JP2008278791A

JP2008278791A - 核酸増幅装置、方法および細胞培養・核酸増幅方法

Info

Publication number: JP2008278791A
Application number: JP2007125472A
Authority: JP
Inventors: Hideyuki Terazono; 英之寺薗; Kenji Yasuda; 賢二安田; Mamoru Fukushima; 守福島
Original assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Current assignee: Tokyo Medical and Dental University NUC
Priority date: 2007-05-10
Filing date: 2007-05-10
Publication date: 2008-11-20

Abstract

【課題】微量核酸を増幅する方法を提供する。
【解決手段】基板温度を５０度から１００度の間で温度計測をしながら一定に保つ機能を有する透明電極を帯状に複数表面に配置したチップと、チップ上に構成されたミネラルオイル層と、ミネラルオイル層中に水滴を導入する手段と、水滴の蛍光強度の変化を計測する手段と、水滴に水の吸収を有する波長の集束光を照射して加熱する手段からなることを特徴としたリアルタイム核酸増幅装置。
【選択図】図３

Description

本発明は、微量核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅装置、方法および細胞培養の過程からリアルタイム核酸増幅の過程までを同じ装置で実行できる細胞培養・リアルタイム核酸増幅方法を提供する。

化学反応を極微量で行うマイクロデバイスや、細胞を１個ずつ取り扱い、細胞に対して種々反応を行ったり観測を行ったりするシステムを実現するための新しい技術が種々提案されている。たとえば、本願の発明者らによる特開２００６−１６２２６４号公報では、反応媒体を含む液滴を複数種準備して、これらを選択的に衝突させて反応を行わせる具体案が開示されている。

従来の生化学反応をはじめとする化学反応は、ある大きさを有する容器の中で行うのが一般的であったが、このような液滴による操作ができれば、文字通りの微量反応が実現できる。このような微量反応の実現は、準備する試料の量の低減が可能になるのみならず、反応速度の向上等操作性の面でも有利であるのみならず、反応生成物を最小限にできるので無駄がないと言う点でも有用である。
特開２００６−１６２２６４号公報

本発明は、核酸増幅を微量反応として液滴内で実現しようとするものである。すなわち、細胞一つを液滴に収納して細胞単位で細胞が有する核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅装置に関する。さらに、核酸増幅の対象である液滴内に収納した細胞を液滴内で増幅して、増幅された細胞を利用して細胞が有する核酸を増幅するリアルタイム核酸増幅方法に関する。

本発明は、以下の、核酸増幅装置、核酸増幅方法、核酸増幅用基板、細胞培養・核酸増幅方法、および細胞培養・核酸増幅用基板を提供する。
（１）複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液を保持でき、細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペットを保持する手段、
前記溶液をピペット内部から押し出して前記ピペット先端部に一つの細胞を含む液滴を形成する手段、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを確認するための手段、
前記ピペット先端部から滴下される前記液滴を受ける透明基板を載置するための手段であって、前記透明基板が熱伝導性部材を備える、透明基板載置手段、
前記透明基板載置手段を操作し、前記滴下される液滴を前記透明基板上に所定の間隔で並べる手段、ならびに
前記透明基板上に設けられた熱伝導部材の温度を所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とする、リアルタイム核酸増幅装置。
（２）一つの細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含む液滴を形成する手段、
前記液滴のサイズをコントロールする手段、
前記透明基板上に形成された液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層を有する透明基板を載置する手段であって、前記透明基板上に透明電極が設けられている、透明基板載置手段、
前記液滴の温度を所定のパターンで経時的に変化するように前記透明電極に流す電流を制御する手段、ならびに
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
（３）前記液滴の温度信号を検出する手段が前記透明電極に設けられ、前記温度信号に基づいて前記透明電極に流す電流を制御する手段を有する上記（２）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（４）前記熱伝導性部材または前記透明電極にレーザー光線を照射する手段を備え、事前に検討した前記レーザー光線の照射による前記液滴の温度上昇をデータを基礎に前記透明電極に照射するレーザー光線を制御する手段を有する上記（１）または（２）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（５）前記液滴にレーザー光線を照射する手段を備え、事前に検討した前記レーザー光線の照射による前記液滴の温度上昇をデータを基礎に前記液滴に照射するレーザー光線を制御する手段を有する上記（１）または（２）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（６）前記一つの細胞を含む液滴を形成する手段がシリンジポンプと連通するピペットであり、該ピペットが細胞の種類単位で使い捨てとされる上記（１）または（２）記載のリアルタイム核酸増幅装置。
（７）基板上に細胞を含む液滴を形成し、該液滴中の該細胞に含まれる核酸をＰＣＲ増幅する方法であって、
細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペット内に複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液を保持する工程、
前記ピペット先端部に一つの細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する工程、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを判断する工程、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴を透明基板上の所定の位置に滴下し並べる工程、ならびに
前記透明基板上の液滴の温度を所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度を所定のパターンで経時的に変化するように制御する工程、
を含む核酸増幅方法。
（８）所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の所定の領域を囲う壁、
前記透明基板上に所定の細胞を包含した液滴を保持するための空間を有するアガロースゲルの層、
を有する細胞培養リアルタイム核酸増幅装置用基板の前記アガロースゲルの層の空間のそれぞれに細胞の培養液を有する液滴を滴下し並べる工程、
前記細胞を培養する工程、
前記細胞の培養後に前記液滴の培養液を前記細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ溶液に置換する工程、ならびに
前記細胞の内包する核酸をＰＣＲにより増幅する工程、
を含む細胞培養・リアルタイム核酸増幅方法。
（９）所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の一面にアレー状に配列された複数の透明電極、
該透明電極の一端に設けられた温度検出手段、および
前記透明電極の設けられた透明基板の所定の領域を囲う壁、
を備えるリアルタイム核酸増幅装置用基板。
（１０）前記透明電極に所定の細胞を包含する液滴を配列した後、前記壁に囲まれた前記所定の領域内に所定の溶媒層を形成した上記（９）記載のリアルタイム核酸増幅装置用基板。
（１１）所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の一面にアレー状に配列された複数の透明電極、
該透明電極の一端に設けられた温度検出手段、
前記透明電極の設けられた透明基板の所定の領域を囲う壁、
前記透明電極上に所定の細胞を収納した液滴を保持するための空間を有するアガロースゲルの層、
を備える細胞培養・リアルタイム核酸増幅装置用基板。
（１２）細胞１個を通過させることのできる先端開口径を有する、細胞１個を含む液滴を形成するためのピペットを保持する手段と、
前記ピペットに細胞を含む溶液を補充し、該ピペットから該細胞を含む溶液を押し出すための溶液操作手段であって、前記細胞を含む溶液が、前記細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼをさらに含む、溶液操作手段と、
前記ピペットの先端に形成される液滴を光学的に観察し、細胞１個を含む液滴の形成を確認するための光学系と、
前記ピペットから滴下する前記液滴を受ける透明基板を載置するステージであって、前記透明基板が前記液滴の温度を制御するための手段を備える、ステージと、
前記ステージの位置を制御する手段とを備える、
核酸増幅装置。
（１３）前記溶液操作手段が、前記ピペットに連通するシリンジポンプである、上記（１２）記載の核酸増幅装置。
（１４）前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記透明電極に電流を供給するための電流源を含み、
該温度検出手段により検出した温度信号に従って前記透明電極に流す電流を調節することによって、前記透明基板上の液滴の温度を制御する、
上記（１２）または（１３）記載の核酸増幅装置。
（１５）前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記液滴にレーザー光線を照射する手段を含み、
前記温度検出手段により検出した温度信号にしたがって前記レーザー光線の照射量を制御する、上記（１２）または（１３）記載の核酸増幅装置。
（１６）前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記透明電極にレーザー光線を照射する手段を含み、
前記温度検出手段により検出した温度信号にしたがって前記レーザー光線の照射量を制御する、上記（１２）または（１３）記載の核酸増幅装置。
（１７）更に、前記液滴のサイズを制御するために、細胞を含まない溶液を前記液滴に加えるための第２のピペットを保持および操作する手段を備える、上記（１２）〜（１６）のいずれか記載の核酸増幅装置。
（１８）前記透明基板上に前記透明電極の一部または全部を含む領域を囲むように側壁が形成され、該領域内に前記液滴と非親和性の溶媒が保持されている透明基板を使用する、上記（１２）〜（１７）のいずれか記載の核酸増幅装置。

本発明では、あらかじめ細胞の特徴に着目して分離された細胞の懸濁液を吸い上げたピペット先端に一つの細胞を含有する適当な大きさの液滴を形成する。この際、細胞の懸濁液は、この細胞が有することが期待されている核酸の増幅のためのプライマー、ＤＮＡ鎖の伸長を行う酵素であるポリメラーゼ、拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素を包含するＰＣＲ溶液とすることができる。あるいは、前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するＰＣＲ溶液としてもよい。ピペットの先端に形成させる液滴は光学系でモニターして液滴の大きさを監視して制御する。

透明な基板上に前記液滴を滴下させ、液滴を適宜配置する。前記透明基板上の液滴の時間に対する温度を所定のパターンに変化させ、液滴単位で独立して液滴内の細胞のＰＣＲによる核酸増幅を実施する。

必要に応じて、上記細胞の核酸増幅に先行して、それぞれの液滴内の溶液を細胞の培養液として、細胞の培養を行う。その後、液滴内の培養液をＰＣＲ溶液に置換した後、培養された細胞の核酸増幅を行う。

本発明によれば、細胞単位で独立しての核酸増幅を実施することができる。

図１（ａ）は、本発明の実施例のリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の平面図、（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。１はシリコン基板であり、例えば、その厚さは１ｍｍ、大きさは２０ｍｍ×２０ｍｍである。２は壁であり、シリコン基板で製作され、その厚さは、例えば、１ｍｍ、高さは１０ｍｍである。３₁，３₂，３₃及び３₄はたとえばＩＴＯによる透明電極である。これらの透明電極３は、基板の幅の全長２０ｍｍにわたって設けられている。幅は３００μｍ、厚さは必要な電気抵抗値に応じて決めればよい。壁２は、前記基板１の上面に配列される透明電極３の大部分の領域を囲うものとされる。４₁，４₂，４₃及び４₄は透明電極３の一端に貼り付けられたサーミスタである。サーミスタ４₁，４₂，４₃及び４₄はペルチェ素子とされてもよい。５は位置決め用のマーカーであり、シリコン基板１の一面に形成される。図では、壁２の内側に設けたが、外側であっても良い。

図２（ａ）は、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に核酸増幅の対象となる細胞を含む液滴を載置するシステム構成の例を説明する概念図、図２（ｂ）は、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に細胞１２を包含する液滴２１が分配された結果を示す断面図である。本発明の実施例では、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に細胞を含む液滴を載置するための第１のピペット１１と、液滴２１のサイズを調整するための第２のピペット２０とを備えるものとして説明される。また、液滴２１を載置する操作に先行して壁２で囲われた領域内に８ｍｍの深さでミネラルオイル３８を張る。なお、ミネラルオイル３８を張る操作は液滴２１を載置する操作の後に、行うものとしてもよい。

核酸増幅の対象となる細胞１２は、あらかじめセルソータ等で分類される。ＤＮＡ複製において核酸増幅の対象となる細胞１２は、細胞１２に期待される核酸の増幅のためのプライマー、ＤＮＡ鎖の伸長を行う酵素であるポリメラーゼ、拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素を包含するＰＣＲ溶液１３、あるいは、前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するＰＣＲ溶液１３に懸濁された状態で準備される。４０₁，４０₂，４０₃および４０₄は分類された細胞ごとに準備された試料を入れた試験管を示す。第１のピペット１１は試験管４０₁，４０₂，４０₃および４０₄から試料を吸引して、第１のピペット１１の先端に形成される液滴を光学的にモニターしながらリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の液滴を分配する。この際、細胞ごとに第１のピペット１１とシリンジポンプ３１を接続するチューブ３０も含めて第１のピペット１１を取り替えれば、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に載置される細胞１２を異なったものとする場合にも、これらが混在することは防止できる。

１９はＸＹ方向に駆動される光学的に透明なステージであり、２７はステージ１９の駆動装置である。ステージ１９の上面にはリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００が載置される。リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の上部には、分配すべき細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３があらかじめ吸い上げられて保持されている第１のピペット１１が配置される。第１のピペット１１の根元部には、チューブ３０を介してシリンジポンプ３１が設けられ、シリンジポンプ３１には駆動装置３２が取り付けられている。また、シリンジポンプ３１にはあらかじめＰＣＲ溶液１３を吸引しておくものとする。シリンジポンプ３１が駆動装置３２により駆動されると、第１のピペット１１内のＰＣＲ溶液１３が細胞１２とともに押し出される。なお、第１のピペット１１の根元部とチューブ３０との接続部が離れたように図示されているのは、第１のピペット１１を拡大して表示するためであり、分離されているわけではない。

一方、第１のピペット１１の先端部に形成される液滴のサイズを調整するために、第１のピペット１１の先端部に形成される液滴に溶液を供給するための第２のピペット２０の先端が配置される。第２のピペット２０の根元部にはチューブ３４を介してシリンジポンプ３５が設けられ、シリンジポンプ３５には駆動装置３６が取り付けられている。また、シリンジポンプ３５にはあらかじめＰＣＲ溶液１３を吸引しておくものとする。シリンジポンプ３５が駆動装置３６により駆動されると、シリンジポンプ３５内のＰＣＲ溶液が第２のピペット２０から押し出される。第１のピペット１１の先端部に形成されている液滴にＰＣＲ溶液を供給して液滴のサイズを大きくすることができる。

第１のピペット１１の先端部の近傍の内部および先端部に形成される液滴２１の大きさをモニターするための光学系を構成する光源１６、集光レンズ１７が設けられ、これに対向する位置でリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の下部にコリメートレンズ１８およびモニター２５が設けられる。したがって、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄およびステージ１９は、光学的に透明である必要がある。２６は、いわゆる、パソコンであり、モニター２５からの入力信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて駆動装置２７，３２，３６および３７に必要な信号を与える。なお、ここでは、図示しなかったが、モニター２５の検出している画面と同一の表示をパソコン２６のモニターに表示するのが便利である。そうすれば、モニター２５は、小型のＣＣＤカメラとすることができる。また、操作入力信号２８は、パソコン２６の入力装置を介して与えられるものである。

ここで、第１のピペット１１のサイズについて考えると以下のようである。第１のピペット１１は、その先端に、一つの細胞のみを含有する適当な大きさの液滴を構成できるようにすることが必要である。第１のピペット１１は、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３をピペットで吸い上げてから使用するが、液滴２１を構成するときに、第１のピペット１１の先端を通過する細胞がモニター２５で誤り無く検出できることが必要である。したがって、第１のピペット１１の先端部の直径は細胞１個が通過するのを許すが、一度に二つ以上の細胞が通過できないものとする。すなわち、透明で、先端部の直径が、一般的な動物細胞用として２０〜１００μｍ、バクテリアなどの微生物用では５μｍ程度とするのが良い。

第１のピペット１１の先端部に形成された液滴２１をリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に移すためのピペットの上下動駆動装置３７が設けられる。ここでは、上下動駆動装置３７は第１のピペット１１に連係するものとする。上下動駆動装置３７に、使用者により、第１のピペット１１を下げる操作信号２８が与えられると、第１のピペット１１は下に動き、第１のピペット１１の先端部に形成された液滴を透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のいずれかに移す。上下動駆動装置３７に、使用者により、第１のピペット１１を復旧させる操作信号２８が与えられると、第１のピペット１１は図に示す位置に戻る。第１のピペット１１の図に示す位置への復旧は、下げ操作から、パソコン２６により、タイムシーケンシャルに行われるものとしても良い。一点差線３９は上下動駆動装置３７と第１のピペット１１との連係を意味する。

リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に細胞１２を分配する全体的な操作について以下説明する。まず、システムが起動されると、使用者は、図１（ａ）で説明したマーカー５に着目してリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００が所定の起動位置にあるように位置決めする。次に、細胞１２の最初の分配位置を第１のピペット１１および第２のピペット２０の先端部に対応する位置に移動させる操作入力信号２８に応じて、駆動装置２７によりステージ１９を操作する。リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のいずれかが所定の位置まで来ると、第１のピペット１１内部の細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３を細胞１２とともに排出する操作を行う。この際、第１のピペット１１の先端部の外側と先端部近傍の内部を光源１６とモニター２５からなる光学系で監視する。モニター２５の出力をパソコン２６に取り込み、パソコン２６の画像演算結果をもとに駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１の送液を制御することができる。

モニター２５で第１のピペット１１の先端を監視しながら、駆動装置３２を動作させて、シリンジポンプ３１を動かし、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３を第１のピペット１１の先端から排出して、ピペット先端に液滴２１を形成する。このとき、液滴２１中に一つの細胞が挿入されたことをモニター２５を通してパソコン２６が認識し、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させる。

細胞１２の認識は、第１のピペット１１の先端部の液滴２１中に存在する細胞１２を直接検出することでも良いが、より効率的には、第１のピペット１１の内部を移動する細胞１２をモニター２５で監視し、パソコン２６で細胞のピペット内での位置と移動速度を計算し、第１のピペット１１の先端から液滴２１内に排出される時を予測してシリンジポンプ３１を制御してもよい。後者の認識方法を用いれば、たとえば短い間隔で複数の細胞がピペット１１内を移動している場合などに細胞を１個だけ液滴の中に入れる場合に有利となる。

ここで、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の細胞濃度が低いときは、細胞が第１のピペット１１の先端から出る直前に液滴２１を形成し始め、所定時間後に液滴形成を停止すれば、液滴２１の大きさを一定にすることができる。液滴を形成したくないときは、たとえばブロアーで第１のピペット１１の先端から出てくる液を吹き飛ばせばよい。あるいは、基板１の外にドレインを設け、そこに排出してもよい。

一方、細胞１２を含むＰＣＲ溶液１３の細胞濃度が高いと、第１のピペット１１から排出される液量がまちまちとなる。すなわち、第１のピペット１１から排出される細胞１２の排出の頻度が上がるから、液を排出させる時間を所定の時間に固定していると、その時間内に次の細胞１２が液滴２１の中に入ってしまう可能性がある。このようなケースでは、第２のピペット２０を用いる。第２のピペット２０とこれに連結されたシリンジポンプ３５には、ＰＣＲ溶液が入れられている。すなわち、モニター２５を通して細胞１２が液滴２１に入るのをパソコン２６が確認したとき、駆動装置３２に停止指令を出して、シリンジポンプ３１を停止させるとともに、このときまでに液滴２１を形成するのに駆動されたシリンジポンプ３１の繰り出し量から、その時点の液滴２１の体積を割り出す。この体積と液滴２１の所望の体積との差をパソコン２６で計算する。この計算結果に応じて、その時点に出来ている液滴２１に第２のピペット２０で溶液を加えるように、パソコン２６から駆動装置３６に動作信号を送り、シリンジポンプ３５を駆動して、第２のピペット２０を用いて液滴２１の体積が所定の値になるまでＰＣＲ溶液を加える。

第２のピペット２０を用いて液滴２１にＰＣＲ溶液を加えるとき、第２のピペット２０に液滴中の細胞１２が逆流しないように、第２のピペット２０の先端は細胞が通らない大きさ、たとえば０．２μｍφとするのが良い。あるいは、先端が０．２μｍのフィルター構造を有するものとするのが良い。

このようにして作成した細胞が１個含まれる液滴２１は、第１のピペット１１の上下動駆動装置３７により、ステージ１９の上に置かれたリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のいずれかに接触させられ、液滴２１は透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に移動する。細胞１２を含む液滴２１が透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のいずれか、すなわち、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のいずれかに移動したことが確認されると、使用者は操作信号２８を与えて、ステージ駆動装置１０を動かし、次の液滴を置く位置にピペット先端が位置するように、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００を移動させる。この移動は、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の配置の情報をパソコン２６に与えておけば、パソコン２６によって自動的に行うことができる。そして、この新しい位置で、上述のようにして第１のピペット１１の先端に新たな液滴を形成し、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に移動させる。これを繰り返して、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の必要な部位に液滴を置く。

図２（ｂ）は、図２（ａ）を参照して説明した、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００に細胞を分配するシステムによって、リアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上に細胞が分配された結果を示す断面図である。シリコン基板１上の壁２で囲われた領域内の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に細胞１２と、これを包み込む形の液滴２１が配置されている。壁２で囲われた領域内全てにミネラルオイル３８が張られている。液滴２１は０．２から２μｌ程度なので、１０ｍｍの高さの壁２の内側に、ミネラルオイル３８を入れると、液滴２１は核酸増幅中の温度上昇による蒸発から保護される。

ここで、ミネラルオイルを使用する理由は、ミネラルオイル３８の比重が０．９程度と小さいので、液滴２１の安定度がよい点にある。これにより、核酸増幅中、常に液滴２１は安定して透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄上にとどまっている。ミネラルオイルは蒸発の防止が主体であるので、液滴２１がミネラルオイルに十分に埋まる程度が良く、たとえば深さ８ｍｍになるようにミネラルオイル３８を静かに流し込む。

図３（ａ）はリアルタイム核酸増幅装置用チップ１００の基板１上の透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に細胞１２を含む液滴２１が分配された結果を模式的に示す斜視図である。透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄には端部にサーミスタ４₁，４₂，４₃及び４₄が設けられている。図３（ｂ）、図３（ｃ）は透明電極３₁に細胞１２を含む液滴２１が分配された状態を拡大して模式的に示す断面図である。図３（ｂ）では、透明電極３₁上にＳＵ−８による保持用の突起４１₁，４１₂を形成した例である。図は断面であるので、両側の突起しか表れていないが、透明電極３₁の長さ方向にも突起を形成するのが良い。図３（Ｃ）では、透明電極３₁上に親水性領域４２を形成した例である。ＩＴＯによる透明電極上に親水性領域４２を形成するには、たとえば、交流放電によるプラズマイオンを親水性領域４２に限って透明電極表面に軽く打ち込むものとすればよい。

次に、本発明の実施例によるリアルタイム核酸増幅について説明する。ＰＣＲは（１）ＤＮＡの１本鎖への変性（たとえば、９４℃）、（２）プライマーの結合（たとえば、６０℃）、（３）耐熱性ポリメラーゼによる相補鎖の合成（たとえば、７２℃）、という温度サイクルを何回も繰返すことにより核酸増幅を行うものである。この例では、まず、液滴２１の温度を９４℃に上げてＤＮＡの１本鎖への変性を行わせることになるが、最初の段階では、細胞１２が、この高温により破砕されて、内部の核酸が液滴内に分散し、鋳型としての核酸となる。次いで、液滴２１の温度を６０℃に下げて鋳型としての核酸にプライマーを結合させる。再び、液滴２１の温度を７２℃に上げて、ポリメラーゼにより鋳型としての核酸の相補鎖の合成を行う。この際、ＰＣＲ溶液が通常のＤＮＡ鎖の伸長を行うポリメラーゼである場合には、相補鎖の合成に併せて拡散増幅の評価をするためのインターカレータ蛍光色素が二本鎖に取り込まれる。一方、ＰＣＲ溶液が前記ポリメラーゼをヘキソカイネースを有するポリメラーゼとし、インターカレータ蛍光色素に代えてレポーターフラグメント（プローブ）を包含するものとされている場合には、レポーターフラグメント（プローブ）が二本鎖に取り込まれる。

液滴２１の温度制御に関しては、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の両端から電流を通して加熱するとともに、サーミスタ４₁，４₂，４₃及び４₄の抵抗変化として得られる温度信号に着目して、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のそれぞれの電流を制御して、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の温度制御を行うことができる。この場合、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のそれぞれに載置されている液滴２１の温度が透明電極単位で上昇する。透明電極への電流通電による他に、１０６４ｎｍの波長の単色光レーザー源のレーザー光線を直接透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に照射しても良い。この波長の光は透明電極（ＩＴＯ）に吸収されて熱に変わるので、透明電極３のレーザー光線の照射された点の近傍の透明電極の温度が上昇する。したがって、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のそれぞれに載置されている液滴２１の内、透明電極３のレーザー光線の照射された点の液滴のみ温度が上昇する。また、１４８０ｎｍの波長の単色光レーザー源のレーザー光線を透明電極（ＩＴＯ）を透過させて直接液滴に照射することにしても良い。この波長の光はＩＴＯには吸収されず、水滴に吸収されて熱に変わるので、レーザー光線の照射された液滴のみ温度が上がる。レーザー光線の照射により透明電極３の温度を上げて液滴の温度を上げる場合およびレーザー光線の照射により直接、液滴の温度を上げる場合は、レーザー光線の照射位置の透明電極３の温度の上昇およびこれによる液滴２１の上昇温度および液滴２１の温度を直接検出することはできないので、それぞれ、レーザー光線のパワーと照射時間に応じて液滴２１の温度がどれだけ上がるかを事前に検討しておき、この結果に応じたレーザー光線の照射を制御することが必要である。

図４は透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の温度制御を透明電極に通電して行う場合の概要と液滴の蛍光を観察する概要を説明する図である。図の便宜上、上段部に透明電極への通電の制御、下段部に蛍光観察を示す。パソコン２６は、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のサーミスタ４₁，４₂，４₃及び４₄の抵抗変化として得られる温度信号に応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムから得られる制御信号、および、使用者がモニター２５の表示画面を見ながら与える操作入力信号２８に応じて切り替えスイッチ４３により、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に流す電流源４４の電流を制御する。この場合は、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄のそれぞれをラインスキャンしながら温度を所定のパターンになるように制御することになる。

一方、前記温度制御により進行する液滴２１内のリアルタイム核酸増幅の状態は、対物レンズ５１で観察される。対物レンズ５１の焦点位置はパソコン２６による信号に応じて駆動装置５２によって移動させることができる。対物レンズ５１の倍率は４０倍以上のものが使用できるが、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の温度制御により液滴２１の温度制御を行う場合は、上述したように、ライン制御となるので、透明電極単位に液滴の観察を行うことになる。したがって、倍率を下げて、対物レンズ５１の位置も、基板から少し離して、一つの透明電極上にある液滴を一度に観察できるようにして、各液滴の蛍光についての情報はパソコン２６によって処理するものとするのがよい。

また、蛍光観察のために、光源７１からの光をバンドパスフィルタ７２によって励起光波長のみ透過させ、観察するときのみシャッター７３によって励起光が液滴２１に照射されるように制御される。シャッター７３を通過した励起光はダイクロイックミラー７４によって液滴２１に照射される。このとき対物レンズ２６で観察されるのは、光源７１からの励起光によって液滴２１が発した蛍光である。液滴２１が発する蛍光は、対物レンズ２６を通過した光のうちミラー７８およびバンドパスフィルタ７９によって、蛍光観察の波長帯のみを選択的に透過させて、カメラ８０で観察することができる。カメラ８０の信号はパソコン２６に送られデータとして利用される。

図５は液滴２１の温度制御を１０６４ｎｍの波長の単色光レーザー源４５のレーザー光線を透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に照射して行う場合の概要と液滴の蛍光を観察する概要を説明する図である。パソコン２６は、あらかじめ検討され入力されているレーザー光線のパワーと照射時間のデータに応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムによって単色光レーザー源４５への制御信号を制御して、コリメートレンズ４７、反射鏡４９および対物レンズ５１を介して制御されたレーザー光線を透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄に照射する。この場合は、温度制御される液滴２１ごとに透明電極３へのレーザー光線の照射を制御することになるので、各透明電極３への照射に応じてステージ１９を移動する。

図６は液滴２１の温度制御を１４８０ｎｍの波長の単色光レーザー源４６のレーザー光線を透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄を透過させて液滴２１に直接照射して行う場合の概要と液滴の蛍光を観察する場合を説明する図である。パソコン２６は、あらかじめ検討され入力されているレーザー光線のパワーと照射時間のデータに応じて、あらかじめ格納してある所定のプログラムによって単色光レーザー源４６への制御信号を制御して、コリメートレンズ４８、反射鏡５０および対物レンズ５１を介して制御されたレーザー光線を液滴２１に照射する。この場合は、個々の液滴２１のそれぞれを個別にスキャンして制御することになるので、個々の液滴２１の照射に応じてステージ１９を移動する。

図６の説明から容易に分かるように、液滴にレーザー光線を直接照射して、温度制御を行うときは、透明電極３はなくてもよい。

図４から図６を参照して説明したＰＣＲでは、液滴はたとえば、９４℃から６０℃の範囲で温度制御されることになるから、透明電極３はミネラルオイル３８も含めて透明基板１の温度が６０℃となるために必要な電流を連続して供給するようにするのがよい。この場合、いずれの場合でも、ミネラルオイル３８も含めて透明基板１の温度が６０℃となっていることを前提に液滴の温度制御をすることができ、温度パターンの制御が短時間でできるメリットがある。

図７（ａ）は、上述した細胞の核酸増幅に先行して、それぞれの透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の上に保持する細胞を含む液滴内に細胞の培養液を入れて、細胞の培養をした後、培養された細胞の核酸増幅をすることにより、効果的に核酸増幅をすることのできる細胞培養核酸増幅のための基板の例を示す平面図、図７（ｂ）は、図７（ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。図１に示す参照符号と同じものは同じものを示す。図７に示す細胞培養核酸増幅のための基板は、図１と対比して、壁２の内側の領域にアガロースゲルの層６を形成した後、透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄の上の液滴を保持する位置のアガロースゲル６を除去して液滴保持穴７₁，７₂，７₃、７₄、７₅および７₆を形成する。したがって、液滴保持穴７₁，７₂，７₃、７₄、７₅および７₆部分でのみ透明電極３₁，３₂，３₃及び３₄が見えている。図７（ａ）ではアガロースゲルの層６の厚さは、保持したい液滴の直径と同程度でよい。液滴保持穴７の形成は、図６に示す構成で単色光レーザー源４６により波長が１４８０ｎｍのレーザー光線を液滴保持穴７を形成したい位置に、円を描くように照射することでアガロースゲル６を溶解させればよい。波長１４８０ｎｍレーザー光線は基板１および透明電極３には実質的に吸収されず、アガロースゲルでのみ吸収されるので、アガロースゲルの温度が上がりアガロースゲルは溶解し、液滴保持穴７が形成される。

図７（ｃ）は、上述した細胞培養核酸増幅のための基板の液滴保持穴７に、図２で説明したのと同じ要領で液滴２１を形成した状態を示す断面図である。液滴２１は透明電極３の周辺のアガロースゲルの層６により支持されて安定に載置される。細胞培養中は、たとえば、周囲温度を３６℃に保持して細胞１２の培養が進められる。この場合、ミネラルオイル３８は乾燥防止が主体であるとともに、液滴２１内の培養液のＣＯ₂の交換のためにミネラルオイル３８は液滴２１がようやく浸る程度の量とするのがよい。

図８（ａ）は、細胞培養中の液滴２１の中の培養液の交換に好適なピペットの例を示す斜視図、図８（ｂ）は、図８（ａ）に示すピペットを使用して培養液の交換を行う状態を模式的に示す断面図である。６１はピペットであり、先端の開口部に細胞阻止片６２が取り付け部６３，６４により取り付けられている。ピペット６１の先端の開口部周辺と細胞阻止片６２の間には細胞が通過できない隙間が設けられている。図８（ｂ）に示すように、ピペット６１とピペット２０とを液滴２１に挿入してピペット６１から液滴２１内の培養液を吸引しながらピペット２０により新しい培養液を注入すれば、液滴２１内の細胞を誤って吸引して失ってしまうことなく培養液が交換できる。図２に示す構成において、ピペット１１に代えてピペット６１を取り付けてシリンジポンプ３１で液滴２１内の培養液を吸引することにし、ピペット２０から培養液を供給することとすれば、図８（ｂ）に示す構成での培養液の交換ができる。

図７（ｃ）に示す形で培養が進められた後、核酸増幅に移行することになるが、この段階で、液滴内の培養液を取り除きＰＣＲ用の溶液に置き換える必要がある。このときも、図８（ａ）に示すピペットを使用して液の交換を行うことにすればよい。核酸増幅に移行すれば、最初に、液滴２１はたとえば９４℃という高温になされるので、液滴２１の周辺のアガロースゲル６は自ずと溶解して除去される。

（ａ）は、本発明の実施例に好適なリアルタイム核酸増幅装置用チップの平面図、図１（ｂ）は平面図のＡ−Ａ位置で矢印方向に見たときの断面図である。（ａ）は、リアルタイム核酸増幅装置用チップの透明電極に細胞を分配するシステム構成を説明する概念図、図２（ｂ）は、リアルタイム核酸増幅装置用チップの透明電極に細胞が分配された結果を示す断面図である。（ａ）はリアルタイム核酸増幅装置用チップの基板上の透明電極に細胞を含む液滴が分配された結果を模式的に示す斜視図である。図３（ｂ）、図３（ｃ）はそれぞれ透明電極に細胞を含む液滴が分配された状態を拡大して模式的に示す断面図である。透明電極の温度制御を透明電極に通電して行う場合の概要を説明する図である。透明電極の温度制御を１０６４ｎｍの波長の単色光レーザー源の光線を直接透明電極に照射して行う場合の概要を説明する図である。液滴の温度制御を１４８０ｎｍの波長の単色光レーザー源の光線を直接液滴に照射して行う場合の概要を説明する図である。（ａ）は、上述した細胞の核酸増幅に先行して、それぞれの透明電極の上に保持する細胞を含む液滴内に細胞の培養液を含ませておき、細胞の培養をした後、培養された細胞の核酸増幅をすることにより、効果的に核酸増幅をすることのできる細胞培養核酸増幅のための基板の例を示す平面図、（ｂ）は、図７（ａ）のＡ−Ａ位置で矢印方向に見た断面図である。（ｃ）は、上述した細胞培養核酸増幅のための基板の液滴保持穴７に、図２で説明したのと同じ要領で液滴２１を形成した状態を示す断面図である。（ａ）は、本実施例で細胞培養中の液滴の中の培養液の交換に好適なピペットの例を示す斜視図、（ｂ）は、図８（ａ）に示すピペットを使用して培養液の交換を行う状態を模式的に示す断面図である。

符号の説明

１…シリコン基板、２…壁、３₁，３₂，３₃及び３₄…透明電極、４₁，４₂，４₃及び４₄…サーミスタ、５…配置決め用のマーカー、１２…細胞、１１，２０…ピペット、１３…細胞１２を含むＰＣＲ溶液、１６…光源、１７…集光レンズ、１８…コリメートレンズ、１９…ステージ、２１…液滴、２５…モニター、２６…パソコン、２７，３２，３６，３７…駆動装置、２８…操作入力信号、３０，３４…チューブ、３１，３５…シリンジポンプ、３８…ミネラルオイル、３９…駆動装置とピペットとの連係を示す線、４１₂，４１₂…突起、４２…親水性領域、４３…切り替えスイッチ、４４…電流源、４５…１０６４ｎｍの波長の単色光レーザー源、４６…１４８０ｎｍの波長の単色光レーザー源、４７，４８…コリメートレンズ、４９，５０…反射鏡、５１…対物レンズ、１００…リアルタイム核酸増幅装置用チップ。

Claims

複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液を保持でき、細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペットを保持する手段、
前記溶液をピペット内部から押し出して前記ピペット先端部に一つの細胞を含む液滴を形成する手段、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを確認するための手段、
前記ピペット先端部から滴下される前記液滴を受ける透明基板を載置するための手段であって、前記透明基板が熱伝導性部材を備える、透明基板載置手段、
前記透明基板載置手段を操作し、前記滴下される液滴を前記透明基板上に所定の間隔で並べる手段、ならびに
前記透明基板上に設けられた熱伝導部材の温度を所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度が所定のパターンで経時的に変化するように制御する温度制御手段、
を備えることを特徴とする、リアルタイム核酸増幅装置。
一つの細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含む液滴を形成する手段、
前記液滴のサイズをコントロールする手段、
前記透明基板上に形成された液滴より比重が小さくかつ実質的に液滴と混ざらない溶媒層を有する透明基板を載置する手段であって、前記透明基板上に透明電極が設けられている、透明基板載置手段、ならびに
前記液滴の温度を所定のパターンで経時的に変化するように前記透明電極に流す電流を制御する手段、
を備えることを特徴とするリアルタイム核酸増幅装置。
前記液滴の温度信号を検出する手段が前記透明電極に設けられ、前記温度信号に基づいて前記透明電極に流す電流を制御する手段を有する請求項２記載のリアルタイム核酸増幅装置。
前記熱伝導性部材または前記透明電極にレーザー光線を照射する手段を備え、事前に検討した前記レーザー光線の照射による前記液滴の温度上昇をデータを基礎に前記透明電極に照射するレーザー光線を制御する手段を有する請求項１または２記載のリアルタイム核酸増幅装置。
前記液滴にレーザー光線を照射する手段を備え、事前に検討した前記レーザー光線の照射による前記液滴の温度上昇をデータを基礎に前記液滴に照射するレーザー光線を制御する手段を有する請求項１または２記載のリアルタイム核酸増幅装置。
前記一つの細胞を含む液滴を形成する手段がシリンジポンプと連通するピペットであり、該ピペットが細胞の種類単位で使い捨てとされる請求項１または２記載のリアルタイム核酸増幅装置。
基板上に細胞を含む液滴を形成し、該液滴中の該細胞に含まれる核酸をＰＣＲ増幅する方法であって、
細胞の一つが通過するにふさわしい所定の大きさの先端開口径を有するピペット内に複数の細胞と該細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ反応溶液を保持する工程、
前記ピペット先端部に一つの細胞を含む溶液をピペット内部から押し出して液滴を形成する工程、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴内に一つの細胞が包含され、所定の大きさの液滴となったことを判断する工程、
前記ピペット先端部に形成された前記液滴を透明基板上の所定の位置に滴下し並べる工程、ならびに
前記透明基板上の液滴の温度を所定のプログラムに従って制御し、前記液滴の温度を所定のパターンで経時的に変化するように制御する工程、
を含む核酸増幅方法。
所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の所定の領域を囲う壁、
前記透明基板上に所定の細胞を包含した液滴を保持するための空間を有するアガロースゲルの層、
を有する細胞培養リアルタイム核酸増幅装置用基板の前記アガロースゲルの層の空間のそれぞれに細胞の培養液を有する液滴を滴下し並べる工程、
前記細胞を培養する工程、
前記細胞の培養後に前記液滴の培養液を前記細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼを含むＰＣＲ溶液に置換する工程、ならびに
前記細胞の内包する核酸をＰＣＲにより増幅する工程、
を含む細胞培養・リアルタイム核酸増幅方法。
所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の一面にアレー状に配列された複数の透明電極、
該透明電極の一端に設けられた温度検出手段、および
前記透明電極の設けられた透明基板の所定の領域を囲う壁、
を備えるリアルタイム核酸増幅装置用基板。
前記透明電極に所定の細胞を包含する液滴を配列した後、前記壁に囲まれた前記所定の領域内に所定の溶媒層を形成した請求項９記載のリアルタイム核酸増幅装置用基板。
所定の大きさを有する透明基板、
該透明基板の一面にアレー状に配列された複数の透明電極、
該透明電極の一端に設けられた温度検出手段、
前記透明電極の設けられた透明基板の所定の領域を囲う壁、
前記透明電極上に所定の細胞を収納した液滴を保持するための空間を有するアガロースゲルの層、
を備える細胞培養・リアルタイム核酸増幅装置用基板。
細胞１個を通過させることのできる先端開口径を有する、細胞１個を含む液滴を形成するためのピペットを保持する手段と、
前記ピペットに細胞を含む溶液を補充し、該ピペットから該細胞を含む溶液を押し出すための溶液操作手段であって、前記細胞を含む溶液が、前記細胞の内包する核酸をＰＣＲ増幅するためのプライマーおよびポリメラーゼをさらに含む、溶液操作手段と、
前記ピペットの先端に形成される液滴を光学的に観察し、細胞１個を含む液滴の形成を確認するための光学系と、
前記ピペットから滴下する前記液滴を受ける透明基板を載置するステージであって、前記透明基板が前記液滴の温度を制御するための手段を備える、ステージと、
前記ステージの位置を制御する手段とを備える、
核酸増幅装置。
前記溶液操作手段が、前記ピペットに連通するシリンジポンプである、請求項１２記載の核酸増幅装置。
前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記透明電極に電流を供給するための電流源を含み、
該温度検出手段により検出した温度信号に従って前記透明電極に流す電流を調節することによって、前記透明基板上の液滴の温度を制御する、
請求項１２または１３記載の核酸増幅装置。
前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記液滴にレーザー光線を照射する手段を含み、
前記温度検出手段により検出した温度信号にしたがって前記レーザー光線の照射量を制御する、請求項１２または１３記載の核酸増幅装置。
前記透明基板上の前記液滴の温度を制御するための手段が、該透明基板上に形成された前記液滴を載置する透明電極および該透明電極上に設けられた温度検出手段を含み、
前記装置がさらに前記透明電極にレーザー光線を照射する手段を含み、
前記温度検出手段により検出した温度信号にしたがって前記レーザー光線の照射量を制御する、請求項１２または１３記載の核酸増幅装置。
更に、前記液滴のサイズを制御するために、細胞を含まない溶液を前記液滴に加えるための第２のピペットを保持および操作する手段を備える、請求項１２〜１６のいずれか記載の核酸増幅装置。
前記透明基板上に前記透明電極の一部または全部を含む領域を囲むように側壁が形成され、該領域内に前記液滴と非親和性の溶媒が保持されている透明基板を使用する、請求項１２〜１７のいずれか記載の核酸増幅装置。