CN106167833A

CN106167833A - 一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的rt‑pcr引物和探针组合及试剂盒

Info

Publication number: CN106167833A
Application number: CN201610343472.6A
Authority: CN
Inventors: 陈瑶; 吴英松; 李明
Original assignee: Southern Medical University
Current assignee: Southern Medical University
Priority date: 2016-05-20
Filing date: 2016-05-20
Publication date: 2016-11-30
Anticipated expiration: 2036-05-20
Also published as: CN106167833B

Abstract

本发明具体公开了一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT‑PCR引物和探针组合及试剂盒，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～24所示。以所述引物和探针组合为基础，结合实时定量PCR技术灵敏可靠的优势以及微列阵技术同时检测多种基因表达量的优势，开发一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT‑PCR阵列试剂盒，一次RT‑PCR反应可以同时快速检出8种虫媒脑炎病毒，以实现RT‑PCR检测多种病原体的集成化和高通量。可以应用于大规模病原体筛查，为致病性脑炎虫媒病毒感染诊断和确定感染源提供技术支持，对致病性脑炎临床防控具有重要的现实意义。

Description

一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合及试剂盒

技术领域

本发明涉及疾病体外诊断领域，具体涉及一种同时检测8种脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合及试剂盒。

背景技术

病毒感染引起的神经系统损伤已经逐渐成为临床上最常见的中枢神经系统感染性疾病，烈性脑炎病毒类、肠道病毒等多重病毒感染均可以引发不同程度神经系统症状。80％以上的中枢神经系统病毒感染是由肠道病毒(enteroviruses)引起的，包括柯萨奇病毒(Coxsackie virus)、埃可病毒(ECHO virus)及脊髓灰质炎病毒(polio-virus)等。近几年，一些新发现的脑炎病毒，尤其是一系列虫媒性病毒和人畜共患性脑炎病毒以其症状复杂，诊断困难，死亡率高逐渐引起了人们的严重关注。目前的研究表明脑炎病毒感染的临床症状包括发热、头疼，咳嗽、咽痛、躯体疼痛、头痛、畏寒和疲劳等。有时还会出现腹泻和呕吐，病情可迅速进展，突然高热、肺炎，重者可能出现意识模糊，抽搐，颈项强直，呼吸衰竭、多器官损伤，导致死亡。目前尚无特效的治疗药物以及相应疫苗。因此对于病毒性脑炎的早期快速诊断，对疾病的治疗、控制以及预防都具有重要的现实意义。

虫媒病毒性脑炎是由嗜神经性虫媒病毒引起中枢神经系统疾病。嗜神经性虫媒病毒是一组以吸血昆虫为传播媒介的病毒，其中多种病毒可以造成急性脑炎，病死率高，造成严重的公共卫生问题。嗜神经性虫媒病毒主要包括：黄病毒属(flavivirus)的日本脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)、森林脑炎病毒(tick-borne encephalitisvirus，TBE)、西尼罗病毒(West Nile virus，WN)；甲病毒属(alphavirus)的东方马脑炎病毒(eastern equine encephalomyelitis virus，EEEV)、西方马脑炎病毒(western equineencephalomyelitisvirus，WEEV)、委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan equineencephalomyelit is virus，VEEV)和布尼亚病毒科(Bunyaviridae)加利福尼亚脑炎病毒组(California encephalit is virus group，CEV)等，其引起的人类脑炎症状十分危急而凶险，临床表现与乙型脑炎很相似，病死率约在35％以上。是目前国际社会列为防生物恐怖的主要种类之一，在国内属一类管理的病毒种类，备受关注。以尼帕病毒(NipahVirus,NiV)和亨德拉病毒(HendraVirus，HeV)为代表的此类数种人畜共患性脑炎病毒，因为感染宿主多，病程猛烈迅速，致死率奇高，同样引发严重的关注。病毒性脑炎症状复杂，发病急骤，致死率高，常见混合感染的病例，尤其是与其他疾病及其他病毒引发的脑炎在早期症状上难以区别，因此在感染早期，快速、准确的进行鉴别和诊断，是虫媒病毒脑炎防控的重点。

临床上脑炎病毒的检测和诊断，主要依靠流行病学资料，临床表现、脑脊液实验室检查和病毒学分析。由于其症状与化脓性脑膜炎、结核性脑膜炎、真菌性脑膜炎以及肠道病毒引发的脑炎非常类似，因此常规的病毒学检测，血清学检测等，由于耗时长，疾病早期灵敏性不足，以及对操作的器械，环境，操作人员技术能力的要求较高，很难在疾病发生的早期进行大规模的筛查诊断以及提供准确及时的信息，影响行政及医疗部门对疾病流行的控制。

目前，对于病毒性脑炎来说，核酸诊断是最灵敏快捷的检测方法。目前应用于脑炎病毒的检测方法有RT-PCR、巢式PCR、多重PCR和生物芯片等。基于PCR反应的核酸诊断方法是目前最常用的实验方法。但是PCR检测不同的病原需要根据不同的特异性引物采用不同的反应体系和反应条件。因此如果要同时进行多种病原体的筛选则工作量巨大，耗时长久。高通量大样本的快速筛选成为了临床病原监测和诊断的趋势。

多重PCR也是一种能够通过在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，同时进行多种基因检测的技术。但是由于多重PCR技术存在多重引物相互影响，可能降低检测的灵敏性和特异性。在应对多重病原感染时，容易出现结果混淆，而且检测往往需要与电泳，测序，杂交等技术相联系才能获得较可信的结果，可能耗时更长，数据分析也比较复杂，目前市场上大多数的多重PCR检测，往往局限在某一种病毒或者遗传病的分型，而很少通用应用于新发突发传染病的诊断，以及大规模的病原体筛查。

生物芯片是目前最常使用的高通量的核酸检测方法。其通过微电子技术将特异性的核酸和蛋白标记在硅片、玻片或者硝酸纤维膜上，通过分子杂交的方法来进行病原学检测，具有灵敏性高，通量大的优点。但是，生物芯片应用于现场和临床还有许多的实际问题，例如研究成本高，标记技术复杂，一般实验室难以承担。方法标准化存在限制，各个实验室的设备以及对样本处理的方法不同，导致结果差异巨大，很难形成数据的可比性。假阳性和假阴性结果往往影响结果的判定，生物芯片的特异性有待提高。

因此，一种具有广泛适用性的，通量高，特异性，灵敏性强，可以用于大规模病原体筛查的检测方法，帮助疾病控制人员了解疾病发生的情况，及早确定感染病原。对于虫媒病毒的诊断，具有重要的现实意义。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供了一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合。

本发明的另一个目的是提供一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR阵列试剂盒。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～24所示，所述8种虫媒脑炎病毒为东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。

一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR阵列试剂盒，所述试剂盒含有如上SEQID NO：1～24所述的引物和探针组合，试剂盒还包含阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂。

优选地，所述引物和探针的浓度均为5～15pmol/μl。

更优选地，所述引物的浓度为10pmol/μl，所述探针的浓度为5pmol/μl。

优选地，所述阴性质控品为生理盐水，所述阳性质控品为含有东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒等8种虫媒脑炎病毒检测靶标序列的重组假病毒。更优选地，将需要检测的8种虫媒脑炎病毒的靶标序列按EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV排列顺序全部组合在一条基因链上，将该基因链整合到假病毒中，得到阳性质控品。更优选地，所述阳性质控品的浓度为1×10⁶拷贝数/ml。

制备阳性质控品中使用的假病毒是通过市售的逆转录病毒包装系统构建而成。相对于利用质粒DNA作为阳性模版的标准品来说，由逆转录病毒构建的阳性指控品完全模拟了实际情况，为衣壳和包膜包裹的RNA片段，可以为实验的全过程，包括病毒核酸的提取，RNA至DNA的逆转录，以及最后的核酸扩增进行阳性参照。

优选地，所述试剂盒由以下成分组成：一步法RT-PCR反应缓冲液，一步法RT-PCR反应酶混合液，SEQ ID NO：1～24所述的引物和探针组合，96孔检测板，DEPC水，阳性质控品，阴性质控品。

优选地，所述试剂盒的反应体系为：一步法RT-PCR反应缓冲液2.5μl，10pmol/μl的上游引物和下游引物各0.1μl，5pmol/μl的探针0.1μl，DEPC水14.2μl，一步法RT-PCR反应酶混合液3μl，模板5μl，共25μl；其中一步法RT-PCR反应酶混合液组成为：10U/μl的热启动Taq酶0.5μl，50U/μl逆转录酶0.5μl，25mM的dNTPs 0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl，一步法酶稀释液1.1μl。

更优选地，所述试剂盒反应体系中一步法RT-PCR反应缓冲液的镁离子浓度为2.0mmol/L。最优选地，所述一步法RT-PCR反应缓冲液包含10mmol/L Tris-HCl(pH8.0)、150mmol/L KCl、2.0mmol/L MgCl₂。

优选地，所述试剂盒的反应条件为:50℃逆转录15min，1个循环；94℃15min，1个循环；最后95℃15s，55～60℃45s，45个循环。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明通过设计获得8种致病性脑炎病毒荧光实时定量PCR检测引物和探针组合，所述引物和探针的序列如SEQ ID NO：1～24所示。结合实时定量PCR技术灵敏可靠的优势以及微列阵技术同时检测多种基因表达量的优势，经过优化的实时定量PCR体系，在相同的PCR反应条件下保证阵列内不同反应管内的基因有相近的扩增效率，并且获得与单个基因实时定量PCR反应相当的灵敏度，特异性和可重复性。基于Taqman的实时定量PCR阵列方法，极大的提升了检测的灵敏性，稳定性以及检测的线性范围，尤其是封闭的反应以及实时检测不仅避免了操作误差，环境污染，还极大的减少了扩增后鉴定需要的测序，杂交，电泳等繁琐步骤。检测方法简单，省时省力，适用面广，使用方便。建立针对烈性脑炎病毒的单板、多物种荧光实时定量PCR阵列检测平台，使一次PCR反应可以同时快速检出8种致病性脑炎病毒，以实现荧光PCR检测多种病原体的集成化和高通量。RT-PCR阵列技术应用将极大满足虫媒脑炎病毒快速检测与监测工作的需要，既保证PCR诊断高灵敏和特异性，又可以满足突发性时间和传染性疾病爆发时的快速高通量检测的要求，也可以用于大规模病原体筛查，为致病性脑炎虫媒病毒感染诊断和确定感染源提供技术支持。帮助疾病控制部门了解疾病发生的情况，对致病性脑炎临床防控具有重要的现实意义。

本发明提供的实时荧光RT-PCR阵列试剂盒可以检测出虫媒脑炎病毒的最低浓度为1.0×10¹拷贝/ml，说明本发明提供的试剂盒具有非常好的灵敏度，可为灵敏、快速早期诊断虫媒脑炎病毒感染提供可靠的实验证据。

本发明的试剂盒在检测肠道病毒71型、肠道病毒75型、卡萨奇病毒B型、脊髓灰质炎病毒、登革热病毒Ⅰ～Ⅳ型、霍乱弧菌O1、霍乱弧菌O139、大肠杆菌O157毒株等具有脑膜脑炎症候的病原体时，无假阳性反应。说明本发明提供的试剂盒具有非常好的特异性，可为早期诊断虫媒脑炎病毒感染提供可靠的实验证据。

附图说明

图1为8种虫媒脑炎病毒96孔板一次性检测结构示意图，其中行1～8分别为东方马脑炎病毒，西方马脑炎病毒，委内瑞拉脑炎病毒，西尼罗病毒，日本脑炎病毒，森林脑炎病毒，尼帕病毒，亨德拉病毒检测体系；第1列为阳性质控品检测孔，第2列为阴性质控品检测孔，第3～12列为样品检测孔；每个样品按列加样同时进行8个病原检测。

图2为一步法荧光定量RT-PCR检测RNA标准品的灵敏度试验和标准曲线。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体实施例对本发明做进一步详细说明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

实施例1

1、标本和样品的准备：以构建的含有目的扩增区域的重组假病毒作为脑炎病毒检测的阳性质控品；以肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、肠道病毒75型(Enterovirus75，EV75)、卡萨奇病毒B型(Coxsackievirus B，CBV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)、登革热病毒(Dengue virus，DENV)Ⅰ～Ⅳ型、霍乱弧菌O1(Vibrio cholerae O1，Vc O1)、霍乱弧菌O139(ibrio cholerae O139，Vc O139)、大肠杆菌O157(E.coli O157)的核酸提取物(均由福建省疾病预防控制中心(CDC)提供)作为特异性参考品；以去离子水及健康人血清作为阴性质控品，分别提取上述阳性质控品与特异性参考品的RNA，阴性质控品待用。

检测样品由临床医师根据实际情况进行标本采集，可检测的标本包括，咽拭子、脑脊液、血清。采集方法如下：①咽拭子：取咽拭子浸取液，离心取上清，密封保存，低温送检；②脑脊液：采集时间为出现神经系统症状后3d内，采集量为1.0～2.0ml。采集后立即装入无菌带垫圈的冻存管中，4℃下送达实验室，-20℃以下低温冷冻保藏，需长期保存的标本存于-70℃以下冰箱。③血清：无菌采集静脉血约1ml，分别于室温和4℃静置2小时和1小时后，离心(8,000rpm，5分钟)分离并收集血清标本。标本可立即用于测试，也可以保存于-70℃待测，保存期为6个月。标本运送采用0℃冰壶。

样品RNA提取：样品RNA提取参照RNA提取试剂盒说明书进行。提取后的RNA立刻进行检测，或储存于-70℃以下冰箱用于后续检测。

2、引物和探针的设计：通过对已报导的脑炎病毒的核酸序列进行序列比对分析，以脑炎病毒特征性基因为扩增靶位点，选择无二级结构且高度保守的区段，根据引物探针设计的基本原则，结合软件和人工设计多对引物和探针，通过比对工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/)的blast比对进行引物同源性检索，进一步筛选特异性较高的引物和探针，荧光定量PCR的扩增片断大小均在50～150bp，且所有引物和探针拥有类似的GC含量和Tm值。在探针序列5’端标记作为荧光发生基团(报告基团)的6-FAM亚磷酰胺，在探针序列3’端标记借助活性连接臂偶联上作为荧光淬灭(抑制基团)的TAMARA。

3、引物和探针的筛选：以上述步骤2中设计的多组引物和探针分别检测阳性质控品与阴性参考品的RNA，经反复试验，筛选出特异性、灵敏度和重复性好的最佳引物和探针组合。

4、引物和探针浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从2pmol/μl至15pmol/μl浓度梯度的引物和从2pmol/μl至15pmol/μl浓度梯度的探针进行PCR反应，经多次重复试验发现引物和探针浓度在5～15pmol/μl反应之间均可，其中最佳的引物浓度为10pmol/μl，最佳的探针浓度为5pmol/μl。

5、镁离子浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1mmol/L至2.5mmol/L浓度梯度的镁离子进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的镁离子浓度为2.0mmol/L。

6、热启动Taq酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的热启动Taq酶用量为3～7U/反应。

7、RT酶用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从1U(酶单位)至8U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RT酶用量为1.5～3.5U/反应。

8、RNA酶抑制剂用量的优化：在25μL反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从5U(酶单位)至40U浓度梯度的酶用量/反应进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的RNA酶抑制剂用量为15～25U/反应。

9、dNTPs浓度的优化：在反应体系中其他组分不变的情况下，分别使用从0.1mmol/L至0.25mmol/L浓度梯度的dNTPs进行PCR反应，经多次重复试验，最终确定最佳的dNTPs浓度为0.20mmol/L。

10、反应体系的优化：本发明采用一步法RT-PCR体系，根据酶的活性和靶多核苷酸的长度，主要对退火温度和延伸时间进行了优化，经多次重复试验，最终确定最佳的反应温度和时间为：50℃逆转录15min，1个循环；94℃10min，1个循环；最后95℃15s，55～60℃45s，45个循环。

11、阳性质控品的制备与优化：除少数病原体可获得核酸样品外，大多数病原体由于属于烈性传染病病原体，未能获得天然核酸样品，通过人工合成的方法，将需要检测的8种虫媒脑炎病毒的靶标序列按EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV排列顺序全部组合在一条基因链上，然后由Takara公司合成该基因全长，片段大小为2629bp，基因命名为EEPV，同时由Takara公司构建重组PLPCX逆转录病毒载体，重组质粒命名为PLPCX-EEPV。PLPCX-EEPV与PVSV-G包装质粒共转染GP2-293细胞包装和制备包含靶标序列的假病毒。

为去除转染时质粒DNA或细胞裂解释放出的基因组DNA污染，病毒上清经过DNA酶消化，经RT-PCR和PCR鉴定不含有DNA污染后，将离心获得的病毒颗粒与新生牛血清混合，制备10⁶copies/μl浓度假病毒悬液，分装100μl/管，冻干后制备阳性标准品备用。使用时用DEPC水等比例稀释即可使用，每反应5μl。阴性质控品的制备与优化：阴性质控品为生理盐水，每反应5μl。

12、反应体系建立：一步法RT-PCR反应缓冲液(镁离子浓度为2.0mmol/L)2.5μl，10pmol/μl的上游引物和下游引物各0.1μl，5pmol/μl的探针0.1μl，DEPC水14.2μl，一步法RT-PCR反应酶混合液3μl，模板5μl，共25μl；其中一步法RT-PCR反应酶混合液组成为：10U/μl的热启动Taq酶0.5μl，50U/μl逆转录酶0.5μl，25mM的dNTPs0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl，一步法酶稀释液1.1μl。

试剂盒的待检样品是咽拭子、脑脊液、血清等标本。

结合优化的RT-PCR反应条件和反应体系，试剂盒的结果判定如下：

(1)如果检测样品的RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM检测通道无对数增长期或Ct值＞35，可判样品为相应病毒感染阴性；

(2)如果检测样品的RT-PCR反应体系扩增曲线在FAM检测通道有对数增长期且FAM检测通道Ct值≤32，可判定相应病毒感染阳性；

(3)如果检测样品的RT-PCR反应体系的扩增曲线在FAM检测通道32＜Ct值≤35，需要对样品重新进行核酸提取和检测操作，若再次实验结果FAM检测通道Ct值≤32，且曲线有明显对数增长期，判样品为阳性；若FAM检测通道Ct值＞35，可判样品为阴性；

本发明提供的实时荧光RT-PCR阵列试剂盒可以检测出虫媒脑炎病毒的最低浓度为1.0×10¹拷贝数/ml，说明本试剂盒具有非常好的灵敏度。可为灵敏、快速早期诊断虫媒脑炎病毒感染提供可靠的实验证据。

实施例2

一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR阵列试剂盒，试剂盒由以下试剂成分组成：一步法RT-PCR反应缓冲液(镁离子浓度为2.0mmol/L)，SEQ ID NO：1～24所示的引物和探针组合，DEPC水，10U/μl的热启动Taq酶，50U/μl逆转录酶，25mM的dNTPs，40U/μl的RNA酶抑制剂，一步法酶稀释液，阳性质控品，阴性质控品。

另外，试剂盒中还包括96孔检测板和一份使用说明书。

试剂盒的具体使用方法如下：

96孔检测板的装配。先提前配制好引物和探针混合液，然后再平分加入八连管每孔中(方便加样和减少孔之间的误差)，-20℃备用。每板每种病毒配制八个孔，板上分布如图1。引物和探针混合液的成分如下：一步法RT-PCR反应缓冲液(含MgCl₂)2.5μl，上游引物(10pmol/μl)0.1μl，下游引物(10pmol/μl)0.1μl，探针(5pmol/μl)0.1μl，DEPC水14.2μl，总体积17μl。

配制96份量的一步法RT-PCR反应酶混合液(冰盒上操作)，-20℃备用。每孔体系如下：10U/μl的热启动Taq酶0.5μl，50U/μl逆转录酶0.5μl，25mM的dNTPs0.4μl，40U/μl的RNA酶抑制剂0.5μl，一步法酶稀释液1.1μl，共3μl。

荧光定量PCR总反应体系：根据RNA提取试剂盒要求提取病毒核酸作为检测样品，每个样品按列加样同时进行十二个病原检测，均取60μl核酸提取物，混合36μl反应酶系，充分轻柔混合后，分别取8μl按照1～8的顺序加入8个检测孔中。每个96孔板为10人份检测规格。第一列为阳性质控品检测孔，第二列为阴性质控品检测孔，其余10列为样品检测孔。检测模式见示意图1。加样完成后，PCR反应管3000rpm离心30秒，放入PCR扩增仪。每孔反应体系如下：引物和探针混合液17μl，荧光定量PCR反应酶混合液3μl，模板5μl，总体积25μl。

加完样后，轻轻盖好八连管至完全闭合，离心后，上机设定程序，反应条件如下：50℃逆转录15min，1个循环；94℃15min，1个循环；最后95℃15s，55℃45s，45个循环。

在每个循环退火延伸结束时收集荧光信号，荧光模式设为FAM/TAMARA双标记模式。

结果分析：反应结束后自动保存结果，根据分析后图像调节Baseline的Start值、End值以及Threshold值(用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在3～15、End值可设在5～20，调整阴性对照的扩增曲线平直或低于阈值线)，点击Analysis自动获得分析结果，在Report界面察看结果。

试剂盒的质量控制如下：

阴性质控品：FAM检测通路扩增曲线无对数增长期或Ct值＞35；

阳性质控品：FAM检测通路扩增曲线有明显对数增长期，且FAM检测通道扩增曲线Ct值≤32；

以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

确定本试剂盒的阳性样本参考值为FAM检测通道CT值≤32，阴性样本参考值为FAM检测通道Ct值＞35，FAM检测通道32＜Ct值≤35为灰度区。

实施例3试剂盒的性能评价

灵敏度试验：将标准品10倍倍比稀释成模板，稀释度为10^-4～10^-10，对应的拷贝数浓度为10⁶、10⁵、10⁴、10³、10²、10¹、10⁰拷贝/μl 7个梯度，并设空白对照(体系中不加模板，以水代替)，按上述反应体系和反应条件进行一步法荧光定量RT-PCR反应，并绘制标准曲线，以检测为阳性的最低检测浓度确定为该方法的检测灵敏度。

标准曲线的建立：通过10倍倍比稀释RNA标准品，以10⁶～10⁰拷贝数/μl 7个稀释度进行一步法荧光定量RT-PCR后，得到扩增曲线和标准曲线(图2)；以起始模板的对数为X轴，Ct值为Y轴做回归曲线，即得到以上12种病毒检测的标准曲线，线性关系表达式见图2右纵列内，从图中的标准曲线方程可知曲线斜率处于理论值范围-3.0～-3.5之间，由斜率得出的PCR扩增效率范围在90％～110％，相关系数R²>0.98(表3)，表明不同梯度模板拷贝数的对数与Ct值之间呈良好的线性关系，其中，EEEV、WEEV、VEEV、JEV、WNV、NiV、HeV、TBEV RNA标准品均在10⁶～10¹拷贝/μl的范围之间具有良好的线性关系，空白对照均无荧光增加。将待测样品的Ct值带入表达式就可以计算出它们的初始拷贝数，也可直接从仪器上读取。

表3一步法荧光定量RT-PCR检测RNA标准品的斜率、相关系数和扩增效率

检测对象	斜率	相关系数R²	扩增效率E(％)
				EEEV	-3.337	0.997	100.227
WEEV	-3.649	0.996	94.267
				VEEV	-3.58	0.999	95.668
JEV	-3.643	0.998	99.006
				WNV	-3.448	0.998	100.843
NiV	-3.368	0.996	95.264
				HeV	-3.468	0.998	100.421
TBEV	-3.747	0.996	97.504

交叉试验和特异性试验：为了评价荧光定量PCR阵列检测的特异性，用建立好的TaqMan一步法荧光定量RT-PCR阵列体系，在一块板中一次性检测EEEV、WEEV、VEEV、TBEV、JEV、WNV、NiV、HeV、病毒株以及参考样品肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)、肠道病毒75型(Enterovirus 75，EV75)、卡萨奇病毒B型(Coxsackievirus B，CBV)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)、登革热病毒(Dengue virus，DENV)Ⅰ～Ⅳ型、霍乱弧菌O1(Vibriocholerae O1，Vc O1)、霍乱弧菌O139(ibrio cholerae O139，Vc O139)、大肠杆菌O157(E.coli O157)，每块板均设阴性对照(H₂O)和阳性对照(标准品RNA)，以确定反应特异性。结果显示，其他参考样品及阴性对照检测结果为阴性，表明该方法具有良好的特异性，能抵抗常见合并感染和污染物的干扰。结果见表4。

表4一步法荧光定量RT-PCR检测的特异性分析

SEQUENCE LISTING

<110> 南方医科大学

<120> 一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合及试剂盒

<130>

<160> 24

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 17

<212> DNA

<213> 东方马脑炎病毒

<400> 1

acctgcaccc ggaccat 17

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 东方马脑炎病毒

<400> 2

cattgtcgag ttggatttgc at 22

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 东方马脑炎病毒

<400> 3

ccttgctgac gaccaggtca cttgg 25

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 西方马脑炎病毒

<400> 4

gtgcgcccgt cagacat 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 西方马脑炎病毒

<400> 5

cgggtcttca gcgcttatg 19

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 西方马脑炎病毒

<400> 6

caatcaccgc tatcattgta tctgccc 27

<210> 7

<211> 23

<212> DNA

<213> 委内瑞拉脑炎病毒

<400> 7

aacatgacga tgacaggaga agg 23

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 委内瑞拉脑炎病毒

<400> 8

catggccata actatgatgg aagt 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 委内瑞拉脑炎病毒

<400> 9

aacacgctgg aatcgagtgg gaat 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 森林脑炎病毒

<400> 10

aaccacaccg agctgatacc a 21

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 森林脑炎病毒

<400> 11

ggaatctgtg cagtgcttct atg 23

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 森林脑炎病毒

<400> 12

ttcyaaagtg ctggctyccg taccgc 26

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> 日本脑炎病毒

<400> 13

caagggaatg aaatagtgga tgtg 24

<210> 14

<211> 21

<212> DNA

<213> 日本脑炎病毒

<400> 14

ggcactctgt tcggtgacat c 21

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> 日本脑炎病毒

<400> 15

tgccacgcca ctctgaccca tag 23

<210> 16

<211> 22

<212> DNA

<213> 西尼罗脑炎病毒

<400> 16

taacttcaaa gcccaatgtc ag 22

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> 西尼罗脑炎病毒

<400> 17

gacgttggtt tgcctttgtt a 21

<210> 18

<211> 24

<212> DNA

<213> 西尼罗脑炎病毒

<400> 18

ctacggcgtg ctactctgcg gaga 24

<210> 19

<211> 26

<212> DNA

<213> 尼帕脑炎病毒

<400> 19

atggcakaat agactkggac taagtt 26

<210> 20

<211> 25

<212> DNA

<213> 尼帕脑炎病毒

<400> 20

gcctctctmg cctgaamatt actct 25

<210> 21

<211> 27

<212> DNA

<213> 尼帕脑炎病毒

<400> 21

aactcgctgc tgcmgttcar gaaacat 27

<210> 22

<211> 21

<212> DNA

<213> 亨德拉脑炎病毒

<400> 22

ggaatccaag gaagcttcga c 21

<210> 23

<211> 19

<212> DNA

<213> 亨德拉脑炎病毒

<400> 23

cttcccagct cgtcggaca 19

<210> 24

<211> 28

<212> DNA

<213> 亨德拉脑炎病毒

<400> 24

caaagtggca tctttcatgc tccatctc 28

Claims

1.一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针序列如SEQ ID NO：1～24所示，所述8种虫媒脑炎病毒为东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉马脑炎病毒、西尼罗病毒、日本脑炎病毒、森林脑炎病毒、尼帕病毒和亨德拉病毒。

2.一种同时检测8种虫媒脑炎病毒的RT-PCR 阵列试剂盒，其特征在于，含有权利要求1所述的引物和探针组合，还包括所述试剂盒检测所需的阳性质控品、阴性质控品和荧光定量检测试剂。

3. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述引物和探针浓度均为5～15 pmol/μl。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述引物浓度为10pmol/μl，所述探针浓度为5pmol/μl。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述阴性质控品为生理盐水，阳性质控品为含有8种虫媒脑炎病毒检测靶标序列的重组假病毒。

6. 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品浓度为1×10⁶ 拷贝数/ml。

7. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒由以下成分组成：一步法RT-PCR反应缓冲液，一步法RT-PCR反应酶混合液，引物和探针组合， 96孔检测板，DEPC水，阳性质控品，阴性质控品。

8. 根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应体系为：一步法RT-PCR反应缓冲液 2.5μl，10pmol/μl的上游引物和下游引物各0.1μl，5pmol/μl的探针0.1μl，DEPC水14.2μl，一步法RT-PCR反应酶混合液3μl，模板5μl，共25μl；其中一步法RT-PCR反应酶混合液组成为：10U/μl的热启动Taq酶0.5μl，50U/μl逆转录酶0.5μl，25mM的 dNTPs0.4μl，40U/μl 的RNA酶抑制剂0.5μl，一步法酶稀释液1.1μl。

9. 根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒的反应条件为：50℃逆转录15min，1个循环；94℃ 15min，1个循环；最后95℃ 15s，55～60℃ 45s，45个循环。