된 특성을 갖는 개체를 포함할 수 있으나, 그에 제한되는 것은 아니다.
액적 내의 개체들의 수는, 예를 들어, 광학적으로 결정될 수 있다. 개체의 수는 액적 및/또는 개체(또는 개체들)의 물리적 특성(예를 들어, 형광 레벨) 및/또는 화학적 특성에 의해 선택적으로 또는 추가적으로 결정될 수 있는데, 이는 상기 특성이 액체에 포함된 개체들의 개수에 비례(scale with)할 수 있기 때문이다. 물리적 및/또는 화학적 특성들은 표준 기술들을 사용하여 결정될 수 있다.
유체로부터 액적을 마련(제조)하기 위한 다양한 방법들 및 장치들이 사용될 수 있다. 예들은 T-접합부, Y-접합부, 흐름 집중 장치들(flow focusing devices) 등이 포함되나, 이에 한정되지는 않는다.
액적이 하나 이상의 개체들, 특히 하나 이상의 타겟 개체를 포함하는지 여부 또는 개체 없음을 포함하는지 여부는, 전기적, 광학적, 열적, 음향적, 기계적, 시간적, 공간적 및 액적의 기타 특성들, 예를 들어 기타 물리적 또는 화학적 특성들 중 하나 이상에 기초하여 결정될 수 있다.
액적을 분류하는 기술들은 자기장-기반 액적 분류, 유전영동, 음향 파형 액적 분류, 및 기타를 포함하지만 이에 국한되지는 않는다.
추출 및/또는 식별 단계들은 단일 액적이 하나 이상의 타깃 개체들을 포함하는지 여부에 대한 추가 결정을 가능하게 하여, 그에 의해 단일 액적에서의 단일 타깃 개체 또는 개체들의 단일 타깃 조합을 얻는 확률이 증가된다.
본원에 기술된 방법의 실시예들은 하기에 추가로 기술되는 바와 같이, 예를 들어 액적 중의 생존가능한 세포들의 단일클론성 보증을 증가시키는데 특히 적합하다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 배출하는 것은 상기 결정 및/또는 상기 개체의 특성에 응답하여 정의된 위치에서 상기 분류된 액적을 배출하는 것을 포함한다. 그에 의해 분류된 액적이 예를 들어 마이크로타이트 플레이트의 웰 내로 배출될 수 있다. 그에 의해, 분류된 액적이 분배될 마이크로타이터 플레이트의 특정 웰은 (하나의 유형의 정의된 수의 개체들일 수 있는 또는 복수의 유형들의 개체들 각각일 수 있는) 액적 내의 미리 결정된 수의 개체 및/또는 개체 또는 개체들의 특성, 예를 들어 물리적 특성(예를 들어, 형광 레벨 또는 다른 물리적 특성) 및/또는 화학적 특성과 같은 특성에 의해 선택된다.
본원에 기재된 방법들의 바람직한 실시예들에서, 액적은 50 내지 1,000 피코리터, 바람직하게는 300 내지 700 피코리터의 체적을 갖는다(융합된 액적은 더 클 수 있음). 그러한 부피들은 유체의 소모 비용을 최소한으로 유지하면서, 예를 들어 세포 또는 생체분자의 단일 개체 또는 소수 개체들을 포함하는 것을 용이하게 하고,나아가 더 작은 액적들이 신속한 처리를 용이하게 한다는 점에서 바람직하다. 그러나 더 큰 액적들이 채용될 수 있다.
예를 들어, 미생물 배양 또는 세포들을 성장 및/또는 유지하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 상기 하나 이상의 개체의 성장 및/또는 유지를 위해 상기 액적을 배양하는 것을 더 포함한다. 여기에 설명된 방법의 실시예들을 사용하여 제공된 개체들을 성장시킬 때, 단일 액적에서 단일 타겟 개체 또는 개체들의 단일 타겟 조합을 얻는 확률이 실시예들에서 99.997% 보다 높기 때문에, 높은 단일클론성 보증은 예를 들어 다수의 생존가능한 세포들을 얻는 것을 허용한다.
상기 액적은 하나 이상의 개체들(또는 엔티티 없음)을 포함하는지 여부에 대한 결정 이전에 배양기에 제공될 수 있고 및/또는 결정 및 분류 단계들 후에 배양기에 제공될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 액적은 추출 단계 이후에 배양될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 방법은 상기 배양 동안 상기 하나 이상의 개체에 대한 안정성 테스트를 수행하는 것을 더 포함한다. 예를 들어, 단일 액적에서 하나 이상의 세포에 대한 안정성 테스트을 수행하는 것은, 안정성 시험 동안 사멸하거나 또는 주요 분석물 또는 생체분자의 산물이 변경되거나 또는 퇴화(degraded)되지 않은 생존가능한 세포를 분류하는 것을 허용한다. 이것은 예를 들어 생존가능한 세포들 또는 높은 생산자들 또는 주요 분석물 등의 보다 높은 단일클론성 보장을 얻는 것을 허용한다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달하는 것은, 디커플러(decoupler)에서 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 분리(decoupling)하는 것을 포함하고, 상기 디커플러는 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 분류된 액적을 격리시키고 상기 격리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하도록 구성된다.
이러한 방식으로, 단일 액적은 하나 이상의 액적을 포함하는 유체로부터 분리될 수 있다. 그 다음, 액적은 하나의 유체 흐름 경로로부터 다른 유체 흐름 경로로 변환될 수 있으며, 이후에 예를 들어 그 방법이 구현되는 미세유체 칩으로부터 분배될 수 있다. 액적이 생존가능한 단일 개체(또는 생존가능한 개체들만의 복수개 또는 그것의 특정 조합), 예를 들어 생존가능한 단일 세포를 포함하는지 여부를 결정하는 것이 특히 바람직할 수 있다. 이것은 생존가능한 단일 개체(또는 생존가능한 개체들만의 복수개 또는 그것의 특정 조합)를 포함하는 유체만의 액적들로부터 격리시키는 것을 허용할 수 있다. 그 결과, 생존가능한 단일 개체(또는 생존가능한 개체들만의 복수개 또는 그것의 특정 조합)를 각각 포함하는 단일 액적들을 제공하기 위한 단일클론성 보장이 심지어 더욱 증가될 수 있다.
예를 들어 미세유체 칩으로부터 이송된 액적을 배출하는 것은 단일 액적에 포함된 하나 이상의 개체가 추가로 칩-외부(off-chip)에서 분석될 수 있으므로 특히 바람직할 수 있다.
본 방법의 바람직한 실시예에서, 상기 배출하는 것은 상기 분류된 액적이 이송되는 유체(예를 들어 오일, 그러나 그에 제한되지는 않음)를 가열하는 것을 포함한다. 이는 잉크-젯 프린터로부터 유체가 배출되는 것과 유사한 액적 배출을 허용한다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은 성장 배지 유체에서 분류된 액적을 배출시키기 위해 성장 배지 유체를 제2 유체 흐름 경로로 주입하는 것을 더 포함한다. 이것은, 예를 들어 집단이 단일 배출된 액적 내에 포함된 하나 이상의 개체로부터 성장될 수 있고, 예를 들어, 배출된 액적이, 예를 들어 세포 집단들 또는 생체 분자 집단들과 같은 집단들을 성장시키기 위한 성장 배지 유체에서 마이크로타이터 웰로 배출될 수 있기 때문에 특히 바람직할 수 있다.
또 다른 바람직한 실시예에서, 배출하는 것은 가압된 유체 배출을 통해 식별된 액적을 배출하는 것을 포함한다. 이것은 하나 이상의 개체, 특히 하나 이상의 살아있는(생존가능) 개체를 포함하는 액적들이 더 높은 속도로 및/또는 제어된 방식으로 분배될 수 있으므로 특히 바람직할 수 있다. 이와 관련하여, 다수의 액적들을 담고 있는 유체의 제1 유체 흐름 경로로부터 하나 이상의 생존가능 개체들을 포함하는 액적을 격리시키고 제2 흐름 경로에 상기 액적을 제공하는 것이 특히 중요할 수 있는데, 이는 제1 유체 흐름 경로에서 다른 액적들의 흐름에 영향을 주지 않으면서 제2 흐름 경로로부터 단일 액적의 가압된 유체 방출을 허용하기 때문이다. 그에 의해 단일 액적 내에서 예를 들어 하나 이상의 생존가능한 세포 또는 생체분자의 제어된 방출이 달성될 수 있다.
본원에 기술된 방법 및 시스템은 예를 들어 생체 분자와 같은 시약(반응물) 및/또는 세포에 특히 적합할 수 있는데, 이는 전술 한 바와 같이 예를 들어 세포 집단의 성장이 단일의 생존가능한 세포(또는 생존가능한 세포들만의 다수)로부터 기인하는 것이 법규 상 요구될 수 있기 때문이다.
본원에 기술된 방법들 및 시스템을 제공함으로써, 소모 비용, 특히 개체들을 포함하는 유체들의 비용 및/또는 납 약물(lead drug)을 전달하는 시간이 상당히 감소될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 방법은: 제2 복수의 개체들을 복수의 제2 유체에 제공하는 것; 상기 제2 유체로부터 제2 액적을 마련하는 것; 및 상기 제1 유체로부터 마련된 상기 제1 액적과 상기 제2 유체로부터 마련된 상기 제2 액적을 융합하여 융합된 액적을 획득하는 것을 더 포함하고, 상기 추출하는 것은 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 상기 융합된 액적을 이송함으로써 상기 융합된 액적을 추출하는 것을 포함한다. 이것은 제1 및 제2 세포들, 세포 및 시약(반응물), 및 다른 조합들을 포함하는 융합된 액적을 얻는 것을 허용할 수 있다. 액적들을 용합하는 것은, 제1 및 제2 액적들 중 하나 또는 모두를 전기적으로 충전하는 것에 의한 전자-유착(electro-coalescence)을 사용하여, 수동적 또는 기계적 융합에 의해, 예를 들어 흐름 채널들에 모양을 갖는 형성 또는 액적들에 함께 힘을 인가하는 구성을 제공함으로써, 화학적으로 촉진된 융합을 채용함으로써, 및/또는 다른 기술들을 사용함으로써, 수행될 수 있다.
따라서, 제1 및 제2 액적들을 용합시키는 것은, 예를 들어 단일 세포(또는 다수의 세포)가 시약에 어떻게 반응 하는지를 조사할 수 있다. 또한, 시약에 노출된 단일 세포(또는 다수의 세포)에 대해 안정성 시험을 수행하거나 단일 세포-쌍(또는 세포들의 조합) 간의 상호작용을 분석할 수 있다.
예를 들어 단일 세포(또는 세포들)과 시약의 융합을 위해, 상기 제1 액적이 단일 개체(또는 다수의 개체들)을 포함하는지 포함하지 않는지 여부를 먼저 결정하는 것이 바람직할 수 있다. 따라서, 바람직한 실시예에서, 상기 결정하는 것 및/또는 분류하는 것은 상기 액적들의 상기 융합 이전에 수행된다.
추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 방법은: 상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함하는지 여부, 또는 상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 개체들 중 상기 개체를 포함하지 않는지 여부를 결정하는 것; 및 상기 결정의 결과에 따라 상기 제2 액적을 분류하는 것을 더 포함한다. 이는 예를 들어, 제2 액적이 하나 이상의 타겟 개체를 포함하는 경우에만 제1 액적이 제2 액적과 융합됨을 보장하는 것을 허용한다. 바람직하게는, 상기 융합은 상기 제1 및 제2 복수의 개체들 중 하나 이상의 타겟 개체를 각각 포함하도록 결정된 상기 제1 액적 및 상기 제2 액적에 대해서만 수행된다.
따라서, 본 방법의 실시예들은, 예를 들어, 단일 쌍의 세포들, 또는 생체분자와 같은 세포 및 시약의 단일 쌍 또는 하나 이상의 시약과 하나 이상의 세포의 단일 타겟 조합을 분석할 수 있으며, 이들은 단일 액적에 포함된다.
따라서, 본 방법의 바람직한 실시예에서, 융합된 액적은, 단일 쌍의 2개의 세포들, 또는 단일 쌍의 세포과 시약, 또는 하나 이상의 세포와 하나 이상의 시약의 단일 조합, 특히 시약이 생체분자인 하나 이상의 세포와 하나 이상의 시약의 단일 조합을 포함한다. 단일 액적 내에 포함된 한 쌍의 두 개체들의 다른 조합들이 본 명세서에 기술된 방법의 실시예들을 사용하여 분석 및/또는 추가 처리될 수 있음이 이해될 것이다.
당업자는 방법들이 또한 다수의 개체들/시약들을 결합하는 데에도 사용될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
상기 방법의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 분류하는 것은 다른 시점들(points in time)에 상기 유체 흐름 경로의 복수의 위치들에서 상기 액적을 검출하여 상기 분류하는 것의 시간조절(timing)을 위해 상기 유체 흐름 경로 내 상기 액적의 속도를 결정하는 것을 포함한다. 상기 방법의 실시예들은 유체 흐름 경로 내의 액적(들)의 특정 위치가 결정 및/또는 예측될 수 있기 때문에 액적(들)을 분류하는 것의 개선된 제어를 가능하게 한다. 따라서, 예를 들어, 광 게이트 센서와 같은 한 쌍의 센서가 액적의 이동 속도를 추정하는데 사용될 수 있다. 이후 액적의 미래 위치가 예측될 수 있다. 이것은, 예상된 시간과 장소에 액적이 존재함을 확인함으로써, 예를 들어 액적이 존재하는지 확인하거나 또는 정확한 채널로 지시된/분류된 것인지를 확인하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 관련된 측면에서, 2개의 생물체들의 단일 쌍을 포함하는 액적의 제조 방법이 제공되고, 상기 방법은: 제1 유체 내에 복수의 제1 생물체들을 제공하는 것 및 제2 유체 내에 복수의 제2 생물체들을 제공하는 것; 상기 제1 유체로부터 제1 액적을 마련하는 것 및 상기 제2 유체로부터 제2 액적을 마련하는 것; 상기 제1 액적이 상기 제1 복수의 생물체들의 단일 개체를 포함하는지 여부 및 상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 생물체들의 단일 개체를 포함하는지 여부를 결정하는 것; 및 각각 단일 개체를 포함하는 것으로 결정된 상기 제1 액적 및 상기 제2 액적을 융합하는 것을 포함한다. 따라서, 제1 및 제2 액적들 각각에 대한 결정 단계가 액적들을 융합하기 전에 수행되기 때문에, 단일 액적에서 2개의 개체들의 단일 쌍을 얻을 확률이 증가될 수 있다.
본 발명의 전술한 제1 측면의 바람직한 실시예들이 여기에 동일하게 적용된다. 따라서, 예를 들어, 분류된 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 이송함으로써 유체의 제1 유체 흐름 경로로부터 융합된 액적이 추출될 수 있다. 바람직하게는, 제1 및 제2 액적들은 각각 상기 본 발명의 제1 측면의 모든 단계들 및 이들의 바람직한 실시예들을 거칠 수 있다. 따라서, 제1 복수의 생물체들 및 제2 복수의 생물체들로부터 각각 단일 쌍의 개체들을 포함하는 융합된 액적을 얻을 확률이 상당히 증가될 수 있다.
상기 액적들을 융합하는 것은, 전기-유착(electro-coalescence)에 의해, 정전기 인력으로 상기 액적들을 융합하기 위해 상기 제1 및 제2 액적들 중 하나 또는 모두를 전기 충전함으로써, 수동적 또는 기계적 융합에 의해, 화학 촉진된 융합에 의해, 또는 다른 기술들을 사용하여, 수행될 수 있다.
본 발명의 관련된 측면에서, 액적에 포함된 생물체의 대사(metabolizing) 및/또는 분석 방법이 제공되며, 상기 생물체는 단일 세포, 2개의 세포들의 단일 쌍, 세포 및 반응물의 단일 쌍을 포함하고, 상기 방법은 전술한 측면들 및 실시예들 중 어느 하나의 방법을 사용하여 상기 액적에 포함된 상기 생물체를 제공하는 것을 포함한다.
대사(성장)는 예를 들어 박테리아의 경우 개체들의 수를 증가시키는 것을 포함할 수 있거나, 또는 포유동물 세포와 같은 개체의 대사를 통해 예를 들어 산물을 생성하는 것을 허용하는 것을 포함할 수 있다.
본원에 기술된 방법의 실시예들은 매우 높은 단일클론성 보증을 가져오기 때문에, 단일 액적에 포함된 단일 세포(또는 생체분자 또는 다른 개체)를 성장시키는데 특히 적합하며, 단일 셀로부터 성장한 세포 집단 내 세포들은 모든 것이 서로 실질적으로 동일할 확률이 매우 높다. 유사하게, 단일 액적 내 단일 세포 분석은 임의의 측정들이 관심 세포에 대해 수행되는 것을 보장한다. 예를 들어, 돌연변이들이 모두 실질적으로 동일하지는 않을 수 있는 세포들(또는 다른 개체들)의 통계적 분포를 초래할 수 있기 때문에, 이것은 단일 액적에 포함된 많은 수의 세포들에 대해 보장되지 않을 수 있다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 하나 이상의 개체를 포함하는 액적을 제공하기 위한 미세유체 시스템이 제공되며, 상기 시스템은: 복수의 개체들을 포함하는 유체로부터 액적을 마련하는 액적 생성 장치; 상기 액적이 상기 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함 하는지 여부를 결정하는 분석기; 상기 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하는 액적 분류 장치; 및 상기 분류된 액적을 상기 미세 유체 시스템 내 상기 유체의 유체 흐름 경로로부터 분리시키기 위한 디커플러(decoupler)를 포함한다.
바람직한 실시예들에서, 미세유체 시스템은 상기 분리된 액적(또는 예를 들어 디커플러를 통해 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달된 상기 분류된 액적)을 식별하도록 구성된 추가 분석기, 및 식별된 액적을, 예를 들어 저장소(예를 들어 마이크로타이터 플레이트) 내로 배출하도록 구성된 액적 분배 유닛을 더 포함한다.
바람직하게는, 분석기 또는 분석기들은 액적이 복수의 개체들 중 단일 타겟 개체를 포함하는지 여부 및/또는 액적이 복수의 개체들 중 개체들의 단일 타겟 조합을 포함하는지 여부를 결정하도록 구성된다.
따라서, 미세유체 시스템의 실시예들은 단일 액적 내 단일 개체, 예를 들어 단일 세포 또는 생물체들의 단일 쌍 또는 개체들의 단일 타겟 조합을 얻는 것을 허용한다. 액적 형성 장치, 분석기 및 액적 분류 장치 및 디커플러 각각은 특정 확률로 단일 액적 내 하나 이상의 목표 개체들을 얻는 것을 허용한다. 미세유체 시스템의 실시예들을 사용하여 단일 액적 내 단일 개체 또는 개체들의 단일 조합을 얻는 조합 확률은 99.9 %보다 높을 수 있으며, 특히 99.99 %보다 높을 수 있다. 따라서, 디커플러는 단일 액적이 단일 개체를 포함하는지에 대한 추가 결정을 위해 분석기를 포함할 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 디커플러는 상기 분류된 액적을 상기 유체 흐름 경로로부터 격리시키기 위한 격리 유닛 및 상기 격리된 액적을 상기 미세유체 시스템의 제2 유체 흐름 경로로 안내하기 위한 가이드를 포함한다. 이는 단일 액적 내에 포함된 단일 개체(또는 개체들의 단일 조합)가 격리되고 다른 액적들 또는 유체와 별도로 분배 및/또는 분석될 수 있기 때문에 특히 바람직할 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 가이드는 회전 유닛을 포함하고, 상기 회전 유닛은 상기 격리된 액적을 저장하기 위한 액적 저장 유닛을 포함하며, 상기 회전 유닛은 상기 액적 저장 유닛에 저장된 상기 격리된 액적이 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송되게끔 회전하도록 구성된다.
관심 개체(또는 복수의 개체들)를 포함하는 액적이 검출되면, 상기 액적은 액적 저장 유닛에 배치될 수 있고, 회전 유닛이 회전되어 제2 유체 흐름 경로에 액적이 제공될 수 있다. 일부 실시예들에서, 회전 유닛은 제1 및 제2 유체 흐름 경로들을 완성한다.
일부 다른 실시예들에서, 분기된 흐름 채널이 유사한 목적을 위해, 보다 구체적으로 액적을 선택/분배하기 위해 사용될 수 있다.
일부 실시예들에서, 액적 저장 유닛은 제1 및 제2 유체 흐름 경로들을 각각 완성하는 채널일 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 가이드는 병진 유닛(translational unit)을 포함하고, 상기 병진 유닛은 상기 격리된 액적을 저장하는 액적 저장 유닛을 포함하며, 상기 병진 유닛은 상기 액적 저장 유닛에 저장된 상기 격리된 액적이 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송되게끔 병진 방향으로 이동하도록 구성된다.
회전 유닛과 유사하게 관심 개체(또는 복수의 개체들)를 포함하는 액적이 검출되면, 상기 액적은 병진 유닛의 액적 저장 유닛에 배치될 수 있고, 병진 유닛이 이동되어 제2 유체 흐름 경로에 액적이 제공될 수 있다. 일부 실시예들에서, 병진 유닛은 제1 및 제2 유체 흐름 경로들을 완성한다.
일부 실시예들에서, 액적 저장 유닛은 제1 및 제2 유체 흐름 경로들을 각각 완성하는 채널일 수 있다.
바람직한 실시예에서, 가이드는 입력 채널을 2개 이상의 출력 채널들과 결합하도록 구성될 수 있다. 이에 따라, 가이드의 채널은 요동-유사 운동(swinging-like motion)으로 움직일 수 있어, 입력 유체 흐름 경로와 복수의 출력 유체 흐름 경로들의 연결이 허용된다.
바람직한 실시예에서, 상기 미세유체 시스템은 상기 하나 이상의 개체를 성장 및/또는 유지하기 위해 상기 액적을 배양시키기는 배양기를 더 포함한다. 전술한 바와 같이, 실시예에서, 단일 액적에서 단일 타겟 개체 또는 (복수의 실질적으로 동일한 개체들일 수 있는) 개체들의 단일 타겟 조합을 얻는 확률이 99.99% 보다 높기 때문에, 높은 단일클론성 보증은 예를 들어 본원에 기재된 미세유체 시스템의 실시예들을 사용하여 하나 이상의 개체를 성장시킬 때 다수의 생존가능한 개체들(예를 들어, 세포들, 생체분자들 또는 다른 개체들)을 얻는 것을 허용한다.
상기 배양기는 유체 흐름 경로 방향으로 분석기 앞에 배치될 수 있고 및/또는 유체 흐름 경로 방향으로 분석기 및 액적 분류 장치 뒤에 배치될 수 있다. 추가적으로 또는 대안적으로, 배양기는 미세유체 시스템에서 유체 흐름 방향으로 디커플러 뒤에 배치될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서 상기 배양기는 상기 배양 동안 상기 하나 이상의 개체에 대한 안정성 테스트를 수행하기 위한 안정성 테스트 유닛을 포함한다. 단일 액적에서 하나 이상의 개체, 예를 들어 세포(세포들)에 대한 안정성 테스트을 수행하는 것은, 안정성 시험 동안 사멸하거나 또는 주요 분석물 또는 생체분자의 산물이 변경되거나 또는 퇴화(degraded)되지 않은 생존가능한 개체들을 분류하는 것을 허용한다. 이것은 예를 들어 생존가능한 세포들을 포함하나 그에 제한되지는 않는 생존가능한 개체들, 높은 레벨의 주요 분석물 등을 생산하는 세포들 및/또는 다른 개체들 및 생체분자들의 심지어 보다 높은 단일클론성 보장을 얻는 것을 허용한다.
바람직한 실시예에서 상기 미세유체 시스템은 상기 분리된 액적을 분배하기 위한 분배 유닛을 더 포함한다. 그에 의해 상기 분리된 액적은 예를 들어 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰들 내로 분배될 수 있고, 여기서 단일 액적(또는 다중 액적들)에 포함된 하나 이상의 개체가 저장되고 이후에 추후 처리 또는 분석을 위해, 또는 후속 사용을 위해, 예를 들어 발효 등에 사용될 수 있도록, 추적될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 분배 유닛은 성장 매체 유체를 저장하기 위한 저장소를 포함하고, 상기 분배 유닛은 상기 성장 매체 유체 내의 상기 분리된 액적을 분배하도록 구성된다. 이는 분배 단계 및 하나 이상의 개체를 포함하는 단일 액적을 성장 매체 유체에 배치하는 단계가 단일 단계로 결합될 수 있기 때문에, 특히 바람직할 수 있다. 액적은 개체 또는 개체-함유 액적을 포함하는 성장 배지 유체로부터 제조될 수 있으며, 이는 이후 예를 들어 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰들로 분배될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 분배 유닛은 가압된 유체 방출을 통해 상기 액적을 분배하기 위한 고압 유닛(또는 저압 유닛)을 포함한다. 압력 변화는 압전, 열 및 가압 가스 방법을 포함하되 이에 국한되지 않는 많은 기술들에 의해 생성될 수 있다. 가압된 유체 방출을 통해 액적을 배출하는 것이 특히 바람직할 수 있는데, 그 이유는 이후에 더 상세히 설명되는 바와 같이, 미세유체 시스템으로부터 액적을 분배하는 시간이 현저히 단축될 수 있고 및/또는 상이한 출력을 통해 배출이 제어될 수 있기 때문이다. 미세유체 시스템으로부터 분배될 관심 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 격리 또는 분리함으로써, 분배될 액적만이 고압 유닛에 노출된다. 고압 유닛에 노출되는 액적에 대해서는 분석기 및 액적 분류 장치에서의 액적 분석 및 분류를 달성하기 어려울 수 있으므로, 분리된 액적만을 고압 유닛에 노출시키는 것이 바람직할 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 액적 생성 장치는 복수의 액적 생성 장치들을 포함하고, 상기 미세유체 시스템은 상기 복수의 액적 생성 장치들을 사용하여 준비된 복수의 액적들을 융합시키기 위한 액적 융합 장치를 더 포함한다. 따라서, 미세유체 시스템의 실시예들은 예를 들어 단일 쌍의 세포, 또는 세포 및 시약의 단일 쌍, 또는 단일 융합된 액적 내에 함유된 특정 개체들의 단일 조합의 분석을 가능하게 한다.
상기 액적 융합 장치는 상기 미세유체 시스템에서 유체 흐름 경로 방향에서 상기 분석기 및 액적 분류 장치의 앞에 배치될 수 있다. 바람직하게는, 상기 액적 융합 장치는 유체 흐름 경로 방향에서 분석기 및 액적 분류 장치의 뒤에 배치될 수 있으며, 이는 제1 및 제2 복수의 개체들 중 각각 하나 이상의 타겟 개체를 포함하도록 결정된 액적들만을 융합시키는 것을 허용하기 때문이다.
선택적으로, 액적 융합 장치는 디커플러 뒤에 배치될 수 있다. 그렇게 하는 이점은, 하나 이상의 관심 개체를 각각 포함하는 2개의 액적들의 확률이, 이들 액적들을 융합하기 전에 비교적 높을 수 있다는 것이다.
상기 액적 융합 장치는 전자-유착(electro-coalescence)에 의해 상기 액적들을 융합시키기 위한 전기장을 생성하기는 전기장 생성부를 포함할 수 있다. 선택적으로 또는 추가적으로, 상기 액적 융합 장치는 액적들을 전기 충전하는 하나 이상의 충전 장치를 포함할 수 있다. 그에 의해 액적들을 융합이 액적들의 정전기 인력을 통해 촉진된다. 대안적으로 또는 부가적으로, 액적 융합은 예를 들어 액적이 다른 액적 상에 충돌하여 다른 액적과 융합할 수 있는 채널 구조를 통한 수동 액적 융합을 허용하는 채널 기하구조들을 포함하는 액적 융합 장치를 제공함으로써 달성될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 분석기는 형광 검출기, 산란 광 검출기, 이미징 검출기, 음파 발생 및 검출 유닛, 및 자기-활성화 셀 분류 장치 중 하나 이상을 포함한다. 이들 장치들 중 하나 이상을 통해 액적의 내용물이 결정될 수 있고, 그 결정에 따라 액적이 액적 분류 장치에서 분류될 수 있다. 액적의 내용물을 분석하기 위해 액적에서 검출될 목표 내용물에 따라 하나 이상의 특정 방법 또는 장치가 다른 방법 또는 장치보다 선호될 수 있음이 이해될 것이다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 분석기 및/또는 액적 분류 장치는 상기 미세유체 시스템에서의 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 (다른 시점들에서) 상기 미세유체 시스템의 상이한 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 포함하고, 상기 액적 분류 장치는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하도록 구성된다. 이는 미세유체 시스템의 유체 흐름 경로 내의 액적(들)의 위치가 결정 및/또는 예측될 수 있기 때문에, 액적(들)의 개선된 분류를 가능하게 한다.
본 발명의 추가적인 측면에서, 기판 지지(substrate bearing)를 갖는 액적 분류 또는 분배 장치가 제공되며, 이는 하나 이상의 미세유체 입력 채널들의 세트; 미세유체 출력 채널들의 세트; 및 상기 입력 채널들과 상기 출력 채널들 사이의 이동가능 분류 요소를 포함하고, 상기 분류 요소는 상기 입력 채널들을 상기 출력 채널들에 연결하기 위한 미세유체 채널들의 세트를 포함하고, 상기 분류 요소는 제1 위치와 제2 위치 사이에서 이동가능하며, 상기 제1 위치에서, 적어도 제1 입력 채널이 연결되어 상기 제1 입력 채널로부터 제1 출력 채널로의 유체 흐름이 허용되고, 상기 제2 위치에서, 상기 채널 내 하나 이상의 액적을 지지(bearing)하는 유체 길이가 이동하여 상기 유체의 길이가 상기 제2 출력 채널로 유동한다.
따라서, 액적 분류/분배 장치의 실시예들은 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 액적을 이송함으로써 제1 유체 흐름 경로로부터 액적을 추출하는 것을 허용한다. 따라서, 액적 분류 장치는 미세유체 장치의 미세유체 채널을 연결 및/또는 완료하는데 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이것은 미세유체 시스템의 제1 유체 흐름 경로로부터 액적 분리가 가능하고, 예를 들어 제2 유체 흐름 경로로부터의 가압 유체 방출에 의해 시스템으로부터 분배될 수 있기 때문에 특히 바람직할 수 있다.
액적 분류/분배 장치의 바람직한 실시예들에서, 상기 분류 요소는 제1 및 제2 입력 채널들로부터 유체의 길이를 교체하기 위해 제1 및 제2 위치들 사이에서 회전 가능하고, 그에 따라 제1 및 제2 입력 채널들은, 대응하는 제1 및 제2 출력 채널들로 흐르거나 또는 대응하는 제2 및 제1 출력 채널들로 흐르도록 교체된다. 따라서, 액적의 성분들에 대한 사전 결정은 제1 유체 흐름 경로로부터 관심 액적(또는 대안으로 관심 없는 액적)을 추출하여 액적을 분류하는 것을 허용할 수 있고 상기 결정에 기초하여 그것을 제2 유체 흐름 경로에 제공하는 것을 허용할 수 있다.
따라서, 액적 분류/분배 장치의 실시예들은 미세유체 시스템 내의 유체 흐름 경로를 방해하지 않으면서 유체 흐름 경로로부터 액적을 추출하는 것을 허용한다.
본 발명의 관련된 측면에서, 액적들을 분류 또는 분배하는 방법이 제공되며, 상기 방법은: 제1 및 제2 미세유체 흐름들을 제공하는 것으로서, 상기 흐름들 중 적어도 하나는 액적들을 포함하는, 제공하는 것; 및 상기 흐름들의 일부를 포함하는 턴테이블을 회전시켜 액적들을 제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들 중 하나에 선택적으로 지시(direct)하는 것을 포함한다. 따라서, 본 방법의 실시예들은, 예를 들어 액적 및/또는 그 내용물들의 특성에 대한 사전 결정에 기초하여 액적들을 분류하는 것을 허용한다.
본 발명의 관련된 측면에서, 미세유체 흐름들 내의 액적들을 분류 또는 분배하기 위한 장치가 제공되고, 상기 장치는: 제1 및 제2 입력 미세유체 흐름들로서, 상기 흐름들 중 적어도 하나는 액적들을 포함하는, 제1 및 제2 입력 미세유체 흐름들; 제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들; 상기 입력 및 상기 출력 흐름들 사이의 유동들의 일부를 포함하는 회전 턴테이블; 및 상기 액적들을 상기 제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들로 선택적으로 지시(direct)하기 위해 상기 턴테이블의 회전을 제어하는 제어부를 포함한다.
액적이 예를 들어 제1 입력 미세유체 흐름으로부터 회전하는 턴테이블의 흐름들의 부분들 중 하나로 유입되면, 턴테이블은 제2 출력 미세유체 흐름에서 액적이 빠져나갈 수 있도록 회전될 수 있다. 만일, 액적 및/또는 그 내용물(들)의 이전의 분석에 기초하여, 채널 내에 액적을 유지하는 것이 바람직한 경우, 턴테이블은 회전하지 않고, 그에 따라 액적은 예를 들어 상기 회전 턴테이블의 흐름의 일부를 통해 제1 입력 미세유체 흐름으로부터 상기 제1 출력 미세유체 흐름으로 유동한다.
본 발명의 관련된 측면에서, 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 피코액적을 전달하기 위한 세포, 생체분자 및 개체 분류 또는 분배 장치가 제공되며, 상기 분류 장치는: 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 피코액적을 분리시키기 위한 디커플러; 및 상기 분리된 미세액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하는 가이드를 포함하고, 상기 가이드는: 상기 분리된 피코액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 회전하도록 구성된 회전 유닛; 및/또는 상기 분리된 피코액적를 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 병진 방향으로 이동하도록 구성된 병진 유닛을 포함한다. 액적이 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 분리되고 안내될 것인지에 관해서는 액적이 분류 장치로 들어가기 전에 결정될 수 있다. 선택적으로 또는 부가적으로, 이러한 결정은 액적이 분류 장치 내에 있을 때 만들어질 수 있다.
바람직한 실시예에서, 세포, 생체분자 및 개체 분류 장치는 하나 이상의 마이크로타이터 플레이트 및/또는 하나 이상의 유리 슬라이드 및/또는 하나 이상의 어레이 또는 상기 피코액적들 중 하나 이상이 하나 이상의 어드레스 가능한 위치에서 분배될 수 있는(dispensible) 다른 포맷들을 포함하는 x-y 이동 플랫폼을 더 포함한다. 따라서, 액적은 미리-정의 된 패턴에 따라 마이크로타이터 플레이트의 하나 이상의 개별 웰 및/또는 하나 이상의 유리 슬라이드 및/또는 하나 이상의 어레이 또는 다른 포맷들으로 분배될 수 있으며, 액적들 및 그 내용물들은 이후 예를 들어, 집단들을 성장시키기 위해 추가 처리 및/또는 분석될 수 있다.
본 명세서에 기술된 액적 분류/분배 장치의 실시예들, 및/또는 셀, 생체분자 및 개체 분류/분배 장치의 실시예들은 액적 디스펜서, 특히 피코액적 디스펜서에 통합될 수 있다. 그러한 액적 디스펜서(분배기)는 선택된(분류된) 액 적을 미세 유체 채널로부터 저장소 내로 선택적으로 분배하도록 구성된다.
나아가, 본 명세서에 기술된 액적 분류/분배 장치의 실시예들, 및/또는 셀, 생체분자 및 개체 분류/분배 장치의 실시예들, 및 또는 피코액적 디스펜서의 실시예들은 미세유체 장치 내로 구현될 수 있다.
카트리지들
추가적인 측면에서, 본 발명은 분류된 미세유체 액적의 자동화된 분류 및 분배를 위한 미세유체 카트리지를 제공하며, 상기 카트리지는: 분류 영역에 체결된 분류 입력 채널로서, 상기 분류 영역은 상기 입력 채널에 체결된 2이상의 분류 출력 채널들 및 상기 분류 입력 채널로부터의 액적을 상기 분류 출력 채널들 중 선택된 하나에 선택적으로 지시(direct)하는 액적 지시기(droplet director)를 포함하는, 분류 입력 채널; 및 상기 분류 출력 채널둘 중 하나에 체결되어 저장소에서 수집을 위해 상기 카트리지로부터 선택된 상기 액적들을 분배하는 액적 디스펜서를 포함하고, 상기 액적 디스펜서는, 상기 저장소에서의 수집을 위해 에멀전 흐름으로부터 액적들을 상기 디스펜서 출력 채널로 배출하는 액적 배출 메커니즘을 포함한다.
이러한 카트리지의 실시예들은 예를 들어 약제-내성 박테리아와 같이 106 또는 109 개의 액적들 내에 오직 하나만 존재할 수 있는 타겟을 확인 및 수집하는 것과 같은 여러 중요한 문제들을 해결하기 위해 사용될 수 있는 일회용/소모 장치를 제공한다. 광의의 측면에서, 이것은 관심있는 액적의 신호를 확인한 다음, 추가의 분석을 위해 원칙적으로 공통 저장소에서 일부 바람직한 실시예들에서는 별개의 식별 가능한 저장소에서 이들 액적들을 수집함으로써 행해질 수 있다. 이 후자의 접근법은 개별적으로 식별된 특성들을 갖는 세포 또는 다른 개체들이, 예를 들어 후속 분석 또는 사용을 위해 다중-웰 플레이트로부터 회수될 수 있게 하여 - 그러한 다중-웰 저장소의 개별 웰들이 효과적으로 선택된 특성들을 갖는 개별 개체들을 수집하는데 사용될 수 있게끔 한다.
보완적인 방식으로, 분석에 직접 사용하기보다는, 카트리지의 실시예들은 개념적으로 모두 동일한 액적들(예를 들어, 세포들)의 집단에서 변화된(예를 들어, 음성) 응답을 식별하기 위해 '안정성 테스트 모드'에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 이 동작 모드에서 카트리지는 예를 들어 세포에 의한 물질 생산이 중단된, 다시 말해 발효 배치에서의 낙하 수율 문제를 해결하기 위한 개별 사례를 식별하는데 사용될 수 있다.
바람직한 실시예들에서, 카트리지는 액적들이 제어된 방출 이전에 액적의 내용물들을 배양할 수 있도록, 바람직하게는 제어된 온도에서 액적들이 유지될 수있는 배양 영역 또는 챔버를 포함한다. 실시예들에서, 이 영역은 에멀젼 내에 분산될 때보다 더 큰 밀도로 액적들을 유지하도록 구성된다; 이는 챔버의 상부에서 액적들을 보유함으로써(전형적으로 '떠다님(float)') 그리고 액적들의 제어된 방출을 위해 챔버의 상부에 밸브 또는 유사물을 제공함으로써 달성될 수 있다 - 사용 시에 카트리지는 위쪽에서 배양 챔버의 상부(top)로 방위(orientated)된다. 초과 운반 유체(오일)는 방출되어 폐기될 수 있다. 본질적이지는 않지만, 바람직하게는, 배양 영역은 분류 영역의 상류에 있다.
당업자는 에멀전(이중 에멀전일 수 있음)이 일반적으로 유중수 에멀젼임을 이해할 것이다. 카트리지는 바람직하게는 미세액적 처리 시스템과 인터페이스하도록 구성된다 - 즉 실시예들에서, 카트리지는 감지 및 제어 기능들을 제공하는 미세액적 처리 시스템에 부착 및 해제될 수 있다. 실시예들에서, 미세액적 처리 시스템은 액적 분류를 위한 액적 특성 감지 및 배양 챔버를 위한 온도 제어를 제공하고, 또한 액적을 수집하기 위해 디스펜서 출력 채널과 저장소 웰들 사이의 상대 운동도 제공할 수 있다.
전형적인 실시예에서, 카트리지는 일반적으로 미세유체 채널, 하나 이상의 유지 영역, 밸브 등을 지지(bearing)하는 평평한 플레이트의 형태를 갖는다. 이는 바람직하게는 실질적으로 광학적으로 투명하며, 예를 들어 폴리디메틸실록산(PDMS) 또는 환상 올레핀 중합체 또는 공중합체(COP 또는 COC)와 같은 플라스틱 재료의 범위로부터 제조될 수 있다. 이후 카트리지는 멀티-웰 또는 마이크로타이터 플레이트를 향해 아래쪽으로 향해진 디스펜서 출력 채널을 갖는 시스템/기기에서 수직 또는 적절한 각도로 장착될 수 있다. 이후 기기는 카트리지 및/또는 플레이트를 이동시켜 출력 채널을 선택된 웰로 향하도록 할 수 있다.
바람직한 실시예들에서, 카트리지에는 다수의 유체 연결부들이 제공되며, 이는 카트리지가 기기 내에 삽입될 때 자동적으로 이루어질 수 있다. 에멀젼의 생성은 카트리지-내 또는 카트리지-밖에서 수행될 수 있다. 예를 들어, 실시 예들에서, 카트리지에는 하나의 에지를 따라 (카트리지가 수직일 때 정확한 방향으로 있도록) 저장소가 제공되고, 칩-상-액적(droplet-on-chip) 액적 생성을 위해 (물 및 성장 배지와 같은) 오일 및 수성 배지를 보유하도록 제공된다.
미세유체 카트리지의 실시예들은 매우 큰 집단으로부터 관심 생물체를 함유하는 극소수의 매우 희소한 액적들을 확인하는 것을 통해 지시되도록 앞서 기술되었다. 액적 분류기는 액적 디스펜서보다 1~2배 빠르게 작동할 수 있다 - 예를 들어 디스펜서는 1~10Hz에서 작동하는 반면 분류기는 100~1,000Hz에서 작동할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 대상 개체들의 통계로 인해, 디스펜서는 계속 작동하지 않을 수 있다. 따라서, 일부 바람직한 카트리지의 구현들에서, 상기 분류 영역과 상기 분배 영역 사이에 하나 이상의 에멀전 흐름 버퍼 영역이 제공되고, 상기 액적 디스펜서로의 에멀전 흐름 속도가 제어된다. 실시예들에서 그러한 버퍼 영역은 전술한 배양 영역과 다소 유사한 챔버를 포함할 수 있으며, 과량의 오일이 사이펀으로 제거(siphoned off)되거나 폐기되도록 액적들이 축적될 수있다. 예를 들어, 액적들은 챔버의 상부로 부유되는 것이 허용될 수 있고 상기 챔버로부터 액적들이 밸브 등으로 제어된 방식으로 방출될 수있다.
버퍼 영역이 포함되는 경우, 실시예들에서 이것은 미세유체 채널의 길이를 포함할 수 있으며, 예를 들어 사형 구성(serpentine configuration)으로, 액적들의 순서가 유지되도록 배열될 수있다. 이러한 방식으로, 버퍼의 상류에서 측정된 액적 특성을 갖는 액적의 동일성이 유지될 수 있는데, 이는 액적들의 순서 또는 시퀀스가 유지되기 때문이다. 그러나, 다른 배열들에서, 넓은 채널 또는 챔버가 사용될 수 있으며, 이는 더 큰 용량의 제공을 용이하게 하는 이점을 갖는다. 이 경우, 액적의 특성은 버퍼 영역으로부터의 (순서에 따른) 그들의 퇴출(exit) 이후에 측정될 수 있다. 두 경우 모두에서, 바람직한 실시예들은 액적의 하나 이상의 특성을 액적의 식별 가능한 특성, 일반적으로 그것의 위치에 연결하고, 그에 따라 액적이 웰/저장소들에 분배될 때 웰/저장소(들) 내의 액적(들)의 특성들이 알려진다.
따라서, 본원에 기재된 이들 및 다른 방법/장치의 바람직한 실시예들에서, 식별된 웰/저장소 내의 분배된 액적의 내용물들은 알려지고 후속 사용을 위해 저장된다. 이러한 방식으로, 원하는/목표 특성을 갖는 액적 내용물들(예를 들어, 세포, 단백질, 항체, 시약 또는 분석물)이 액적 분배 이후에 원하는/목표 특성을 갖는 내용물들을 갖는 것으로 알려진(기록된) 웰/저장소의 내용물을 회수함으로써 추적될 수 있다.
일부 바람직한 실시예들에서, 디스펜서의 출력 채널은 에멀전으로부터의 액적의 유리 또는 액적의 내용물의 유리를 촉진시키는 메커니즘을 포함한다. 전술한 바와 같이, 전형적으로 액적의 내용물들은 종종 성장 배지에서의 세포와 같은 생물체 및 수분을 포함한다. 카트리지의 목적은 특정 특성이나 특징을 가진 (희소) 생물체의 물질을 추출하는 것이고, 이는 하나 이상의 저장소에서 타겟 액적들을 수집하여 이루어지며, 상기 저장소는 예를 들어 마이크로타이터 플레이트의 웰에서 20-50 마이크로리터의 물/성장 배지를 포함한다. 대조적으로, 에멀전의 배출된 슬러그는 50~300nl의 체적(채널 폭에 부분적으로 의존)을 가질 수 있고 반면에 액적은 약 50 pl 이상의 부피를 가질 수 있다. 실제로, 에멀젼 슬러그가 디스펜서 출구 채널로부터 배출될 때, 액적으로부터의 물 및 그 내용물들은 오일의 표면 상에 부유하게 될 수 있음이 발견되었다(오일 밀도에 부분적으로 의존함 그리고 불소화되었는지 여부에 의존함). 따라서, 액적 배출 메커니즘의 실시예들은 바람직하게는 액적을 에멀젼으로부터 추출하고 및/또는 액적을 파쇄(break up)하는 시스템을 포함한다. 이는 디스펜서 출력 채널의 노즐을 좁히거나, 및/또는 출력 채널을 가로질러 메시(mesh)를 형성함으로써 기계적으로 달성될 수 있고; 및/또는 이는 예를 들어 전압이 인가되어 전기장을 생성시켜 에멀젼/액적을 파괴시키는 한 쌍의 전극을 디스펜서 출력 채널의 출구에 인접하게 제공함으로써 전기적으로 달성될 수 있으며, 및/또는 예를 들어 퍼플루오로옥타놀(perfluorooctanol)과 같은 탈유화제(de-emulsification agent)의 스트림을 디스펜서 출력 채널에 부가함으로써 화학적 메카니즘이 사용될 수 있다.
일부 바람직한 실시예들에서, 상기 미세유체 카트리지는 상기 미세유체 카트리지 내의 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 (상이한 시점에서) 상기 미세유체 카트리지의 다른 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 더 포함하고, 상기 액적 지시기는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 지시하도록 구성된다. 이는 카트리지 내의 액적(들)의 위치가 분류 영역에서 액적(들)의 분류에 대한 제어를 더 개선하기 위해 결정 및/또는 예측될 수 있기 때문에 특히 유리할 수 있다.
일부 바람직한 실시예들에서, 상기 액적 배출 메커니즘은 액적들을 상기 디스펜서 출력 채널로 지시하도록 상기 에멀젼 흐름 내의 압력을 증가시키는 메커니즘을 포함한다. 일부 실시예들에서, 이것은 (후술 될 T-접합의 형태로) 메인 채널 및 사이드 채널을 가지도록 디스펜서 출력을 배열하고, 이후 압력 펄스를 인가하여 액적을 추루력을 위해 사이드 채널(디스펜서 출력 채널)로 유도함으로써 달성될 수 있다. 일 실시예에서, 그러한 배열은 사이드 채널(디스펜서 출력 채널)로의 에멀전 흐름의 길이를 따른, 핀치 밸브들과 같은 한 쌍의 밸브들을 포함할 수 있다. 이 방법으로 밸브를 닫아 흐름을 분리한 다음 격리된 에멀전 슬러그에 압력을 가하여 액적을 포함하는 에멀전을 디스펜서 출력 채널로 유도할 수 있다. 다른 접근법에서, 에멀전 슬러그는 제1 채널/흐름으로부터 제2 흐름으로 전달될 수 있으며, 압력 펄스는 슬러그 및 그와 관련된 액적을 배출하도록 적용될 수 있다. 당업자는 다른 구성들이 가능하다는 것을 인식할 것이다. 적절한 압력 펄스는 예를 들어 압전 변환기를 사용하여 기계적으로 제공될 수 있다. 대안적으로, 압력 펄스는 예를 들어 (잉크젯 프린터와 유사한 방식으로) 전기 가열 요소 및 기포 팽창에 의해 전기적으로 생성될 수 있다. 일부 바람직한 실시예들에서, 증가된 압력 펄스가 그 액적과 함께 에멀젼 슬러그를 배출하도록 인가되지만, 당업자는 원칙적으로 후술하는 구성이 채용되어 대신에 감압의 펄스가 사용되어 액적들이 에멀전 흐름으로부터 디스펜서 출력 채널로 배출되는데 사용됨을 이해할 것이다.
일부 바람직한 구현들에서, 배출을 위해 액적의 존재를 감지/검출하는데 사용되는 시스템으로부터 액적 배출 메카니즘을 물리적으로 분리하는 것이 편리하다. 실시예들에서, 이는 배출을 위해 분류 시스템에 의해 선택된 액적의 위치 및 속도 중 하나 또는 둘 모두를 감지하기 위해 카트리지를 수용하는 기기(미세액적 처리 시스템)를 사용함으로써 달성된다. 상기 감지는 액적 배출 메커니즘의 상류에서 수행될 수 있고, 그에 따라 액적이 배출 메커니즘에 도달할 때 액적의 위치가 예측될 수 있다. 원칙적으로 에멀전의 유속을 충분히 정확하게 조절할 수 있다면 액적 속도를 측정할 필요가 없지만, 실제로는 속도를 측정하는 것이 유리하다. 채널 크기 변동 및 그에 따른 액적 속도 변동을 감소시키기 위해, 채널 크기 공차를 제어하는 것이 더욱 유리하다. 이러한 방식으로 액적 토출 메커니즘과 별도의 위치에서 액적들을 이미징하는 것은 카트리지/기기를 더욱 간단하고 효과적으로 만든다.
전술한 바와 같이, 일부 바람직한 실시예들에서, 액적들은 복수의 분리된 웰들을 포함하는 마이크로타이터 플레이트 등의 개별 웰들 내로 분배된다. 이후 기기(미세액적 처리 시스템)는 분배된 액적을 저장소로 선택적으로 지시(direct)하는 제어 시스템을 포함할 수 있다. 실시예들에서, 카트리지 또는 멀티-웰 플레이트는 X-Y 이동가능 스테이지 상에 장착되어 카트리지 및 플레이트가 디스펜서 출력 채널을 선택된 저장조소 지시하도록 서로에 대해 이동될 수있다. 전술한 바와 같이, 웰은 기기의 적용/분석/노드 동작에 따라 하나 이상의 액적을 보유할 수 있다.
일부 바람직한 구현들에서, 액적의 하나 이상의 특성이 분류를 위한 기기에 의해 조사될 때, 원하는 특성을 갖는 선택된, 타겟 액적에 대해 대응하는 데이터가 저장된다. 이후, 이 데이터는 액울이 분배되는 특정 웰 또는 저장소를 식별하는 정보와 관련된다. 이러한 방식으로 나중에 특정 특성을 갖는 액적은 추후 분석을 위해 그 저장소로부터 회수 될 수 있고 및/또는 멀티-웰 저장소가 특정 특성 또는 특성들의 범위를 갖는 액적 세트를 추출하는데 사용될 수 있다.
분류는 예를 들어, 측정된 값과 임계값의 비교에 기초할 수 있지만, 선택된 액적들은 매개변수의 값의 범위를 가질 수 있으며, 이것은 다시 액적 내 생물체의 일부 다른 특성 측정 활동과 상호관련될 수 있다. 따라서 하나 이상의 매개변수의 측정을 저장소의 특정 웰에 있는 액적과 연결할 수 있는 것이 유용하다. 계측기에 의해 감지될 수있는 특성들의 예들로는 다음을 포함할 수 있다(그러나 그에 제한되지는 않음): 형광 정도, 산포도, 발광 정도, 흡광도 중 하나 이상과 같은 광학 특성; 전기적 컨덕턴스와 같은 전기적 또는 자기적 특성; 세포가 살아 있는지 또는 죽어 있는지와 같은 하나 이상의 유도되거나 추론된 특성(광학 측정으로부터 추론될 수 있음). 당업자는 실시예들에서 액적들을 분류할 때 개별 액적의 하나 이상의 특성을 감지하는 것이 편리하지만, 원칙적으로 저장소 식별 데이터와 관련하여 저장된 감지 데이터는 분류 후에 부가적으로 또는 대안적으로 별도의 센서 구성에 의해 감지될 수 있다. 두 경우들 모두, 결합된 카트리지 및 기기의 실시예들이 추후 분석 또는 사용을 위해 개별 분배된 액적들의 추적을 용이하게 한다.
전술한 바와 같이, 카트리지의 실시예들을 사용할 수 있는 용도들은 직접 액적 평가 및 생물체 안정성/생존가능성 평가를 포함한다. 일부 응용에서는 단일클론성(monoclonality)의 보장이 중요하다 - 즉, 세포와 같은 생물체를 포함하고 있는 개별 저장소/웰들이 그러한 개체를 하나만 포함하는 것이 바람직할 수 있다. 이것은 예를 들어 항체가 세포 라인(cell line)으로부터 생성되는 경우 중요하다 - 예를 들어 항체가 약품을 생성하는데 사용되는 경우, 항체가 세포의 단일 클론에서 유래되었다고 실질적으로 보장할 수 있는 것이 규제 목적 상 중요할 수 있다. 이러한 적용들을 위해, 배양 챔버는 일반적으로 필요하지 않으며, 따라서 그러한 챔버가 없는 카트리지 버전이 사용될 수 있다. 대안 적으로, 배양 챔버가 우회될 수 있는 보다 일반적인 카트리지가 제공될 수 있거나, 다른 버전에서, 액적들은 이전에 기술된 바와 같이 배양 없이 배양 챔버를 통과할 수 있다.
미세유체 카트리지의 실시예들이 단일클론성 보증을 위해 사용될 수 있는 한 가지 방법은 액적 분류기를 사용하여 단일 세포만을 포함하는 액적들을 선택하고, 2개 이상의 세포들을 갖는 액적 및 빈 액적을 폐기하는 것이다. 액적 내의 세포의 수는 광학적으로, 예를 들어 광학적 흡광, 산란광, 형광을 검출함으로써, 또는 (일부 바람직한 실시예들에서) 액적 내의 개별 세포들을 가시화하고 계수함으로써, 광학적으로 결정될 수 있다. 그러한 접근법은 빈 액적 생성에 대한 강한 통계적 편향을 갖는 액적들을 생성함으로써 촉진된다. 일반적으로 액적 생성 시스템은 플로우 포커싱(flow focusing)을 채용하고 포아송 통계를 따르는 다수의 생물체들을 포함하는 액적을 생성한다. 그러한 시스템을 운영하여 단클론성 보증을 용이하게 하고, 그에 따라 액적들의 절반 이하가 바람직하게는 30%, 20% 또는 10% 미만의 생물체를 포함한다 - 예를 들어 시스템은 단지 약 5%의 액적이 단일 개체/셀을 포함하도록 작동될 수 있다.
이 기술들은 함께 단일클론성에 대한 실질적인 보증을 제공할 수 있다 - 즉, 웰/저장소 당 단일 세포만이 존재한다는 것이다. 그러나, 실시예들에서, 이론적으로 제1 스테이지가 단일 생물체/세포를 함유하는 액적만을 선택된 출력 채널로 들어가도록 허용해야 함에도 불구하고, 추가의 확신이 바람직할 수 있는데, 이것은 제1 스테이지 다음에 제2 분류 스테이지를 추가함으로써 제공될 수 있다. 실시예들에서, 이 제2 분류 스테이지는 액적 디스펜서와 효과적으로 결합될 수 있다 - 즉, 실시예들에서, 디스펜서는 액적마다 정의된 수(또는 수치 범위)의 생물체를 갖는 액적들을 선택하도록 구성될 수 있다. 따라서, 액적 배출 메커니즘은 액적이 단일 생물체, 또는 보다 일반적으로, 한정된 수 또는 수치범위의 생물체만을 포함한다는 확인에 따라 선택적일 수 있다. 편리하게, 액적 당 개체의 수/수치범위의 검출은 전술한 바와 같이 선택된 액적의 속도/위치를 감지하기 위해 사용되는 센서(들)에 의해 이루어질 수 있다. 이 방법에서 매우 높은 수준의 단클론성 보증이 제공될 수 있다.
우리가 단클론성 보증의 특정 응용을 기술하였지만, 상기 기술은 액적 당 단일 개체에 한정된 것이 아닌 액적 당 한정의 생물체를 표적화하도록 적응될 수 있다. 예를 들어, 포유류 세포가 아닌 박테리아가 들어있는 액적을 조작할 때에는 수치 범위가 더욱 적절하다. 이것은 액적 당 수십 개의 유기체들, 예를 들어 액적 당 25-35 개의 개체들을 정의할 수 있다.
상기 기술의 또 다른 적용에서, 전술한 일반적인 유형의 미세유체 카트리지는 '융합 분석' 또는 기능 분석 모드의 동작을 제공할 수 있다.
이 모드의 동작을 제공하기 위해, 미세유체 카트리지에는 적어도 2개의 입력 채널 및 적어도 하나의 출력 채널을 갖는 액적 융합 영역이 제공되어 분류 영역에 대한 입력이 제공된다(배양 영역은, 존재하는 경우, 분류 영역의 전후에 있을 수 있음). 당업자가 알 수 있듯이, 물리적 융합 기술 및 액적 융합을 유발하기 위해 전기장 또는 다른 장을 이용하는 기술들을 포함하는 많은 미세액적 융합 기술이 이용될 수 있다(일부 예들은 본원의 초기 출원인 WO2009/050512 에 설명되어 있으며, 상기 문헌은 본원에 참조로서 병합된다). 광범위한 관점에서, 액적 융합 영역은 분류 영역의 상류의 생물체들을 결합하는데 사용되고, 그에 따라 융합된 액적은 결합된 개체들 사이의 잠재적으로 드문 상호작용에 기초하여 선택될 수 있다. 전술한 바와 같이, 융합될 액적들을 포함하는 2개(이상)의 에멀전들은 카트리지 내에서 또는 카트리지 외부에서 생성될 수 있다. 일부 바람직한 실시예들에서, 그러한 시스템은 하나의 생물체가 다른 것에 저항할 수 있는 매우 드문 경우들을 식별하는데 사용될 수 있으며, 잠재적으로 백만분의 1 또는 10억분의 1의 확률까지 감소할 수 있다. 따라서, 예들은 HIV에 의한 감염에 저항성인 T-세포 또는 식세포에 내성인 박테리아를 포함할 수 있으며, 통상의 기술자는 시스템의 실시예들이 다른 유사한 상황들을 식별하는 데 사용될 수 있다는 것을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 또한 통상의 기술자가가 알 수 있는 바와 같이, 세포 분류는 임의의 다양한 물리적 특성들, 전형적으로 광학 특성들에 기초하여; 일 접근법에서, 액적 내의 개체가 살아있는지 또는 죽어있는지 여부에 대한 결정이 이루어진다.
비록 2개의 출력 채널들을 갖는 분류 영역이 기술되었지만, 원칙적으로 3개 이상의 출력 채널들이 제공될 수 있고, 예를 들어 개체들의 혼합된 집단이 그룹 또는 카테고리로 분류될 수있다(예를 들어, 전기장을 인가하기 위해 전극들의 쌍들을 사용하여 액적들을 선택적으로 지시함으로써 다중 채널로의 분류가 달성될 수 있음). 예를 들어, 발효를위한 세포 집단에서, 개체군은 높은, 중간 및 낮은 생산성 그룹으로 분류될 수 있으며, 예를 들어, 중간 생산성을 갖는 세포들이 대규모 발효 시스템에서 더욱 강건하기 때문에 높은 생산성을 갖는 세포들보다 바람직할 수 있다. 따라서, 그러한 구성에서 임의의 하나 이상의 출력 채널이 추가 처리/분석을 위해 선택된 액적들의 내용물들을 수집하는데 사용될 수 있다는 것이 이해될 것이다.
광범위하게 이야기하면, 사용되는 카트리지의 실시예들에서, 샘플 및 오일은 카트리지의 한쪽 가장자리 상의 별도의 무균 저장소에 적재되며 (카트리지는 수직으로 또는 적절한 각도로 장착됨) 에멀전이 생성된다. 에멀젼은 액적이 위로 부유하는 배양 챔버로 펌핑되고 초과된 오일은 폐기되도록 작동한다. 그 후 배양 챔버를 몇 분에서 몇 시간 동안 가열, 예를 들어 섭씨 37도로 가열한 다음 대사를 제한하기 위해 예를 들어 약 섭씨 8도로 냉각시킨다. 액적 집단은 이후 타겟 액적이 선택되고 그곳에서 보유 영역으로 이동되는 분류 영역으로 이동(펌핑)되고, 다시 초과 유분은 제거되고(초과분을 사이펀으로 제거(siphoned off)되거나 폐기되는 것을 허용함) 이후 액적들은 한방울씩 방출되며(이 과정을 용이하게 하기 위해 추가 오일이 첨가됨), 액적 배출 메커니즘이 선택된 액적들을 액적들에 대한 공통 또는 개별 저장소내로 배출하는 분배 영역으로 이동된다.
우리는 다수의 액적 처리 영역들을 가질 수 있는 카트리지들, 특히 액적 생성, 액적 배양, 액적 분류, 액적 보유 ("완충"), 및 액적 분배에 대해 설명하였다. 실시예들에서, 카트리지는 베이스 또는 기판을 가지며, 상기 베이스 또는 상기 기판에 이들 기능의 일부 또는 전부를 수행하는 개별 모듈들이 원하는대로 부착될 수 있는 모듈형으로 제공된다. 이것은 그러한 배치의 모듈들 사이에 표준 인터페이스 또는 인터페이스 집합을 가짐으로써 촉진될 수 있다.
본 발명의 관련된 측면에서, 액적 내에 하나 이상의 타겟 개체를 제공하기 위한 미세유체 시스템이 제공되며, 상기 미세유체 시스템은: 상기 액적이 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들 및 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들의 특성을 포함하는지 여부 중 하나 또는 모두를 검출하는 제1 검출기를 포함하고, 상기 미세유체 시스템은: 상기 검출의 결과에 따라 상기 액적을 분류하기 위한 분류 장치; 및 하나 이상의 타겟 위치들에서 상기 분류된 액적을 분배하기 위한 액적 분배 유닛을 포함하고, 상기 미세유체 시스템은 상기 타겟 위치를 상기 제1 검출기에서 검출된 상기 타겟 개체 또는 상기 타겟 개체들의 상기 특성과 상관시키도록 구성된다.
따라서, 액적들은 마이크로타이터 플레이트의 개별 웰들 또는 다른 매질에 분배될 수 있다. 제1 검출기에서의 검출에 기초하여 액적이 분배될 수 있기 때문에, 특정 타겟 위치(예를 들어, 마이크로타이터 플레이트의 웰일 수 있음)에서의 액적은 전체로서 액적의 특성들 및/또는 그것의 성분들(있는 경우)에 상관될 수 있다. 이러한 특성은 형광 레벨, 산란 발광 레벨, 흡광도 레벨, 전도도 레벨, 및 다른 화학적 및/또는 물리적 특성들 중 하나 이상일 수 있지만, 이에 제한되지는 않는다.
따라서, 예를 들어, 본 발명의이 측면 및 다른 측면에 따라, 본 발명의 방법/시스템의 실시예들은 어떤 액적/저장소(예를 들어, 멀티-웰 플레이트의 어느 웰)가 어떤 특성을 갖는지를 결정하는데 사용될 수있다. 이것은 나중에 특정 방법으로 반응하는 세포 또는 생물체를 확인하고 더욱 구체적으로는 그 샘플을 제공할 수 있도록 사용될 수 있다 (식별된 특성들을 갖는 타겟 개체/액적이 식별된 웰 내에 보유되기 때문이고, 실시예들에서, 액적/세포/개체가 어느 저장소/웰로 분배되는지에 관한 로그 기록이 유지되기 때문이다).
대안으로, 분류되고 분석된 액적들은 단일 저장소에 분배될 수 있다.
액적이 분배될 수있는 타겟 위치에 관한 결정이 이루어지기 전에 액적 및/또는 그 성분들에 대한 하나 이상의 추가 분석을 수행하는 것이 바람직할 수 있다.
따라서 바람직한 실시예에서, 상기 미세유체 시스템은 상기 타겟 개체 또는 상기 타겟 개체들의 상기 특성을 검출하기 위한 제2 검출기를 더 포함하고, 상기 액적 분배 유닛은 상기 타겟 위치를 상기 제2 검출기에서 검출된 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들의 상기 특성과 상관시키도록 더욱 구성된다.
따라서, 이들 하나 이상의 추가 분석은 예를 들어, 하나 이상의 타겟 개체, 특히 특정 수의 타겟 개체들을 액적에서 식별할 확률 및/또는 특정 특성(예를 들어 특정 형광 레벨로서, 형광 레벨의 특정 범위 내에 있을 수 있음)을 갖는 하나 이상의 타겟 개체를 식별할 확률을 증가시킬 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 액적 분배 유닛은 상기 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위한 제2 분류 장치를 포함하고, 상기 제2 분류 장치는: 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 액적을 분리시키기 위한 디커플러; 및 상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하기 위한 가이드를 포함하고, 상기 가이드는: 상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 회전되도록 구성된 회전 유닛; 및/또는 상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 병진 방향으로 이동하도록 구성된 병진 유닛을 포함한다.
상기 제2 분류 장치는 이전 분석에 기초하여 관심 액적을 격리시키는데 사용될 수 있다. 따라서, 분배된 액적이, 액적 내에서, 하나 이상의 타겟 개체, 특히 특정 수의 타겟 개체들 및/또는 특정 특성을 갖는 하나 이상의 타겟 개체를 가질 확률이, 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 격리함으로써 증가될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 액적 분배 유닛은 입력 채널 및 복수의 출력 채널들을 포함하는 미세유체 채널 접합부를 포함하고, 상기 액적 분배 유닛은, 상기 제1 및/또는 제2 검출기들을 통한 상기 검출을 기초로 하여, 상기 액적이 상기 복수의 출력 채널들 중 어느 것에 안내되는지를 제어하도록 구성된다.
따라서, 바람직하게는, 관심 밖의 액적이 폐기될 수 있다. 다른 액적들은 제1 및/또는 제2 검출기에서의 이전의 분석에 기초하여 미세유체 시스템으로부터 액적이 분배되는 동안 (존재한다면) 그 성분들의 특성에 따라 분류될 수 있다.
추가의 하나 이상의 검출기 및/또는 분석기가 미세유체 시스템에서 이용될 수 있으며, 미세유체 시스템으로부터의 액적의 분배는 하나 이상의 검출기 및/또는 부석기에서 이들 추가 분석 중 하나 이상과 상관될 수 있음이 이해될 것이다.
상기 미세유체 시스템의 바람직한 실시예에서, 상기 액적 분배 유닛은, 상기 액적 분배 유닛의 유체 흐름 경로 내의 압력을 변화시켜 상기 복수의 출력 채널들 중 어느 것에 상기 액적이 안내되는지를 제어하는 압력 조절 유닛을 포함한다. 예를 들어 상이한 출력 채널들 사이의 압력을 변화시킴으로써, 액적들은 이전의 분석 또는 액적의 검출에 따라 특정 출력 채널을 향해 안내될 수 있고 이 출력 채널로부터 분배될 수 있다.
선택적으로 또는 부가적으로, 액적이 분배되는 출력 채널을 제어하는 것은, 히터를 사용하여 액적의 온도를 제어하는 것, 압전 전극을 사용하는 것, 음향 액추에이터를 사용하는 것, 액적의 다른 물리적 및/또는 기계적 특성들을 이용하는 것 중 하나 이상에 의해 제어될 수 있다.
상기 미세유체 시스템의 추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 제1 출력 채널은 일반적으로 상기 입력 채널의 유체 흐름 경로 방향으로 상기 입력 채널에 연결되고, 상기 제2 출력 채널은 상기 입력 채널로부터 분기되고, 상기 액적 분배 유닛은 상기 제2 출력 채널과 연결된 펌프를 더 포함하고, 상기 펌프는 상기 입력 채널로부터 상기 액적을 흡입하도록 구성되며, 상기 압력 조절 유닛은 상기 제1 및/또는 제2 검출기에서의 상기 검출에 응답하여 상기 입력 채널 내의 압력을 증가시켜 상기 제1 출력 채널을 통해 상기 액적을 배출하도록 구성된다.
일단 관심 액적이 검출되면, 입력 채널에서 압력이 증가하여, 액적이 펌프에 의해 제2 출력 채널로 흡입되지 않고, 액적이 제1 출력 채널에 제공될 수 있다.
대안적으로, 입력 채널의 압력은 일반적으로 임계치보다 높을 수 있고, 그에 따라 입력 채널의 압력 변화 없이 액적이 제1 출력 채널에 제공됨이 이해될 것이다. 일단 관심 액적이 검출되면, 입력 채널 내의 압력은 타겟 액적이 펌프에 의해 제2 출력 채널로 흡입되도록 감소될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 상기 미세유체 시스템은 하나 이상의 액적 보유 영역들을 더 포함하고, 상기 보유 영역은 상기 분류 장치와 상기 액적 분배 유닛 사이에 배치되고, 상기 보유 영역은 상기 액적 분배 유닛으로의 상기 분류된 액적의 흐름을 제어하도록 구성된다. 이 실시예는 액적 분배 유닛으로의 액적의 더욱 정밀하고 정확한 제어를 가능하게 한다.
추가적인 바람직한 실시예에서, 상기 미세유체 시스템은, 상기 미세유체 시스템에서 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 (다른 시점들에서) 상기 미세유체 시스템의 다른 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 더 포함하고, 상기 분류 장치는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하도록 구성된다. 이는 미세유체 시스템 내의 액적(들)의 위치가 결정 및/또는 예측될 수 있고, 분류 장치에서 액적(들)을 분류하는 개선된 제어를 가능하게 하기 때문에 특히 유리할 수 있다.
본 발명의 추가적인 관련된 측면에서, 미세유체 칩이 제공되며, 상기 미세유체 칩은: 하나 이상의 생물체를 포함하는 미세액적들을 생성하기 위한 액적 생성 영역; 상기 생물체를 배양 및/또는 저장하기 위한 액적 배양기 및/또는 저장 영역; 상기 생물체의 하나 이상의 특성에 기초하여 상기 미세액적을 분류하기 위한 액적 분류 영역; 및 상기 분류된 미세 액적을 분배하기 위한 액적 분배 영역을 포함하고, 상기 액적 생성 영역, 상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역, 상기 액적 분류 영역 및 상기 액적 분배 영역은 상기 미세유체 칩의 단일 칩 디자인 상에 통합된다.
미세유체 칩은 무균성, 사용 편의성을 보장하며, 발전기, 배양기, 분류 칩 및 디스펜서가 단일 미세유체 칩에 통합됨으로써 상당한 비용 절감을 가능하게 한다.
바람직한 실시예에서, 미세유체 칩은 상기 영역들 사이에서 상기 미세액적의 미세유체 흐름 경로를 변경하기 위한 미세유체 흐름 경로 전환 유닛; 및 상기 미세유체 흐름 경로 전환 유닛을 제어하기 위한 제1 프로세서를 포함하는 제어 유닛을 포함한다. 이는 미세유체 칩의 특정 부분 또는 부분들, 예를 들어 배양 영역이 생략되어 그것이 특정 액적 또는 액적들을 처리하는데 사용되지 않을 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
미세유체 칩 상에 다양한 밸브들이 제공되어, 미세유체 칩의 상이한 영역들을 통하는 미세액적들의 흐름 또는 유속이 제어될 수 있다.
바람직한 실시예에서, 미세유체 칩은 상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역에서 (및/또는 다른 특정 영역들에서) 액적들을 국부적으로 가열하기 위한 히터를 더 포함하고, 상기 히터를 제어하기 위한 제2 프로세서를 더 포함한다. 제1 및 제2 프로세서는 단일 프로세서일 수 있다. 따라서, 실시예들은 유리하게는 미세유체 칩의 특정 위치들 또는 영역들에서만 액적들 및 그 성분들을 가열하는 것을 허용하여, 미세유체 칩의 다른 영역들에서의 액적들의 가열이 방지될 수 있다.
추가적인 바람직한 실시예에서, 미세유체 칩은 상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역에서 (및/또는 다른 특정 영역들에서) 액적들을 국부적으로 냉각하기 위한 냉각기(cooler)를 더 포함하고, 상기 냉각기를 제어하기 위한 제3 프로세서를 더 포함한다. 제1, 제2, 및/또는 제3 프로세서는 단일 프로세서일 수 있다. 따라서, 실시예들은 유리하게는 미세유체 칩의 특정 위치들 또는 영역들에서만 액적들 및 그 성분들을 냉각하는 것을 허용하여, 미세유체 칩의 다른 영역들에서의 액적들의 냉각이 방지될 수 있다.
가열(및 선택적으로 냉각)을 제공할 수 있는 실시예들은 예를 들어, 폴리머라제 연쇄 반응이 미세유체 칩의 하나 이상의 특정 영역에서 수행되는 것을 허용할 수 있다.
미세유체 시스템, 액적 분류 또는 분배 장치, 액적 디스펜서, 미세유체 장치, 미세유체 카트리지, 미세액적 처리 시스템 및 생물체의 미세액적-기반 처리용 기기와 관련하여 전술한 바람직한 실시예들 또한, 미세유체 칩에서의 바람직한 바람직한 실시예들로서 구현될 수 있음이 이해될 것이다.
다중-모드 동작
다른 측면에서, 본 발명은 생물체의 미세유체 액적-기반 처리를 위한 기기를 제공함, 상기 기기는 생물체를 포함하는 액적들의 하나 이상의 유중수 에멀젼을 생성하는 액적 생성 시스템; 상기 액적들을 처리하기 위한 액적 처리 시스템; 및 처리된 상기 액적들을 하나 이상의 저장소에 분배하는 액적 분배 시스템을 포함하고, 상기 액적 처리 시스템은 적어도 단일클론성 모드의 동작 및 분석 모드의 동작을 포함하는 다수의 상이한 동작 모드들에 대해 구성 가능하다.
실시예들에서, 상기 액적 처리 시스템은 적어도 액적 분류 유닛/기능을 포함하고, 상기 단일클론성 모드의 동작은 상기 생물체에 의한 액적들의 점유에 기초하여 액적들을 분류하는 것을 포함한다. 상기 분석 모드의 동작은 상기 액적을 배양하는 것을 포함하고, 필수적이지는 않지만 바람직하게는 분류 전에 액적 배양 유닛에서 액적이 배양될 수 있다. 상기 분류는 이후 상기 배양 동안의 상기 생물체의 산물에 기초하여 이루어질 수 있다.
상기 액적 처리 시스템은 적어도 하나의 액적 융합 유닛을 더 포함할 수 있으며, 이 경우 동작 모드는 융합 평가 모드를 포함할 수 있고, 한 세트의 액적 내의 생물체들을 제2 세트의 액적 내의, 예를 들어 다른 생물체와 같은 물질과의 조합의 결과에 기초하여 분류가 이루어진다. 실시예들에서, 액적 처리 시스템은 하나 이상의 상호교환가능한 또는 모듈식 카트리지로 구체화된다 - 즉, 예를 들어 상이한 카트리지가 상이한 동작 모드 각각에 대해 제공될 수 있거나, 대안적으로, 모듈 카트리지가 상이한 동작 모드들 각각을 위해 제공될 수 있거나, 또는 선택적으로, 분류 기능, 배양 기능, 분배 기능 등과 같은 상이한 액적 처리 기능들이 카드리지 기판 상에 선택적으로 조립될 수 있다.
보다 상세하게는, 단일클론성 동작 모드는 생물체, 전형적으로는 세포를 액적 내에, 바람직하게는 대다수의 빈 액적들 대다수를 향하여 편향된 방식으로 캡슐화하는 것을 포함할 수 있다. 이후 단일 셀에 의해 점유되는 것으로 분류 유닛에서 식별된 액적들이 선택적으로 액적 분배 유닛으로 지시되고, 여기서 이들이 처리되고 분배된다. 실시예들에서, 단일 액적은 개별 웰 또는 저장소에 분배될 수 있지만, 2개 이상의 액적들을 저장소 또는 웰에 분배하는 것도 수용가능하다. 예를 들어, 개체들 또는 세포들이 추후 처리를 위해 재-주입될 경우, 웰/저장소는 더 많은 수의 액적들을 보유할 수 있다.
분석 모드에서, 액적 당 1개 이상의 개체/세포, 예를 들어 액적 당 2개 또는 3개의 세포를 캡슐화하는 것이 허용 될 수 있다. 실시예들에서, 이들은 이들이 따뜻하게 되고 대사되는 단백질 등과 같은 산물을 생성하는 배양 챔버에 제공된다. 전형적으로, 상기 산물은 액적 내의 하나 이상의 시약과 상호작용하여, 예를 들어 형광 신호와 같은 측정가능 신호를 생성하고, 이후 이것은 최적의 생산자를 수집 및 분배하기 위해 액적들을 분류하는데 사용될 수 있다. 선택적으로, 배양 영역 이전에, 특히 배양 전에 빈 액적들을 제거하기 위해 분류 유닛이 제공될 수 있다. 이것은 배양 챔버의 부피를 줄이는데 도움이 되며, 액적 생성/개체 캡슐화가 빈 액적들을 많은 부분 야기하는 경우 - 사용된 공정에 따라, 90% 이상의 액적들이 비어있을 수 있는데, 이러한 경우에 특히 유리하다.
안정성 분석 모드로 명명될 수 있는 다른 분석 모드에서, 유사한 배양, 선택 및 분배 프로세스가 사용될 수 있지만, 초기 집단의 하위그룹을 식별하는 것을 목표로 한다. 그러한 하위그룹은 최적의 생산, 전형적으로 단백질 제조, 예를 들어 약물 제조를 나타내는 하위그룹일 수 있다. 최적 생산은 반드시 최대 생산일 필요는 없지만, 예를 들어 일정한 생산(시간이 지남에 따라 쇠퇴하는 것이 아니라 일정 기간 동안 유지되는 생산) 또는 (넓은) 범위의 환경 조건에 걸쳐 유지되는 생산일 수 있다. 따라서, 그러한 안정성 분석의 실시예들은 안정한 생산자들인 개체들을 확인하기 위해, 예를 들어 발효 공정과 같은 생산 공정을 위한 또는 생산 공정의 품질 관리를 위한 생산자를 선택하는데 사용될 수 있다. 실시예들에서, 개체는 액적 내에 하나 이상의 시약으로 캡슐화되고 이후 배양될 수 있으며, 이후 형광 신호와 같은 측정가능한 신호를 찾고, 이는 이후 하나 이상의 저장소에서의 수집 및 분배를 위해 개체들의 타겟 하위-집단을 구별하는데 사용될 수 있다.
추가적인 측면에서, 융합 동작 모드에서, 통상적인 절차는 2세트의 액적들을 생성하고, 적어도 하나가 생물학적 엔티티를 캡슐화하는 것을 포함하고; 이들은 미리 생성되어 대응하는 저장소에서 제공되거나, 예를 들어 카트리지-내에서 생성될 수 있다. 융합 분석은 액적 융합, 배양, 분류 및 분배를 포함할 수 있다. 선택적으로, 사전-분류는 전술 한 바와 같이 배양하기 전에 및/또는 액적 융합 이후에 사용될 수 있다. 융합 분석은 예를 들어 독성 연구, 환경 연구, 메타게노믹 연구, 약물 흡수 연구 등에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 후자의 경우에, 약물은 알려진 농도의 미세액적의 한 세트에 제공될 수 있으며, 이어서 약물의 농도는 배양 후에 (원격으로 또는 정제(aliquot)를 통해 취함으로써) 측정될 수 있어 약물의 농도의 변화가 결정되고, 그로부터 약물 흡수가 유추될 수 있다.
전술한 각각의 동작 모드에 대해, 실시예들에서, 분배 유닛은 또한 추가 선택 단계를 제공할 수 있다 - 즉, 시스템은 조합된 액적 분류 및 분배 단계를 포함할 수 있다.
본 발명의 이러한 측면 및 다른 측면이 첨부된 도면을 참조하여 단지 예로서 설명될 것이다.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 개략도를 도시한다.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 추가적인 예의 개략도를 도시한다.
도 3은 본 발명의 실시예에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 추가적인 예의 개략도를 도시한다.
도 4a 및 도 4b는 본 발명의 실시예에 따른 미세유체 카트리지의 개략도들을 도시한다.
도 5a 및 도 5b는 본 발명의 실시예에 따른 디커플러 및 제어 유닛의 개략도들을 도시한다.
도 6은 본 발명의 실시예에 따른 유체 흐름 및 디커플러의 개략도를 도시한다.
도 7a 내지 도 7c는 본 발명의 실시예에 따른 디커플러의 개략도들을 도시한다.
도 8은 본 발명의 실시예에 따른 디스펜서(분배기)의 개략도를 도시한다.
도 9는 본 발명의 실시예에 사용하기 위한 예시적인 액적 생성 및 분류 시스템을 도시한다.
도 10a 및 도 10b는 본 발명의 실시예들에 따른 추가의 미세유체 카트리지들의 도면들을 도시한다.
도 11a 내지 도 11d는 본 발명의 일 실시예에 따른 액적 처리 시스템을 제어하기 위한 예시적인 제어 시스템을 도시한다.
도 12는 본 발명의 일 실시예에 따른 액적 처리 시스템의 예시적인 물리적 구성을 도시한다.
도 13은 세포 분석을 위한 국면들의 개략도를 도시한다.
도 14a 및 도 14b는 액적의 내용물들을 결정하는 방법의 개략도를 도시한다.
도 15는 하이브리도마에 의한 피코액적들 내 단일클론 항체 분비를 도시한다.
도 16a 내지 16d는 차이니즈 햄스터 난소 세포들의 집단들을 도시한다.
도 17은 상이한 피코액적 크기들에 대한 배양 시간 대 생존 가능한 CHO-S 세포들의 백분율을 도시한다.
도 18a 및 도 18b는 본 발명의 실시예들에 따른 미세유체 칩 및 제어 시스템의 개략적인 블록도를 도시한다.
도 19a 내지 도 19c는 본 발명의 실시예들을 사용한 피코액적들에서의 단일 세포들의 검출을 도시한다.
도 20a 내지 도 20c는 피코액적들로부터의 적색 및 녹색 형광의 산란도의 시간 경과를 도시한다.
도 1은 본원에 기술된 실시예들에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 제1 예를 개략적으로 도시한다. 이 모드는 이 예에서 단일클론성 보증 모드라고 명명된다.
이 예에서, 다수의 세포들이 유체에 제공되며, 이 예에서는 물에 제공되고, 선택적으로 성장 배지를 포함하여 제공된다. 제1 단계에서, 유체로부터 개별 액적들이 형성된다. 전술한 바와 같이, 이는 예를 들어 T-접합부, Y-접합부, 유동 집중 장치 또는 다른 장치를 사용함으로써 달성될 수있다. 생성된 액적들은 이 예에서 오일 유체 내로 운반된다.
하나 이상의 세포를 포함하거나 포함하지 않을 수 있는 개별 액적들은 미세유체 장치를 통해 오일 에멀전 내로 안내된다.
이 예에서, 피코액적 세포 현탁액(picodroplet cell suspension), 즉 오일 에멀젼 내의 액적들은 검출 및 분류 장치를 향하여 안내된다. 단일 액적이 하나 이상의 세포를 포함하는지 여부는, 액적의 전기적, 광학적, 열적, 음향적, 기계적, 시간적, 공간적 및 기타 물리적 특성 중 하나 이상에 기초하여 분석기에서 검출될 수 있다. 분석기의 분석에 기초하여, 즉 단일 액적이 하나 이상의 목표 세포를 포함하는지 여부에 대한 결정에 기초하여, 액적은 액적 분류 장치에서 분류될 수 있다. 이 예에서, 하나 이상의 세포를 함유하지 않은 피코액적들은 버려진다. 또한, 이 예에서, 관심 있는 단일 세포를 함유하는 액적들은 미세유체 시스템의 디커플러(decoupler)를 향하여 안내된다.
이후 하나 이상의 관심 세포를 함유하는 액적은 제1 유체 흐름 경로로부터 추출되어 제2 유체 흐름 경로로 전달된다. 이 예에서, 타겟 액적들은 성장 배지 유체 내의 제1 유체 흐름 경로로부터 추출된다. 액적이 성장 배지 유체에 혼입되는, 타겟 세포를 함유하는 액적은 이후 가압된 유체 방출을 통해 마이크로타이터 플레이트(microtitre plate) 내로 분배된다. 이 예에서, 압력 소스는 성장 배지 유체가 주입되는 유체 경로에 부착된다. 피코액적들은 그에 의해 희석화될 수 있다. 마이크로타이터 플레이트의 다른 웰들(wells)에 액적들을 분배하기 위해 이 실시 예에서는 로보틱 xy 이동 스테이지가 제공된다.
액적 검출, 분류 및 세포 분배는 이 예에서 온도 제어된 환경에서 수행된다.
이 예에서, 단일 세포를 함유하고 마이크로타이터 플레이트에 배치되지 않는 피코액적은 제1 유체 흐름 경로에서 버려지도록 안내된다.
전술한 바와 같이, 마이크로 타이터 플레이트에 배치된 단일 액적에서 단일 세포를 발견할 확률은 99.997 % 이상일 수 있다.
도 1의 예에서, 자동화된 플레이트 스태커 인터페이스(plate stacker interface)가 서로의 상부에 다양한 마이크로 타이터 플레이트를 적층하도록 제공될 수 있다.
도 1의 시스템의 바람직한 구현들에서, 그리고 후술하는 시스템들과 유사하게, 카메라와 같은 이미징 장치가 액적들이 (마이크로타이터 플레이트 내로) 분산되는 지점에 또는 그 근처에 제공된다. 상기 이미징 장치는 액적이 단지 하나의 세포들(또는 다른 생물체)를 함유하는지, 또는 선택적으로 2개 이상의 세포들을 함유하는지 또는 세포가 없는지 여부를 결정하기 위해 액적을 묘화하는데 사용될 수 있다. 다른 접근법들에서, 이러한 목적으로 액적으로부터의 산란의 광학 검출이 검출될 수 있다. 이후, 그러한 광학 시스템은 단일클론성을 모니터링 하기 위한 도구로서 사용될 수 있고, 보다 구체적으로 웰(well)이 단 하나의 세포를 함유하지 않을 때 (또는 그 반대의 경우) 식별 및 기록하는 제어 시스템과 연계하여 사용될 수 있으며, 그에 따라 시스템은 이후 식별된 웰에 대한 오류를 표기(flag)할 수 있다.
도 2는 본원에 기술된 실시예에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 추가 예에 대한 개략도이다. 직접 평가 모드와 안정성 테스트 모드의 2가지 다른 동작 모드가 표시된다.
이 예에서, 세포들은 분석 시약과 함께 유체 내로 제공된다. 이후 도 1에 나타난 예에서 설명한 바와 같이 개별 액적들이 유체로부터 형성된다.
유체 함유 세포 및 분석 시약들로부터 제조된 액적들은 이후 배양기로 인도된다. 배양기는 액적들 내에서 세포를 성장 및/또는 유지하는데 사용될 수 있다. 전술한 바와 같이, 배양기는 배양(incubation) 중에 세포들에 대한 안정성 테스트를 수행할 수 있는 안정성 테스트 유닛을 포함할 수 있다. 단일 액적 내 세포에 대한 안정성 테스트를 수행하면 분석기 및 액적 분류 장치에서의 탐지 및 분류 단계들 동안 생존가능한 세포들만 분류할 수 있으며, 이는 안정성 테스트 동안 성능이 저하되거나 죽지 않는다.
액적의 내용을 결정하고, 결정에 기초하여 액적을 분류하고, 디커플러에서 관심 액적의 잠재적인 추출에 관한 추가적인 단계들이 도 1의 개략도와 관련하여 설명된 바와 같이 수행된다.
도 3은 본원에 기술된 실시예들에 따른 액적 검출, 분류 및 분배의 추가 예에 대한 개략도이다. 이 모드는 이 실시예에서 피코액적 융합 분석 모드(picodroplet fusion assay mode)로 지칭된다.
이 예에서 피코액적 융합 분석 모드가 설명된다. 제1 세포 유형 A는 제1 유체에 제공된다. 이후 이 제1 유체에서 개별 액적들이 형성된다. 제2 세포 유형 B는 제2 유체에 제공되고, 그로부터 개별 액적이 형성된다. 제1 유체로부터 제조된 액적 뿐만 아니라 제2 유체로부터 제조된 액적 또한 융합 장치(도 3의 전극들)를 향해 안내된다. 이 예에서, 제1 및 제2 유체들로부터 각각 2개의 액적들이 전자-유착(electro-coalescence)에 의해 제조된다. 이후, 융합된 액적들은 도 1 및/또는 도 2의 개략도들에 도시된 바와 같이 더 처리될 수 있다.
전술한 바와 같이, 상기 액적 융합 장치는, 예를 들어, 분석기 및 액적 분류 장치 뒤에서 미세유체 시스템의 유체 흐름 방향으로 배치될 수 있다. 이 예에서, 그러한 구성은 성장 및/또는 추가적인 분석 및 처리에 관심 있는 세포들을 포함하는 것으로 결정된 액적들에 대해서만 액적 융합 장치 내의 액적들을 융합시키는 것을 허용할 수 있다.
이제 도 4a를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 (일회용) 미세유체 카트리지(410)를 포함하는 미세액적 처리 시스템/기기(400)의 실시예의 블록도가 도시된다. 기기(400)는 일반적으로 성장 배지를 포함하는 수성 매질을 보유하는 저장소(402)를 가지며, 포유 동물 세포, 박테리아 등과 같은 생물학적 개체가 처리를 위해 보유된다. 한 세트의 저장소(404a-d)는 시스템의 다양한 단계들에서 에멀전을 제공하기 위해 오일을 보유한다. 비록 저장소(402, 404)가 카트리지의 일부가 아닌 기기의 일부로서 도시되어 있지만, (도 10a에서 나중에 나타난 바와 같이) 다른 실시예에서 카트리지의 일부일 수도 있다; 예를 들어 융합 또는 기능 분석을 위해 사용되는지 여부와 같은, 카트리지 기능에 따라, 하나 이상의 수성 저장소(402)가 있을 수 있다. 저장소들(402, 404)로부터의 유체들은 유체 구동 모듈(406)로 도시된 도 4a의 개별 펌프들에 의해 펌핑되며, 이는 다시 카트리지와 통합될 수 있다. 한 세트의 유체 유동 라인들(408)은 도 12를 참조하여 나중에 설명되는 바와 같이, 카트리지가 기기에 삽입될 때 카트리지의 개별 포트들에 연결된다.
도시된 카트리지(410)는 액적 생성 영역(412), 액적 배양/저장 영역(414), 액적 분류 영역(416), 유동 버퍼 영역(418) 및 액적 디스펜서(420)를 포함한다. 상기 카트리지의 실시예들에서 이들 영역들 각각은 모듈식(modular)이고, 에멀전 흐름 처리 구성은 카트리지 베이스 또는 홀더에 부착할 모듈을 선택함으로써 선택될 수 있어서, 선택된 모듈들은 특정 카트리지에 대해 원하는 기능을 수행하도록 서로 인터페이스할 수 있다.
도 4a에서, 보다 작은 원형 영역들은 액적 처리 영역들에 대한 입구/출구 포트들을 나타내며, 이들은 카트리지 구성에 따라 카트리지-내(on-cartridge) 또는 카트리지-외(off-cartridge) 연결들을 나타낼 수 있다; 더욱 큰 원형 영역들은 액적 감지 영역들을 나타내고, 교차된 원형들은 밸브들을 나타낸다.
실시예들에서, 카트리지의 액적 생성 모듈 또는 영역(412)은 에멀젼을 생성하기 위한 수성 샘플 입구(422) 및 오일 입구(424)를 포함한다. 이들 액체들의 흐름들은 에멀젼이 생성되어 영역의 출력 채널(428)에 제공되는 유동 포커스 접합부(426)에 제공된다. 예를 들어, 일부 예시적인 수치들을 제공하기 위해, 생성 오일은 시간 당 1400 μl의 유속을 가질 수 있고, 예를 들어 세포 현탁액과 같은 샘플은 시간당 1000 μl의 유속을 가질 수 있으며, 출력 채널 내 오일-내-물 에멀전은 1000Hz에서 700 피코리트의 액적들을 포함하는 시간당 2400 μl의 유속을 가질 수 있다.
이후 (대안적으로 카트리지 외부에서 생성되어 저장소에 첨가될 수 있는) 에멀전은 이 예에서 배양/저장 영역(414)에 제공된다. 이는 저장 챔버(430)를 포함하며, 이 저장 챔버(430) 내에서 개별 액적들(432)은 위로 떠오르고, 반면에 초과 오일은 (밸브를 거쳐) 채널(434)을 통해 저장소(436)로 버려지며, 저장소(436)로부터, 잠재적으로, 오일이 재순환될 수 있다. 실시예들에서, 오일은, 예를 들어, 불소 오일(fluorous oil)을 포함하며, 이는 챔버(430)에 저장되는 동안 액적들 내에서 세포들과 같은 생물체들의 증가된 성장을 가능하게 하는 산소를 포획하기에 특히 적합하다. 따라서, 챔버(430)에는 임계값(예를 들어, 챔버(430)의 체적의 50%)을 이상 불소 오일로 채워질 수 있고, 그에 따라 특정 기간 동안 액적 내의 개체에 충분한 산소가 제공될 수 있다. 실시예들에서, 카트리지가 위치되는 기기는, 바람직하게는 온도 제어를 위한 온도 센서와 함께, 배양 챔버(430)에 인접한 펠티어 효과 장치와 같은 냉각 장치 및/또는 히터 플레이트와 같은 가열 장치를 포함한다. 이러한 방식으로, 챔버는 제어된 기간 동안 가열되어 액적들의 내용물들을 배양한 다음 냉각시켜 배양을 실질적으로 억제할 수 있다. 배양 챔버는 선택적인 측면 채널(440)을 갖는 출구 채널(438)을 갖고, 선택적인 측면 채널(440)에서는 스페이싱 오일(spacing oil)이 수신되어, 출구에서의 에멀전 내 액적들이 챔버(430)로부터 공급됨에 따라 이격된다. 약 200,000개의 액적들이 0.22 ml의 체적에 저장되는 이전의 수치 예를 계속하면, 약 2.2 ml의 체적 내에 2,000,000 백만 이하의 액적들이 있고(67%의 패킹을 가정), 따라서 (액적들이 이전에 챔버를 채우는 오일을 대체하기 때문에) 약 2.2 ml의 오일이 버려질 수 있다. 배양 영역으로부터의 출력 채널(438)은 시간 당 약 350μl의 유속을 가질 수 있으며; 스페이싱 오일은 포트(440) 또는 후속 분류 영역(후술)에서 시간 당 약 8,000-11,000μl의 속도로 첨가될 수 있다.
분류 영역(416)은, 이 실시예에서의 입력 채널(442)로서, 배양 영역의 출력 채널(438)에 연결되고, 및 한 쌍의 출력 채널들(444, 446)로 이어지며, 채널(444)은 원하는 액적들을 함유하고, 상기 액적들은 선택된 타겟 분석물(개체 또는 개체들)의 부하(load)를 갖는다. 채널(446)은 폐기물 저장소(436)로 진행한다. 선택적으로, 유입구(448)는 분류 영역 내로의 유동에 스페이싱 오일을 추가하기 위해 제공된다. 분류 영역은 액적 내용물들이 카트리지를 보유하는 기기에 의해 (광학적으로) 조사되는 영역(450)을 포함하며, 이는 전극들(452)을 구동하여 액적들이 채널(444) 또는 채널(446) 중 하나에 선택적으로 향하게 한다(전극들(452)에 대한 연결들은 간결성을 위해 도 4a에 도시되지 않음). 이전의 수치 예를 계속하면, 분류 영역(416)에 대한 입력 에멀젼에서의 액적들의 공간 비는 1:10 내지 1:20 일 수 있고, 액적들은 수 100Hz의 속도로 분류 영역으로 진입할 수 있다. 채널(444)의 유속은 시간당 약 5,000 μl일 수 있고, 1,000 내지 10,000 개의 액적들을 포함할 수 있다; 채널(446) 내의 에멀전의 유속은 실질적으로 동일할 수 있지만, 이 에멀전은 약 19,000-2,000,000 액적들(시간당)을 포함할 수 있다.
분류 영역의 '목표' 출력 채널(444)은 '흐름 버퍼' 영역(418) 또는 공간/홀드의 입력 채널(454)에 결합된다. 이것은 통상적으로 배양 챔버(430)보다 다소 작은 챔버(456)를 포함하며, 상기 챔버(456) 내에서 액적들은 출력 채널(458)로 방출되기 전에 임시 보유된다(예를 들어, 챔버의 상부에서 부유).
실시예들에서, 오일은 불소 오일(fluorous oil)을 포함하며, 이는 챔버(456)에 저장되는 동안 액적들 내에서 세포들과 같은 생물체들의 증가된 성장을 가능하게 하는 산소를 포획하기에 특히 적합하다. 따라서, 챔버(456)에는 임계값(예를 들어, 챔버(4560)의 체적의 50%)을 이상 불소 오일로 채워질 수 있고, 그에 따라 특정 기간 동안 액적 내의 개체들에 충분한 산소가 제공될 수 있다. 챔버(456)로부터의 해제(release)는 입력 채널(460)을 통해 스페이싱 오일을 추가함으로써 촉진된다. 배양 영역과 유사한 방식으로, 유동 버퍼 영역은 또한 폐기물 저장소(436)로의 출력 채널(462)을 포함한다. 수치적 예시로서, 10 ml 부피의 챔버(456)는 10,000개의 액적들을 저장할 수 있다. 채널(458) 내 출력 유속은 시간당 4μl 이다; 채널(460) 내의 스페이싱 오일은 시간 당 약 5,000μl로 흐를 수 있다; 채널(462) 내의 폐기물은 예를 들어, 시간 당 10-5,000μl의 가변 속도로 흐를 수 있다.
도시된 실시예에서, 유동 버퍼 영역(418)의 출력 채널(458)은 채널(464)을 통한 액적 디스펜서 영역(420)로의 입력을 제공한다. 도시된 실시예에서 디스펜서 채널(466)은 디스펜서로의 제2 입력을 제공하며, 타겟 액적의 추출 및 배출을 위해 사용되는 오일인 용리제(eluent)를 운반한다.
디스펜서는 폐기물로 다시 유동하는 제1 출력 채널(468) 및 저장소에서의 수집을 위해 선택된 액적을 배출하기 위한 디스펜서용 유출구(472)를 제공하는 제2 출력 채널(470)을 갖는다. 추가 채널(476)은 이 예에서, 예를 들어 0-2.5bar 범위의 압력에서 압축 공기를 수용하도록 유입구(478)에 결합된다. 이러한 방식으로, 멀티-웰 저장소(484)의 웰 내에서의 수집을 위해 선택된, 타겟 액적(482)을 함유하는 에멀젼(480)의 슬러그(slug)를 방출하도록 (밸브(477)를 폐쇄한 이후) 출력 채널(470)에서 유동하는 에멀젼에 압력 펄스가 인가될 수 있다. 도시된 실시예에서 디스펜서(420)는 디스펜서 출력 채널(470)과 연결되는 유체 흐름 고리(fluid flow linking) 또는 폐기물 채널(468)과 연결되는 유체 흐름 고리 내로 액적을 선택적으로 유도하는데 사용될 수 있는 회전 밸브(474)를 갖는다.
선택적으로, 디스펜서(420)는 영역(486)에 대한 하나 이상의 액적 감지 영역을 포함할 수 있다. 이들은 액적이 언제 유동에 존재하는지를 식별하고 이에 따라 액적 분사의 타이밍을 제어하여 에멀젼 슬러그(480)를 방출하도록 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로 이들 관찰 영역들 중 하나 이상은 타겟 액적의 내용물들을 감지하는데 사용될 수 있고, 실시예들에서, 이 감지는 예를 들어, 액적(482)의 내용물들의 단일클론성(monoclonality)의 추가 보장을 제공하기 위해 또는 액적(482) 내의 개체들의 개수 또는 수치 범위에 걸친 또는 액적 내용물에 걸친 일부 추가적인 선택성을 제공하기 위해, 방출된 액적들에 대한 추가 레벨의 선택을 적용하는데 사용될 수 있다.
실시예에서, 멀티-웰 플레이트(484)는 선택적으로 수성 (성장) 배지(490)가 제공될 수 있는 복수의 웰들(488)을 포함할 수 있다. 실시예들에서, 다중-웰 플레이트(484)는, 예를 들어 X-Y 스테이지(미도시)에 의해 이동되어, 각각의 웰은 단지 하나의 액적이 들어있는 단 하나의 슬러그를 수용한다. 더욱이, 실시예들에서, 도 4a의 시스템을 제어하는 장비는 액적의 특성, 특히 분류기 내에서 (또는 액적이 버퍼 영역을 통과하는 동안 쉽게 추적되지 않는 경우, 디스펜서 이후에) 액적의 내용물들을 감지한다. 따라서, 각각의 웰 내에서, 예를 들어 형광성(fluorescence) 등과 같이, 각각의 액적의 하나 이상의 특성을 정의하여 기록(log)이 생성될 수 있고 저장될 수 있다. 이러한 방식으로, 관심 있는 특성 또는 특성들을 갖는 소수의 또는 개별적인 단일 개체들이 추후 연구 또는 사용을 위해, 예를 들어 분석, 항체 생성, 발효 등을 위해 선택될 수 있다.
예를 들어, 미세액적 처리 시스템/기기(400)의 영역들(414, 416, 420)에 다양한 센서들이 채용될 수 있으며, 이는 액적들의 검출을 허용한다. 이들 센서들은 광 센서들 및/또는 전기 센서들일 수 있다. 전기 센서들은, 액적 내에 세포가 존재하면 절연 세포가 액적의 전기적 특성에 영향을 미치므로 커패시턴스 측정에 의해 세포를 저장하는 액적이 존재하는지 또는 아닌지를 검출할 수 있게 한다는 사실을 이용할 수 있다. 커패시턴스 측정을 사용하여, 액적 크기가 더욱 결정될 수 있다. 당업자는 액적 및/또는 액적 성분들을 검출하기 위한 대안적인 방법 및 기술에 익숙할 것이다.
센서들은 액적들을 카운트하는데 사용될 수 있고, 복수의 센서들을 순차적으로 제공함으로써, 처리 시스템/기기를 통해 흐르는 액적의 속도가 결정될 수 있다. 이는 예를 들어 적절한 시간에 액적의 분류를 활성화시키는 것을 허용한다. 이는 액적 분류를 허용하는 유닛들이 특정 시간에만 활성화될 필요가 있기 때문에 액적 처리 시스템 또는 미세유체 칩을 보다 효율적으로 만들 수 있다.
일부 예들에서, 유동 방향에서 분류 연결부 뒤에 추가적인 센서가 제공된다. 상기 추가 센서는, 결정된 속도 데이터에 기초하여 그리고 상기 추가 센서에 의한 액적의 검출을 상기 분류 연결부로부터의 상류 센서들로부터의 검출 데이터와 비교함으로써, 액적이 정확한 유동 경로/채널로 분류되었는지의 여부를 재확인하는데 사용될 수 있다. 액적이 정확하게 분류되지 않았다면, 이전의 분류된 액적을 복수의 유동 경로들/채널들 사이에서 추가로 분류함으로써 분류 접합부로부터 하류로 추가 작용들이 취해질 수 있다.
이제 도 4b를 참조하면, 이는 앞서 기술된 것들과 동일한 요소가 동일한 참조 번호로 표시되는 미세액적 처리 시스템/기기(400')의 다른 실시예를 도시한다. 도 4b의 구성은 부분적으로 또는 심지어 전체적으로, 예를 들어 상기 기기 내의 링크된 모듈들 상에서 전술한 카트리지에 대해 분리되어 구현될 수 있다. 도 4b의 배열의 바람직한 구현 예는 보드-외(off-board) 생성 및 보드-외 액적 분류를 갖지만, 보드-내(on-board) 액적 배양/저장 및 분배(dispensing)를 갖는 '반-모듈식(semi-modular)' 카트리지이다. 이전처럼, 교차된 원들은 밸브들을 나타낸다; 도 4b의 변형예에서는 2개의 유동 버퍼 영역들이 도시된다. 당업자는 요구들에 따라 다수의 상이한 시스템들이 상이한 기능들로 조립될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명의 바람직한 실시예에 사용되는 광학 시스템들 중 일부는 도 4b를 참조하여 설명될 것이다; 유사한 광학 시스템들이 도 4a의 구성과 함께 사용될 수 있으며, 애플리케이션에 따라, 설명 가능한 시스템들 모두가 필요하지 않음이 이해될 것이다. 따라서, 도 4b의 배열에서, 제1 광학 감지 영역(491)은 광학 시스템에 의한 액적의 크기확인(sizing)에 사용된다; 제2 광 감지 영역(492)은 광학 진단 목적으로 사용된다. 제3 광학 감지 영역(493)은 광학 셀 검출 및 분류(예를 들어, 액적 내의 세포의 이미징)에 사용되고, 제4 광학 감지 영역(494)은 분류-후 진단을 위해 사용될 수 있다. 광학 감지 영역(495)은 진단 목적으로 유사하게 사용될 수 있고, 광학 감지 영역(496)은 타이밍 목적으로 (예를 들어, 디스펜서에 대한 액적 위치/속도/시간을 설정하기 위해) 사용될 수 있으며, 액적 광학 감지 영역(497)은 예를 들어 (선택적) 분배에서 사용하기 위한 액적 내용물(셀) 검출에 사용될 수 있다. 도 4b의 기기 내 분배 영역(420')은 아래의 도 8을 참조하여 기술된 유형의 디스펜서를 포함할 수 있다.
도 5a는 여기에 설명된 실시예에 따른 디커플러(500)의 개략도를 도시하며, 액적은 제1 유체 흐름 경로(채널)(502)로부터 추출될 수 있는데, 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로(채널)(504)로 액적을 이송함으로써 수행될 수 있다.
이 예에서, 개별 액적들은 디커플러를 향한 유중수 에멀젼(water-in-oil emulsion) 내의 제1 채널(502)에서 안내된다. 관심 액적이 디커플러에 인입되면, 디커플러의 회전 유닛(506)은 관심 액적이 제1 채널로부터 장치의 제2 채널(504)로 전달되도록 회전될 수 있다. 이후, 제2 채널에서 유동하는 오일은 제2 채널의 유출구(508)로 액적을 안내할 수 있다. 일단 액적이 장치의 제2 채널(504)에 있으면, 그것은 제1 채널로부터 분리되고, 이후 바람직하게는 제2 채널에 압력이 가해져 유출구(508)로부터 선택된 액적이 방출된다.
디커플러는, 예를 들어 미세유체 칩 상에서, 피코액적 또는 다른 관심 체적(예를 들어, 세포, 박테리아 및 다른 것들)을 함유하는 유체 체적(에멀전의 슬러그)을 분리시키고, 이 체적의 유체를 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 이동시키는데 사용될 수 있고, 그로부터 상기 액적은 후속하여 상기 미세유체 칩 밖으로 분배될 수 있다.
이 예에서, 회전 유닛을 갖는 디커플러는 미세유체 채널 네트워크 내의 제1 유체 흐름 경로를 크게 방해하지 않으면서 유체 체적의 정확한 포획 및 격리를 가능케 한다. 디커플러는 오프-칩 디스펜스 메커니즘의 디커플링을 더욱 가능하게 하여, 격리된 유체 체적의 칩 밖으로의 정확하고 신속한 배출을 보장한다. 이 예에서, 디커플러의 회전 유닛은 최대 5Hz 이상의 속도로 작동할 수 있다(실시예들에서 마이크로타이터 플레이트의 스텝 이동 속도에 의해 제한됨).
도 5a에 도시된 디커플러는 액적 디스펜서의 일부를 형성할 수 있다. 일 접근법에서, 도시된 바와 같이, 배출을 위해 선택된 액적은 채널(502)로부터 채널(504)로 전달될 수 있고, 이후 (에멀전의 슬러그에서의) 액적을 방출하기 위해 공기압과 같은 압력이 채널(504)에 인가될 수 있다. 액적이 소망되지 않거나 배출되지 않아야 하는 경우, 그것은 채널(502)에 남겨질 수 있고, 이는 폐기 진행된다. 대안적으로, 채널(504)은 패기 진행될 수 있고, 원치 않는 액적들은 채널(503)로부터 채널(504)로 전달된다; 이후 배출을 위한 액적은 다시 공기압 등에 의해 채널(502)의 개방부(open)로부터 배출될 수 있다.
도 5b는 디커플러에 대한 예시적인 제어 유닛의 블록도를 도시한다. 제어 유닛(500)은 이 예에서 액적의 내용물들 및 그들의 물리적 특성들을 검출하는데 사용될 수 있는 검출기(502)를 포함한다. 검출기(502)뿐만 아니라 제어 유닛(500)의 다른 유닛들도 버스(504)를 통해 서로 연결된다.
프로세서(506)는 검출기(502)로부터 얻어진 신호를 처리하도록 구성된다. 제어 유닛(500)에 운영체제/소프트웨어(508)가 제공되고, 이는 프로세서(506)에서 처리되고 검출기(502)를 통해 얻어진 신호에 적용될 수 있으며, 그에 따라 액적 내 세포들의 성분들 및 이들의 물리적 특성들이 결정된다. 운영체제/소프트웨어(508)는 메모리(512)에 저장될 수 있다.
검출기(502)로부터 프로세서(506)로 제공되는 신호의 결과에 따라, 디커플러(510)에 신호가 제공될 수 있다. 이 신호는 이 예에서 디커플러(510)의 회전 유닛을 제어하고, 그에 의해 상기 제1 유체 흐름 경로에서의 액적이 유지되거나, 또는 상기 액적이 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송된다.
예를 들어, 분석된 액적들의 성분들과 관련함 임의의 정보, 예를 들어 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달된 액적들의 개수 및 다른 정보에 관한 임의의 정보는, 메모리에 저장될 수 있고, 이는 메모리(512)에 통합될 수 있다.
도 6은 본원에 기술된 실시예에 따른 예시적인 유체 유동들 및 디커플러의 개략도를 도시한다. 나타난 바와 같이, 관심 샘플은 예를 들어 미세유체 장치 상의 용기에 저장될 수 있는 유체로 제공된다. 피코액적들은 일반적으로 위에서 설명한 유체로 마련될 수 있다. 이 예에서, 용리액(eluent)과 희석제(diluents)를 위한 추가 용기들이 제공된다. 오일 저장소는 오일 흐름이 장치를 통해 하나 이상의 개체들을 포함하는 액적들을 안내하는 것을 허용할 수 있다.
이 예에서, 용리액 용기, 희석제 (오일) 용기 및 샘플 유체 용기 각각은 미세유체 채널들에 의해 디커플러의 상이한 입력단들에 연결된다. 일단 액적이 입력단에서 디커플러에 인입되면, 상기 액적은 디커플러 채널 네트워크를 통해, 이 예에서는 회전 유닛으로 안내될 수 있다. 이후, 상기 액적은 상기 회전 유닛을 회전시킴으로써 일 채널로부터 다른 채널로 전달될 수 있다.
이 예에서, 회전 솔레노이드는 회전 유닛을 회전시키기 위해 사용된다. 상기 회전 유닛은 도 5b와 관련하여 전술 한 바와 같이 제어될 수 있다.
일 액적이 특정 출력단에서 디커플러를 빠져나가기로 결정되면, 액적은 디커플러 또는 미세유체 장치 또는 칩으로부터 분배될 수 있다. 이 예에서, xy-스테이지가 xy-평면 내 원하는 위치에서, 예를 들어 마이크로타이터 플레이트 또는 다른 포맷으로 액적을 분배하기 위해 제공된다. 또한, 장치로부터 액적을 분배하기 위한 유속을 보다 정확하게 제어하기 위해 공압식 흐름 제한기(pneumatic flow restrictor)가 제공될 수 있다. 이 예에서, 열전대가 디커플러의 출력단과 공압식 흐름 제한기 사이의 채널에 연결된다. 하나 이상의 노즐들이 디커플러의 출력단들에 제공될 수 있다. 이 예에서, 추가의 고속 솔레노이드 밸브가 액적들의 분배를 제어하기 위해 제공된다.
도 6의 예시적인 장치에서, 고압 유닛이 제공되고 이는 가압된 유체 배출을 통해 장치로부터 액적들을 분배할 수 있게 한다. 고압 유닛은, 이 예에서, 압축 가스 용기, 채널 네트워크의 압력을 조절하기 위한 다양한 압력 조절기들, 및 압축 가스 용기 및 조절기들을 압력 센서와 연결하는 T-접합부를 포함한다. 가압된 유체 배출을 통해 액적을 분사하기 위해 채널 네트워크 내의 압력을 제어하는 것이 다른 대체 구성들에 의해 허용될 있음이 이해될 것이다.
이 예에서, 폐기물 용기는 액적 분류 장치의 유출구에 연결된다. 개체들이 없거나 관심이 없는 개체들을 포함하는 액적들은 폐기될 수 있다.
도 6에 도시된 디커플러의 유입구들 중 어느 것도 출구로서 사용될 수 있으며, 그 반대도 마찬가지임이 이해될 것이다.
도 7은 본원에 설명된 실시예들에 따른 디커플러의 개략도를 도시한다.
도 7a는 예시적인 디커플러의 개략적인 평면도를 도시한다. 나타난 바와 같이, 다양한 유입구들이 디커플러 상에 제공된다. 유입구들은 채널들을 통해 디커플러의 회전 유닛에 연결된다. 상기 회전 유닛은 채널 네트워크를 통해 상기 디커플러의 유출구에 추가로 연결되어, 상기 장치로부터 액적이 분배될 수 있다.
도 7b는 디커플러의 회전 유닛의 개략적인 측면도를 도시한다. 회전 유닛의 치수는 단지 예시적인 것임이 이해될 것이다. 회전 유닛은 액적이 회전 유닛에 진입 및/또는 배출될 수 있는 개구(도 7b의 D)를 포함할 수 있다.
도 7c는 회전 유닛을 갖는 디커플러의 개략적인 사시도를 도시한다. 이 예에서는, 4개의 유입구들과 1개의 유출구가 제공된다. 그러나, 전술한 바와 같이, 각각의 유입구는 출구로서 사용될 수도 있고, 유출구는 장치의 특정 요구 조건에 따라 유입구로서 동등하게 사용될 수 있다.
이제 도 8을 참조하면, 이는 액적 디스펜서(800)의 예시적인 실시예를 도시한다. 이것은 공유 채널 (유동) 부분(808)을 갖는 입력 채널(802) 및 제1 및 제2 출력 채널들(804, 806)을 포함한다. 채널(804)에는 노즐(810)이 공급되며, 액적(814)을 포함하는 에멀전(802)의 슬러그를 분배하기 위한 유출구에서 공급된다. 채널(806)은 실시예들에서는 흡입에 의해 폐기된다. 디스펜서는 또한 가압된 공기 공급을 위한 공기 유입구(816)를 갖는다. 입력 채널(802)은 간격들로 액적들(820)을 갖는 오일 공급(oil feed)(818)을 수용한다. 입력 채널(802)에는 공급 밸브(feed valve)(822)가 제공된다; 폐기물 출력 채널(806)에는 차단 밸브(824)가 제공되고, 공기 공급 유입구(816)는 공기 밸브(826)로 책정(priced)된다. 도시된 예에서, 영역(828)은 광학 액적 검출 영역을 정의한다. 2개의 출력 채널들(804, 806) 사이의 공유 유동 경로의 길이를 한정하는 공기 입구(816)와 채널(806) 사이의 분리(830)는 에멀젼(812)의 배출된 슬러그의 길이를 한정한다.
액적이 없는 오일 또는 불필요한 액적이 있는 오일이 디스펜서를 통과할 때 공급 밸브(822)가 개방되고 차단 밸브(824)가 개방되어 유입구 유체 흐름이 공유 채널 영역(808)을 따라 통과하여 채널(806)을 통해 흡입 폐기된다. 분배 용 액적이 채널(808)에서 검출될 때, 밸브들(822 및 824)은 차단되고 공기 밸브(826)는 개방되어 채널(808)로부터 액적(814)을 함유하는 에멀전(812)의 슬러그가 출력 채널(804)을 따라 노즐 삽입부(810)로 배출된다. 액적 검출이 상류에서 수행되는 시스템에서, 분배용 액적이 채널(808)에 존재할 것으로 예측될 때 상응하는 절차가 구현될 수 있다.
실시예에서, 노즐은 에멀젼의 슬러그, 특히 액적을 파괴하도록 형상화될 수 있고 및/또는 유사한 목적을 위해 메시(mesh)가 제공될 수 있으며, 그에 따라 슬러그/액적이 수성 배지를 함유하는 웰로 분배될 때, 액적 내용물들은 상부에 떠다니기보다는 웰의 수성 배지 내로 유리(liberated)된다. 선택적으로, 노즐(810)은 유사한 목적을 위한 다른 수단, 예를 들어 전기장을 생성하기 위한 하나 이상의 전극; 및/또는 탈-유화제(de-emulsification agent)를 운반하기 위한 추가 채널을 구비할 수 있다.
속도 제어 유닛은 액적 디스펜서(800)로 흐르는 액적의 속도를 제어하기 위해 선택적으로 제공될 수 있다. 속도 제어 유닛은 액적 디스펜서(800)의 전방에 있는 보유 챔버에 결합될 수 있고, 이는 정의된 속도로 액적 디스펜서로 액적을 공급하는 것을 허용한다.
일부 실시예들에서, 채널(806)은 채널(804)에 비해 더 넓어서, 폐기물 채널(806)을 향한 액적들의 바이어스(bias)가 생성된다. 이는 액적 디스펜서(800)가 통합된 미세유체 시스템 또는 칩이 수직 배향으로 사용되는 실시 예들에서 특히 유용할 수 있고, 상기 수직 배향에서 수성 액적들은 시스템 또는 칩의 상부를 향해 유동하는 경향을 갖는다. 따라서, 시스템 또는 미세유체 칩이 수직으로 사용되는 실시예들에서, 채널(806)은 바람직하게는 액적 디스펜서(800)의 상부 측에 배치된다.
도 9는 본 발명의 실시예들에 사용하기 위한 예시적인 액적 생성 및 분류 시스템을 도시한다. 따라서, 도 9는 앞서 기술된 액적 생성 및 분류 기능들을 구현하기 위해 카트리지 상에서 구현될 수 있는 시스템의 예를 도시한다. 예를 들어 도 14a 및 도 14b와 관련하여 설명된 바와 같이, 액적의 성분들이 (있는 경우) 분석되면, 이 분석에 기초하여 액적이 분류될 수 있는데, 이 예에서는 전극들(삽입 도면에서 흑색으로 도시됨)을 사용하여 전기장을 인가함으로써 분류될 수 있다. 이 예에서, 액적의 분류는 액적의 쌍극자 모멘트에 기초한 것이고, 이에 의해 액적은 그 성분들에 따라 상이한 전기력을 경험한다.
도 10a는 샘플/오일 저장소들이 카트리지에 내장된 본 발명의 실시예에 따른 액적 처리 카트리지(1000)의 사시도를 도시한다. 도시된 바와 같이, 카트리지는 카트리지의 밸브를 작동시키기 위한 영역(1002), 분류 영역을 위한 전기 연결부들(1004), 및 (도시된 사시도에서 숨겨진) 분배 노즐(1006)을 포함한다.
도 10b는 본 발명의 일 실시예에 따른 모듈식 카트리지(1050)의 위에서 바라본 평면도이다. 도시된 모듈식 구현은 액적 생성 모듈(1052), 액적 배양/저장 모듈(1054), 액적 분류 모듈(1056), 액적/홀드(흐름 버퍼) 영역(1058), 및 액적 분배 영역(1060)을 포함한다. 상기 도시는 또한 예시적인 밸브들(1064) 및 데이텀 위치 빈들(datum location bins)(1066)의 위치들뿐만 아니라 모듈들 사이의 카트리지-내 연결부들(1062)('매니 폴드 채널')도 도시한다. 실시예들에서 채널들(1062)은 가스켓이 제공되는 카트리지의 베이스 플레이트에 정의되고, 이후 모듈식 액적 처리 영역들(1052-1060)은 바람직하게는 데이텀 핀들(1066)에 의해 위치되는 개스킷 위에 개별 플레이트들을 부착함으로써 구현된다.
이제 도 11을 참조하면, 이는 본 발명의 실시예에 따른 미세액적 처리 기기를 위한 제어 시스템의 측면들을 도시한다. 제어 시스템은 후술되는 바와 같이 다양한 센서들 및 액추에이터들이 제공된 범용 또는 전용 컴퓨터 상에서 구현 될 수 있다.
따라서 도 11a를 참조하면, 이것은 샘플(1104) 및 오일(1106)에 대한 센서에 결합된 제어 컴퓨터 시스템(1102)을 포함하고, 에멀젼 생성을 제어하기 위해 밸브(1108)를 제어하는 액적 생성 제어 시스템들(1100)을 도시한다. 제어부(1102)는 또한 온-보드 프로세싱(on-board processing)을 갖는 카메라인 지능형 카메라(1110)에 체결된다. 그러나, 대안 적으로, 카메라에 도시된 처리는 제어부(1102)에 의해 구현될 수 있고, 그 역도 마찬가지로, 원칙적으로 제어부(1102)의 기능들이 카메라(1100) 상에 구현될 수도 있다는 것이 이해될 것이다. 지능형 카메라는 예를 들어 발광 다이오드(LED) 조명과 같은 조명(1114)을 제어하는 이미지 캡쳐 시스템(1112)을 포함한다. 이미지 캡쳐 모듈(1112)은 또한 이미지를 캡쳐하는 카메라(미도시)도 포함한다. 캡쳐된 이미지는 액적 크기 제어 절차(1116)에 의해 처리되며, 이는 에멀전 형성을 제어하기 위해 샘플 및 오일의 유동 속도를 제어하는 펌프(1120, 1122)를 제어하는 제어 루프(1118)를 구현한다.
도 11b는 온도 제어 시스템(130)을 도시하며 이 예에서 온도 제어 시스템(130)은 동일 제어부(1102)를 사용하고, 이 예에서 동일 제어부(1102)는 PID(비례-적분-미분) 제어부(1132)에 체결된다. 이것은 하나 이상의 제어 루프를 구현할 수 있고, 각각은 온도 센서(1134) 및 예를 들어 펠티에 효과 장치(1136)와 같은 냉각 장치 및/또는 히터(미도시)와 같은 온도 제어 장치를 포함할 수 있다. 선택적으로 다른 센서들/제어부도 구현될 수 있다.
일부 실시예들에서, 전체 시스템 또는 미세유체 칩을 가열 및 냉각시키는 것을 허용하는 가열/냉각 유닛이 제공될 수 있다. 가열 및 냉각은 특정 영역들에서 예를 들어 미세유체 칩의 특정 영역에서만 국부적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 가열 및 냉각은 시스템 또는 미세유체 칩의 배양기에서 제공될 수 있다. 일부 실시예들에서, 시스템 또는 미세유체 칩의 온도는 섭씨 8-10 도로 설정된다. 이후 가열/냉각 유닛은 예를 들어 배양기에서 온도를 섭씨 37도로 증가시키는데 사용될 수 있으며, 이어서 온도는 예를 들어 섭씨 8-10도로 다시 낮추질 수 있는데, 이는 액적들에 저장된 세포들이나 다른 개체들에서의 생물학적 활동을 중지하기 위함이다. 따라서, 본원에 기술된 실시예들은 생물학적 개체들의 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction, PCR)을 허용할 수 있으며, 이는 일반적으로 반복되는 가열 및 냉각 사이클들로 구성된다. 이후, 상기 액적들은 가열/냉각 사이클(들)에 이어서 분류될 수 있다.
도 11c는 지능형 카메라(1142)를 또한 포함하는 액적 분류 제어 시스템(1140)을 도시한다(덤 카메라(dumb camera)가 대안적으로 채용될 수도 있다). 도시된 예에서, 분류 시스템은 액적 플래시 조명 장치(1144), 셀 검출을 위한 광전자 증배관(1146), 셀 검출 확인을 위한 선택적인 추가의 이미징 장치(1148)를 포함하며, 바람직하게는 모두 셀 검출 알고리즘(1150)의 제어 하에 동작한다. 분류 제어 시스템은 또한 전술한 분류 전극들에 제어 신호를 제공하기 위해 신호 생성기(1152) 및 선택적인 증폭기(1154)도 포함한다.
도 11d는 제어부(1102)에 의해 수행되는 처리와 함께, 추가의 지능형 카메라(1162)를 포함하는(반복하지만 덤 카메라일 수 있음) 도시된 예에서 액적 분배 제어 시스템(116)을 도시한다. 도시된 예에서, 카메라(1162)는 액적 조명, 특히 플래시 장치(1164)를 제어하고, 셀 검출 알고리즘(1168)을 이용하여, 예를 들어 셀과 같은 액적 내용물들을 검출하기 위해, 이미징 장치(미도시)로부터의 이미지 캡쳐 절차(1166)를 구현한다. 제어 절차(1170)는 압축 공기 소스(1172), 선택적으로 (도 4a의 밸브(477)와 같은) 밸브(1174), 및 멀티-웰 플레이트(484)를 유지하는 X-Y 스테이지(1176)를 제어한다.
도 12는 액적 처리 기기(1200)의 물리적 구성의 일 예를 도시하며, 앞서 기술된 것들과 유사한 요소들은 유사한 참조 번호로 표시된다. 도 12는 액적 생성, 분류 및 분배 각각을 위한 지능형 카메라들(1202, 1204, 1206)의 위치들을 도시한다. 이들은 LED 제어부(1208)의 제어 하의 개별 (LED) 조명(1114, 1144, 1164)을 갖는다. 시스템은 또한 카트리지(410) 및 상기 카트리지를 위한 배양기의 히터 플레이트(1210), 및 액적 생성 및 배양을 위한 밸브 액추에이터들(1212)도 도시한다. 다중-웰 플레이트(484)는 X-Y 스테이지(1214) 상에 장착된다. 도 12는 액적 생성, 분류, 스페이싱, 및 분배를 위한 오일을 제공하는 샘플 저장소(402) 및 오일 저장소들 및 펌프들(404a-d)을 도시한다. 이 기기는 또한 이들 저장소들을 공급하는 내부 오일 용기(1216) 및 폐유 용기(436)도 포함한다. 이 기기는 사용자 인터페이스(1218)뿐만 아니라 이전에 기술된 제어 시스템을 포함한다.
도 13은 세포 분석을 위한 국면들의 개략도를 도시한다: 당업자에게 공지된 장치 및 방법은 국면들 A, B 및 D에서 실행된다. 항원은 표준 기술들에 따라 국면 A에서 선택되고 생산된다. 이 실시예에서, B-세포의 면역화(immunization) 및 단리(isolation)는 본원에 기재된 실시예들에 따라 분류 및/또는 분석될 세포를 함유하는 유체를 수득하기 위해 국면 B에서 수행될 수 있다. 국면 C에서, 여기에 기술된 장치 및 방법의 실시예들을 사용하여 단일 액적 내에서 단일 세포가 얻어질 수 있다. 단일 피코액적 내 생존 가능한 세포가 제공될 수 있으며, 이를 바탕으로 국면 D에서 추가 실험들이 수행될 수 있고, 이 예에서 전사체 해독(transcriptomics) 및 시퀀싱 실험이 수행될 수 있다.
도 14a 및 도 14b는 액적의 내용물들을 결정하는 방법의 개략도를 도시한다. 이 예에서는 2개의 형광 염료들인 AF647과 AF488이 피코액적에 제공된다. 이 예에서, 하이브리도마 세포(hybridoma cell)가 피코액적에 존재할 때, 단백질 또는 항체와 같은 하이브리도마의 산물은 각각의 AF647 및 AF488 형광염료에 결합될 수 있다(이들 각각은 하이브리도마 산물의 상이한 대응 부분에 결합하는 관련 항체를 가짐). 이에 따라 결합은 AF647과 AF488 형광 염료들 사이에서 형광 공명 에너지 전달(FRET; Fluorescence Resonance Energy Transfer)이 일어나 형광을 변화시킨다. 따라서, 생물학적 개체, 이 예에서는 세포의 산물의 선택적 검출을 허용하는 상호작용이 발생하는 경우 신호, 이 예에서는 광 신호가 생성된다.
도 14b는 이 예에서 피코액적 내의 하나 이상의 하이브리도마 세포의 존재에 기초한 형광 검출을 도시한다. 임계값 이상의 신호가 검출되면, 하이브리도마 세포가 피코액적 내에 있는 것으로 확인된다. 이 예에서 약 0.5V의 배경전압(background)은 분석기에 제공되는 비어있는 피코액적들 때문이다. 따라서, 임계값보다 높은 신호, 이 예에서는 대략 1.1V를 나타내는 액적은 추가의 분류 및/또는 분석, 및/또는 성장을 위해 수집될 수 있다. 이 임계값 이하의 신호를 발생시키는 액적은 필요에 따라 폐기될 수 있다.
공여체(donor) 및 수용체(acceptor) 형광체들(fluors)은 일련의 FRET 분석에 대해, 그리고 액적에서 검출되는 하나 이상의 특정 세포 또는 다른 개체들에 따라 최적화될 수 있음이 이해될 것이다.
도 14a 및 도 14b에 도시된 형광 검출은, 예를 들어, 전술한 바와 같이 액적 분류 장치 및/또는 디커플러에서 사용될 수 있다.
도 15는 하이브리도마에 의한 피코액적들에서의 단일클론 항체 분비(monoclonal antibodies secretion)를 도시한다. 측정들은 FRET-기반 ELISA(enzyme-linked immunosorbent assay)를 사용하여 수행되었다.
그래프는 배양 기간 대 생성된 항체의 농도를 나타낸다. 어두운 막대는 다중 세포를 포함하는 표준 시험관에서 성장한 벌크 배양물을 나타낸다. 빨간색 막대는 단일 세포가 피코액적에 제공되는 샘플을 나타낸다(약 700 파이의 체적). 도 15의 삽입 그래프는 농도 대 형광 강도를 도시한다.
나타난 바와 같이, 생성된 항체의 수는 벌크 배양으로 성장한 배양액과 1시간 이상의 기간 후에 단일 세포로부터 성장한 배양액 사이에서 유사하다 - 피코액적 내 단일 세포의 t=0에서의 농도는 무시할 수 있음이 이해될 것이다. 전술한 바와 같이, 그럼에도 불구하고 단일 세포로부터 세포 배양을 성장시키는 것이 바람직할 수 있는데, 이는 세포 집단 전체에 걸쳐 높은 단일클론성을 보장하기 때문이다. 이것은 본원에 기술된 실시예들에 따라 마련된 피코액적 내 세포로부터 성장한 세포들의 농도가 표준 시험관에서 다수의 세포들로부터 성장한 것만큼 높거나 심지어 그보다 더 높을 수 있음을 보여 주며, 이에 따라 단일 개체로부터 성장된 집단에 대해 더욱 높은 단일클론성 보장이 달성된다.
도 16a 내지 도 16c는 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary)(CHO-S) 세포들의 집단의 광학 이미지들을 도시한다. 이 예에서, 피코액적들은 약 84㎛의 평균 직경 및 약 300pi의 평균 체적을 갖는다. 도 16a에서, 셀들은 밝은 영역(bright field) 아래에서 보일 수 있다. 세포가 생존 가능한지 여부를 결정하기 위해, 형광 염료, 이 예에서는 DRAQ-7이 제공될 수 있다(도 16b). 병합된 이미지는 도 16c에 나타난다; 생존 가능한 세포들은 도 16c에서 녹색 형광을 나타낸다.
배양 시간 대 생존 가능한(즉, 살아있는) CHO-S 세포의 백분율이 다양한 기술에 대하여 도 16d에 나타난다. 파란색 막대는 제어 배양들을 나타낸다. 녹색 막대는 본원에 기재된 실시예들에 따라 피코액적 제조 기술을 통해 얻어된 세포 배양들을 나타낸다. 자주색 막대는 FACS로 분류된 액적에서 성장한 집단들에 대한 분석을 보여주며, 분홍색 막대는 FACS를 사용하여 분류되고 분배된 집단들을 나타낸다.
나타난 바와 같이, 본원에 기재된 실시예들을 사용하여 제조된 샘플들로부터 성장된 생존 가능한 세포들의 백분율은 FACS 기술을 통해 얻어진 것보다 상당히 높다. 이 결과는 피코액적(picodroplet) 내 세포(또는 세포들)의 캡슐화가 세포 생존가능성에 측정가능한 영향을 미치지 않음을 보여주며, 상기 설명된 실시예들에 따라 액적 준비, 분류 및 분배의 장점들이 입증된다.
도 17은 상이한 피코액적 크기들, 이 dPdptj 300 pl, 500pl 및 700 pl에 대한 배양 시간 대 생존 가능한 CHO-S 세포의 백분율을 나타낸다. 이 분석을 통해 생성 속도를 높이기 위해 피코액적의 크기를 줄일 수 있는지 여부가 결정될 수 있다.
조사한 모든 피코액적 크기들에 대해 일반적으로 생존 세포들의 비율이 비슷하다는 것을 알 수 있다. 그러나, 특정 배양 시간 이후, 예를 들어 9시간 이후, 700 pl의 부피를 갖는 피코액적은 생존 가능한 세포의 가장 높은 백분율을 나타냈다. 이것은 액적의 더 큰 부피가 장시간 동안 세포에 영양분을 제공하여 세포가 더 오랜 기간 동안 생존할 것이기 때문에 기대될 수 있다.
도 18a는 여기에 기술된 실시예들에 따른 미세유체 칩(180)의 이미지를 도시한다.
미세유체 칩(180)은 명세서 전반에 걸쳐 기술된 바와 같이 시스템의 다양한 모듈들을 단일 칩 설계로 통합한다. 이 예에서, 미세유체 칩(180)은 액적 생성 영역(412), 액적 배양기/저장 영역(414), 액적 분류 영역(416) 및 액적 분배 영역(420)을 포함한다. 이 예에서, 미세유체 칩(180)은 저장 챔버들(456) 및 밸브들(182)을 포함하고, 이들은 필요에 따라 액적들이 제어가능한 시구간 동안(예를 들어, 수초 내지 수분) 챔버(456) 내에 유지될 수 있기 때문에 미세유체 칩(180)에 걸쳐 액적들의 이송을 지연시키는 것을 허용한다.
미세유체 칩(180)의 보유 챔버들(456)은 액적 분배 영역(420)과 기술적으로 가능한 한 근접한 것이 바람직하다. 이는 액적 이송 및 분배의 더 나은 제어를 허용하며, 이는 수성 액적들이 오일과 비교하여 상이한 유동 속도를 가질 수 있기 때문에 특히 어려울 수 있다. 보유 챔버(456)가 액적 분배 영역(420)(또는 액적 분배 유닛)에 가까울수록, 보유 챔버(456)와 액적 분배 영역(420) 사이에서 이송되는 액적의 시간이 감소될 수 있기 때문에, 액적 분배가 더 많이 제어 가능해진다. 이것은 수직으로 작동되는 칩 설계에서 특히 중요할 수 있으며, 이로써 액적이 칩의 상부로 부유하게 된다.
미세유체 칩(180)의 실시예에서, 미세유체 칩(180)의 상이한 부분들 및 영역들의 상이한 워크플로우들을 격리할 수 있는 제어 시퀀스가 사용된다. 예를 들어, 액적은 그것이 액적 분배 영역(420)에 도달하기 전에 액적 생성 영역(412)으로부터 직접 액적 분류 영역(416)으로 제공될 수 있다. 이 예에서, 액적 생성 영역(412)과 액적 분류 영역(416) 사이의 액적 배양/저장 영역(414)은 생략되어 있다. 미세유체 칩(180)의 상이한 (하나 이상의) 부품들/영역들이 생략될 수 있음이 이해될 것이다.
도 18b는 도 18a에 도시된 미세유체 칩을 작동시키기 위한 제어 시스템(1800)의 개략적인 블록도를 도시한다. 제어 시스템(1800)은 전술한 미세유체 시스템, 액적 분류 또는 분배 장치, 액적 디스펜서, 미세유체 장치, 미세유체 카트리지, 미세유체 처리 시스템 및 생물체들의 미세액적-기반 처리를 위한 기기를 작동시키는데 동등하게 사용될 수 있다. 따라서, 제어 시스템(1800)은 액적 생성 장치/유닛, 액적 저장/배양 장치/유닛, 액적 분류 장치/유닛 및 액적 분배 유닛/액적 디스펜서 중 하나 이상이 단일 칩 설계에 통합되지 않는 시스템에서 사용될 수 있다.
개략적으로 말하면, 제어 시스템(1800)은 적절하게 프로그램된 범용 프로세서(1802)를 포함한다. 제어 시스템(1800)은 모두 공통 데이터 및 제어부(1810)에 의해 링크된 작업 메모리(1804), 영구 프로그램 메모리(1806) 및 데이터 저장소(1808)를 포함한다. 이 예에서, 시스템을 구성하기 위해 사용자 인터페이스(1812)도 제공된다. 제어 시스템(1800)은 디스플레이, 메모리, 프린터, 데이터 저장 장치 및 네트워크(1816) 중 하나 이상에 연결된 출력부(1814)도 포함하여, 예를 들어 액적의 하나 이상의 특성(액적(들) 내의 하나 이상의 개체들의 하나 이상의 특성)을 예를 들어 마이크로타이트 플레이트 내에서의 그것의 위치와 함께 상호관련시키는 데이터가 디스플레이, 저장, 인쇄 또는 배포된다. 당업자는 부가적으로 또는 대안적으로 다른 형태의 저장/출력이 사용될 수 있음을 이해할 것이다.
이 예에서, 작업 메모리(1804)는 액적 개체 데이터, 액적 크기 데이터, 액적 형광 데이터, 액적 속도 데이터, 및 액적(들) 및/또는 그것의 개체/개체들에 관한 다른 물리적 및/또는 화학적 데이터/특성들을 보유(일시적일 수 있음)하고, 처리하고, 조작하는데 사용된다.
영구 프로그램 메모리(1806)는, 이 예에서, (선택적) 사용자 인터페이스 코드, 운영 체제 코드, 출력에 대한 인터페이스를 제어하기 위한 데이터 통신 제어 코드, 예를 들어 액적 처리 시스템/미세유체 칩으로의 저장소로부터의 액적들의 제공을 제어하기 위한 액적 제공 코드, 예를 들어 생물체들을 포함하는 예를들어 용액으로부터의 액적 제조를 제어하기 위한 액적 제조 코드, 상기 액적 프로세싱 시스템/미세유체 칩 내의 유중수 에멀젼 내의 액적(들)의 유속을 제어하기 위한 액적 흐름 속도 코드, 액적 처리 시스템/미세유체 칩의 하나 이상의 부분에에서의 액적들의 흐름 경로를 제어하기 위한 액적 흐름 경로 코드(예를 들어, 배양과 같은 하나의 영역 또는 처리 단계는 생략될 수 있고, 액적은 하나의 영역/처리 유닛으로부터 다른 것으로 직접 제공될 수 있다), 액적들의 융합을 제어하기 위한 액적 융합 코드, 액적 내의 하나 이상의 개체들의 결정/식별을 제어하기 위한 액적 개체 결정 코드, 형광 액적들의 검출 및 그 처리를 제어하기 위한 액적 형광 검출 코드, 액적 처리 시스템/미세유체 칩 내의 액적의 속도의 결정을 제어하기 위한 액적 속도 결정 코드, 액적 분류 유닛/영역에서 액적들의 분류를 제어하기 위한 액적 분류 코드, 액적의 디커플링을 제1 유체 흐름 경로로부터의 제2 유체 흐름 경로로 제어하기 위한 액적 디커플링 코드, 예를 들어 액적 및/또는 그것의 개체들의 하나 이상의 특성들에 대한 이전 얻어진 데이터에 기초하여 액적을 선택하는 것을 제어하기 위한 액적 선택 코드, 예를 들어 하나 이상의 흐름 경로의 하나 이상의 영역에서 액적 처리 시스템/미세유체 칩 내 압력을 조절함으로써 액적의 배출/분배를 제어하기 위한 액적 배출/분배 코드, 액적들의 배양을 제어하기 위한 액적 배양 코드, 하나 이상의 액적에 대해 수행된 안정성 테스트를 제어하기 위한 액적 안정성 테스트 코드, 및 보유 챔버들에서 액적의 보유를 제어하기 위한 액적 보유 코드를 저장할 수 있다.
이들 코드들은 제어 시스템(1800)에 대응하는 기능을 제공하기 위해 프로세서(1802)에 의해 로드되고 구현된다.
이들 코드들의 일부 또는 전부는 예를 들어 CD-ROM과 같은 착탈식 저장 매체(1818)에 의해 예시적으로 도시된 캐리어 매체 상에 제공될 수 있다.
데이터 저장부(1808)는, 이 예에서, 액적 내에 저장된 하나 이상의 개체에 관한 정보(및 액적이 임의의 개체들, 예를 들어 생물체들을 포함하거나 포함하지 않는지 여부)를 제공하는 액적 개체 데이터, 액적(들)의 크기에 관한 정보를 제공하는 액적 크기 데이터, 액적(들)의 형광 특성에 관한 정보를 제공하는 액적 형광 데이터, 및 주어진 시간에 액적 처리 시스템/미세유체 칩 내 특정 위치 및/또는 영역에서 액적(들)의 속도에 관한 정보를 제공하는 액적 속도 데이터룰 저장한다. 당업자는 액적(들) 및/또는 그 개체 또는 개체들의 다른 물리적 및/또는 화학적 특성들이 데이터 저장소(1808)에 저장될 수 있다는 것을 이해할 것이다.
본 발명은 또한, 예를 들어 범용 컴퓨터 시스템 또는 디지털 신호 프로세서(DSP) 상에서 전술한 시스템 및 방법을 구현하기 위한 프로세서 제어 코드를 더 제공한다. 이 코드는 디스크, CD 또는 DVD-ROM, 비 휘발성 메모리(예를 들어 플래시)와 같은 프로그램되는 메모리 또는 읽기 전용 메모리(펌웨어)와 같은 비-일시적인 물리적 데이터 운반체에 제공된다. 본 발명의 실시예들을 구현하기 위한 코드(및/또는 데이터)는 C와 같은 종래의 프로그래밍 언어(인터프리트 방식 또는 컴파일 방식)의 소스, 객체 또는 실행가능 코드, 어셈블리 코드, 또는 하드웨어 기술 언어를 위한 코드를 포함할 수 있다. 당업자가 알 수 있는 바와 같이, 그러한 코드 및/또는 데이터는 서로 통신하는 복수의 결합된 구성요소들 사이에 분배될 수 있다.
이제 칩의 실시예들과 함께 사용하기 위한 일부 예시 제어 시퀀스들을 설명한다. 미세유체 칩(카트리지)의 제어는 장비의 소프트웨어 제어를 통해 달성될 수 있다. 실시예들에서, 하드웨어 제어 명령들 또는 스크립트들의 시퀀스들이 하드웨어/소프트웨어 제어 인터프리터에 보내지고 이 정보는 하드웨어 구성요소들에 특정된 명령들로 변환된다.
칩 상에 샘플(예를 들어, 세포들 또는 다른 생물학적 또는 분석-관련된 물질들의 샘플)을 로딩한 후에, 칩은 기기 상으로 로딩된다. 다양한 동작 모드들이 가능합니다; 이들 모드들은 적절한 명령 제어 시퀀스들(제어 스크립트들)의 선택에 의해 구현된다. 기기의 동작 모드의 2가지 예들이 이하에 요약된다: (1) 단일클론성 보증 모드; 및 (2) 직접 분석 모드.
단클론성 보증 모드 시퀀스에 대한 칩 제어 시퀀스의 예는 다음과 같다:
전형적인 초기화 단계들은 샘플 로딩과 칩 프라이밍(chip priming)이다(여기서 칩의 채널들과 캐비티들이 기포가 없도록 오일로 채워진다). 단계들는 다음과 같이 계속된다:
1. 피코액적 생성 및 샘플 캡슐화
2. 단일클론성의 광학적 검출(예를 들어 이미징 및/또는 산란을 기초로)
3. 피코액적 분류(광 신호들을 기초로)
4. 피코액적 수집
5. 피코액적 분배(바람직하게는 전술한 바와 같은 광학적 검출/단일클론성의 확인을 포함함).
액적이 에멀전의 슬러그에 분배된 후, 슬러그는 전형적으로 이미 물을 함유하고 있는 (마이크로타이트 플레이트) 웰로 인입된다. 거기에서 물리적인 작용을 통해 및/또는 다른 수단에 의해, 예를 들어 전기장을 통해, 세포가 액적으로부터 물로 방출(released)되어 웰에 수집되고 오일은 물과 분리된다. 시스템 동작이 완료되면 바람직하게는 시스템/칩이 세정된다.
직접 평가 모드(Direct Assay Mode)의 칩 제어 시퀀스의 예는 단일클론성 보증 모드(Monoclonality Assurance Mode)에서 전술한 것과 동일한 초기화 및 페이로드 수집 단계들을 가질 수 있다. 또한 직접 평가 모드(Direct Assay Mode)는 다음 단계들을 포함할 수 있다:
1. 피코액적 생성 및 샘플 캡슐화
2. 배양(예를 들어 섭씨 37도)
3. 단일클론성의 광학적 검출(예를 들어 이미징 및/또는 산란을 기초로)
4. 분석을 위한 광학적 검출(예를 들어 형광 및/또는 발광)
5. 피코액적 분류(광 신호들을 기초로)
6. 피코액적 수집(양성인 분석(assay positive))
7. 피코액적 분배(바람직하게는 전술한 바와 같은 광학적 검출/단일클론성의 확인을 포함함).
도 19a 내지 도 19c는 본원에 기술된 실시예들을 사용한 피코액적에서의 단일 세포의 검출을 나타낸다. 이 예에서, 생성된 항체의 양이 결정된다.
도 19a-c의 그래프의 x-축은 녹색 형광 강도를 임의의 단위로 나타내고, y-축은 적색/녹색 형광 비율 강도를 임의 단위로 나타낸다. 액적들은 녹색 빛에 노출된다. 이 예에서, 더 많은 항체들이 차이니즈 햄스터 난소(Chinese hamster ovary) 세포들로부터 생산될수록, FRET 강도가 높아져 그 결과 녹색에서 적색으로의 이동이 형광 신호에 더 많이 존재하게 된다. 당업자는 점점 더 많은 항체의 결과로 녹색-적색 변화의 관찰에 익숙할 것이다. 본원에 기술된 방법 및 시스템은 2시간 후, 본원에 기재된 실시예들을 이용하여 차이니즈 햄스터 난소 세포들로부터 상당량의 항체가 생산 될 수 있음을 보여 주며 - "A"로 표시된 클러스터는 항체 집단을 나타낸다. 클러스터 "B"는 세포가 없거나 항체가 포함되지 않은 피코액적 집단을 나타낸다.
방법은 예를 들어 특정 범위 내에 있는 적색 및 녹색 형광 강도를 나타내는 액적들만을 분류하도록 구현될 수 있다. 이는 도 20a 내지 도 20c에서 나타나는데, 피코액적들로부터 적색과 녹색 형광의 시간에 따른 산란도(scatter plot)를 나타낸다. 적색 사각형들은 피코액적 분류를 위한 게이팅 설정을 정의하고, 특정 범위 내에서 적색 형광을 표시하고 특정 범위 내에서 녹색 형광을 표시하는 피코액적들만이 분류될 수 있다. 피코액적 분류를 위한 게이팅 세트를 한정하는 적색 사각형의 모양, 크기, 및 위치는 액적(및 그 개체들)이 가져야 하는 특정 특성들(예를 들어, 형광 특성들)에 따라 선택될 수 있음이 이해될 것이다.
바람직한 실시예들에서 생물체를 함유하는 유중수 에멀젼의 액적들을 처리하는 것에 적용되는 기술들이 설명되었다. 그러나 원칙적으로, 유기물 또는 무기물과 같은 비-생물학적 개체들도 유사한 방식으로 처리될 수 있다. 마찬가지로 설명된 기술들은 원칙적으로 수중유 에멀젼에서의 오일의 액적들을 처리하는 것에도 적용될 수 있다.
많은 다른 효과적인 대안들이 당업자에게 이루어질 수 있음이 자명하다. 본 발명은, 설명된 실시예들에 한정되지 않고, 본 명세서에 첨부된 청구항들의 사상 및 범위 내에 있는 당업자에게 자명한 변경들을 포함하는 것으로 이해될 것이다.

Claims (68)

  1. 하나 이상의 개체들을 포함하는 액적을 제공하는 방법으로서,
    유체 내 복수의 개체들을 제공하는 것;
    상기 유체로부터 액적을 마련하는 것;
    상기 액적이 상기 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함하는지 아니면 상기 액적이 상기 개체를 포함하지 않는지 여부를 결정하는 것;
    상기 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하는 것; 및
    상기 분류된 액적을 저장소로 분배하는 것을 포함하고,
    상기 분배하는 것은, 상기 분류하는 것 이후:
    상기 분류된 액적을 포함하는 유체에 대한 유체 흐름 경로를 선택하는 것; 및
    상기 선택된 경로로부터 상기 분류된 액적을 배출하는 것을 포함하는, 방법.
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 분배하는 것은,
    분배를 위해 상기 분류된 액적을 확인하는 것;
    상기 유체의 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 분류된 액적을 추출하는 것으로서, 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 전달함으로써 수행되는, 추출하는 것; 및
    상기 제2 유체 흐름 경로에 압력을 인가함으로써 상기 분류된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로부터 상기 저장소로 배출하는 것을 포함하는, 방법.
  3. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 전달하는 것은 상기 분류된 액적이 상기 제1 유체 흐름 경로의 부분에 있는 동안 분배를 위해 상기 분류된 액적에 압력을 인가하는 것을 포함하고,
    이후 상기 분류된 액적이 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달되고 상기 분류된 액적이 배출되는 것을 포함하는, 방법.
  4. 청구항 1 또는 청구항 2에 있어서,
    상기 분배하는 것은,
    상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달하는 것; 및
    이후 상기 제2 유체 흐름 경로에 압력을 인가하여 상기 액적을 배출하는 것을 포함하는, 방법.
  5. 청구항 1 내지 청구항 4 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 추출하는 것은,
    상기 분류된 액적이 정의된 수의 상기 개체들을 포함하는 경우 및/또는 상기 분류된 액적이 정의된 특성을 갖는 개체를 포함하는 경우에만, 상기 분류된 액적을 추출하는 것을 포함하고,
    특히, 상기 마련하는 것, 상기 결정하는 것, 상기 분류하는 것, 및 상기 배분하는 것에 기초하여, 상기 배출된 액적이 단일 타겟 개체 또는 상기 개체들의 단일 목표 조합을 포함하는 확률이 99.9%보다 크고, 특히 99.997%보다 큰, 방법.
  6. 청구항 1 내지 청구항 5 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배출하는 것은
    상기 결정 및/또는 상기 개체의 특성에 응답하여 정의된 위치에서 상기 분류된 액적을 배출하는 것을 포함하는 방법.
  7. 청구항 1 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 개체의 성장 및/또는 유지를 위해 상기 액적을 배양하는 것을 더 포함하고,
    특히 상기 배양 동안 상기 하나 이상의 개체에 대한 안정성 테스트를 수행하는 것을 더 포함하는, 방법.
  8. 청구항 1 내지 청구항 7 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 전달하는 것은,
    디커플러(decoupler)에서 상기 분류된 액적을 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 분리(decoupling)하는 것을 포함하고,
    상기 디커플러는 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 분류된 액적을 격리시키고 상기 격리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하도록 구성되는, 방법.
  9. 청구항 1 내지 청구항 8 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배출하는 것은 상기 분류된 액적이 이송되는 유체를 가열하는 것을 포함하는, 방법.
  10. 청구항 1 내지 청구항 9 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분류된 액적이 성장 배지의 유체에서 배출되도록 성장 배지를 상기 제2 유체 흐름 경로로 주입하는 것을 더 포함하는 방법.
  11. 청구항 1 내지 청구항 10 중 어느 한 항에 있어서,
    제2 복수의 개체들을 복수의 제2 유체에 제공하는 것;
    상기 제2 유체로부터 제2 액적을 마련하는 것; 및
    상기 제1 유체로부터 마련된 상기 제1 액적과 상기 제2 유체로부터 마련된 상기 제2 액적을 융합하여 융합된 액적을 획득하는 것을 더 포함하고,
    상기 추출하는 것은 상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 제2 유체 흐름 경로로 상기 융합된 액적을 이송함으로써 상기 융합된 액적을 추출하는 것을 포함하는, 방법.
  12. 청구항 11에 있어서,
    상기 결정하는 것 및/또는 분류하는 것은 상기 융합 이전에 수행되는, 방법.
  13. 청구항 11 또는 청구항 12에 있어서,
    상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함하는지 여부, 또는 상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 개체들 중 상기 개체를 포함하지 않는지 여부를 결정하는 것; 및
    상기 결정의 결과에 따라 상기 제2 액적을 분류하는 것을 더 포함하는, 방법.
  14. 청구항 13에 있어서,
    상기 융합은, 각각 상기 제1 및 제2 복수의 개체들의 단일 타겟 개체를 포함하도록 결정된 상기 제1 액적 및 상기 제2 액적 및/또는 각각 상기 제1 및 제2 복수의 개체들의 단일 타겟 조합을 포함하도록 결정된 상기 제1 액적 및 상기 제2 액적에 대해서만 수행되는, 방법.
  15. 청구항 11 내지 청구항 14 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합된 액적은 2개의 세포들의 단일 쌍, 세포 및 시약(reagent)의 단일 쌍, 하나 이상의 세포의 단일 조합, 또는 하나 이상의 세포와 하나 이상의 시약의 단일 조합을 포함하고,
    특히 상기 시약은 생체분자(biomolecule)인, 방법.
  16. 청구항 1 내지 청구항 15 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분류하는 것은
    다른 시점들(points in time)에 상기 유체 흐름 경로의 복수의 위치들에서 상기 액적을 검출하여 상기 분류하는 것의 시간조절(timing)을 위해 상기 유체 흐름 경로 내 상기 액적의 속도를 결정하는 것을 포함하는, 방법.
  17. 2개의 생물체들의 단일 쌍을 포함하는 액적의 제조 방법으로서,
    제1 유체 내에 복수의 제1 생물체들을 제공하는 것 및 제2 유체 내에 복수의 제2 생물체들을 제공하는 것;
    상기 제1 유체로부터 제1 액적을 마련하는 것 및 상기 제2 유체로부터 제2 액적을 마련하는 것;
    상기 제1 액적이 상기 제1 복수의 생물체들의 단일 개체를 포함하는지 여부 및 상기 제2 액적이 상기 제2 복수의 생물체들의 단일 개체를 포함하는지 여부를 결정하는 것; 및
    각각 단일 개체를 포함하는 것으로 결정된 상기 제1 액적 및 상기 제2 액적을 융합하는 것을 포함하는, 방법.
  18. 청구항 17에 있어서,
    상기 융합은, 전기-유착(electro-coalescence)에 의한 정전기 인력으로 상기 액적들을 융합하기 위해 상기 제1 및 제2 액적들 중 하나 또는 모두를 전기 충전함으로써, 물리적 응축 또는 물리적 충돌에 의해, 수행되는, 방법.
  19. 액적에 포함된 생물체의 대사(metabolizing) 및/또는 분석 방법으로서,
    상기 생물체는 단일 세포, 2개의 세포들의 단일 쌍, 세포 및 시약의 단일 쌍을 포함하고,
    상기 방법은 청구항 1 내지 청구항 18 중 어느 한 항에 따른 방법을 사용하여 상기 액적에 포함된 상기 생물체를 제공하는 것을 포함하는, 방법.
  20. 하나 이상의 개체를 포함하는 액적을 제공하기 위한 미세유체 시스템으로서,
    복수의 개체들을 포함하는 유체로부터 액적을 마련하는 액적 생성 장치;
    상기 액적이 상기 복수의 개체들 중 하나 이상의 개체를 포함 하는지 여부를 결정하는 분석기;
    상기 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하는 액적 분류 장치; 및
    상기 분류된 액적을 상기 미세 유체 시스템 내 상기 유체의 유체 흐름 경로로부터 분리시키기 위한 디커플러(decoupler)를 포함하는, 시스템.
  21. 청구항 20에 있어서,
    상기 디커플러는, 상기 분류된 액적을 상기 유체 흐름 경로로부터 격리시키기 위한 격리 유닛 및 상기 격리된 액적을 상기 미세유체 시스템의 제2 유체 흐름 경로로 안내하기 위한 가이드를 포함하는, 시스템.
  22. 청구항 21에 있어서,
    상기 가이드는 회전 유닛을 포함하고, 상기 회전 유닛은 상기 격리된 액적을 저장하기 위한 액적 저장 유닛을 포함하며,
    상기 회전 유닛은 상기 액적 저장 유닛에 저장된 상기 격리된 액적이 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송되게끔 회전하도록 구성되는, 시스템.
  23. 청구항 21에 있어서,
    상기 가이드는 병진 유닛(translational unit)을 포함하고, 상기 병진 유닛은 상기 격리된 액적을 저장하는 액적 저장 유닛을 포함하며,
    상기 병진 유닛은 상기 액적 저장 유닛에 저장된 상기 격리된 액적이 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송되게끔 병진 방향으로 이동하도록 구성되는, 시스템.
  24. 청구항 20 내지 청구항 23 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 하나 이상의 개체를 성장 및/또는 유지하기 위해 상기 액적을 배양시키기는 배양기를 더 포함하는, 시스템.
  25. 청구항 24에 있어서,
    상기 배양기는 상기 배양 동안 상기 하나 이상의 개체에 대한 안정성 테스트를 수행하기 위한 안정성 테스트 유닛을 포함하는, 시스템.
  26. 청구항 20 내지 청구항 25 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분리된 액적을 분배하기 위한 분배 유닛을 더 포함하는, 시스템.
  27. 청구항 26에 있어서,
    상기 분배 유닛은 성장 매체 유체를 저장하기 위한 저장소를 포함하고, 상기 분배 유닛은 상기 성장 매체 유체 내의 상기 분리된 액적을 분배하도록 구성되는, 시스템.
  28. 청구항 26 또는 청구항 27에 있어서,
    상기 분배 유닛은 가압된 유체 방출을 통해 상기 액적을 분배하기 위한 고압 유닛을 포함하는, 시스템.
  29. 청구항 20 내지 청구항 28 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적 생성 장치는 복수의 액적 생성 장치들을 포함하고,
    상기 미세유체 시스템은 상기 복수의 액적 생성 장치들을 사용하여 준비된 복수의 액적들을 융합시키기 위한 액적 융합 장치를 더 포함하는, 시스템.
  30. 청구항 29에 있어서,
    상기 액적 융합 장치는 전자-유착(electro-coalescence)에 의해 상기 액적들을 융합시키기 위한 전기장을 생성하기는 전기장 생성부를 포함하는, 시스템.
  31. 청구항 29에 있어서,
    상기 액적 융합 장치는 정전기 인력에 의해 상기 액적들을 융합하기 위해 액적들을 전기 충전하는 하나 이상의 충전 장치를 포함하는, 시스템.
  32. 청구항 20 내지 청구항 31 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석기는 형광 검출기, 산란 광 검출기, 이미징 검출기, 음파 발생 및 검출 유닛, 및 자기-활성화 셀 분류 장치 중 하나 이상을 포함하는, 시스템.
  33. 청구항 20 내지 청구항 32 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 분석기 및/또는 액적 분류 장치는 상기 미세유체 시스템에서 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 다른 시점들에서 상기 미세유체 시스템의 상이한 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 포함하고,
    상기 액적 분류 장치는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하도록 구성되는, 시스템.
  34. 기판 지지(substrate bearing)을 갖는 액적 분류 또는 분배 장치로서,
    하나 이상의 미세유체 입력 채널들의 세트;
    미세유체 출력 채널들의 세트; 및
    상기 입력 채널들과 상기 출력 채널들 사이의 이동가능 분류 요소를 포함하고,
    상기 분류 요소는 상기 입력 채널들을 상기 출력 채널들에 연결하기 위한 미세유체 채널들의 세트를 포함하고,
    상기 분류 요소는 제1 위치와 제2 위치 사이에서 이동가능하며,
    상기 제1 위치에서, 적어도 제1 입력 채널이 연결되어 상기 제1 입력 채널로부터 제1 출력 채널로의 유체 흐름이 허용되고,
    상기 제2 위치에서, 상기 채널 내 하나 이상의 액적을 지지(bearing)하는 유체 길이가 이동하여 상기 유체의 길이가 상기 제2 출력 채널로 유동하는, 장치.
  35. 청구항 34에 있어서,
    상기 분류 요소는 제1 및 제2 입력 채널들로부터 유체의 길이를 교체하기 위해 제1 및 제2 위치들 사이에서 회전 가능하고, 그에 따라 제1 및 제2 입력 채널들은, 대응하는 제1 및 제2 출력 채널들로 흐르거나 또는 대응하는 제2 및 제1 출력 채널들로 흐르도록 교체되는, 장치.
  36. 액적들을 분류 또는 분배하는 방법으로서,
    제1 및 제2 미세유체 흐름들을 제공하는 것으로서, 상기 흐름들 중 적어도 하나는 액적들을 포함하는, 제공하는 것; 및
    상기 흐름들의 일부를 포함하는 턴테이블을 회전시켜 액적들을 제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들 중 하나에 선택적으로 지시하는 것을 포함하는, 방법.
  37. 미세유체 흐름들 내의 액적들을 분류 또는 분배하기 위한 장치로서,
    제1 및 제2 입력 미세유체 흐름들로서, 상기 흐름들 중 적어도 하나는 액적들을 포함하는, 제1 및 제2 입력 미세유체 흐름들;
    제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들;
    상기 입력 및 상기 출력 흐름들 사이의 유동들의 일부를 포함하는 회전 턴테이블; 및
    상기 액적들을 상기 제1 및 제2 출력 미세유체 흐름들로 선택적으로 지시하기 위해 상기 턴테이블의 회전을 제어하는 제어부를 포함하는, 장치.
  38. 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 피코액적을 전달하기 위한 세포, 생체분자 및 개체 분류 또는 분배 장치에 있어서,
    상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 피코액적을 분리시키기 위한 디커플러; 및
    상기 분리된 미세액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하는 가이드를 포함하고,
    상기 가이드는,
    상기 분리된 피코액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 회전하도록 구성된 회전 유닛; 및/또는
    상기 분리된 피코액적를 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 병진 방향으로 이동하도록 구성된 병진 유닛을 포함하는, 장치.
  39. 청구항 38에 있어서,
    하나 이상의 마이크로타이터 플레이트 및/또는 하나 이상의 유리 슬라이드 및/또는 하나 이상의 어레이 및/또는 상기 피코액적들 중 하나 이상이 하나 이상의 어드레스 가능한 위치에서 분배될 수 있는 다른 포맷들을 포함하는 x-y 이동 플랫폼을 더 포함하는, 장치.
  40. 액적 디스펜서로서,
    청구항 34 또는 청구항 35의 액적 분류/분배 장치 또는 청구항 38 또는 청구항 39의 액적/분류 장치; 및
    액적 분류/분배 장치에 의해 선택된 액적을 미세유체 채널로부터 저장소로 분배하는 미세유체 채널 오리피스를 포함하는, 액적 디스펜서.
  41. 청구항 34 또는 청구항 35의 액적 분류/분배 장치, 또는 청구항 38 또는 청구항 39의 액적/분류 장치, 또는 청구항 40의 피코액적 디스펜서를 포함하는 미세유체 장치.
  42. 분류된 미세유체 액적의 자동화된 분류 및 분배를 위한 미세유체 카트리지로서,
    분류 영역에 체결된 분류 입력 채널로서, 상기 분류 영역은 상기 입력 채널에 체결된 2이상의 분류 출력 채널들 및 상기 분류 입력 채널로부터의 액적을 상기 분류 출력 채널들 중 선택된 하나에 선택적으로 지시(direct)하는 액적 지시기(droplet director)를 포함하는, 분류 입력 채널;
    상기 분류 출력 채널둘 중 하나에 체결되어 저장소에서 수집을 위해 상기 카트리지로부터 선택된 상기 액적들을 분배하는 액적 디스펜서를 포함하고,
    상기 액적 디스펜서는, 상기 저장소에서의 수집을 위해 에멀전 흐름으로부터 액적들을 상기 디스펜서 출력 채널로 배출하는 액적 배출 메커니즘을 포함하는, 미세유체 카트리지.
  43. 청구항 42에 있어서,
    상기 분류 영역과 상기 분배 영역 사이의 에멀전 흐름 버퍼 영역으로서, 상기 액적 디스펜서로의 에멀전 흐름 속도를 제어하는 에멀전 흐름 버퍼 영역을 더 포함하는, 미세유체 카트리지.
  44. 청구항 42 또는 청구항 43에 있어서,
    액적 입력부를 갖는 액적 배양 영역;
    배양을 위해 액적들을 보유하는 액적 보유 영역; 및
    상기 분류 입력 채널에 체결된 출력부를 더 포함하는, 미세유체 카트리지.
  45. 청구항 42 내지 청구항 44 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 디스펜서 출력 채널은 상기 에멀전으로부터의 액적의 또는 액적의 내용물의 유리(liberation)를 촉진시키는 메커니즘을 포함하는, 미세유체 카트리지.
  46. 청구항 42 내지 청구항 45 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적 디스펜서는 액적 당 정의된 수 또는 수치 범위의 생물체들을 갖는 액적들을 선택하도록 구성되는, 미세유체 카트리지.
  47. 청구항 42 내지 청구항 46 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세유체 카트리지 내의 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 상이한 시점에서 상기 미세유체 카트리지의 다른 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 더 포함하고,
    상기 액적 지시기는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 지시하도록 구성되는, 미세유체 카트리지.
  48. 청구항 42 내지 청구항 47 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적 배출 메커니즘은 액적들을 상기 디스펜서 출력 채널로 지시하도록 상기 에멀젼 흐름 내의 압력을 증가시키는 메커니즘을 포함하는, 미세유체 카트리지.
  49. 청구항 48에 있어서,
    상기 액적 배출 메커니즘은 배출을 위해 상기 에멀젼 흐름 내의 액적을 선택하도록 상기 압력을 선택적으로 조절하도록 구성되는, 미세유체 카트리지.
  50. 미세액적 처리 시스템으로서,
    청구항 49에 따른 미세유체 카트리지를 포함하고,
    상기 선택된 액적의 속도 및 위치 중 하나 또는 모두를 감지하는 센서, 및 상기 속도/위치에 응답하여 상기 압력을 조절하는 제어부를 더 포함하는, 미세액적 처리 시스템.
  51. 미세액적 처리 시스템으로서,
    청구항 42 내지 청구항 49 중 어느 한 항에 따른 미세유체 카트리지를 포함하고,
    상기 미세액적 처리 시스템은 복수의 상기 저장소들 및 분배된 액적을 선택적으로 저장소에 지시하는 제어 시스템을 더 포함하는, 미세액적 처리 시스템.
  52. 청구항 51에 있어서,
    특히 상기 분류 영역과 관련하여, 상기 출력 채널로 분류하거나 또는 분류되도록 액적의 하나 이상의 특성을 감지하는 액적 감지 시스템을 더 포함하고,
    상기 제어 시스템은 개별 액적에 대한 액적 데이터가 식별된 저장소 내의 개별 액적에 대한 데이터를 검색하기 위해 검색될 수 있도록 상기 하나 이상의 감지된 특성에 관한 액적 데이터를 저장하도록 구성되는, 미세액적 처리 시스템.
  53. 액적 내에 하나 이상의 타겟 개체를 제공하기 위한 미세유체 시스템에 있어서, 상기 미세유체 시스템은,
    상기 액적이 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들 및 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들의 특성을 포함하는지 여부 중 하나 또는 모두를 검출하는 제1 검출기를 포함하고,
    상기 미세유체 시스템은:
    상기 검출의 결과에 따라 상기 액적을 분류하기 위한 분류 장치; 및
    하나 이상의 타겟 위치들에서 상기 분류된 액적을 분배하기 위한 액적 분배 유닛을 포함하고,
    상기 미세유체 시스템은 상기 타겟 위치를 상기 제1 검출기에서 검출된 상기 타겟 개체 또는 상기 타겟 개체들의 상기 특성과 상관시키도록 구성되는, 미세유체 시스템.
  54. 청구항 53에 있어서,
    상기 타겟 개체 또는 상기 타겟 개체들의 상기 특성을 검출하기 위한 제2 검출기를 더 포함하고,
    상기 액적 분배 유닛은 상기 타겟 위치를 상기 제2 검출기에서 검출된 상기 타겟 개체 또는 타겟 개체들의 상기 특성과 상관시키도록 더욱 구성되는, 미세유체 시스템.
  55. 청구항 53 또는 청구항 54에 있어서,
    상기 액적 분배 유닛은 상기 액적을 제1 유체 흐름 경로로부터 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위한 제2 분류 장치를 포함하고,
    상기 제2 분류 장치는:
    상기 제1 유체 흐름 경로로부터 상기 액적을 분리시키기 위한 디커플러; 및
    상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 안내하기 위한 가이드를 포함하고,
    상기 가이드는:
    상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 회전되도록 구성된 회전 유닛; 및/또는
    상기 분리된 액적을 상기 제2 유체 흐름 경로로 이송하기 위해 병진 방향으로 이동하도록 구성된 병진 유닛을 포함하는, 미세유체 시스템.
  56. 청구항 53 내지 청구항 55 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 액적 분배 유닛은 입력 채널 및 복수의 출력 채널들을 포함하는 미세유체 채널 접합부를 포함하고,
    상기 액적 분배 유닛은, 상기 제1 및/또는 제2 검출기들을 통한 상기 검출을 기초로 하여, 상기 액적이 상기 복수의 출력 채널들 중 어느 것에 안내되는지를 제어하도록 구성되는, 미세유체 시스템.
  57. 청구항 56에 있어서,
    상기 액적 분배 유닛은, 상기 액적 분배 유닛의 유체 흐름 경로 내의 압력을 변화시켜 상기 복수의 출력 채널들 중 어느 것에 상기 액적이 안내되는지를 제어하는 압력 조절 유닛을 포함하는, 미세유체 시스템.
  58. 청구항 57에 있어서,
    상기 제1 출력 채널은 일반적으로 상기 입력 채널의 유체 흐름 경로 방향으로 상기 입력 채널에 연결되고,
    상기 제2 출력 채널은 상기 입력 채널로부터 분기되고,
    상기 액적 분배 유닛은 상기 제2 출력 채널과 연결된 펌프를 더 포함하고,
    상기 펌프는 상기 입력 채널로부터 상기 액적을 흡입하도록 구성되며,
    상기 압력 조절 유닛은 상기 제1 및/또는 제2 검출기에서의 상기 검출에 응답하여 상기 입력 채널 내의 압력을 증가시켜 상기 제1 출력 채널을 통해 상기 액적을 배출하도록 구성되는, 미세유체 시스템.
  59. 청구항 53 내지 청구항 58 중 어느 한 항에 있어서,
    하나 이상의 액적 보유 영역들을 더 포함하고,
    상기 보유 영역은 상기 분류 장치와 상기 액적 분배 유닛 사이에 배치되고,
    상기 보유 영역은 상기 액적 분배 유닛으로의 상기 분류된 액적의 흐름을 제어하도록 구성되는, 미세유체 시스템.
  60. 청구항 53 내지 청구항 59 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 미세유체 시스템에서 상기 액적의 속도를 결정하기 위해 다른 시점들에서 상기 미세유체 시스템의 다른 위치들에서 상기 액적을 검출하기 위한 복수의 센서들을 더 포함하고,
    상기 분류 장치는 상기 속도 결정의 결과에 따라 상기 액적을 분류하도록 구성되는, 미세유체 시스템.
  61. 생물체의 미세유체 액적-기반 처리를 위한 기기로서,
    생물체를 포함하는 액적들의 하나 이상의 유중수 에멀젼을 생성하는 액적 생성 시스템;
    상기 액적들을 처리하기 위한 액적 처리 시스템; 및
    처리된 상기 액적들을 하나 이상의 저장소에 분배하는 액적 분배 시스템을 포함하고,
    상기 액적 처리 시스템은 적어도 단일클론성 모드의 동작 및 분석 모드의 동작을 포함하는 다수의 상이한 동작 모드들에 대해 구성 가능한, 기기.
  62. 청구항 61에 있어서,
    상기 액적 처리 시스템은 적어도 하나의 액적 분류 유닛을 포함하고,
    상기 단일클론성 모드의 동작은 상기 생물체에 의한 액적들의 점유에 기초하여 액적들을 분류하는 것을 포함하며,
    상기 분석 모드의 동작은 상기 액적을 배양하는 것을 포함하고 상기 배양 동안의 상기 생물체의 산물에 기초하여 액적들을 분류하는 것을 포함하는, 기기.
  63. 청구항 61 또는 청구항 62에 있어서,
    상기 액적 처리 시스템은 하나 이상의 상호교환 가능한 또는 모듈식 액적 처리 카트리지를 포함하는, 기기.
  64. 청구항 63에 있어서,
    상기 하나 이상의 상호교환 가능한 또는 모듈식 액적 처리 카트리지는 적어도 하나의 액적 융합 유닛을 더 포함하고,
    상기 동작 모드들은 액적 융합 평가 모드의 동작을 포함하는, 기기.
  65. 미세유체 칩으로서,
    하나 이상의 생물체를 포함하는 미세액적들을 생성하기 위한 액적 생성 영역;
    상기 생물체를 배양 및/또는 저장하기 위한 액적 배양기 및/또는 저장 영역;
    상기 생물체의 하나 이상의 특성에 기초하여 상기 미세액적을 분류하기 위한 액적 분류 영역; 및
    상기 분류된 미세 액적을 분배하기 위한 액적 분배 영역을 포함하고,
    상기 액적 생성 영역, 상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역, 상기 액적 분류 영역 및 상기 액적 분배 영역은 상기 미세유체 칩의 단일 칩 디자인 상에 통합되는, 미세유체 칩.
  66. 청구항 65에 있어서,
    상기 영역들 사이에서 상기 미세액적의 미세유체 흐름 경로를 변경하기 위한 미세유체 흐름 경로 전환 유닛; 및
    상기 미세유체 흐름 경로 전환 유닛을 제어하기 위한 제1 프로세서를 포함하는 제어 유닛을 더 포함하는, 미세유체 칩.
  67. 청구항 65 또는 청구항 66에 있어서,
    상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역에서 액적들을 국부적으로 가열하기 위한 히터를 더 포함하고,
    상기 히터를 제어하기 위한 제2 프로세서를 더 포함하는, 미세유체 칩.
  68. 청구항 65 또는 청구항 66에 있어서,
    상기 액적 배양기 및/또는 저장 영역에서 액적들을 국부적으로 냉각하기 위한 냉각기(cooler)를 더 포함하고,
    상기 냉각기를 제어하기 위한 제3 프로세서를 더 포함하는, 미세유체 칩.
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