DK172575B1 - Udleveringsindretning til med styret hastighed at udlevere en væskeprøve til en diagnosticeringsindretning, diagnosticering - Google Patents

Description

DK PR 172575 B1 ι

Opfindelsen angår in vitro diagnostiseringstestindretninger. Mere specielt angår opfindelsen en udleveringsindretning til udlevering af en væskeprøve med styret hastighed til en diagnosticeringsindretning, og som omfatter et porøst understøtningslag med en øvre overflade, hvorpå et specifikt udformet testområde er placeret, og hvor den øvre overflade også stræk-5 ker sig uden for testområdet. Endvidere angår opfindelsen et diagnosticeringskit omfattende en sådan udleverings indretning og fremgangsmåde til bestemmelse afen analyt i en væske-prøve under brug af udleveringsindretningen/diagnosticeringskittet.

De seneste fremskridt inden for immunologi har åbnet mulighed for en ny form for diagnosticeringsindretninger, der kendes under betegnelsen gennemstrømningsdiagnosticerings-10 indretninger eller kortere gennemstrømningsindretninger. Normalter tests, der udføres med disse indretninger, meget nemmere at udføre end konventionelle immunod iagnosticerings-analyser. De kræver mindre præcision ved pipettering og færre håndteringer. De eliminerer ligeledes behovet for dyre instrumenter til udlæsning af resultaterne.

En sådan gennemstrømnings indretning er beskrevet i US patentskrift nr. 4.632.901. Den 15 der viste indretning omfatter en første del, som består afen membran eller et filter, hvortil der er bundet et antistof, eller som er i stand til at ekstrahere celler eller cellefragmenter ffa en væskeprøve. Funktionen af denne første del er at udfælde analytten på membranen eller filteret. Indretningen omfatter yderligere en anden del, som muliggør strømning gennem den første del. Ved anvendelse påføres en væskeprøve og flydende reagenter på den første dels 20 ene overflade. Reagenterne strømmer gennem den første del til den anden del. Enhver analyt, som bliver udfældet på den første del ved binding til et bestemt bindingstnateriale for analytten eller ved fysisk tilbageholdelse af celler eller cellefragmenter, der har forbindelse med analytten, som derefter kan detekteres ved hjælp af et sporstofsystem. Reagenterne til sporstofsystemet er ligeledes påført den første dels første overflade og strømmer 25 gennem dette til den anden del. Tilstedeværelse eller mangel på en detekterbar reaktion på den første del indikerer tilstedeværelsen eller manglen af analytten, der er bundet hertil.

En anden gennemstrømningsindretning er beskrevet i US patent nr. 4.366.241. Denne indretning har en immunosorberende zone og en væskeabsorberende zone, som i væskemæs- 2 DK PR 172575 B1 sig henseende er forbundet med den immunosorberende zone. Den immunosorberende zone omfatter den ene del af et immunologisk par, der er bundet til zonen, så den ikke breder sig.

Under brug påføres en væskeprøve, og reagenterne til det indikerende system i den immunosorberende zone. Tilstedeværelsen eller manglen af den detekterbare reaktion i den immuno-5 sorberende zone indikerer tilstedeværelsen eller manglen på analytten i prøven.

US patentskrift nr. 4.366.241 beskriver adskillige indretninger og analysefremgangsmåder.

Patentet viser, at der kan anvendes et eller flere lag, som kan være placeret mellem det immunosorberende lag og den væskeabsorberende zone. Disse lag fungerer som barrierelag til forhindring af tilbagestrømning fra det væskeabsorberende lag til det immunosorberende 10 lag, som fyldstof, som strømningskontrollerende lag eller lignende.

Et af kravene til disse gennemstrømningsindretninger er, at de skal sprede prøven tilstrækkeligt på det øverste lag, således at analytten udfældes på laget, typisk sker det ved en bindingsreaktion. Derefter kan sporstoffets reagenter spredes tilstrækkeligt ud over det øverste lag, så at den ønskede reaktion kan opstå. Hvis indretningen suger væsken gennem lagene 15 alt for hurtigt, kan reaktionen ikke gennemføres. US patent nr.4.920.046 med samme ansøger leder tanken hen på det problem, at styre strømningen gennem en porøs understøtning til et testområde på dens øvre overflade. Den beskrevne indretning omfatter et porøst lag med porer tilstrækkelig store til at et ikke reageret sporstof og analytten kan strømme igennem til et absorberende lag. Det porøse lag og det absorberende lag samvirker således, 20 at strømningen af reagenterne styres gennem det porøse lag ind i det absorberende lag.

Indretningen kan ligeledes omfatte et strømningsstyrende lag, der kan være placeret mellem det porøse lag og det absorberende lag.

For nyligt er der blevet introduceret et kit til detektering af streptokokker type A. Kittet anvender den opfindelse, der er beskrevet i US patentansøgning nr. 106.757 og omfatter alle 25 reagenser og materialer, der er nødvendige for at detektere analytten i prøver, der er udtaget fra en patients hals. Prøven udtages ved hjælp af en indretning i form af en DispensTube·.

Indretningen består af et testrør, hvori prøven anbringes sammen med ekstraktionsreagenserne. Efter at prøven er blevet ekstraheret sættes en prop med en dråbetæller på røret, og den 3 DK PR 172575 B1 ekstraherede prøve kan påføres testindretningen. Dråbetælleren omfatter selvfølgelig et filter til at fange store fragmenter, der er til stede i prøven. Når prøven er blevet ekstraheret, kan den fuldstændige analysefremgangsmåde udføres i løbet af mindre end tre til fem minutter.

Kittet kan detektere streptokokker type A i ganske små koncentrationer.

5 Skønt Directigen 1-2-3® testkittet (Becton Dickinson Microbiology Systems, Cokeysville, MD), der er beskrevet ovenfor, fungerer ganske godt ved streptokokker type A, ønskes der ved analyser for andre analytter en yderligere strømningskontrol.

Et andet problem, der har vist sig ved fremkomsten af ganske følsomme og specifikke analyser, er problemet med falske positive reaktioner, der opstår ved tilstedeværelsen af 10 andre stoffer end analytten, og som går i forbindelse med forbindelsesstofferne i sporstofferne, og som ikke kan specificeres af analytimmobiliseringslaget i testsystemet. Således vil ved analyser, hvor man anvender et sporstofsystem, der omfatter monoklonale antistoffer, som er udvundet fra antisera fra mus, prøver fra folk med antistoffer mod mus give falske positive resultater. Af denne grund er der et behov for at eliminere tabet af den effektive 15 specificering, der opstår ved tilstedeværelsen af antistoffer til de forbindelser, der anvendes til at fremstille et antiserum, der bruges ved analysen.

Opfindelsen angår en udleveringsindretning af den indledningsvis angivne art, og som er ejendommelig ved, at den omfatter et kammer til optagelse af væskeprøven, hvilket kammer har en bund, en åbning i kammerets bund, og som er udformet med samme størrelse og 20 form som testområdet, og en strømningsstyrende membran, som er fastgjort til kammeret, og som dækker åbningen, og hvorigennem væskeprøven udleveres på det specifikt udformede testområde på en øvre overflade af det porøse understøtningslag. Derved opnås et mindre krav til præcis pipettering og færre håndteringer, da en væskeprøve kan anbringes i kammeret og derefter strømme ud på det porøse understøtningslag.

25 I en foretrukken udførelsesform for udleverings indretningen er der midler til selektivt at fjerne forstyrrende medier, som kan påvirke analysen, mens det tillades det, der skal analyseres, at strømme ud af kammeret. Fortrinsvis består midlerne til at fjerne forstyrrende 4 DK PR 172575 B1 medier af bestemte bindingsstoffer, som går i forbindelse med de forstyrrende medier, og som ikke reagerer med analytten. De bestemte bindingsstoffer til fjernelse af forstyrrende medier er bekvemt påført den strømningsstyrende membran.

Endnu en foretrukken udførelsesform for opfindelsen består i, at den strømningsstyrende 5 membran er forsynet med reagenter til analysen, hvilke reagenter er påført membranen.

Dette tillader tør opbevaring af reagenterne før anvendelsen. Når prøven eller en anden væske passerer gennem den strømningsstyrende membran, opløses reagenterne og føres til testindretningen.

Ved en foretrukken udførelsesform for udleveringsindretningen omfatter denne yderligere 10 et håndtag, der er fastgjort til kammeret. Håndtaget tillader håndtering af udleverings indretningen uden at røre nogen af de væsker, der er blevet placeret i kammeret. I de tilfælde, hvor udleverings indretningen skal anvendes og smides væk før, at sporstoffet tilføres til diagnosticeringsindretningen, er håndtaget specielt ønskværdigt.

Kittet ifølge opfindelsen kan omfatte en udleverings indretning, som angivet ovenfor, og en 15 in vitro diagnosticeringsindretning, der svarer til væskens udleveringsegenskaber. Således kan der udvikles systemer, hvor væskeudleveringsindretningen og en gennemstrømningsdiagnosticeringsindretning er tilpasset til en bestemt analyt og en bestemt analyse.

Opfindelsen angår også en fremgangsmåde. Denne er ejendommelig ved, at udleveringsindretningens kammer placeres ud for testområdet, at der tilføres vxskeprøve til kammeret, 20 at væskeprøven bringes til at strømme ud med en styret udstrømningshastighed, at væskeprøven bringes i berøring med en øvre overflade af understøtningslaget ved det specifikt udformede testområde, samtidig med at der uden for testområdet ikke påføres dele af væskeprøven, og hvor det i det specifikt udformede testområde bindingsmateriale til analytten ikke samvirker med understøtningslaget, og at der derefter foretages en detektering af tilstede-25 værelsen af analytten i væskeprøven, som er kommet i berøring med det specifikt udformede testområde ved anvendelse af et sporstof. Herved kan der tilføres reagenter i form af et sporsystem til testområdet gennem en væskeudleveringsindretning eller uafhængigt væskeud- 5 DK PR 172575 B1 leveringsindretningen. Således er det i de tilfælde, hvor styringen af strømningshastigheden af sporstoffet konjugerer hen over testområdet, vigtigt at kunne styre dette; væskeudleveringsindretningen kan anvendes til at påvirke styringen. På tilsvarende vis kan det ved nogle systemer med mange væskeudleveringsindretninger anvendes til at udlevere stoffer af væ-5 sentlig forskellig størrelse med styrede strømningshastigheder.

Diagnosticeringskittet ifølge opfindelsen er ejendommeligt ved, at gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen består af et hus med en åbning, en porøs understøtning, som har en øvre overflade med et specifikt udformet testområde, og området uden for det specifikke testområde på den porøse understøtning, og at understøtningsindretningen til væsken består 10 af et kammer til optagelse af væskeprøven, og hvor kammerets sidevægge afsluttes af en bund, og hvor en åbning i kammerets bund har samme størrelse og form, som det specifikt udformede testområde i gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen, og hvor der i kammeret er fastgjort en strømningsstyrende membran, som dækker den åbning, hvorigennem væskeprøven udleveres til det specifikt udformede testområde på den øvre overflade 15 af den porøse understøtning i gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen, hvilken udlevering af væskeprøven foregår med en styret hastighed, når kammeret er placeret ud for gennemstrømningsdiagnisticeringsindretningen.

Opfindelsen forklares nedenfor under henvisning til tegningen, hvor fig. 1 viser en udleveringsindretning ifølge opfindelsen, set fra siden, 20 fig. 2 et snit langs linien 2-2 i fig. 1, fig. 3 en gennemstrømningsdiagnosticeringsindretning til anvendelse i et kit ifølge opfindelsen, set ffa oven, fig. 4 samme set fra siden, og fig. 5 et snit langs linien 5-5 i fig. 3.

6 DK PR 172575 B1

Idet der henvises tegningen udgøres udleveringsindretningen ifølge opfindelsen af et kammer, der foroven har udad forløbende rande 11 og nedad forløbende sidevægge 12. De nedad forløbende sidevægge 12 ender i en bund 13. En åbning 14 i bunden 13 tillader en væske i kammeret at strømme ud. Det foretrækkes at udleverings indretningen har et håndtag 5 20, der er fastgjort til kammeret 10. Håndtaget 20 har fortrinsvis et område 21 med et tværsnit, der er tyndere end resten af håndtaget for at gøre håndtaget let bøjeligt.

Kammeret og håndtaget er hensigtsmæssigt tildannet ud i ét ved støbning. Materialevalget er ikke kritisk. Fagfolk på området er fortrolige med velegnet plast. Kammeret skal være tilstrækkeligt stort til at indeholde en væskeprøve på f.eks. 400 μΙ. Åbningen er dimensio-10 neret til opnåelse af den ønskede gennemstrømningskapacitet for den aktuelle analyse. Den kan hensigtsmæssigt have en diameter i området 0,13 cm til 0,56 cm. Fortrinsvis har åbningen en diameter på 0,3 cm.

En strømningsstyrende membran 30 er fastgjort til bunden af kammeret. Strømningsstyrende membraner er tilgængelige fra forskellige steder, der er kendt af fagfolk på området. Den 15 på nuværende tidspunkt foretrukne er en nylon 66 membran, der har en porestørrelse på 3,0 μπι (Immunodyne® I, Pali Corporation, East Hills, N.Y. 11548). Membranen kan fastgøres til kammeret ved en hvilken som helst velegnet metode herunder ved hjælp af et klæbemiddel, ved varmeforsegling og ved ultralydsvejsning.

Det foretrukne udstyr ifølge opfindelsen gør brug af den ovenfor beskrevne udleveringsind-20 retning og gennemstrømningsdiagnostiseringsindretningen vist i fig. 3-5. Testindretningen 40 udgøres af en porøs understøtning 45 med en øvre og en nedre overflade og et testområde 48 på den øvre overflade. Op til den porøse understøtnings 41 nedre overflade er der et strømningsstyrende lag 42. Umiddelbart neden under det strømningsstyrende lag er der et porøst afstandslag 43. Umiddelbart under det porøse afstandslag er der et absorberende lag 25 44.

Testindretningens lag 41, 42, 43 og 44 kan være forbundet med hinanden på enhver hensigtsmæssig måde f.eks. ved sammensyning af lagene. Den samlede indretning er hensigts- 7 DK PR 172575 B1 mæssigt anbragt inden i en beholder omfattende en bundpart 45 og et låg 46. Låget 46, der I igger hen over den porøse understøtning 41, indbefatter en ophøjet del, der har en passende åbning 47, som ligger hen over testområdet 48. Som vist i figuren er testområdet 48 en trekant, der er fuldstændig omgivet af en baggrundsdel af den porøse understøtning, der 5 også ligger inden for området afgrænset af åbningen 47.

Låget 46 er oppebåret oven over den porøse understøtning 41 ved hjælp af tandagtige fremspring 49, der strækker sig op af fra siderne af bundparten 45. Fremspringene 49 er tilstrækkeligt høje til at tilvejebringe luftrum 50, der tilvejebringer ventilation af testindretningens 40 sider.

10 Lågets 46 ophøjede del, der omgiver åbningen 47, kan indbefatte et farvet område 51, hvis farve er i kontrast med lågets 46 farve og den farve, der skal frembringes i testområdet med henblik på at tilvejebringe en bedre aflæsning af prøveresultaterne, som normalt bestemmes af farven. Ved den foretrukne udførelsesform er beholderen omfattende bundparten 45 og låget 46 med farvet område 51 fremstillet af plastmaterialer.

15 Det foretrækkes, at udleverings indretningen er udformet således at kammeret 10 passer ind i åbningen 47 i beholderens top. Særligt foretrækkes det, at kammerets bund er dimensioneret og udformet til at blive parret med understøtningens 47 øvre overflade. Ved brug tilsættes væskeprøven og reagenser, for hvilke strømstyring er ønsket, til kammeret og tillades at strømme gennem membranen til testområdet. Når der ikke længere er behov for 20 udleveringsindretningen, kan den fjernes ved brug af håndtaget og kasseres.

Ved et andet aspekt ved opfindelsen tjener udleveringsindretningen yderligere til at fjerne generende stoffer fra væsker, der skal anvendes i prøven. Denne funktion kan opnås ved at belægge kammerets indre vægge, strømstyringsmembranen eller begge med et specifikt bindende materiale, som binder det generende stof uden at binde analytten og materiale 25 aktivt i analysen. Fortrinsvis er den strømstyrende membran belagt med et specifikt bindende materiale. F.eks. når analysen anvender antistoffer fra mus, kaniner eller geder, og meget lave analytniveauer skal påvises, kan antistoffer i patientens sera over for dyrearten, 8 DK PR 172575 B1 der benyttes til at fremstille reagenserne, forårsage falske positive resultater. Dette problem eksisterer også, når der benyttes monoklonale antistoffer.

Yderligere træk og fordele ved opfindelsen vil fremgå af de efterfølgende ikke begrænsende eksempler.

5 Sammenligningseksempel 1

Fremstilling af diagnostiseringsindretning

Schleicher & Schuell nitrocellulosemembraner med en porestørrelse på 5 μπ belægges med 50 μΐ af et monoklonalt antistof over for cytoplasmiske antigener (48-52 kD) af svampen Candida Albicans beskrevet i US patent nr. 4.670.382. Belægningsopløsningen indeholder 10 antistoffer i en mængde på 100 μ£/ιη1 i phosphatpufret saltvand (0,1 M, pH 6,0) indeholdende 0,2% NaN3. Efter tørring blokeres membranen med 0,5% gelatine i phosphatpufret saltvand (0,1 M, pH 8,0). Membranerne tørres dernæst.

Testindretningen samles ved at anbringe nitrocellusemembranen oven på en lagdelt kompo-sit. De to bundlag er absorberende cellulosepapir (6,3 mm tyk). Oven over disse bundlag 15 er der et porøst afstandslag omfattende et ikke-vævet stof af rayon (Schleicher & Schuell katalog nr. 5-S). De tre lag sammensyes og det porøse understøtningslag af nitrocellulose anbringes ovenover. Den samlede komposit er 1 cm1 og 0,5 cm tyk. Antistofpletten på nitrocellulosemembranen har form som en trekant. Kompositten anbringes i en beholder, som vist i figurerne.

20 Fremstilling af udleveringsindretning

Et kammer og et håndtag fremstilles i polystyrenharpiks (Kharpiks KR03, Phillips Petroleum, Bartleville, OK). Kammeret er cylindrisk med en ydre diameter på 1 cm. Dens kapacitet er 400 μΙ. Kammeret er udformet med en 0,3 cm åbning i bunden. Kammeret passer nøje ind i åbningen i gennemstrømningsindretningen.

9 DK PR 172575 B1

En strømstyrende membran varmeforsegles til kammerets bund. Den dækker fuldstændig åbningen i bunden af kammeret. Membranen er en nylon 66 membran. Der fremstilles indretninger med membraner, der har en gennemsnitlig porestørrelse på 3 jxm, og med membraner, der har en gennemsnitlig porestørrelse på 1,2 μΐη (Immunodyne I® katalog nr.

5 B1A030HC5 henholdsvis B1A012HC5, Pali Corporation, East Hill, NY).

Fremstilling af testsuspension

Serumprøver indeholdende kendt koncentration af cytoplasmisk antigen (48-50 kD) af svampen Candida Albicans fremstilles af indsamlet bloddonorsera podet med antigen med koncentrationer på 500 ng/ml, 200 ng/ml, 100 ng/ml, 50 ng/ml og 25 ng/ml.

10 Sporstoffremstilling A. Fremstilling af partikelformet liposommærke 1. Til en 100 ml rundbundet rotationsinddamperkolbe tilsættes: a. 50 mg cholesterol (Sigma #CH-S), b. 94 mg distearoylphosphatidylcholin, (Avanti Polar Lipids #850365), 15 c. 10 mg distearoylphosphatidylglycerol (Avanti Polar Lipids), d. 3,75 mg tværbindingsmiddel (distearoylphosphatiylethanolamin-p-maleimidophenyl) capryl (Becton Dickinson Immunodiagnostic, Orangeburg, N.Y.), og e. 50 ml chloroform (Fisher).

2. Der omrystes for at blande.

20 3. Der placeres på rotationsinddamper med følgende indstillinger:

Vandbadstemperatur = 44*C Rotationshastighed = 4 10 DK PR 172575 B1 4. Vakuum forøges langsomt indtil skumning ophører (ca. 30-40 minutter).

5. Trykket reduceres og lipisomerne får lov til at sammensluttes ved 44’C i 30 minutter.

6. Der lyofiliseres natten over.

7. På en rotationsinddamper tilsættes 50 ml destilleret vand og der omrøres ved 60eC

5 uden vakuum indtil lipidfilmen opløses.

8. Der fryses i tøris og methanol.

9. Der lyofiliseres til en tør pulveriseret liposom.

10. Der fremstilles separat en farvet opløsning af sulforhodamin B (0,1 M i natriumace tatsaltopløsningspuffer, 0,1 M, pH 4,5).

10 11. Der tilsættes 50 ml af den farvede opløsning af liposompulveret og opvarmes til 60°C

i 15 minutter.

12. Det varme liposompræparat ekstruderes gennem en 1,0 μπι, en 0,4 μία og derefter en 0,2 μχα Biorad Uniporepolycarbonatmembran (Biorad).

13. Det frie farvede materiale adskilles fra liposomsuspensionen på en Sepharose CL6B

15 kromatografisøjle (Pharmacia), der er ækvilibreret i 50 mM natriumacetatpuffer, pH

4,5 med 1 mM EDTA og 50 mM NaCI.

14. Liposomerne lagres i den i trin 13 angivne puffer.

B. Kobling af partikelformet liposommærke til specifikt bindingsmateriale.

11 DK PR 172575 B1 1. Gedeantistof over for kanin (6 mg, Jackson Immuno Research, Westgrove, PA) i phosphatpuffet saltopløsning (100 mM, pH 7,5) blandes med SPDP (Sigma) i et molært forhold på 6,6 SPDP: 1 mg antistof; blandingen 5 skylles med nitrogen og forsegles. Den får lov til at reagere i 30 minutter ved stuetemperatur under omrøring.

3. Der tilsættes t/10 volumen 1 M natriumacetat, pH 1,5 g omrøres i 30 sekunder.

4. Der tilsættes 1/100 volumen 1 M dithiothreitol i vand.

10 5. Dithiothreitol fjernes ved at føre reaktionsvolumenet over en Sephadex G-25-medium-søjle, der er ækvilibre-ret med Tris-puffer (50 mM Tris, 50 mM natriumacetat, 50 mM NaCl, 1 mM EDTA, pH 8,0). Der skylles med nitrogen og forsegles.

15 6. OD2iiU og poolproteinholdige fraktioner registreres.

7. Denne opløsning blandes med 10 ml frisk fremstillet liposomer. Liposommængden bestemmes af forholdet 20 μΜ phosphor til 1,25 mg udvundet protein. Phosphorbestemmelsen kan variere fra lipo sompræparat til liposomprxparat.

20 8. Der skylles med N2 og forsegles.

9. Der omsættes i 2 timer natten over ved stuetemperatur.

10. Det koblede produkt fraskilles på en Sepharose Fast Flow®-kromatografisøjle (Pharmacia), der er ækvilibre- 12 DK PR 172575 B1 ret med standardboratpuffer (pH 8).

11. Der opsamles og pooles tomvolumenfraktion.

12. Der lagres ved 4eC.

Analvseprocedure 5 Analyser køres med og uden indretningen. Når der ikke anvendes nogen udleveringsindretning sættes testsuspensionen og alle reagenser direkte til testområdet i diagnosticerings-indretningen. Når udleveringsindretningen anvendes, indsættes den i diagnosticerings indretningsåbningen og en testsuspension (200 μΙ) placeres i kammeret. Den strømmer gennem til testområdet og derfra gennem absorptionslaget. En aliquot mængde kaninantistof over 10 for cytoplasmisk antigen (48-52 kD) fra svampen Candida albicans (ISO μΐ, 300 μg/ml) placeres derefter i kammeret i udleveringsindretningen og får lov til at strømme gennem til testområdet. Derefter fjernes udleverings indretningen fra diagnosticeringsindretningen og kasseres. Sporstoffet (150 μΐ) tilsættes.

Testområdet vaskes derefter med vaskepufferen (0,1 M guanidin- HC1), og resultaterne 15 aflæses derefter ved visuelt at observere tilstedeværelsen af en markant lyserød farve (trekant) .

Den totale tid til udførelse af hver analyse er 3 til 5 minut- ter. I tabel I betegner symbolet " + +" tilstedeværelsen af en markant lyserød farve på testområdet, symbolet" +" betegner en svag lyserød farve, og symboletbetyder, at der ikke observeres nogen farve. Anven-20 delsen af udleveringsindretningen forbedrer analysens følsomhed væsentligt, fra 200 ng/ml til 25 ng/ml.

13 DK PR 172575 B1

Tabel 1

Analyse- Antigenkoncentration ng/ml format 500 200 100 50 25 ingen udleve- + + + 5 ringsindretning 3 μπι indretning ++ ++ + + + + + 1,2 μπι indretning + 4- ++ ++ + + +

Eksempel 2

Fremstilling af diagnosticeringsindretning 10 Nitrocellulosemembraner, som har en gennemsnitlig porestørrelse på 5 μπι (MSI, West Borough, MA), belægges med 50 μΐ af et monoklonalt antistof til det cytoplasmiske antigen (48-52 kD) til svampen Candida Albicans, der er beskrevet i US patent nr. 4.670.382. Belægningsopløsningen indeholder antistoffer svarende til 75 μg/ml i en phosphatpufret saltvand (0,1 M, pH 6,0), der indeholder 0,2% NaN3. Efter tørring bliver membranen 15 blokeret med 0,5 % gelatine i phosphatpufret saltvand (0,1 M, pH 8,0). Membranerne tørres derefter.

Testindretningen samles ved, at man placerer nitrocellulosemembranerne øverst i et sammensat lag. De to nederste lag består af absorberende cellulosepapir (6,3 mm tyk). Oven over disse nedre lag anbringes et porøst afstandsdannende lag, der består af et ikke-vævet 20 netværk af rayon (Schleicher & Schuell katalog nr. 5-S). Oven over rayonlaget placeres en unidirektionel strømningsstyrende membran af polycarbonat, der har en porestørrelse på en 1,0 μπι (Nuclepore, Pleasantville, CA). De fire lag syes sammen, og det porøse nitrocelluloseunderstøtnings lag placeres ovenpå. De samlede sammensatte lag har en størrel- 14 DK PR 172575 B1 se på 1 cm2 og er 0,5 cm tykt. Antistofområdet på nitrocellulosemembranen har en udformning som en trekant. Det sammensatte lag placeres i en beholder, som vist i figurerne.

Analysen blev udført under anvendelse af en udleveringsindretning og et sporstof, som beskrevet i sammenligningseksempel 1. Med udleveringsindretningen indsat i åbningen i 5 diagnosticeringsindretningen blev en 200 μΐ prøve af serum, der var podet med 10 ng/ml af det cytoplasmiske antigen (48-52 kD) fra svampen Candida Albicans, tilsat og fik lov til at strømme igennem og ned til diagnosticeringsindretningen. En aliquot mængde af antistoffer fra kaniner mod antigenet (150 μΐ, 75 μξ/ηύ) placeredes derefter i kammeret i udleveringsindretningen, hvorefter det strømmede til testområdet. Derefter fjernedes udleve-10 ringsindretningen og kasseredes. Sporstoffet (150 μΐ) tilføres til testområdet. Efter at sporstoffet var strømmet gennem testområdet, vaskes testområdet med en vaskepuffer (0,1 M guanidin HC1), og resultatet udlæses ved betragtning med øjet af tilstedeværelse af en udtalt lyserød trekant i testområdet. Når eksperimentet blev gentaget under anvendelse af serum, der ikke var podet med antigen, observeredes et negativt resultat.

15 Eksempel 3

Fremstilling af udleveringsindretningen

Et kammer og et håndtag fremstilles af polystyrenharpiks (K- harpiks JCR03, Phillips Petroleum, Bartlesville, OK). Kammeret er cylindrisk med en udvendig diameter på 1,0 cm.

Rumfanget er på 400 μ\. Kammeret er fremstillet med en 0,3 cm stor åbning i bunden.

20 Kammeret passer tæt ned i åbningen i gennemstrømningsindretningen.

En strømningsstyrende membran er fastgjort ved varmeforsegling til kammerets bund. Det dækker fuldstændigt åbningen i kammerets bund. Membranerne, der anvendtes, var af nylon 66 (Immunodyne I®, Pali Corporation, East Hills, NY) eller nitrocellulose (MSI, West Borough, Mass.). De strømningsstyrende membraner i udleveringsindretningen var behand-25 let med blokeringsopløsninger, der var fremstillet på følgende måde:

Claims (9)

1. Udleveringsindretning til udlevering af en væskeprøve med styret hastighed til en diag nosticeringsindretning, og som omfatter et porøst understøtningslag (45) med en øvre overflade, hvorpå et specifikt udformet testområde (48) er placeret, og hvor den øvre overflade også strækker sig uden for testområdet (48), kendetegnet ved, at den omfatter et kammer (10) (eng: well) til optagelse af væskeprøven, hvilket kammer (10) har 25 en bund (13), en åbning (14) i kammerets (10) bund (13), og som er udformet med samme DK PR 172575 B1 størrelse og form som testområdet (48), og en strømningsstyrende membran (30), som er fastgjort til kammeret (10), og som dækker åbningen (14), og hvorigennem væskeprøven kan udleveres på det specifikt udformede testområde (48) på den øvre overflade af det porøse understøtningslag (45).

2. Udleveringsindretning ifølge krav l, kendetegnet ved, at den yderligere omfat ter midler til selektivt at fjerne forstyrrende medier fra en væskeprøve uden at udfælde en analyt i væskeprøven.

3. Ud leverings indretning ifølge krav 2, kendetegnet ved, at midlerne til selektivt at fjerne forstyrrende medier består af et bestemt bindingsmateriale for det forstyrrende 10 medie.

4. Udleverings indretning ifølge krav 3, kendetegnet ved, at det bestemte bindingsmateriale er påført den strømningsstyrende membran (30).

5. Udleveringsindretning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den strømningsstyrende membran (30) er påført en analysereagent, der kan frigives.

6. Udleveringsindretning ifølge krav 1, kendetegnet ved, at den yderligere omfat ter et håndtag (20), der er fastgjort til kammeret (10) for at gøre håndtering af indretningen nemmere, uden at man kommer til at berøre væskeprøven i kammeret (10).

7. Diagnosticeringskit, kendetegnet ved, at det omfatter en udleveringsindretning, som angivet i et eller flere af de foregående krav, med en diagnosticeringsindretning.

8. Fremgangsmåde til bestemmelse af en analyt i en væskeprøve under brug af udleverings- indretningen/diagnosticeringskittet ifølge et eller flere af kravene 1-7, kendetegnet ved, at udleveringsindretningens kammer (10) placeres ud for testområdet (48), at der tilføres en væskeprøve til kammeret (10), at væskeprøven bringes til at strømme med en styret udstrømningshastighed, at væskeprøven bringes i berøring med en øvre overflade af DK PR 172575 B1 understøtningslaget (45) ved det specifikt udformede testområde (48), samtidig med, at der uden for testområdet (48) ikke påføres dele af væskeprøven, og hvor det i det specifikt udformede testområde (48) bindingsmateriale (eng: binding species) til analytten ikke samvirker med understøtningslaget, og at der derefter foretages en detektering af tilstede-5 værelsen af analytten i væskeprøven, som er kommet i berøring med det specifikt udformede testområde (48), ved anvendelse af et sporstof.

9. Diagnosticeringskit ifølge krav 7, og som omfatter en udleveringsindretning til en væskeprøve til en diagnosticeringsindretning, især en gennemstrømningsdiagnosticeringsindretning med en styret strømningshastighed, kendetegnet ved, gennemstrømningsdi-10 agnosticeringsindretningen består af et hus med en åbning, en porøs understøtning (45), som har en øvre overflade med et specifikt udformet testområde (48), og område uden om det specifikke testområde (48) på den porøse understøtning (45), og at udleveringsindretningen til væsken består af et kammer (10) til optagelse af væskeprøven, og hvor kammerets (10) sidevæg (12) afsluttes af en bund (13) og hvor en åbning (14) i kammerets (10) bund (13) 15 har samme størrelse og form som det specifikt udformede testområde (48) i gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen, og hvor der til kammeret (10) er fastgjort en strømnings-styrende membran (30), som dækker den åbning (14), hvorigennem væskeprøven udleveres til det specifikt udformede testområde (48) på den øvre overflade af den porøse understøtning (45) i gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen, hvilken udlevering af væskeprø-20 ven foregår med en styret hastighed, når kammeret (10) er placeret ud for gennemstrømningsdiagnosticeringsindretningen.