CN112495454A - 用于提供含有一个或多个实体的小滴的系统和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于提供含有一个或多个实体的小滴的系统和方法。我们描述了用于处理水包油乳液中的小水滴的仪器及其筒，所述小滴含生物实体如细胞。用于分选的微流体小滴的自动化分选和分配的微流体筒包括：与分选区域连接的分选输入通道，所述分选区域包括与输入通道连接的两个以上分选输出通道以及将小滴从分选输入通道选择性地引导至分选输出通道中的被选择的一个的小滴引导器；和与分选输出通道中的一个连接以从筒分配被选择的小滴以用于在储蓄器中收集的小滴分配器，其中小滴分配器包括小滴喷射机构以将小滴从乳液流喷射至分配器输出通道中以用于在储蓄器中收集。

Description

用于提供含有一个或多个实体的小滴的系统和方法
发明领域
本发明总体上涉及用于提供含有一个或多个实体，尤其是生物实体的小滴的系统和方法。
发明背景
在本说明书中，我们关注于乳液，通常包含水在油中的微滴，通常是表面活性剂稳定的。可以将一个或多个生物实体如一个或多个活细胞或粒子结合至每个小滴中并且之后在小滴内进行实验，例如进行生物测定。可以以超过数千/秒的速率生成并且处理微滴。
通常，油组合物包含氟油和/或矿物油，并且优选表面活性剂，例如为大约0.5-5％体积/体积。当微滴含有活实体时，氟油的使用是特别有利的，因为氟油擅长将氧输送至微滴。表面活性剂可以是聚合物分子或小分子；例如可以使用来源于全氟醚如KrytoxTM或聚乙二醇(PEG)的嵌段共聚物的表面活性剂。在微滴内的物质或分析物可以包括，例如，细胞、DNA、蛋白质、肽、珠、粒子、晶体、微团、大分子、用于酶测定的物质、细胞器、生物体如细胞例如哺乳动物细胞、酵母细胞、海藻细胞或细菌、病毒、朊病毒等。通常，小滴具有在1-120μm范围内的直径，尽管小滴可以更大(或更小)，得到可以在纳升(nanolitre)至飞升(femtolitre)范围内的体积。
可以使用在微流体装置上的集成有源元件控制单个小滴——例如，我们之前已经在WO2009/050512中描述了通过将它们结合至连续物流中来实现微滴的内容物的芯片上提取的技术。关于微滴的其他一般背景现有技术可以发现于在RainDance TechnologiesInc.名下的专利/申请中，例如 WO2008/063227。根据现有技术，例如US 2008/0053205；“在将小滴生成与荧光激活的小滴分选整合的微流体装置上的单一细胞的胶囊化(Encapsulation of single cells on a microfluidic device integrating dropletgeneration with fluorescence-activated droplet sorting)”,Biomed Microdevices2013,15(3):553-60；“利用小滴技术以单一细胞分辨率分析癌症(Analyzing Cancer atSingle Cell Resolution with Droplet Technology)”,RainDance Technologies,URL:http://raindancetech.com/rdt/wp-content/uploads/2012/05/ poster_analyzing_cancer_with_droplet_technology.pdf，已知了单一细胞或粒子分选。
尽管这些技术是可用的，可以将它们扩展。例如，存在涉及诊断非常稀少的生物实体或事件中的生物行为的一类难题，如与抗药性相关的那些。另一个挑战是确保单克隆：药物监管机构通常要求由单一、存活实体或实体的特定组合生长生物制药和其他化学或生物化学实体。这是因为生长例如来源于单一细胞或来源于多个基本上相同的存活细胞的细胞群体确保了在整个细胞群体中的高概率的单克隆。又一个挑战涉及选择细胞的基团以用于具有高收率的发酵。
对可以用于解决这些问题的技术存在需要。
发明概述
根据本发明的第一方面，因此提供了提供含有一个或多个实体的小滴的方法，所述方法包括：提供在液体中的多个实体；由所述液体制备小滴；确定所述小滴是否含有所述多个实体中的一个或多个实体，或所述小滴是否不含有所述实体；根据所述确定的结果分选所述小滴；和将所述分选的小滴分配至储蓄器中，其中在所述分选之后所述分配包括：选择用于含有所述分选的小滴的液体的液体流动路径；和从所述选择的路径中喷射所述分选的小滴。
发明人已经意识到，可以使用这种方法的实施方案增加在单一小滴例如皮升小滴(picodroplet)(其体积低于大约一千或数千皮升)中得到单一实体或实体的限定单一组合的概率。所述方法的制备、确定/分选和分配步骤中的每一个具有在单一小滴中得到一个或多个靶标实体的特定概率。通过将这些步骤组合，所述方法允许以高于99.9％，尤其是高于99.99％的概率在单一小滴得到单一靶标实体或所述实体的单一靶标组合。例如，这可以利用三个选择阶段来实现：利用泊松(Poisson)统计的胶囊化(如稍后描述的)，在连接处的分选，和在分配时的分选/选择，各自具有例如>90％选择。在类似的方式中，所述方法的实施方案有利于从大群体中提取非常稀少的靶标小滴。
我们注意到，无论在整个说明书中提及哪个实体的单一(靶标)组合，这都可以包含限定数量的基本上相同的实体(例如限定数量的细胞类型)，或在限定范围内的许多基本上相同的实体，或限定数量(具体的或在一定范围内)的第一实体(例如限定数量的第一细胞类型)和限定数量(具体的或在一定范围内)的第二或另外的实体(例如限定数量的第二或另外的细胞类型) 的组合。因此，在小滴中的靶标实体或多个实体可以是，例如：限定数量 (大于或等于一)的类型A的实体；限定数量(大于或等于一)的类型A的实体和限定数量(大于或等于一)的类型B的实体；限定数量(大于或等于一) 的三种以上不同类型的实体中的每一个。
在优选的实施方案中，所述方法还包括鉴别用于分配的所述分选的小滴；从所述液体的第一液体流动路径中提取所述分选的小滴，其通过将所述分选的小滴从所述第一液体流动路径转移至第二液体流动路径中；和通过向所述第二液体流动路径中施加压力将所述分选的小滴从所述第二液体流动路径喷射至所述储蓄器中。
在所述方法的一个优选实施方案中，所述转移包括当处于所述第一液体流动路径的部分中时及其后向用于分配的所述分选的小滴施加压力以将所述分选的小滴从所述第一液体流动路径转移至所述第二液体流动路径中并且喷射所述分选的小滴。在实施方案中，(油包水)乳液沿着第一液体流动路径流动，通过共有流动路径区域，并且之后可以借助施加至流动路径或施加至共有流动路径的正和/或负(抽取)压力继续沿着第一流动路径或转向至第二流动路径中。因此，在实施方案中，分配可以采用具有共有流动区域的分支或T连接通道布置，其任选地但是优选地与用于选择路径的小滴选择/分选机构结合。
在实施方案中，这种方法可以允许之前已经分选的小滴的进一步分选步骤。从而可以在第二分选步骤之前检测小滴，并且任选分析其成分。从而可以在第一液体流动路径的共有流动路径和可以施加压力的路径处进行分选的小滴的检测和/或分析。备选地或另外地，可以在共有流动路径之前检测和/或分析小滴。在优选的实施方案中，可以从其喷射小滴的第二液体流动路径可以包括第一和第二(或另外的)输出通道。可以降低在第二输出通道中的压力(例如，通过使用与第二输出通道连接的泵)。如以上概述的，之后可以通过当在第一液体流动路径中时对应于分选的小滴的检测和 /或分析向分选的小滴施加压力经由第一输出通道分配小滴。这可以确保不使用泵将分选的小滴提取至第二输出通道中。如果从第二输出通道分配小滴，例如如果小滴不是目标的，可以不施加压力，从而泵将小滴抽取至第二输出通道中。用于确定其是否是靶标的小滴的分析可以包括关于在小滴中目标实体的限定数量和/或在小滴中实体或多个实体的性质(例如荧光水平、导电性、和其他物理或化学性质)的分析。以下将会进一步描述这样的通道网络的实施方案。
在所述方法的另一个优选实施方案中，所述分配包括将所述分选的小滴从所述第一液体流动路径转移至所述第二液体流动路径中，然后向所述第二液体流动路径施加压力以喷射所述小滴。这可以是优选的，因为由于仅在第二液体流动路径中施加压力而可以不干扰其他小滴在第一液体流动路径中的流动。然而，备选地，这种类型的分配可以采用如稍后描述的“分离单元”以当不需要小滴时将不需要的小滴从第一液体流动路径转移移动至第二废料路径，通过例如将在第一流动路径中的阀关闭并且向乳液施加压力以将小滴从在第一流动路径末端的喷嘴等中喷射来分配小滴。
以下将会进一步描述用于将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径的装置的实施方案；例如，可以采用如稍后描述的旋转单元、平移单元或分离单元。可以在小滴进入转移单元之前和/或小滴在转移单元中时确定是否将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径。关于是否将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径的确定还可以根据靶标实体的限定数量和/或在小滴中的实体或多个实体的性质(例如荧光水平、导电性、和其他物理或化学性质)。
在所述方法的优选实施方案中，所述提取包括仅当所述分选的小滴包含限定数量的所述实体时和/或当所述分选的小滴包含具有限定性质的所述实体时提取所述分选的小滴。实体的限定数量从而可以在限定范围内。限定性质可以是，例如，物理性质(例如荧光水平或其他物理性质)和/或化学性质。
这可以是优选的，因为可以增加将要被喷射至储蓄器中以例如用于进一步分析和/或生长的含有靶标实体或多个实体的小滴的收率。如以上概述的，作为靶标实体的实体从而可以包括具有限定性质，如但不限于物理性质和/或化学性质的实体，和/或含有限定数量的实体的小滴。
例如，可以光学确定在小滴中的实体的数量。可以通过分析小滴和/ 或实体(或多个实体)的物理性质(例如荧光水平)和/或化学性质来备选地或另外地确定实体的数量，因为所述性质可以与在小滴中含有的实体的数量成比例。物理和/或化学性质可以使用标准技术确定。
可以使用用于由液体制备小滴的各种方法和装置。实例包括但不限于，T连接、Y连接、流动汇聚装置、以及其他。
基于小滴的电、光、热、声、机械、时间、空间和其他特征例如其他物理或化学特征中的一个或多个，可以确定小滴是否含有一个或多个实体，尤其是一个或多个靶标实体，或者不含有实体。
用于分选小滴的技术包括但不限于，基于磁场的小滴分选、介电泳(dielectrophoresis)、声波小滴分选、以及其他。
提取和/或鉴别步骤可以允许关于单一小滴是否含有一个或多个靶标实体的进一步确定，从而增加在单一小滴中得到单一靶标实体或实体的单一靶标组合的概率。
如以下将会进一步描述的，在本文中所述的方法的实施方案特别适用于增加例如小滴中存活细胞的单克隆确定性。
在所述方法的优选实施方案中，其中所述喷射包括响应于所述确定和 /或所述实体的性质在限定位置喷射所述分选的小滴。例如，从而可以将分选的小滴喷射至微量滴定板的孔中。从而通过之前确定的在小滴中的实体的数量(其可以是一种类型的实体或多种类型实体中的每一种的限定数量)，和/或通过实体或多个实体的性质，例如物理性质(例如荧光水平或其他物理性质)和/或化学性质，选择分选的小滴被分配的微量滴定板的具体孔。
在本文中所述的方法的优选实施方案中，小滴具有50-1,000皮升，优选300-700皮升的体积(融合小滴可以更大)。这样的体积是优选的，因为它们有利于含有例如细胞或生物分子的单一实体、或少量实体，而同时将液体的消耗成本保持在最低，并且此外，较小的小滴有利于较快的处理。然而，可以采用更大的小滴。
可以优选的是，培育和/或维持例如微生物培养物或细胞。因此，在优选的实施方案中，所述方法还包括温育所述小滴以用于培育和/或维持所述一个或多个实体。在实施方案中，因为在单一小滴中得到单一靶标实体或实体的单一靶标组合的概率高于99.997％，当生长使用在本文中所述的方法的实施方案提供的一个或多个实体时，高单克隆确定性允许得到大量例如存活细胞。
小滴可以在关于小滴是否含有一个或多个实体(或不含有实体)的确定之前提供至温育器，和/或其可以在确定和分选步骤之后提供至温育器。另外地或备选地，可以在提取步骤之后温育小滴。
在进一步优选的实施方案中，所述方法还包括在所述温育期间对所述一个或多个实体进行稳定性试验。对在单一小滴中的例如一个或多个细胞进行稳定性试验允许分选在稳定性试验期间未降低、改变关键分析物或生物分子的产生或者死亡的存活细胞。这允许得到例如存活细胞或高产者或关键分析物等的甚至更高的单克隆确定性。
在所述方法的优选实施方案中，所述分选的小滴从所述第一液体流动路径向所述第二液体流动路径中的所述转移包括在分离器中将所述分选的小滴与所述第一液体流动路径分离，其中所述分离器被配置成从所述第一液体流动路径中分离所述分选的小滴并且将所述分离的小滴导向至所述第二液体流动路径。
以这种方式，可以从含有一个或多个小滴的液体中分离单一小滴。之后可以将小滴从一个液体流动路径平移至另一个，其随后可以从那里被分配，例如从实施所述方法的微流体芯片。可以特别优选的是，确定小滴是否含有存活的单一实体(或仅存活实体的特定组合或多个存活实体)，例如存活的单一细胞。这可以允许从含有存活的单一实体(或仅存活实体的特定组合或多个存活实体)的仅液体的小滴中分离。作为结果，可以甚至进一步增加提供各自含有存活的单一实体(或仅存活实体的特定组合或多个存活实体)的单一小滴的单克隆确定性。
从例如微流体芯片中喷射被转移的小滴可以是特别优选的，因为可以在芯片外进一步分析在单一小滴中含有的一个或多个实体。
在所述方法的优选实施方案中，所述喷射包括加热在其中输送所述分选的小滴的输送液体(如，但不限于油)。这允许以与从喷墨打印机中喷射液体的方式相似地喷射小滴。
在优选的实施方案中，所述方法还包括将生长培养基液体注入至所述第二液体流动路径中以用于喷射在所述生长培养基液体中的所述分选的小滴。这可以是特别优选的，因为，例如群体可以由在单一喷射小滴中含有的一个或多个实体生长，并且喷射小滴可以例如被喷射至在生长培养基液体中的微量滴定孔中以用于生长群体，例如细胞群体或生物分子的群体。
在进一步优选的实施方案中，所述喷射包括通过加压液体喷射来喷射鉴别的小滴。这可以是特别优选的，因为可以以较高速率和/或以受控方式分配含有一个或多个实体，尤其是一个或多个存活实体的小滴。就此而言，从携带多个小滴的液体的第一液体流动路径中分离含有一个或多个存活实体的小滴并且将小滴提供至第二流动路径可能是特别重要的，以为这允许单一小滴从第二流动路径中的加压液体喷射而不影响其他小滴在第一液体流动路径中的流动。从而可以实现在单一小滴中的例如一个或多个存活细胞或生物分子的受控喷射。
在本文中所述的方法和系统可以特别适用于细胞和/或试剂，如，但不限于生物分子，因为如以上概述的，根据法令规定例如细胞群体的生长可能需要来源于单一、存活细胞(或仅一定数量的存活的细胞)。
通过提供在本文中所述的方法和系统，可以明显降低消耗成本(尤其是含有实体的液体的消耗成本)和/或递送先导药物的时间。
在优选的实施方案中，所述方法还包括：提供在第二液体中的多个第二实体；由所述第二液体制备第二小滴；和将由所述第一液体制备的所述第一小滴和由所述第二液体制备的所述第二小滴融合以得到融合的小滴；其中所述提取包括通过将所述融合的小滴从所述第一液体流动路径转移至所述第二液体流动路径中来提取所述融合的小滴。这可以允许得到含有第一和第二细胞、细胞和试剂、和其他组合的融合的小滴。使用电聚结(electrocoalescence)，通过使第一和第二小滴之一或二者带电，通过被动或机械融合，例如通过提供具有成形结构或其他构造的流动通道以迫使小滴在一起，通过采用化学促进的融合，和/或使用其他技术，可以进行使小滴融合。
使第一和第二小滴融合因此可以允许例如研究单一细胞(或一定数量的细胞)如何与试剂反应。此外，可以对暴露于试剂的单一细胞(或一定数量的细胞)进行稳定性试验，或者可以分析单一细胞对(或细胞的组合)之间的相互作用。
为了使例如单一细胞(或多个细胞)与试剂融合，可以优选的是，首先确定第一小滴是否含有单一实体(或一定数量的实体)或不含有实体。因此，在优选的实施方案中，在所述小滴的所述融合之前进行所述确定和/或分选。
在进一步优选的实施方案中，所述方法还包括：确定所述第二小滴是否含有所述多个第二实体中的一个或多个实体，或者所述第二小滴是否不含有所述多个第二实体的所述实体；和根据所述确定的结果分选所述第二小滴。例如，这允许确保只有在第二小滴含有一个或多个靶标实体的情况下使第一小滴与第二小滴融合。优选地，仅对分别已经被确定为含有第一和第二多个实体中的一个或多个靶标实体的所述第一小滴和所述第二小滴进行融合。
所述方法的实施方案因此允许例如分析在单一小滴中含有的一对细胞，或单配对的细胞和试剂，如生物分子，或一个或多个细胞与一种或多种试剂的单一靶标组合。
因此，在所述方法的优选实施方案中，所述融合的小滴含有单配对的两个细胞、或单配对的细胞和试剂、或一种或多种细胞的单一组合、或一种或多种细胞与一种或多种试剂的单一组合，尤其是其中所述试剂是生物分子。应该理解的是，可以使用在本文中所述的方法的实施方案分析和/ 或进一步处理在单一小滴中含有的一对两个实体的其他组合。
技术人员将会理解，所述方法也可以用于将多个实体/试剂组合。
在所述方法的进一步优选的实施方案中，所述分选包括在所述液体流动路径的多个位置在不同时间点检测所述小滴以确定所述小滴在所述液体流动路径中的速度以用于对所述分选计时。所述方法的实施方案允许对分选一个或多个小滴的改善的控制，因为在可以确定和/或预测液体流动路径中的一个或多个小滴的特定位置。因此，例如，一对传感器，如光电门传感器，可以用于估算小滴的行进速度。之后可以预测小滴在未来时间的位置。这可以用于例如通过检查小滴存在于预期时间和位置来检查小滴存在于正确通道中或已经被引导/分选至正确通道中。
在本发明的相关方面中，提供了制备含有单配对的两种生物实体的小滴的方法，所述方法包括：提供在第一液体中的多个第一生物实体并且提供在第二液体中的多个第二生物实体；由所述第一液体制备第一小滴并且由所述第二液体制备第二小滴；确定所述第一小滴是否含有所述多个第一生物实体的单一实体以及所述第二小滴是否含有所述多个第二生物实体的单一实体；和将分别已经被确定为含有所述单一实体的所述第一小滴和所述第二小滴融合。因此可以增加在单一小滴中得到一对两个实体的概率，因为在这个实例中，在使小滴融合之前进行分别针对第一和第二小滴二者的确定步骤。
上述本发明的第一方面的优选实施方案在这里同样适用。因此，例如，之后可以通过将分选的小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径中而从液体的第一液体流动路径中提取融合的小滴。优选地，第一和第二小滴可以各自经历上述本发明的第一方面以及其优选实施方案的所有步骤。从而可以明显增加分别从多个第一生物实体和多个第二生物实体得到含有一对实体的融合的小滴的概率。
通过电聚结，通过使第一和第二小滴之一或二者带电以用于通过静电吸引使小滴融合，通过被动或机械融合，通过化学促进的融合，或通过其他技术，可以进行使小滴融合。
在本发明的相关方面中，提供了一种代谢和/或分析在小滴中含有的生物实体的方法，其中所述生物实体包括单一细胞、或单配对的两个细胞、或单配对的细胞和试剂，所述方法包括使用上述方面和实施方案中任一项所述的方法提供在所述小滴中含有的所述生物实体。
代谢(培养)可以包括，例如在细菌的情况中，增加实体的数量，或者可以包括允许实体如哺乳动物细胞代谢，例如以产生产物。
因为在本文中所述的方法的实施方案得到非常高的单克隆确定性，它们特别适用于在单一小滴中生长例如单一细胞(或生物分子、或另一种实体)，因为由单一细胞生长的细胞群体中的细胞具有全部基本上彼此相同的非常高的概率。类似地，分析单一小滴中的单一细胞允许确保对目标细胞进行任何测量。这可能不会保证在单一小滴中含有的大的细胞数量，因为例如，突变可能会导致可能并非全部基本上相同的细胞(或其他实体)的统计学分布。
在本发明的另一个方面中，提供了用于提供含有一个或多个实体的小滴的微流体系统，所述系统包括：用于由含有多个实体的液体制备小滴的小滴形成装置；用于确定所述小滴是否含有所述多个实体的一个或多个实体的分析仪；用于根据所述确定的结果分选所述小滴的小滴分选装置；和用于在所述微流体系统中将所述分选的小滴从所述液体的液体流动路径分离的分离器。
在优选的实施方案中，所述微流体系统还包括被配置成鉴别所述分离的小滴(或已经通过例如分离器从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径中的所述分选的小滴)的另外的分析仪，和被配置成将鉴别的小滴喷射至例如储蓄器(例如微量滴定板)中的小滴分配单元。
优选地，一个或多个分析仪被配置成确定小滴是否含有多个实体中的单一靶标实体和/或小滴是否含有多个实体中的实体的单一靶标组合。
微流体系统的实施方案因此允许得到在单一小滴中的单一实体，例如单一细胞或一对生物实体，或实体的单一靶标组合。小滴形成装置、分析仪和小滴分选装置、和分离器中的每一个允许以特定概率在单一小滴中得到一个或多个靶标实体。使用微流体系统的实施方案在单一小滴中得到单一实体或实体的单一组合的组合概率可以高于99.9％，尤其是高于 99.99％。分离器从而可以包括用于关于单一小滴是否含有单一实体的进一步确定的分析仪。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述分离器包括用于从所述液体流动路径中分离所述分选的小滴的分离单元和用于将所述分离的小滴导向至所述微流体系统的第二液体流动路径中的导向器。这可以是特别优选的，因为之后可以分离并且独立于其他小滴或液体分配和/或分析在单一小滴中含有的单一实体(或实体的单一组合)。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述导向器包括旋转单元，其中所述旋转单元包括用于储存所述分离的小滴的小滴储存单元，并且其中所述旋转单元被配置成旋转以将储存在所述小滴储存单元中的所述分离的小滴输送至所述第二液体流动路径中。
一旦已经检测到含有目标实体(或多个实体)的小滴，就可以将小滴放置在小滴储存单元中，并且可以使旋转单元旋转，然后将小滴提供至第二液体流动路径。在一些实施方案中，旋转单元使第一和第二液体流动路径完整。
在一些其他实施方案中，分支流动通道可以用于类似目的，更尤其是用于选择/分配小滴。
在一些实施方案中，小滴储存单元可以是分别使第一和第二液体流动路径完整的通道。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述导向器包括平移单元，其中所述平移单元包括用于储存所述分离的小滴的小滴储存单元，并且其中所述平移单元被配置成在平移方向上移动以将储存在所述小滴储存单元中的所述分离的小滴输送至所述第二液体流动路径中。
与旋转单元类似，一旦已经检测到含有目标实体(或多个实体)的小滴，就可以将小滴放置在平移单元的小滴储存单元中，并且可以使平移单元移动，然后将小滴提供至第二液体流动路径。在一些实施方案中，平移单元使第一和第二液体流动路径完整。
在一些实施方案中，小滴储存单元可以是分别使第一和第二液体流动路径完整的通道。
在优选的实施方案中，导向器可以被配置成使得其将输入通道与两个以上输出通道组合。导向器的通道从而可以以摇摆状运动移动，允许输入液体流动路径与多个输出液体流动路径连接。
在优选的实施方案中，所述微流体系统还包括用于温育所述小滴以用于培育和/或维持所述一个或多个实体的温育器。如以上概述的，在实施方案中，因为在单一小滴中得到单一靶标实体或实体的单一靶标组合(其可以是多个基本上相同的实体)的概率高于99.99％，当使用在本文中所述的微流体系统的实施方案生长一个或多个实体时，高单克隆确定性允许得到大量例如存活实体(例如细胞、生物分子或其他实体)。
可以将温育器在液体流动路径方向上放置在分析仪前，和/或可以将其在液体流动路径方向上放置在分析仪和小滴分选装置后。另外地或备选地，可以在微流体系统中将温育器在液体流动路径方向上放置在后。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述温育器包括用于在所述温育期间对所述一个或多个实体进行稳定性试验的稳定性试验单元。对在单一小滴中的一个或多个实体例如细胞(或多个细胞)进行稳定性试验允许分选在稳定性试验期间未降低、改变关键分析物或生物分子的产生或者死亡的存活实体。这允许得到产生高水平的关键分析物等的存活实体的甚至更高的单克隆确定性，如，但不限于存活细胞、生物分子和其他实体和/或细胞。
在优选的实施方案中，所述微流体系统还包括用于分配所述分离的小滴的分配单元。从而可以将分离的小滴分配至例如微量滴定板的单个孔中，在那里可以储存并且之后获取在单一小滴(或多个小滴)中含有的一个或多个实体以用于进一步处理或分析，或用于随后使用，例如在发酵等中。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述分配单元包括用于储存生长培养基液体的储蓄器，并且其中所述分配单元被配置成在所述生长培养基液体中分配所述分离的小滴。这可以是特别优选的，因为可以这些单一步骤中将分配步骤和将含有一个或多个实体的单一小滴放置在生长培养基液体中的步骤组合。可以由含有包含实体或多个实体的小滴的生长培养基液体制备小滴，其之后可以被分配至例如微量滴定板的单个孔中。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述分配单元包括用于通过加压液体喷射来分配所述小滴的增加的(或降低的)压力单元。压力的改变可以通过许多技术产生，包括但不限于：压电方法、热学方法、和加压气体方法。如以下将会进一步描述的，通过加压液体喷射来喷射小滴可以是特别优选的，因为可以明显缩短从微流体系统中分配小滴的时间，可以控制经由不同输出口的喷射。通过使将要从微流体系统中分配的目标小滴与第一液体流动路径分离或分离，仅使将要被分配的小滴暴露于高压单元。可以优选的是，仅使分离的小滴暴露于高压单元，因为在分析仪和小滴分选装置中的小滴分析和分选可能难以实现使小滴暴露于高压单元。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述小滴形成装置包括多个小滴形成装置，并且其中所述微流体系统还包括用于将使用所述多个小滴形成装置制备的多个小滴融合的小滴融合装置。微流体系统的实施方案因此允许准备在单一、融合的小滴中含有的例如一对细胞、或单配对的细胞和试剂、或特定实体的单一组合的测定。
可以在微流体系统中将小滴融合装置在液体流动路径方向上放置在分析仪和小滴分选装置前。优选地，可以将小滴融合装置在液体流动路径方向上放置在分析仪和小滴分选装置后，因为这允许仅使分别已经被确定为含有第一和多个第二实体中的一个或多个靶标实体的小滴融合。
可以备选地将小滴融合装置放置在分离器后。这样做的优点是，两个小滴各自含有一个或多个目标实体的概率在使那些小滴融合之前可以是较高的。
所述小滴融合装置可以包括用于产生电场以用于通过电聚结将所述小滴融合的电场生成器。备选地或另外地，小滴融合装置可以包括用于使小滴带电的一个或多个充电装置。从而通过小滴的静电吸引来促进小滴的融合。通过提供包括允许例如借助通道结构(小滴可以在此撞击至另一个小滴上从而与其他小滴融合)的被动小滴融合的通道几何结构的小滴融合装置，可以备选地或另外地实现小滴融合。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述分析仪包括下列各项中的一个或多个：荧光检测器、散射光检测器、声波生成和检测单元、和磁激活的细胞分选装置。可以通过这些装置中的一个或多个来确定小滴的内容物，并且可以根据所述确定而在小滴分选装置中分选小滴。应理解的是，取决于在小滴中被检测的靶标内容物，用于分析小滴的内容物的一种或多种具体方法或装置与其他方法或装置相比可以是优选的。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述分析仪和/或小滴分选装置包括多个传感器，所述传感器用于在所述微流体系统的不同位置(在不同时间点)检测所述小滴以确定所述小滴在所述微流体系统中的速度，并且其中所述小滴分选装置被配置成根据所述速度确定的结果分选所述小滴。这允许一个或多个小滴的改善的分选，因为可以确定和/或预测一个或多个小滴在微流体系统的液体流动路径中的位置。
在本发明的另一个方面中，提供了小滴分选或分配装置，所述小滴分选或分配装置包括具有下列各项的基板：一组一个或多个微流体输入通道；一组微流体输出通道；在所述输入通道和所述输出通道之间的可移动分选元件，其中所述分选元件包括一组微流体通道以将所述输入通道与所述输出通道连接，并且其中所述分选元件可以在其中连接至少第一所述输入通道以允许从所述第一输入通道到第一所述输出通道的液体流动的第一位置和其中使在所述通道中并且携带一个或多个小滴的一段液体移动，以致所述一段液体流入第二所述输出通道中的第二位置之间移动。
小滴分选/分配装置的实施方案因此允许通过将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径中而从第一液体流动路径中提取小滴。因此，小滴分选装置可以用于使微流体装置的通道连接和/或完整。如以上概述的，这可以是特别优选的，因为可以将小滴与微流体系统的第一液体流动路径分离，并且通过例如从第二液体流动路径中的加压液体喷射而从系统分配。
在小滴分选/分配装置的优选的实施方案中，所述分选元件可以在第一和第二位置之间旋转以交换来自第一和第二输入通道的液体段，以致它们流动至相应的第一和第二输出通道或被交换以流动至相应的第二和第一输出通道。先前关于小滴的成分的确定因此可以允许通过从第一液体流动路径中提取目标小滴(或备选地，非目标的小滴)来分选小滴并且基于所述确定将其提供至第二液体流动路径。
小滴分选/分配装置的实施方案因此允许从液体流动路径中提取小滴而不干扰在微流体系统内的液体流动路径。
在本发明的相关方面中，提供了分选或分配小滴的方法，所述方法包括：提供第一和第二微流体流，至少一个所述流含有小滴；和使包含所述流的部分的转盘旋转以将小滴选择性地引导至第一和第二输出微流体流中的一个。所述方法的实施方案因此允许例如基于先前关于小滴和/或其内容物的性质的确定来分选小滴。
在本发明的相关方面中，提供了用于这些微流体流中分选或分配小滴的装置，所述装置包括：第一和第二输入微流体流，至少一个所述流含有小滴；第一和第二输出微流体流；和包含在所述输入流和所述输出流之间的流的部分的旋转转盘；和用于控制所述转盘的旋转以将所述小滴选择性地引导至所述第一和第二输出微流体流的控制器。
一旦小滴从例如第一输入微流体流进入旋转转盘的流的部分中的一个，就可以转动转盘，从而小滴可以在第二输出微流体流处离开。基于小滴和/或其一种或多种内容物的之前的分析，如果需要将小滴维持在通道中，则不转动转盘，从而小滴例如从第一输入微流体流经由旋转转盘的物流的一部分流动至第一输出微流体流。
在本发明的相关方面中，提供了用于将皮升小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径的细胞、生物分子和实体分选或分配装置，所述分选装置包括：用于将所述皮升小滴与所述第一液体流动路径分离的分离器；和用于将所述分离的皮升小滴导向至所述第二液体流动路径的导向器，其中所述导向器包括：被配置成旋转以用于将所述分离的皮升小滴输送至所述第二液体流动路径的旋转单元；和/或被配置成在平移方向上移动以将所述分离的皮升小滴输送至所述第二液体流动路径的平移单元。可以在小滴进入分选装置之前确定对于是否将小滴分离并且从第一液体流动路径导向至第二液体流动路径。备选地或另外地，可以当小滴在分选装置内部时做出这个确定。
在优选的实施方案中，所述细胞、生物分子和实体分选装置还包括x-y 移动平台，所述x-y移动平台包括在其上所述皮升小滴中的一个或多个可以分配在一个或多个可寻址位置的一个或多个微量滴定板、和/或一个或多个载玻片、和/或一个或多个阵列或其他形式。因此可以根据预定方式将小滴分配至微量滴定板的一个或多个单个孔、和/或一个或多个载玻片、和/ 或一个或多个阵列或其他形式中，并且之后可以进一步分析和/或处理小滴及其内容物，从而例如使群体生长。
可以将在本文中所述的小滴分选/分配装置的实施方案和/或细胞、生物分子和实体分选/分配装置的实施方案结合至小滴分配器，尤其是皮升小滴分配器中。这样的小滴分配器被配置成将选择的(分选的)小滴从微流体通道选择性地分配至储蓄器中。
此外，在本文中所述的小滴分选/分配装置的实施方案，和/或细胞、生物分子和实体分选/分配装置的实施方案，和/或皮升小滴分配器的实施方案可以实施为微流体装置。
筒(cartridge)
在另一个方面中，本发明提供了用于分选的微流体小滴的自动化分选和分配的微流体筒，所述筒包括：与分选区域连接的分选输入通道，所述分选区域包括与所述输入通道连接的两个以上分选输出通道以及将小滴从所述分选输入通道选择性地引导至所述分选输出通道中的被选择的一个的小滴引导器；和与所述分选输出通道中的一个连接以从所述筒分配被选择的所述小滴以用于在储蓄器中收集的小滴分配器，其中所述小滴分配器包括小滴喷射机构以将小滴从乳液流喷射至分配器输出通道中以用于在所述储蓄器中收集。
这样的筒的实施方案提供了可以用于解决许多重要问题的一次性/消耗性装置，如鉴别和收集可以仅在106或109个小滴中存在一个的靶标，例如耐药性细菌。广义上，这可以通过鉴别来自目标小滴的信号并且之后收集这些小滴以用于进一步分析(原则上在公用储蓄器中，但是在一些优选实施方案中，在单独的、可鉴别的储蓄器中)来完成。后一种方法允许从例如用于随后分析或使用的多孔板中获取具有单独鉴别的性质的细胞或其他实体——这样的多孔储蓄器的单个孔可以有效地用于收集具有选择的性质的单独实体。
以互补的方式，而不是直接用于测定，可以以“稳定性试验模式”使用筒的实施方案以鉴别理论上全部相同的小滴(例如细胞)的群体中改变的 (例如，阴性的)反应。例如，在这种运行模式中，可以使用筒，例如以鉴别已经关闭了借助细胞的物质产生的单独实例，例如解决发酵批次的降低的收率。
在优选的实施方案中，筒包括其中可以优选在控制温度下容纳小滴的温育区域或腔室，以允许在受控释放之前温育小滴的内容物。在实施方案中，这个区域被配置成将小滴保持在比分散在乳液内时大的密度；这可以通过将小滴容纳(通常，“浮”)在腔室的上部并且在腔室的顶部提供阀或类似物以用于小滴的受控释放来实现——在使用中，筒以温育腔室的顶部向上定位。可以将过量的载体液体(油)释放至废料中。优选地，但是并非必需，温育区域在分选区域的上游。
如技术人员将会理解的，乳液(可以是双乳液)通常是油包水乳液。筒优选被配置成与微滴处理系统连接——即在实施方案中，筒可以连接至提供感测和控制功能的微滴处理系统中并且从其中释放。在实施方案中，微滴处理系统提供针对温育腔室的温度控制和用于小滴分选的小滴性质感测，并且还可以提供在分配器输出通道和储蓄器孔之间的相对运动以收集小滴。
在典型的实施方案中，筒通常具有带有微流体通道、一个或多个容纳区域、阀等的平板的形式。其优选为基本上光透明的，并且可以由一系列塑料材料例如聚二甲基硅氧烷(PDMS)或环烯烃聚合物或共聚物(COP或 COC)制造。之后可以将筒竖直或以适合角度安装在具有向下引导至多孔或微量滴定板的分配器输出通道的系统/仪器中。仪器之后可以移动筒和/ 或板以将输出通道引导至选择的孔中。
在优选的实施方案中，筒设置有多个液体连接，其可以当将筒插入至仪器中时自动制造。可以在筒上或在筒外进行乳液的生成。例如，在实施方案中，筒可以沿着一个边缘设置有储蓄器(从而当筒竖直时这些在正确取向上)，以保持油和水性培养基(如水和生长培养基)以用于小滴在芯片上的小滴生成。
之前描述了微流体筒的实施方案，旨在鉴别含有来自非常大的群体的目标生物实体的非常少、极其稀少的小滴。小滴分选器可以运行得比小滴分配器快一个或两个数量级——例如分配器可以以1-10Hz运行，而分选器可以以100-1,000Hz运行。然而，由于靶标实体的统计学，分配器分配器可以不连续运行。因此，在筒的一些优选实施方案中，在筒的分选区域和分配区域之间提供了一个或多个乳液流缓冲区域，以控制到小滴分配器的乳液流速。在实施方案中，这样的缓冲区域可以包括与之前描述的温育区域或多或少类似的腔室，在那里小滴可以在将过量的油虹吸掉或释放至废料时累积。例如，可以允许小滴漂浮至腔室的顶部，它们可以从那里通过阀等以受控方式释放。
在包括缓冲区域的情况下，在实施方案中，其可以包括一段微流体通道，例如蛇形构造的，其被布置为使得维持小滴的次序。以这种方式，可以维持具有在缓冲液上游测量的小滴特征的小滴的特性，因为维持了小滴的次序或顺序。然而，在其他布置中，可以采用加宽的通道或腔室，其具有有利于提供更大容量的优点。在这种情况中，可以在它们从缓冲区域离开(按顺序)之后测量小滴的特征。在两种情况中，优选的实施方案将小滴的一个或多个特征与小滴的可鉴别性质(通常是其位置)相关联，从而当将小滴分配至孔/储蓄器中时，在孔/储蓄器内的一个或多个小滴的性质是已知的。
因此，在本文中所述的这些和其他方法/装置的优选实施方案中，在鉴别的孔/储蓄器中的分配的小滴的内容物是已知的并且储存用于稍后使用。以这种方式，通过获取已知(记录)含有具有所需/目标性质的内容物的孔/ 储蓄器的内容物，可以在小滴分配之后获取具有所需/目标性质的小滴内容物(例如细胞、蛋白质、抗体、试剂或分析物)。
在一些优选的实施方案中，所述分配器的所述输出通道包括用于促进小滴或小滴的内容物从所述乳液中释放的机构。如之前提及的，通常在生长培养基中，小滴的内容物通常包含水和生物实体，如细胞。筒的目的是提取具有特定性质或特征的那些(稀有)生物实体，并且这通过在可以已经在微量滴定板的孔中含有例如20-50μl的水/生长培养基一个或多个储蓄器中收集靶标小滴而完成。通过比较，喷射的乳液弹(slug)可以具有 50-300nl的体积(部分取决于通道宽度)，而小滴可以具有约50pl以上的体积。在实践已经发现，当将乳液弹从分配器输出通道中喷射时，来自小滴的水及其内容物可以最终漂浮在油的表面上(部分取决于油密度并且取决于其是否被氟化)。小滴喷射机构的实施方案因此优选包括用于从乳液中提取小滴和/或使小滴破裂的系统。这可以通过机械方式实现，其通过使分配器输出通道的喷嘴成形例如变窄和/或通过提供横跨输出通道的网；和/或这可以通过电学方式实现，例如通过提供与分配器输出通道的出口相邻的一对电极，可以横跨所述分配器输出通道施加电压以产生电场，从而干扰乳液/小滴；和/或可以采用化学机制，例如通过将脱乳化试剂如全氟辛醇的物流加入至分配器输出通道中。
在一些优选的实施方案中，所述微流体筒还包括多个传感器，所述传感器用于在所述微流体筒的不同位置(在不同时间点)检测所述小滴以确定所述小滴在所述微流体筒中的速度，并且其中所述小滴引导器被配置成根据所述速度确定的结果引导所述小滴。这可以是特别有利的，因为可以确定和/或预测一个或多个小滴在筒中的位置以进一步改善对在分选区域中分选一个或多个小滴的控制。
在一些优选的实施方案中，所述小滴喷射机构包括用于增加所述乳液流中的压力以将小滴引导至所述分配器输出通道中的机构。在一些实施方案中，这可以通过布置分配器以使其具有主通道和侧通道(T连接的形式的，如稍后描述的)并且之后施加压力脉冲以驱使小滴进入用于输出的侧通道(分配器输出通道)中而实现。在一个实施方案中，这样的布置可以包括与侧通道(分配器输出通道)一起的沿着乳液流的长度的一对阀，如节流阀。以这种方式，可以将阀关闭以将物流分离并且之后施加压力以将乳液弹分离，从而驱使含有小滴的乳液进入分配器输出通道中。在另一种方法中，可以将乳液弹从第一通道/物流转移至第二通道/物流中，在那里可以施加压力脉冲以喷射所述块及其相关小滴。技术人员将会认识到其他构造是可能的。可以通过机械方式例如使用压电式转换器提供适合的压力脉冲。备选地，可以通过电学方式产生压力脉冲，例如借助电加热元件和汽泡膨胀 (以与喷墨打印机类似的方式)。在一些优选的实施方案中，施加增压的脉冲以将乳液弹及其小滴喷射，但是技术人员将会理解的是，原则上，可以调整我们稍后描述的布置，从而相反地，使用减压的脉冲以将小滴从乳液流喷射至分配器输出通道中。
在一些优选的实施方案中，方便的是将小滴喷射机构与用于感测/检测用于喷射的小滴的存在的系统物理分离。在实施方案中，这通过使用容纳所述筒的仪器(微滴处理系统)以感测用于喷射的通过分选系统选择的小滴的位置和速度之一或二者实现。可以在小滴喷射机构的上游进行感测，从而可以当小滴到达喷射机构时预测小滴的位置。原则上，如果可以足够准确地控制乳液的流速，则不需要测量小滴速度，但是在实践中，测量速度是有利的。更有利的是，控制通道尺寸公差，以降低通道尺寸的变化以及因此的小滴速度变化。以这种方式在到小滴喷射机构的单独位置中将小滴成像使得筒/仪器更简单并且更有效。
如之前提及的，在一些优选的实施方案中，将小滴分配至包括多个单独的孔的微量滴定板等的单个孔中。仪器(微滴处理系统)之后可以包括控制系统以将分配的小滴选择性地引导至储蓄器。在实施方案中，将筒或多孔板安装在X-Y可移动台上，从而筒和板可以相对于彼此移动以将分配器输出通道引导至选择的储蓄器。如之前提及的，孔可以容纳一个或多个小滴，取决于仪器的应用/测定/运行模式。
在一些优选的实施方案中，当仪器询问小滴的一个或多个性质以用于分选时，为具有所需性质的选择的、靶标小滴储存相应的数据。之后将这个数据与鉴别将小滴分配至其中的特定孔或储蓄器的信息结合。以这种方式，之后可以从其储蓄器中获取具有特定性质的小滴以用于稍后的分析和 /或可以使用多孔储蓄器提取具有特定性质或一系列性质的一组小滴。尽管分选可以基于例如测量值与阈值的比较，选择的小滴可以具有可以进而与测量小滴内生物实体的活性的一些其他性质相关的一系列参数值。其因此可用于能够使一个或多个参数的测量与储蓄器的特定孔中的小滴相关联。可以通过仪器感测的性质的实例包括(但不限于)：光学性质如荧光度、散射度、发光度、吸光度中的一个或多个；电或磁性质如电导；以及一个或多个衍生的或推断的性质，如细胞是活的还是死亡的(其可以根据光学测量推断)。技术人员将会认识到，尽管在实施方案中当分选小滴时方便地感测了单个小滴的一个或多个性质，原则上可以通过单独询问传感器而在分选之后另外地或备选地感测与储蓄器鉴别数据结合储存的感测的数据。在两种情况中，组合的筒和仪器的实施方案有利于追踪用于稍后分析或使用的单个的分配的小滴。
如之前描述的，筒的实施方案可以应用于的用途包括直接小滴测定和生物实体稳定性/活力测定。在一些应用中，单克隆的确定性是重要的——即对于含有生物实体如细胞的单个储蓄器/孔来说可能需要仅含有一个这样的实体。例如，在由细胞系产生抗体的情况下，这是重要的——对于调控目的来说可能重要的是，如果例如抗体用于形成药物，能够基本上保证抗体来源于单一细胞克隆。对于这些应用来说，通常不需要温育腔室，并且因此可以采用不具有这样的腔室的筒形式。备选地，可以提供其中可以忽略温育腔室的更一般的筒，或者在另一种形式中，小滴可以如之前描述的经过温育腔室但是不进行温育。
微流体筒的实施方案可以用于单克隆确定性的一种方式是使用小滴分选器选择仅含有单一细胞的小滴，将空小滴和具有两个以上细胞的小滴传送至废料。可以光学确定在小滴中的细胞的数量，例如通过检测吸光度、散射光、荧光，或者(在一些优选实施方案中)通过将小滴内的单个细胞可视化并且计数。通过利用向形成空小滴的强统计偏倚产生小滴，有利于这样的方法。通常，小滴生成系统采用流动汇聚并且产生含有服从泊松统计的许多生物实体的小滴。通过运行这样的系统以使得少于一半的小滴含有生物实体，优选少于30％、20％或10％，有利于单克隆确定性——例如可以运行系统以使得仅大约5％的小滴含有单一实体/细胞。
这些技术可以共同提供相当大的单克隆的确定性——即每个孔/储蓄器中存在不多于一个细胞。然而，在实施方案中，仍然需要进一步的确定性，并且这可以通过在第一阶段之后增加第二分选阶段而提供——尽管理论上第一阶段应当仅允许含有单一生物实体/细胞的小滴进入选择的输出通道。在实施方案中，这个第二分选阶段可以有效地与小滴分配器组合——即在实施方案中，分配器可以被配置成本身选择具有限定数量(或数值范围)的生物实体/小滴的小滴。因此，根据小滴仅含有单一生物实体还是更通常地限定数量或数值范围的生物实体的确认，小滴喷射机构可以是选择性的。方便地，如之前描述的，可以通过用于感测选择的小滴的速度/ 位置的一个或多个传感器来进行实体/小滴的数量/数量范围的检测。以这种方式，可以提供极高的单克隆确定性程度。
尽管我们已经描述了单克隆确定性的具体应用，上述技术可以适用于靶向限定数量的生物实体/小滴而不是具体地靶向单一实体/小滴。例如当操作含有细菌而不是例如哺乳动物细胞的小滴时，数值范围更适当；这可以限定数十个生物体/小滴，例如25-35个实体/小滴。
在该技术的仍进一步的应用中，上述通用类型的微流体筒可以提供“融合测定”或功能性测定运行模式。
为了提供这种运行模式，微流体筒设置有小滴融合区域，所述小滴融合区域具有至少两个输入通道和至少一个输出通道以提供向分选区域中的输入(如果存在的话，温育区域可以在分选区域之前或之后)。如技术人员将会知晓的，存在许多用于使微滴融合的技术，包括物理融合技术和采用电场或其他场使小滴融合的技术(在我们稍前申请的WO2009/050512 (通过引用结合于此)中描述了一些实例)。广义上，小滴融合区域用于将分选区域上游的生物实体组合，从而可以基于在组合的实体之间的潜在的稀少相互作用选择融合的小滴。如之前描述的，可以在筒上或筒外产生包含要融合的小滴的两种(以上)乳液。在一些优选的实施方案中，这样的系统可以用于鉴别一个生物实体对另一个生物实体具有抗性的非常稀少的情况，这可能低至一百万分之一或十亿分之一的概率。因此，实例可以包括对HIV感染具有抗性的T细胞或对吞噬细胞具有抗性的细菌；技术人员将会方便地能够理解所述系统的实施方案可以用于鉴别其他类似的情况。同样地，因为技术人员将会知晓细胞分选可以基于多种物理性质(通常是光学性质)中的任何一种；在一种方法中，确定小滴内的实体是活的还是死亡的。
尽管我们已经描述了具有两个输出通道的分选区域，原则上可以提供三个以上输出通道，例如以将混合的实体群体分选为多组或多类(例如，通过使用施加电场的电极对选择性地引导小滴，可以实现向多个通道中的分选)。例如，在预期用于发酵的细胞群体中，可以将所述群体分选为高、中和低生产率组，并且可以是例如，具有中生产率的细胞比具有高生产率的那些更理想，因为它们随后在大规模发酵系统中更稳健。因此，应该理解的是，在这样的布置中，可以采用输出通道中的任意一个或多个收集选择的小滴的内容物以用于进一步处理/分析。
在所使用的筒的实施方案中，广义上来说，将样品和油加载至在筒的一个边缘上的单独的无菌储蓄器中(将筒竖直或以适合角度安装)并且产生乳液。将乳液泵送至温育腔室，在那里小滴向上漂浮并且过量的油流向废料。之后在数分钟至数小时的一些时间段内将温育腔室加热至例如37℃，并且之后冷却至例如大约8℃，以限制代谢。之后将小滴群体移动(泵送) 至分选区域，在那里选择靶标小滴并且将其从那里移动至容纳区域，再次移除过量的油(虹吸掉并且使过量的油流向废料)，之后将小滴从容纳区域中逐一释放(加入额外的油以促进这个处理)并且移动至分配区域，在那里小滴喷射机构将选择的小滴喷射至公用或单独的用于小滴的储蓄器中。
我们已经描述了可以具有许多小滴处理区域的筒，所述小滴处理区域尤其是用于小滴生成、小滴温育、小滴分选、小滴容纳(“缓冲”)、和小滴分配。在实施方案中，筒以模块化形式提供，根据需要具有可以连接用于发挥这些功能中的一些或全部的单独模块的基底或基板。这可以通过在这样的布置的模块之间具有标准界面或一组界面而促进。
在本发明的相关方面中，提供了一种用于提供在小滴中的一个或多个靶标实体的微流体系统，所述微流体系统包括：用于检测下列各项之一或二者的第一检测器：所述小滴是否含有所述一个或多个靶标实体；和所述一个或多个靶标实体的性质；所述微流体系统还包括：用于根据所述检测的结果分选所述小滴的分选装置；和用于将所述分选的小滴分配在一个或多个靶标位置的小滴分配单元，其中所述微流体系统被配置成使所述靶标位置与在所述第一检测器中检测的所述一个或多个靶标实体的所述性质相关联。
从而可以将小滴分配至微量滴定板的单个孔中，或者分配至另一种介质上。因为可以基于在第一检测器中的检测来分配小滴，在特定靶标位置 (其可以例如是微量滴定板的孔)处的小滴可以与小滴整体和/或其成分(如果存在的话)的性质相关。这些性质可以是，但不限于荧光水平、散射发光水平、吸光度水平、电导率水平、和其他化学和/或物理性质中的一个或多个。
因此，例如，根据本发明的这个和其他方面二者，我们描述的方法/ 系统的实施方案可以用于确定哪个小滴/储蓄器(例如多孔板的哪个孔)具有那种性质。其可以稍后用于鉴别、并且更具体能够提供以特定方式对应于微流体系统进行的任何测定或试验的细胞或生物实体的样品。(因为具有鉴别的性质的靶标实体/小滴容纳在鉴别的孔内，并且因为在实施方案中，保持将哪个小滴/细胞/实体分配至哪个储蓄器/孔的日志记录)。
备选地，可以将分选并且分析的小滴分配至单一储蓄器中。
可以优选在关于做出可以将小滴分配至哪个靶标位置中的决定之前进行小滴和/或其成分的一个或多个进一步分析。
因此，在优选的实施方案中，所述微流体系统还包括用于检测所述一个或多个靶标实体的所述性质的第二检测器，其中所述小滴分配单元进一步被配置成使所述靶标位置与在所述第二检测器中检测的所述一个或多个靶标实体的所述性质相关联。
这些一个或多个进一步分析从而可以增加例如鉴别在小滴中的一个或多个靶标实体，尤其是特定数值数量的靶标实体的概率，和/或鉴别具有特定性质(例如特定的荧光水平，其可以在特定荧光水平范围内)的一个或多个靶标实体的概率。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述小滴分配单元包括用于将所述小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径的第二分选装置，所述第二分选装置包括：用于将所述小滴与所述第一液体流动路径分离的分离器；和用于将所述分离的小滴导向至所述第二液体流动路径的导向器，其中所述导向器包括：被配置成旋转以用于将所述分离的小滴输送至所述第二液体流动路径的旋转单元；和/或被配置成在平移方向上移动以将所述分离的小滴输送至所述第二液体流动路径的平移单元。
第二分选装置可以用于基于先前的分析将目标小滴分离。因此，可以通过从第一液体流动路径中分离小滴来增加分配的小滴的含有在小滴中的一个或多个靶标实体、尤其是特定数值数量的靶标实体和/或具有特定性质的一个或多个靶标实体的概率。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，所述小滴分配单元包括微流体通道连接，所述微流体通道连接包括输入通道和多个输出通道，其中所述小滴分配单元被配置成基于借助所述第一和/或第二检测器的所述检测控制所述小滴被导向至所述多个输出通道中的哪一个。
因此，优选地，可以将非目标的小滴放置到废料中。其他小滴可以根据它们的成分(如果存在的话)的性质进行分选，而基于在第一和/或第二检测器中的之前的分析从微流体系统中分配小滴。
应该理解的是，可以在微流体系统中使用另外一个或多个检测器和/ 或分析仪，并且小滴在微流体系统外的分配可以与在一个或多个检测器和 /或分析仪中的这些进一步分析中的一个或多个相关。
在微流体系统的优选的实施方案中，所述小滴分配单元包括压力调节单元，所述压力调节单元用于改变在所述小滴分配单元的液体流动路径中的压力以用于控制所述小滴被导向至所述多个输出通道中的哪一个。通过改变例如在不同输出通道之间的压力，可以根据之前的小滴的分析或检测将小滴导向至特定输出通道并且从这个输出通道中分配。
备选地或另外地，控制从其中分配小滴的输出通道可以通过下列各项中的一个或多个进行控制：使用加热器控制小滴的温度，使用压电电极，使用声音驱动器，以及利用小滴的其他物理和/或机械性质。
在微流体系统的另一个优选的实施方案中，通常在所述输入通道的液体流动路径方向上将第一所述输出通道与所述输入通道连接，其中第二所述输出通道从所述输入通道分支，其中所述小滴分配单元还包括与所述第二输出通道连接的泵，其中所述泵被配置成从所述输入通道中抽取所述小滴，并且其中所述压力调节单元被配置成增加所述输入通道中的压力以响应于所述第一和/或第二检测器中的所述检测以通过所述第一输出通道喷射所述小滴。
一旦已经检测到目标小滴，就可以增加输入通道中的压力，从而将小滴提供至第一输出通道，而不是被泵抽取至第二输出通道中。
应该理解的是，备选地，在输入通道中的压力通常可以高于阈值，从而在没有输入通道中的压力变化的情况下将小滴提供至第一输出通道。一旦已经检测到目标小滴，就可以在降低输入通道中的压力，从而通过泵将靶标小滴抽取至第二输出通道中。
在优选的实施方案中，所述微流体系统还包括一个或多个小滴容纳区域，其中所述容纳区域布置在所述分选装置和所述小滴分配单元之间，并且其中所述容纳区域被配置成控制所述分选的小滴向所述小滴分配单元的流动。这个实施方案允许对到小滴分配单元中的小滴物流的更精确和准确的控制。
在进一步优选的实施方案中，所述微流体系统还包括多个传感器，所述传感器用于在所述微流体系统的不同位置(在不同时间点)检测所述小滴以确定所述小滴在所述微流体系统中的速度，并且其中所述分选装置被配置成根据所述速度确定的结果分选所述小滴。这可以是特别有利的，因为可以确定和/或预测一个或多个小滴在微流体系统中的位置，这允许对在分选装置中分选一个或多个小滴的改善的控制。
在本发明的另一个相关方面中，提供了微流体芯片，所述微流体芯片包括：用于生成含有一个或多个生物实体的微滴的小滴生成区域；用于温育和/或储存所述生物实体的小滴温育器和/或储存区域；用于基于所述生物实体的一个或多个性质分选所述微滴的小滴分选区域；和用于分配所述分选的微滴的小滴分配区域；并且其中所述小滴生成区域、所述小滴温育器和/或储存区域、所述小滴分选区域和所述小滴分配区域被集成在所述微流体芯片的单一芯片设计上。
微流体芯片确保无菌、使用的容易程度并且允许明显的成本节约，因为将生成器、温育器、分选芯片和分配器结合至单一微流体芯片中。
在优选的实施方案中，所述微流体芯片包括用于改变所述微滴在所述区域之间的微流体流动路径的微流体流动路径转向单元；和包括用于控制所述微流体流动路径转向单元的第一处理器的控制单元。这可以是优选的，因为可以省略特定部分或多个部分，例如温育区域，从而其可以不用于处理特定的小滴或多个小滴。
可以在微流体芯片上提供多个阀，其允许控制微滴通过微流体芯片的不同区域的流动或流速。
在优选的实施方案中，所述微流体芯片还包括用于在所述小滴温育器和/或储存区域(和/或在其他特定区域)局部加热小滴的加热器，并且还包括用于控制所述加热器的第二处理器。第一和第二处理器可以是单一处理器。实施方案因此可以有利地允许仅在微流体芯片的特定位置或区域加热小滴以及其成分，从而可以避免在微流体芯片的其他区域加热小滴。
在进一步优选的实施方案中，所述微流体芯片还包括用于在所述小滴温育器和/或储存区域(和/或其他特定区域)局部冷却小滴的冷却器，并且还包括用于控制所述冷却器的第三处理器。第一、第二和/或第三处理器可以是单一处理器。实施方案因此可以有利地允许仅在微流体芯片的特定位置或区域冷却小滴以及其成分，从而可以避免在微流体芯片的其他区域冷却小滴。
可以提供加热(和任选的冷却)的实施方案可以允许例如在微流体芯片的一个或多个特定区域进行聚合酶链式反应。
应该理解的是，关于微流体系统、小滴分选或分配装置、小滴分配器、微流体装置、微流体筒、微滴处理系统和用于生物实体的基于微滴的处理的仪器的上述优选实施方案也可以作为在微流体芯片中的优选实施方案实施。
多模式运行
在另一方面中，本发明提供用于生物实体的基于微流体小滴的处理的仪器，所述仪器包括：用于生成包含生物实体的小滴的一种或多种油包水乳液的小滴生成系统；用于处理所述小滴的小滴处理系统；和用于将被处理的所述小滴分配至一个或多个储蓄器中的小滴分配系统；其中所述小滴处理系统可被配置用于多种不同运行模式，所述运行模式至少包括单克隆运行模式和测定运行模式。
在实施方案中，所述小滴处理系统至少包括小滴分选功能/单元并且所述单克隆运行模式包括基于所述所述生物实体对小滴的占有来分选小滴。测定运行模式包括在分选之前温育小滴，但是优选并非必需在小滴温育单元中。分选之后可以基于在温育期间生物实体的产物。所述小滴处理系统还可以包括至少一个小滴融合单元并且所述运行模式之后可以包括融合测定模式，基于一组小滴中的生物实体与第二组小滴中的物质例如其他生物实体的组合的结果进行分选。在实施方案中，所述小滴处理系统以一个或多个可互换的或模块化的筒实施，——即例如，可以为不同运行模式中的每一个提供不同的筒，或者备选地，可以采用模块化的筒，其中可以在筒基板上选择性地组装不同的小滴处理功能，如分选功能、温育功能、分配功能等。
更详细地，单克隆运行模式可以包括优选以偏向大多数空小滴的方式将小滴内的生物实体(通常是细胞)胶囊化。将之后在分选单元中鉴别为被单一细胞占据的那些小滴选择性地引导至小滴分配单元，在那里将它们处理并且分配。在实施方案中，可以将单一小滴分配至单个孔或储蓄器中，但是将两个以上小滴分配至储蓄器或孔中也可以是可接受的。例如，如果将要再注入实体或细胞以用于进一步处理，则孔/储蓄器可以容纳更大数量的小滴。
在测定模式中，将每个小滴中多于一个实体/细胞，例如每个小滴中两个或三个细胞胶囊化可以是可接受的。在实施方案中，之后将这些提供至温育腔室，在那里它们被温热并且代谢以产生产物如蛋白质等。通常，产物与小滴内的一种或多种试剂相互作用，形成可测量的信号，例如荧光信号，并且其之后可以用于分选小滴，例如从而收集和分配最佳生产者。任选地，可以在温育区域之前提供分选单元，尤其用于在温育之前移除空小滴。这有助于减小温育腔室的体积并且在小滴生成/实体胶囊化得到大百分比的空小滴的情况下是特别有利的——根据所使用的过程，90％以上的小滴可能是空的。
在可以被称为稳定性测定模式的另一种测定模式中，可以采用类似的温育、选择和分配过程，但是目的是鉴别初始群体的子组。这样的子组可以是展现出最佳产量(通常是蛋白质的产量)的子组，例如用于药物制造。最佳产量并非必需是最高产量，但是可以是例如一致的产量(随时间保持不变而不是随时间降低的产量)，或在(宽)范围的环境条件下保持不变的产量。因此，可以采用这样的稳定性测定的实施方案鉴别作为稳定生产者的那些实体，例如从而选择用于生产过程如发酵过程或用于生产过程的质量控制的生产者。在实施方案中，可以用在小滴内的一种或多种试剂将实体胶囊化并且之后温育，之后寻找可测量的信号，如荧光信号，其之后可以用于区分实体的靶标亚群以用于在一个或多个储蓄器中分配和收集。
在另外的方面中，在融合运行模式中，典型过程包括生成两个组小滴，至少一个将生物实体胶囊化；这些可以事先生成并且设置在相应储蓄器中或者可以例如在筒上生成。融合测定之后可以包括小滴融合、温育、分选、和分配。任选地，可以如之前描述的在温育之前和/或在小滴融合之后采用预分选。可以采用融合测定，例如用于毒理学研究、环境研究、宏基因组学(metagenomic)研究、药物吸收研究等。例如，在后一种情况中，可以以已知浓度提供一组微滴并且之后可以在温育后测量药物的浓度(远程或通过选取等分试样)，以确定可以根据其推断药物吸收的药物的浓度变化。
对于上述运行模式中的每一个来说，在实施方案中，分配单元还可以提供额外的选择步骤——即小滴分配系统可以包括组合的小滴分选和分配台。
附图简述
现在将仅通过实例的方式，参照附图，进一步描述本发明的这些和其他方面，其中：
图1示出了根据本发明的实施方案的小滴检测、分选和分配的示意图；
图2示出了根据本发明的实施方案的小滴检测、分选和分配的另一个实例的示意图；
图3示出了根据本发明的实施方案的小滴检测、分选和分配的另一个实例的示意图；
图4a和b示出了根据本发明的实施方案的微流体筒的示意图；
图5a和5b示出了根据本发明的实施方案的分离器和控制单元的示意图；
图6示出了根据本发明的实施方案的液体流动和分离器的示意图；
图7a-7c示出了根据本发明的实施方案的分离器的示意图；
图8示出了根据本发明的实施方案的分配器的示意图；
图9示出了用于在本发明的实施方案中使用的实例小滴生成和分选系统；
图10a和10b示出了根据本发明的实施方案的另外的微流体筒的视图；
图11a至11d示出了根据本发明的实施方案的用于控制小滴处理系统的实例控制系统；
图12示出了根据本发明的实施方案的小滴处理系统的实例物理构造；
图13示出了用于细胞分析的各个阶段的示意图；
图14a和14b示出了确定小滴的内容物的方法的示意图；
图15示出了在皮升小滴中借助杂交瘤的单克隆抗体分泌；
图16a至16d示出了中国仓鼠卵巢细胞的群体；
图17示出了针对不同皮升小滴尺寸的相对于培养时间的存活CHO-S 细胞的百分比；
图18a和b分别示出了根据本发明的实施方案的控制系统的微流体芯片和示意性框图；
图19a-c示出了使用本发明的实施方案的皮升小滴中单一细胞的检测；并且
图20a-c示出了来自皮升小滴的红色和绿色荧光的散点图的时间进程。
优选实施方案详述
图1示出了根据在本文中所述的实施方案的小滴检测、分选和分配的第一实例的示意图。在这个实例中，这个模式被称为单克隆确定性模式。
在这个实例中，在任选包括生长培养基的液体(在这个实例中是水)中提供多个细胞。在第一步中，由液体形成单个小滴。如以上概述的，这可以通过使用例如T连接、Y连接、流动汇聚装置、或其他装置实现。在这个实例中，在油的液体中输送已经生成的小滴。
之后在油乳液中通过微流体装置导向可以含有或可以不含有一个或多个细胞的单个小滴。
在这个实例中，将皮升小滴细胞悬浮液，即在油乳液中的小滴导向至检测和分选装置。基于小滴的电、光、热、声、机械、时间、空间、和其他物理特征中的一个或多个，可以在分析仪中检测单一小滴是否含有一个或多个细胞。基于在分析仪中的分析，即关于单一小滴单一小滴是否含有一个或多个靶标细胞的确定，可以在小滴分选装置中分选小滴。在这个实例中，将不含有一个或多个细胞的皮升小滴放置到废料中。此外，在这个实例中，将含有单一目标细胞的小滴导向至微流体系统的分离器。
之后从第一液体流动路径中提取含有一个或多个目标细胞的小滴并且转移至第二液体流动路径中。在这个实例中，在生长培养基液体中从第一液体流动路径中提取靶标小滴。之后将其中将小滴结合在生长培养基液体中的含有靶标细胞的小滴通过加压液体喷射分配至微量滴定板中。在这个实例中，压力源与注入生长培养基液体的流动路径连接。从而可以将皮升小滴稀释。在这个实例中提供自动化xy平移台(translational stage)从而将小滴分配至微量滴定板的不同的孔中。
在这个实例中，在温控环境中进行小滴检测、分选和细胞分配。
在这个实例中，将含有单一细胞并且不放置到微量滴定板中的皮升小滴在第一液体流动路径中导向至废料。
如以上概述的，找到放置到微量滴定板中的单一小滴中的单一细胞的概率可以高于99.997％。
在图1的实例中，可以提供自动化板叠层器界面，从而在彼此顶部上叠层多个微量滴定板。
在图1的系统以及类似的稍后描述的系统的一些优选的实施方案中，在将小滴分配(至微量滴定板中)的点处或附近设置成像装置如相机。成像装置可以用于使小滴成像以确定小滴是否仅含有单一细胞(或其他生物实体)，或备选地两个以上细胞，或不含细胞。在其他方法中，可以出于这种目的检测从小滴的散射的光学检测。之后可以使用这样的光学系统作为监测单克隆的工具，更尤其是与控制系统结合以当孔不仅含有单一细胞(或反之亦然)时进行鉴别和记录，例如从而系统之后可以标记针对鉴别的孔的误差。
图2示出了根据在本文中所述的实施方案的小滴检测、分选和分配的另一个实例的示意图。示出了两种不同的运行模式，引导测定模式以及稳定性试验模式。
在这个实例中，在液体中提供细胞以及测定试剂。如在图1中所示的实例中概述的，之后由液体形成单个小滴。
之后将已经由含有细胞和测定试剂的液体制备的小滴导向至温育器中。温育器可以用于培育和/或维持在小滴中的细胞。如以上概述的，温育器可以包括允许在温育期间对细胞进行稳定性试验的稳定性试验单元。对单一小滴中的细胞进行稳定性试验允许在分析仪和小滴分选装置中的检测和分选步骤期间仅分选在稳定性试验期间未降解或死亡的存活细胞。
如针对图1的示意图概述的，进行确定小滴的内容物、基于所述确定分选小滴、和在分离器中可能的目标小滴的提取的另外步骤。
图3示出了根据在本文中所述的实施方案的小滴检测、分选和分配的另一个实例的示意图。在这个实例中，这个模式被称为皮升小滴融合测定模式。
在这个实例中，说明了皮升小滴融合测定模式。在第一液体中提供第一细胞类型A。之后由这个第一液体形成单个小滴。在第二液体中提供第二细胞类型B，由其形成单个小滴。将已经由第一液体制备的小滴以及已经由第二液体制备的小滴导向至融合装置(在图3中的电极)。在这个实例中，通过电聚结制备分别来自第一和第二液体的两个小滴。如在图1和/ 或图2的示意图中所示，之后可以进一步处理融合的小滴。
如以上概述的，可以将小滴融合装置在微流体系统的液体流动方向上放置在例如分析仪和小滴分选装置后。在这个实例中，这样的构造可以允许仅对已经确定含有目标细胞的小滴使小滴在小滴融合装置中融合，以用于生长和/或进一步分析和处理。
现在参照图4a，其示出了结合根据本发明的实施方案的(一次性)微流体筒410的微滴处理系统/仪器400的实施方案的框图。仪器400具有储蓄器402，其容纳水性培养基，通常包括生长培养基，在其中容纳生物实体如哺乳动物细胞、细菌等以用于处理。一组储蓄器404a-d容纳油以用于在系统的多个阶段提供乳液。尽管示出了储蓄器402、404作为仪器的一部分而不是筒的一部分，在其他实施方案中(如在稍后的图10a中所示)，它们可以是筒的一部分；取决于筒功能，例如其是否用于融合或功能性测定，可以存在多于一个水性储蓄器402。通过在图4a中以液体驱动模块406(其可以再次与筒集成)示出的相应泵泵送来自储蓄器402、404的液体。如稍后参照图12也示出的，当将筒插入至仪器中时，一组液体流动管线408 与筒上的相应端口连接。
示出的筒410包括小滴生成区域412、小滴温育/储存区域414、小滴分选区域416、流动缓冲区域418、和小滴分配器区域420。在筒的实施方案中，这些区域中的每一个是模块化的，并且通过选择与筒基底或保持器连接的模块从而选择的模块彼此连接以发挥特定筒所需的功能，可以选择乳液流处理构造。
在图4a中，较小的圆形区域表示小滴处理区域的入口/出口端口，根据筒构造，其可以表示在筒上或在筒外的连接；较大的圆形区域表示光学小滴感测区域，并且划叉的圆形表示阀。
在实施方案中，筒的小滴生成模块或区域412包括用于生成乳液的水性样品入口422和油入口424。将这些液体的物流提供至流动汇聚连接 426，在那里生成乳液并且将其提供至该区域的输出通道428。通过举例，为了提供一些说明性的数字，生成油可以具有1400μl/小时的流速，样品例如细胞悬浮液可以具有1000μl/小时的流速，并且在输出通道中的油包水乳液可以具有包含在1000Hz的700皮升小滴的2400μl/小时的流速。
在这个实例中，之后将乳液(可以备选地在筒外形成并且加入至储蓄器中)提供至温育/储存区域414。这包括储存腔室430，其中单个小滴432向上漂浮而过量的油通过通道434(经由阀)流动至废料，进入储蓄器(或容器)436中，油可能可以从其中再循环。在实施方案中，油包括氟油，其特别适用于捕获氧，氧允许例如在储存在腔室430中时在小滴中的例如生物实体，如细胞的提高的生长。因此可以用高于阈值的氟油填充腔室430(例如腔室430的体积的50％、或更高)，从而可以在特定时间段内向小滴中的实体提供足够的氧。在实施方案中，筒位于其中的仪器包括加热装置如加热板和/或与温育腔室430相邻的冷却装置如珀耳帖(Peltier)效应装置，优选连同用于温度控制的温度传感器。以这种方式，可以在受控的时间段内加热腔室以温育小滴的内容物并且之后冷却以基本上抑制温育。温育腔室具有出口通道438以及任选的侧通道(或端口)440以在接收间隔油，所述间隔油用于在将小滴从腔室430向外供给时间隔在出口中的乳液中的小滴。继续之前的数值实例，可以在0.22ml的体积中储存大约200,000个小滴，并且在大约2.2ml的体积中略低于2,000,000百万个小滴(假定67％填充)，并且因此大约2.2ml的油可以流向废料(因为小滴置换了之前填充腔室的油)。来自温育区域的输出通道438可以具有大约350μl/小时的流速；可以在侧通道440处或在随后的分选区域中(参见以下)以大约8,000-11,000 μl/小时的速率加入间隔油。
分选区域416具有在这个实施方案中与温育区域的输出通道438连接的输入通道，以及一对输出通道444、446，所述通道444含有具有其负载量的选择的、靶标分析物(一个或多个实体)的所需小滴。通道446通向废料储蓄器436。任选地，提供入口448以用于将间隔油加入至到分选区域中的物流中。分选区域包括区域450，在其中通过容纳筒的仪器(通过光学方式)查询小滴内容物，所述仪器之后驱动电极452以将小滴选择性地引导至通道444或通道446中(为了简单，在图4a中未示出与电极452的连接)。继续之前的数值实例，用于分选区域416的输入乳液中的小滴的标间比 (mark:space ratio)可以是大约1:10至1:20并且小滴可以以约100Hz的速率进入分选区域。在通道444中的流速可以是大约5,000μl/小时，含有1,000 至10,00个小滴；在通道446中的乳液的流速可以是基本上相同的，但是这种乳液可以包含大约190,000-2,000,000个小滴(每小时)。
分选区域的“靶标”输出通道444与间隔/容纳或“流动缓冲”区域418的输入通道454连接。这包括腔室456，通常稍微小于温育腔室430，在其中小滴在释放至输出通道458中之前被临时容纳(例如漂浮在腔室的顶部)。在实施方案中，油包括氟油，其特别适用于捕获氧，氧允许例如在储存在腔室456中时在小滴中的例如生物实体，如细胞的提高的生长。因此可以用高于阈值的氟油填充腔室456(例如腔室456的体积的50％、或更高)，从而可以在特定时间段内向小滴中的实体提供足够的氧。通过经由输入通道460加入间隔油，有利于从腔室456中的释放。以与温育区域类似的方式，流动缓冲区域还包括到废料储蓄器436的输出通道462。通过数值实例的方式，10ml体积的腔室456可以容纳10,000个小滴。在通道458中的输出流速可以是大约4μl/小时；在通道460中的间隔油可以以大约 5,000μl/小时流动；在通道462中的废料可以以例如10-5,000μl/小时的可变速率流动。
在示出的实施方案中，流动缓冲区域418输出通道458提供了经由通道464向小滴分配器区域(或分配器)420的输入口。在示出的实施方案中，分配器通道466提供了向运送洗脱剂(即用来/用于提取和喷射靶标小滴的油)的分配器的第二输入口。
分配器具有再次向废料流动的第一输出通道(或废料通道)468，以及为用于喷射选择的小滴以收集在储蓄器中的分配器提供出口472的第二输出通道470。另一个通道476与入口478连接，在这个实例中，以接收在例如0-2.5巴范围内的压力下的压缩空气。以这种方式，可以向在输出通道 470中流动的乳液施加压力脉冲(在关闭阀477之后)以喷射含有选择的靶标小滴482的乳液弹480以收集在多孔储蓄器484的孔中。在示出的实施方案中，分配器区域420具有旋转阀474，其可以用于将小滴选择性地引导至与分配器输出通道470连接的液体物流中或与第一输出通道468连接的液体物流中。
任选地，分配器区域420可以包括用于486的一个或多个小滴感测区域。这些可以用于鉴别小滴在何时存在于物流中并且用于控制小滴喷射的时机，从而因此喷射乳液弹480。另外地或备选地，可以采用这些观察区域中的一个或多个感测靶标小滴的内容物，并且在实施方案中，这种感测可以用于将进一步的选择水平应用于喷射的小滴，例如以提供小滴482的内容物的单克隆的进一步保证或者提供对小滴内容物或小滴482内实体的数量或数值范围的更进一步的选择性。
在实施方案中，多孔板484可以包括多个孔488，在其中可以任选提供水性(生长)培养基490。在实施方案中，例如，通过X-Y台(未示出)使多孔板484移动，从而每个孔仅容纳一个仅含有单一小滴的乳液弹。此外，在实施方案中，控制图4a的系统的仪器感测在分选器(或如果小滴在其通过缓冲区域期间不容易被追踪，则稍后在分配器中)中的小滴，更尤其是小滴的内容物的性质。因此，可以生成并且储存限定在其相应孔中的每个小滴的一个或多个性质(例如，其荧光等)的日志。以这种方式，可以选择具有一个或多个目标性质的数个或单独一个实体以用于进一步研究或使用，例如用于分析、抗体生成、发酵等。
例如，可以在微滴处理系统/仪器400的区域414、416和420中采用多个传感器，其允许小滴的检测。这些传感器可以是光传感器和/或电传感器。电传感器可以利用这样的事实：如果小滴中的细胞是存在的，绝缘的细胞对小滴的电学性质有影响，从而电容测量允许检测储存细胞的小滴是否存在。使用电容测量，还可以确定小滴的尺寸。技术人员将会熟知用于检测小滴和/或小滴成分的备选方法。
传感器可以用于对小滴计数，并且通过按顺序提供多个传感器，可以确定流经处理系统/仪器的小滴的速度。这允许例如在适当时间启动小滴的分选。这可以使得小滴处理系统或微流体芯片更高效，因为可能仅在特定时间需要激活允许小滴分选的单元。
在一些实例中，在流动方向上在分选连接之后提供另一个传感器。另一个传感器可以用于通过将利用另一个传感器的小滴的检测与来自分选连接上游的传感器的检测数据进行比较并且基于确定的速度数据来复查是否已经将小滴分选至正确的流动路径/通道中。如果小滴尚未被正确分选，可以通过在多个流动路径/通道之间进一步分选稍前的分选的小滴而在分选连接的下游采取进一步行动。
现在参照图4b，其示出了微滴处理系统/仪器400’的另一个实施方案，其中与之前描述的那些相似的元件以相似的附图标记表示。图4b的布置可以部分或甚至完全独立于例如在仪器内的被连接的模块上的之前描述的筒实施。图4b的布置的一个优选实施方案是作为“半模块化”筒，其具有在板外的小滴生成和在板外的小滴分选，但是在板上的小滴温育/储存和分配。如之前所述的，划叉的圆形表示阀；在图4b的变体中，示出了两个流动缓冲区域。技术人员将会理解的是，可以根据要求组装具有不同功能的多个不同系统。
现在将参照图4b描述在仪器的优选实施方案中使用的一些光学系统；相似的光学系统可以与图4a的布置一起使用，并且应该理解的是，取决于应用，将会并非需要全部可描述的系统。因此，在图4b的布置中，光学系统使用第一光学感测区域491以用于确定小滴的尺寸；第二光学感测区域492用于光学诊断目的。第三光学感测区域493用于光学细胞检测和分选(例如通过使小滴内的细胞成像)，并且第四光学感测区域494可以用于分选后诊断。光学感测区域495可以类似地用于诊断目的，光学感测区域496可以用于计时目的(例如确定到分配器的小滴位置/速度/时间)，并且小滴光学感测区域497可以用于小滴内容物(细胞)检测，例如用于(选择性) 分配。在图4b的仪器中的分配区域420’可以包括以下参照图8描述的类型的分配器。
图5a示出了根据在本文中所述的实施方案的分离器510的示意图，其中可以通过将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径(通道) 504中而从第一液体流动路径(通道)502中提取小滴。
在这个实例中，将在第一通道502中在油包水乳液中的单个小滴导向至分离器。一旦目标小滴进入分离器，就可以使分离器的旋转单元506旋转，从而将目标小滴从第一通道转移至装置的第二通道504。在第二通道中流动的油之后可以将小滴导向至第二通道的出口508。一旦小滴在装置的第二通道504中，其就与第一通道分离并且之后优选向第二通道施加压力以从出口508中喷射选择的小滴。
例如，可以在微流体芯片上使用分离器，以分离一定体积的含有皮升小滴的液体(乳液弹)或其他目标体积(例如细胞、细菌等)，并且将该体积的液体从第一液体流动路径平移至第二液体流动路径，随后可以从其中将小滴从微流体芯片上分配下来。
在这个实例中，具有旋转单元的分离器允许液体体积的准确捕获和分离，而不大幅干扰在微流体通道网络内的第一液体流动路径。分离器进一步允许在芯片外的分配机构的分离，确保分离的液体体积从芯片准确且快速离开。在这个实例中，分离器的旋转单元可以以高达5Hz以上的速率运行(在实施方案中，受微量滴定板的步动(step movement)速率限制)。
如在图5a中示出的分离器可以形成小滴分配器的一部分。如示出的，在一种方法中，可以将选择用于喷射的小滴从通道502转移至通道504并且之后向通道504压力如空气压力以喷射小滴(在乳液弹中)。如果不是需要/不喷射小滴，可以将其在通向废料的通道502中静置。备选地，通道 504可以通向废料并且不需要的小滴从通道502转移至通道504；之后可以再次通过空气压力等将用于喷射的小滴从通道502的开口喷射。
图5b示出了用于分离器的实例控制单元的框图。在这个实例中，控制单元500包括检测器514，其可以用于检测小滴的内容物及其物理性质。检测器514以及控制单元500的其他单元通过总线516彼此连接。
处理器518被配置成处理从检测器514得到的信号。在控制单元500 中提供操作系统/软件520，其可以应用于在处理器518中处理并且通过检测器514得到的信号，从而在这个实例中确定在小滴中的细胞的成分及其物理性质。操作系统/软件520可以储存在存储器512中。
根据从检测器514提供至处理器518的信号的结果，可以将信号提供至分离器510。在这个实例中，这个信号用于控制分离器510的旋转单元，从而将小滴维持在第一液体流动路径中，或者将小滴从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径。
例如，关于被分析的小滴的成分的任何信息，已经从第一液体流动路径转移至第二液体流动路径的小滴的数量，以及其他信息可以储存在可以集成至存储器512的存储器中。
图6示出了根据在本文中所述的实施方案的实例液体流动和分离器的示意图。如可以看到的，在可以储存在例如微流体装置上的容器中的液体中提供目标样品。可以由通常如以上概述的液体的制备皮升小滴。在这个实例中，为洗脱剂和稀释剂提供另外的容器。油储蓄器可以允许油物流将含有一个或多个实体的水滴导向通过装置。
在这个实例中，洗脱剂容器、稀释剂(油)容器和样品液体容器中的每一个通过微流体通道与分离器的不同输入口连接。一旦小滴进入在输入口处的分离器，在这个实例中，就可以将小滴通过分离器通道网络导向至旋转单元。之后可以通过使旋转单元旋转将小滴从一个通道转移至另一个通道。
在这个实例中，使用旋转螺线管从而使旋转单元旋转。如以上针对图 5b概述的，可以控制旋转单元。
一旦已经确定小滴离开在特定输出处的分离器，就可以将小滴从分离器或微流体装置或芯片分配。在这个实例中，提供xy台从而将在xy平面中的所需位置处的小滴分配至例如微量滴定板或其他形式中。此外，可以提供气动流动限制器从而更精确地控制流速以用于从装置分配小滴。在这个实例中，热电偶与分离器的输出口和气动流动限制器之间的通道连接。可以在分离器的输出口处提供一个或多个喷嘴。在这个实例中，提供额外的快速螺线管阀以用于控制小滴的分配。
在图6的实例装置中，提供高压单元，其允许通过加压液体喷射从装置分配小滴。在这个实例中，高压单元包括压缩气体容器、用于调节通道网络中的压力的多个压力调节器、和将压缩气体容器和调节器与压力传感器连接的T连接。应该理解的是，备选构造可以允许控制在通道网络中的压力从而通过加压液体喷射喷射小滴。
在这个实例中，废料容器与小滴分选装置的出口连接。可以将含有非目标实体或不含实体的小滴放置到废料中。
应该理解的是，在图6中所示的分离器的入口中的任何一个都可以用作出口，并且反之亦然。
图7示出了根据在本文中所述的实施方案的分离器的示意图。
图7a示出了实例分离器的示意性顶视图。如可以看到的，在分离器上提供多个入口。入口通过通道与分离器的旋转单元连接。旋转单元通过通道网络与分离器的出口进一步连接，在所述出口处可以将小滴从装置中分配。
图7b示出了分离器的旋转单元的示意性侧视图。应该理解的是，旋转单元的尺寸仅是示例性的。旋转单元可以包括开口(图7b中的D)，小滴可以在这里进入和/或离开旋转单元。
图7c示出了具有旋转单元的分离器的示意性透视图。在这个实例中，提供了四个入口和一个出口。然而，如以上概述的，根据装置的具体要求，入口中的每一个也都可以用作出口，并且出口可以等同地用作入口。
现在参照图8，其示出了小滴分配器800的实例实施方案。其包括输入通道802和第一和第二输出通道804、806，以及共有通道(流)部分808。通道804在出口处设置有喷嘴810以用于分配包含小滴814的乳液弹812。在实施方案中，通道806在抽取下通向废料。分配器还具有用于加压空气供应的空气入口。输入通道802容纳以一定间隔具有小滴820的油进料818。输入通道802设置有进料阀822；废料输出通道806设置有截止阀 824，并且空气供应入口设置有空气阀826。在示出的实例中，区域828 限定光学小滴检测区域。在空气入口和通道806之间的间距分离830，限定了两个输出通道804、806之间的共有流动路径的长度，限定了喷射的乳液弹812的长度。
当不具有小滴的油或具有不需要的小滴的油经过分配器时，进料阀 822打开并且截止阀824打开，从而入口液体物流沿着共有通道区域808 通过并且通过通道806向下抽取至废料中。当在通道808中检测到用于分配的小滴时，将阀822和824关闭并且将空气阀826打开以将含有小滴814 的乳液弹812从通道808沿着输出通道804通过喷嘴(或喷嘴插入物)810 喷射出来。当预测在通道808中存在用于分配的小滴时，在上游进行小滴检测的系统中，可以实施相应的过程。
在实施方案中，喷嘴可以成形从而干扰乳液弹、更尤其是小滴，和/ 或可以设置有用于类似目的的网，从而当将块/小滴分配至含有水性培养基的孔中时，将小滴内容物释放至孔的水性培养基中而不是漂浮在顶部上。任选地，喷嘴810可以配备有用于类似目的的其他工具，例如用于生成电场的一个或多个电极；和/或用于运送脱乳化试剂的额外通道。
可以任选提供速率控制单元从而控制流入小滴分配器800中的小滴的速率。速率控制单元可以与在小滴分配器800前的容纳腔室连接，这允许以限定速率将小滴进料至小滴分配器。
在一些实施方案中，与通道804相比，通道806较宽，从而产生小滴向废料通道806的偏向。在这样的实施方案中这可以是特别有用的：以竖直取向采用其中结合小滴分配器800的微流体系统或芯片，其中水性小滴倾向于流动至系统或芯片的顶部。在其中竖直采用系统或微流体芯片的实施方案中，因此优选将通道806布置在小滴分配器800的顶侧。
图9示出了用于在本发明的实施方案中使用的实例小滴生成和分选系统。因此，图9示出了可以在筒上实施以发挥之前描述的小滴生成和分选功能的系统的实例。例如，如针对图14a和14b概述的，一旦已经分析了小滴的成分(如果存在的话)，就可以基于这个分析来分选小滴。在这个实例中，通过使用电极(插图中以黑色示出)施加电场。在这个实例中，小滴分选基于小滴的偶极矩，其中小滴根据其成分经历不同的电场力。
图10a示出了根据本发明的实施方案的小滴处理筒1000的透视图，其中样品/油储蓄器构建至筒中。如示出的，筒包括用于驱动筒的阀的区域 1002、用于分选区域的电连接1004、和分配喷嘴1006(在示出的透视图中隐藏)。
图10b示出了从根据本发明的实施方案的模块化筒1050上方的视图。示出的模块化实施方案包括小滴生成模块1052、小滴温育/储存模块1054、小滴分选模块1056、小滴/容纳(流动缓冲)区域1058、和小滴分配区域1060。示意图还示出了在模块之间的在筒上的通道(或连接)1062(“集流管通道”)，以及实例阀1064的位置和基准定位销1066。在实施方案中，通道 1062限定在在其上设置垫圈的筒的基底板中，并且之后通过在垫圈上连接单独的板来实施模块化小滴处理区域1052-1060，其优选通过基准销1066 定位。
现在参照图11，其示出了根据本发明的实施方案的用于微滴处理仪器的控制系统的多个方面。如以下进一步描述的，控制系统可以在设置有多个传感器和驱动器的通用或专用计算机上实施。
因此，参照图11a，其示出了小滴生成控制系统1100，其包括与用于样品1104和油1106的传感器连接并且控制用于控制乳液生成的阀1108 的控制计算机系统1102。控制器1102还与作为具有板上处理的相机的智能相机1110连接。然而，将会理解的是，备选地，在相机中所示的处理可以通过控制器1102实施，并且反之亦然，原则上可以在相机1110上发挥控制器1102的功能。智能相机包括图像捕获系统1112，其控制照明1114，例如发光二极管(LED)照明。图像捕获模块1112还包括捕获图像的相机(未示出)。被捕获的图像通过小滴尺寸控制程序1116处理，其实施控制回路 1118以控制用于控制样品和油的流速的泵1120、1122并且控制乳液形成。
图11b示出了温度控制系统1130，在这个实例中使用相同的控制器1102，在这个实例中与PID(比例积分微分(proportion-integral-derivative)) 控制器1132连接。这可以实施各自包括温度传感器1134和温度控制装置例如加热器(未示出)和/或冷却装置如珀耳帖效应装置1136的一个或多个控制回路。任选地，还可以实施其他传感器/控制。
在一些实施方案中，可以提供加热/冷却单元，其允许将整个系统或微流体芯片加热和冷却。可以在特定区域中局部进行加热和冷却，例如仅在微流体芯片的特定区域中。例如，可以在系统或微流体芯片的温育器处提供加热和冷却。在一些实施方案中，将系统或微流体芯片的温度设定为 8-10℃。之后可以例如在温育器中使用加热/冷却单元将温度增加至37℃，并且可以随后将温度降低回到8-10℃，从而例如使在小滴中储存的细胞或其他实体中的任何生物活动停止。在本文中所述的实施方案因此可以允许生物实体的聚合酶链式反应(PCR)，其通常由重复加热和冷却循环组成。然后可以在一个或多个加热/冷却周期之后分选小滴。
图11c示出了小滴分选控制系统1140，其还包括智能相机1142(尽管同样可以备选地使用非智能相机)。在示出的实例中，分选系统包括小滴闪光照明装置1144、用于细胞检测的光电倍增管1146、和任选的用于细胞检测确认的另一个成像装置1148，其优选在细胞检测算法1150的控制下运行。分选控制系统还包括信号生成器1152和任选的放大器1154，以为前面描述的分选电极提供控制信号。
图11d示出了小滴分配控制系统1160，在示出的实例中包括通过控制器1102进行处理的另一个智能相机1162(尽管同样地，其可以是非智能相机)。在示出的实例中，相机1162控制小滴照明，尤其是闪光装置1164，并且实施来自成像装置(未示出)的图像捕获程序1166以使用细胞检测算法1168检测小滴内容物，例如细胞。控制程序1170控制压缩空气1172 的来源，任选地是阀1174(如图4a的阀477)和容纳多孔板484的X-Y台 1176。
图12示出了小滴处理仪器1200的实例物理构造，其中与之前描述的那些相似的元件以相似的附图标记表示。图12示出了分别用于小滴生成、分选和分配的智能相机1202、1204、1206的位置。这些具有在LED控制器1208控制下的相应的(LED)照明1114、1144、1164。系统还示出了筒 410和用于筒的温育器的加热器板1210，以及用于小滴生成和温育的阀驱动器1212。多孔板484安装在X-Y台1214上。图12进一步示出了样品储蓄器402和油储蓄器和泵404a-d，以提供用于小滴生成、分选、间隔和分配的油。仪器还包括供应这些储蓄器的内部油容器1216，以及废料油储蓄器436。仪器包括之前描述的控制系统，以及用户界面1218。
图13示出了用于细胞分析的各个阶段的示意图：在阶段A、B和D 中实施本领域技术人员已知的装置和方法。在阶段A中根据标准技术选择和制备抗原。在这个实例中，可以在阶段B中进行B细胞的免疫和分离，从而得到根据在本文中所述的实施方案的含有待分选和/或分析的细胞的液体。在阶段C，可以使用在本文中所述的装置和方法的实施方案在单一小滴中得到单一细胞。可以提供在单一皮升小滴中的存活细胞，可以在阶段D中基于此进行进一步实验，在这个实例中是转录组学和测序实验。
图14a和14b示出了确定小滴的内容物的方法的示意图。在这个实例中，在皮升小滴中提供两种荧光染料，AF647和AF488。在这个实例中，当在皮升小滴中存在杂交瘤细胞时，杂交瘤的产物，如蛋白质或抗体可以与AF647和AF488荧光染料(其每一个具有与杂交瘤产物的不同的相应部分结合的相关抗体)中的每一个结合。结合从而允许在AF647和AF488荧光染料之间发生荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer,FRET)，导致荧光改变。因此，如果发生相互作用，则产生信号，在这个实例中是光信号，允许生物实体(在这个实例中是细胞)的产物的选择性检测。
图14b示出了在这个实例中基于皮升小滴中一个或多个杂交瘤细胞的存在的荧光检测。一旦检测到高于阈值的信号，就在皮升小滴中鉴别了杂交瘤细胞。在这个实例中，大约0.5V的背景归因于提供至分析仪的空皮升小滴。因此，在这个实例中，可以收集得到高于大约1.1V的阈值的信号的小滴，以用于进一步分选、和/或分析、和/或生长。根据需要，可以将产生低于这个阈值的信号的小滴放置到废料中。
应该理解的是，可以针对一系列FRET测定并且根据小滴中待检测的一个或多个特定细胞或其他实体优化供体和受体荧光团(fluor)。
例如，可以在如以上概述的小滴分选装置中和/或分离器中使用在图 14a和14b中所示的荧光检测。
图15示出了在皮升小滴中借助杂交瘤的单克隆抗体分泌。测量使用基于FRET的ELISA进行。
图表示出了制备的抗体相对于培养时间段的浓度。深色条柱表示从结合多个细胞的标准试管生长的大批培养物(bulk culture)。红色条柱表示其中在皮升小滴(其体积为大约700pl)中提供单一细胞的样品。在图15中的插图示出了相对于浓度的荧光强度。
如可以看到的，在1小时以上的时间段之后，在从大批培养物生长的培养物和从单一细胞生长的培养物之间，制备的抗体的数量相当——应该理解的是，在皮升小滴中的单一细胞的t＝0的浓度是可忽略的。如以上概述的，可能有利的却是从单一细胞生长细胞培养物，因为这确保了在整个细胞群体中的高的单克隆。这显示出，与从在标准试管中的多个细胞生长的细胞的浓度相比，从根据在本文中所述的实施方案制备的皮升小滴中的细胞生长的细胞的浓度可以一样高或甚至更高，由此对于从单一实体生长的群体来说，实现了较高的单克隆确定性。
图16a至16c示出了中国仓鼠卵巢(CHO-S)细胞的群体的光学图像。在这个实例中，皮升小滴具有大约84μm的平均直径和大约300pl的平均体积。在图16a中，可以在明视场下看到细胞。为了确定细胞是否是存活的，可以提供荧光染料，在这个实例中是DRAQ-7(图16b)。在图16c中示出了合并图像；在图16c中存活细胞显示出绿色荧光。
在图16d中针对多种技术示出了相对于培养时间的存活(即活的) CHO-S细胞的百分比。蓝色条柱示出了对照培养物。绿色条柱表示通过根据在本文中所述的实施方案的皮升小滴制备技术得到的细胞培养物。紫色条柱示出了通过FACS分选的从小滴生长的群体的分析，并且粉色条柱表示使用FACS分选和分配的群体。
如可以看到的，从使用在本文中所述的实施方案制备的样品生长的存活细胞的百分比明显高于通过FACS技术得到的那些。这种结果显示，在皮升小滴中的细胞(或多个细胞)的胶囊化对细胞活力不具有可测量的影响，证实了根据上述实施方案的小滴制备、分选和分配的优点。
图17示出了针对不同皮升小滴尺寸(在这个实例中是300pl、500pl 和700pl)的相对于培养时间的存活CHO-S细胞的百分比。这个分析可以允许确定是否可以降低皮升小滴的尺寸从而增加生成速率。
可以看出，通常对于所研究的全部皮升小滴尺寸来说，存活细胞的百分比是相似的。然而，在特定培养时间例如9小时之后，具有700pl的体积的皮升小滴含有最高的存活细胞的百分比。这是可以预期的，因为较大的小滴体积可以在更长的时间段内为细胞提供营养物质，从而细胞将会生存更长的时间段。
图18a示出了根据在本文中所述的实施方案的微流体芯片180的图像。
微流体芯片180将如在整个说明书中描述的多个系统模块集成至单一芯片设计中。在这个实例中，微流体芯片180包括小滴生成区域412、小滴温育器/储存区域414、小滴分选区域416和小滴分配器区域420。在这个实例中，如果需要，微流体芯片180包括储存腔室456和允许延缓小滴在整个微流体芯片180中的输送的阀182，因为可以在可控的时间段(例如从数秒至数分钟)内将小滴容纳在腔室456中。
微流体芯片180的容纳腔室456优选与小滴分配器区域420技术上尽可能地接近。这允许小滴输送和分配的更好的控制，这可能是特别困难的，因为水性小滴与油相比可能具有不同的流速。容纳腔室456与小滴分配器区域420(或小滴分配单元)越接近，小滴分配就越可控，因为可以减少小滴在容纳腔室456和小滴分配器区域420之间输送的时间。在其中小滴漂浮至芯片的顶部的竖直运行的芯片设计中，这可能是特别重要的。
在微流体芯片180的实施方案中，使用允许将微流体芯片180的不同部分和区域的不同工作流程分离的控制序列。例如，可以将小滴在其到达小滴分配器区域420之前从小滴生成区域412直接提供至小滴分选区域 416。在这个实例中，省略了在小滴生成区域412和小滴分选区域416之间的小滴温育/储存区域414。应该理解的是，可以省略微流体芯片180的不同的(一个或多个)部分/区域。
图18b示出了用于操作在图18a中所示的微流体芯片的控制系统1800 的示意性框图。应该理解的是，控制系统1800可以等同地用于操作上述微流体系统、小滴分选或分配装置、小滴分配器、微流体装置、微流体筒、微流体处理系统和用于生物实体的基于微滴的处理的仪器。因此，可以在其中不将下列各项中的一个或多个结合至单一芯片设计中的系统中使用控制系统1800：小滴生成装置/单元、小滴储存/温育装置/单元、小滴分选装置/单元和小滴分配单元/小滴分配器。
宽泛而言，控制系统1800包括适宜地编程的通用处理器1802。控制系统1800还包括工作存储器1804、永久性程序存储器1806和数据存储 1808，他们全部通过公用数据和控制器1810连接。在这个实例中，还提供了用户界面1812以用于配置系统。控制系统1800还包括与显示器、存储器、打印机、数据存储和网络中的一个或多个1816连接的输出口1814 以显示、存储、打印或分配例如与其位置在例如微量滴定板中的小滴的一个或多个性质(或在一个或多个小滴中的一个或多个实体的一个或多个性质)相关的数据。技术人员将会理解，另外地或备选地，可以采用其他的存储/输出形式。
在这个实例中，工作存储器1804用于容纳(可以是瞬时的)、处理和操作关于一个或多个小滴和/或其实体/多个实体的小滴实体数据、小滴尺寸数据、小滴荧光数据、小滴速度数据、和其他物理和/或化学数据/性质。
在这个实例中，永久性程序存储器1806储存包括(任选的)用户界面代码操作系统代码的操作系统代码(可以不依赖于平台)，用于控制与输出口的界面的数据通讯控制代码，用于控制将小滴从例如储蓄器提供至小滴处理系统/微流体芯片的小滴提供代码，用于控制由例如包含例如生物实体的溶液制备小滴的小滴制备代码，用于控制在小滴处理系统/微流体芯片中的油包水乳液中的一个或多个小滴的流速的小滴流速代码，用于控制在小滴处理系统/微流体芯片的一个或多个部分中的小滴的流动路径的小滴流动路径代码(例如可以省略一个区域或处理步骤，例如温育，并且可以将小滴从一个区域/处理单元直接提供至另一个)，用于控制小滴的融合的小滴融合代码，用于控制在小滴中的一个或多个实体的确定/鉴别的小滴实体确定代码，用于控制小滴的荧光的检测及其处理的小滴荧光检测代码，用于控制在小滴处理系统/微流体芯片中的小滴的速度的确定的小滴速度确定代码，用于控制在小滴分选单元/区域中的小滴的分选的小滴分选代码，用于控制小滴从第一液体流动路径到第二液体流动路径的分离的小滴分离代码，用于控制基于例如之前得到的小滴和/或其实体的一个或多个性质的数据选择小滴的小滴选择代码，用于控制通过例如调节在小滴处理系统/微流体芯片中在一个或多个流动路径的一个或多个区域处的压力来喷射/分配小滴的小滴喷射/分配代码，用于控制小滴的温育的小滴温育代码，用于控制对一个或多个小滴进行的稳定性试验的小滴稳定性试验代码，以及用于控制小滴在容纳腔室中的容纳的小滴容纳代码。
这些编码由处理器1802加载并且执行，以为控制系统1800提供相应的功能。
可以在载体介质(以可移除存储介质1818例如CD-ROM说明性地示出) 上提供这些编码中的一些或全部。
在这个实例中，数据存储1808存储提供关于在小滴中储存的一个或多个实体的信息(以及小滴是否含有任何实体例如生物实体)的小滴实体数据，提供一个或多个小滴的尺寸的信息的小滴尺寸数据，.提供关于一个或多个小滴的荧光性质的信息的小滴荧光数据，以及提供关于一个或多个小滴在小滴处理系统/微流体芯片中的特定位置和/或区域处在给定时间的速度的信息的小滴速度数据。技术人员将会理解，可以在数据存储1808中存储一个或多个小滴和/或其实体或多个实体的其他物理和/或化学性质。
例如，在通用计算机系统上或在数字信号处理器(DSP)上，本发明进一步提供处理器控制代码，以实施上述系统和方法。在非瞬时性物理数据载体如磁盘、CD-或DVD-ROM、编程存储器如非易失性存储器(例如闪存) 或只读存储器(固件)。实施本发明的实施方案的代码(和/或数据)可以包括在常规编程语言(解释的或编译的)如C中的源、对象或可执行代码，或汇编代码，或用于硬件描述语言的代码。如技术人员将会理解的，这样的代码和/或数据可以在彼此通讯的多个连接的组件之间分布。
我们现在描述用于与芯片的实施方案一起使用的一些实例控制顺序。可以通过仪器的软件控制来实现微流体芯片(筒)的控制。在实施方案中，将硬件控制命令或脚本的序列传送至硬件/软件控制解释器(interpreter)并且将该信息转换为专门针对硬件组件的命令。
在将样品加载至芯片上之后(例如细胞或者其他生物或测定相关物质的样品)，将芯片加载至仪器上。多种运行模式是可能的；这些模式通过选择适合的命令控制顺序(控制脚本)来实施。以下概述了仪器的运行模式的两个实例：(1)单克隆确定性模式；和(2)直接测定模式。
用于单克隆确定性模式顺序的芯片控制序列的实例如下：
典型的初始化步骤是样品加载和芯片填装(priming)(其中用油填充芯片的通道和腔室从而不存在气泡)。步骤之后以下列各项继续进行：
1.皮升小滴生成和样品胶囊化
2.单克隆的光学检测(例如基于成像和/或散射)
3.皮升小滴分选(基于光学信号)
4.皮升小滴收集
5.皮升小滴分配(优选包括如之前描述的单克隆的光学检测/确认)。
在已经将小滴分配在乳液弹中之后，所述块进入通常已经含有水的(微量滴定板)孔。通过物理行为，和/或通过其他方式，例如电场，将细胞从小滴中释放至水中并且收集在孔中，油从水中分离。当系统运行完成时，优选清洗系统/芯片。
用于直接测定模式的芯片控制序列的实例可以具有与以上对于单克隆确定性模式描述的相同的初始化和有效负荷收集步骤。此外，直接测定模式可以包括以下步骤：
1.皮升小滴生成和样品胶囊化
2.温育(例如在37℃)
3.单克隆的光学检测(例如基于成像和/或散射)
4.用于测定的光学检测(例如荧光和/或发光)
5.皮升小滴分选(基于光学信号)
6.皮升小滴收集(测定阳性)
7.皮升小滴分配(优选包括如之前描述的单克隆的光学检测/确认)。
图19a-c示出了使用在本文中所述的实施方案的皮升小滴中单一细胞的检测。在这个实例中，确定制备的抗体的量。
在图19a-c中的图表的x轴示出了在任意单元中的绿色荧光强度，并且y轴示出了在任意单元中的红色/绿色荧光比率强度。将小滴暴露于绿光。在这个实例中，作为较高的FRET强度的结果，由中国仓鼠卵巢细胞制备的抗体越多，在荧光信号中存在的从绿到红的移动越多。技术人员将会熟知作为抗体的生长数量的结果的绿-红移。在本文中所述的方法和系统显示，在2h之后，可以使用在本文中所述的实施方案由中国仓鼠卵巢细胞制备大量抗体——标记为“A”的簇表示抗体群体。簇“B”表示不含细胞或不含抗体的皮升小滴群体。
之后可以实施仅分选展现出例如在特定范围内的红色和绿色荧光强度的那些小滴的方法。这在图20a-c中示出，其显示了来自皮升小滴的红色和绿色荧光的散点图的时间进程。红色正方形限定了用于皮升小滴分选的门控设置，并且可以仅分选显示出在特定范围内的红色荧光和在特定范围内的绿色荧光的那些皮升小滴。应该理解的是，可以根据小滴(及其实体) 应当具有的特定性质(例如荧光性质)来选择限定用于皮升小滴分选的门控设置的红色正方形的形状、尺寸和位置。
我们已经描述了在优选实施方案中应用于处理含有生物实体的油包水乳液的小滴的技术。然而，原则上，可以以相似方式处理非生物实体，如有机或无机物质。同样地，我们描述的技术原则上也适用于处理水包油乳液中的油的小滴。
毫无疑问，对于技术人员来说，将存在许多其他有效的备选方案。应理解的是，本发明不限于所描述的实施方案并且包括在所附权利要求的精神和范围内的对于对本领域技术人员来说显而易见的改进。

Claims (15)

1.用于分选的微流体小滴的自动化分选和分配的微流体筒，所述筒包括：
与分选区域连接的分选输入通道，所述分选区域包括与所述输入通道连接的两个以上分选输出通道以及将小滴从所述分选输入通道选择性地引导至所述分选输出通道中的被选择的一个的小滴引导器；和
与所述分选输出通道中的一个连接以从所述筒分配被选择的所述小滴以用于在储蓄器中收集的小滴分配器，其中所述小滴分配器包括小滴喷射机构以将小滴从乳液流喷射至分配器输出通道中以用于在所述储蓄器中收集。
2.根据权利要求1所述的微流体筒，所述微流体筒还包括在所述分选区域和所述分配区域之间的乳液流缓冲区域以控制到所述小滴分配器的乳液流速。
3.根据权利要求1或2所述的微流体筒，所述微流体筒还包括具有小滴输入口的小滴温育区域、容纳小滴以用于温育的小滴容纳区域、和与所述分选输入通道连接的输出口。
4.根据权利要求1或2所述的微流体筒，其中所述分配器输出通道包括用于促进小滴或小滴的内容物从所述乳液中释放的机构。
5.根据权利要求1或2所述的微流体筒，其中所述小滴分配器被配置用于选择具有限定的数量或数值范围的生物实体/小滴的小滴。
6.根据权利要求1或2所述的微流体筒，所述微流体筒还包括多个传感器，所述传感器用于在所述微流体筒的不同位置在不同时间点检测所述小滴以确定所述小滴在所述微流体筒中的速度，并且其中所述小滴引导器被配置成根据所述速度确定的结果引导所述小滴。
7.根据权利要求1或2所述的微流体筒，其中所述小滴喷射机构包括用于增加所述乳液流中的压力以将小滴引导至所述分配器输出通道中的机构，特别地其中所述小滴喷射机构被配置成选择性地调节所述压力以选择所述乳液流中的小滴以用于喷射。
8.根据权利要求1或2所述的微流体筒，其中在所述分选区域和所述小滴分配器之间提供了一个或多个乳液流缓冲区域，以控制到所述小滴分配器的乳液流速。
9.微滴处理系统，所述微滴处理系统包括根据权利要求8所述的微流体筒，所述微滴处理系统还包括用于感测所述选择的小滴的速度和位置之一或二者的传感器，以及用于调节响应于所述速度/位置的所述压力的控制器。
10.根据权利要求9所述的微滴处理系统或包括根据权利要求1或2所述的微流体筒的微滴处理系统，所述微滴处理系统还包括多个所述储蓄器和用于将分配的小滴选择性地引导至储蓄器的控制系统。
11.根据权利要求10所述的微滴处理系统，所述微滴处理系统还包括小滴感测系统，所述小滴感测系统特别地与所述分选区域相连，以感测小滴的一个或多个性质以用于分选或被分选至所述输出通道中；和
其中所述控制系统被配置成储存与所述一个或多个感测的性质相关的小滴数据，以致单个小滴的小滴数据是可取回的以取回在被鉴别的储蓄器中的单个小滴的数据。
12.用于提供含有一个或多个实体的小滴的微流体系统，所述系统包括根据权利要求1或2所述的微流体筒，所述系统还包括：
用于由含有多个实体的液体制备小滴的小滴形成装置；
用于确定所述小滴是否含有所述多个实体中的一个或多个实体的分析仪；
其中所述微流体筒的所述分选区域被配置成根据所述确定的结果分选所述小滴；和
用于在所述微流体系统中将所述分选的小滴从所述液体的液体流动路径分离的分离器，其中所述微流体筒的所述小滴分配器被配置成分配分离的小滴。
13.根据权利要求12所述的微流体系统，其中所述小滴分配器包括用于储存生长培养基液体的储蓄器，并且其中所述小滴分配器被配置成在所述生长培养基液体中分配所述分离的小滴。
14.根据权利要求9或10所述的微流体系统或根据权利要求1或2所述的微流体筒，其中所述分选区域或所述小滴分配器被配置成使包含第一和第二微流体流的部分的转盘旋转以将小滴选择性地引导至第一和第二输出微流体流中的一个。
15.根据权利要求9或10所述的微流体系统或包括根据权利要求1或2所述的微流体筒的微流体系统，其用于提供在小滴中的一个或多个靶标实体，所述微流体系统包括：
用于检测下列各项之一或二者的第一检测器：
所述小滴是否含有所述一个或多个靶标实体；和
所述一个或多个靶标实体的性质；
并且其中：
所述分选区域被配置成根据所述检测的结果分选所述小滴；和
所述小滴分配器被配置成将所述分选的小滴分配在一个或多个靶标位置，其中所述微流体系统被配置成使所述靶标位置与在所述第一检测器中检测的所述一个或多个靶标实体的所述性质相关联。
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