CN117802274A - 一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明适用于生物检测技术领域，提供了一种森林脑炎病毒Taqman‑qPCR检测试剂盒，森林脑炎病毒Taqman‑qPCR检测试剂盒包括四组引物探针混合液中的任意一组、qPCR反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水。本发明根据森林脑炎病毒远东亚型具有代表性的19种不同的毒株设计出四种引物探针组合，能检测出大部分远东亚型毒株；本发明应用于森林脑炎病毒样本检测、蜱虫样本中森林脑炎病毒检测、和森林脑炎病毒感染动物的早期检测，具有实际意义，可利用简单的步骤就能实现检测的目的，灵敏度和准确性较高，且用时较短；本发明利用探针法qPCR检测，检测下限可达到100核酸拷贝。
Description
技术领域
本发明属于生物检测技术领域，尤其涉及一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒及其应用。
背景技术
森林脑炎病毒（tick borne encephalitis virus, TBEV）是虫媒病毒，主要由蜱虫叮咬引起病毒传播，可引发一种森林地区的自然疫源性疾病，即森林脑炎，感染者主要临床症状以中枢神经系统病变为主要特征，严重者甚至可导致死亡，严重危害林区覆盖居民的健康安全。除对人类造成危害之外，森林脑炎病毒对家禽的危害也不可忽视。感染森林脑炎病毒后，一部分家禽会出现神经系统症状，进而影响其寿命。除此之外，森林脑炎病毒感染牛、羊等动物后，其产出的牛奶、羊奶中也会含有少量森林脑炎病毒，人类食用未经消毒的牛奶及羊奶同样也会感染森林脑炎病毒。林区的饲养犬、饲养鹿等也面临森林脑炎病毒感染的威胁。
目前针对森林脑炎病毒的检测方法主要为病毒分离培养、血清学方法和分子生物学方法。病毒分离培养对细胞培养技术要求极高，不仅易被外源微生物污染，而且操作复杂、对操作人员和操作环境要求较高、耗时很长；血清学方法检测是一种可用的手段，但抗体出现时间较晚，感染前期容易出现检测不到的情况；且出于早期检测及经济等原因考虑，牲畜的感染情况可由PCR手段进行检测。
实时荧光定量PCR（qPCR）通过在PCR过程中引入荧光探针，实时监测扩增反应的进程。这种荧光探针与目标DNA序列的特定区域结合，当DNA扩增过程中的荧光信号增加时，可以定量测量目标DNA的含量。一般可以把qPCR分为DNA结合染料法（SYBR）和基于探针（Taqman）的化学法。相较于DNA结合染料法，基于探针的化学法仅能检测特异性扩增产物，不会产生假阳性，在病原体和病毒检测中应用较广。但是市场上并没有可以对森林脑炎病毒进行核酸检测的商业化产品出售。鉴于科学界、畜牧业及社会上对森林脑炎病毒的检测未满足广大需求，我们提出了一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒。
发明内容
本发明的目的在于提供一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，旨在解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qPCR反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qPCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、KCl和Tris-HCl。
进一步的，四组所述引物探针混合液分别为：
A组.TBEV-NS5-1Forward：5’-CGTACAGGACCTGGCAGTA-3’；
TBEV-NS5-1Reverse：5’-GAGCCTTGGTGTCAACCTT-3’；
TBEV-NS5-1探针：5’-FAM-TTTGAACACTCGCTGCTGTCCAA-BHQ1-3’；
B组.TBEV-NS5-2Forward：5’-TTGGCTGAGGACAAGGT-3’；
TBEV-NS5-2Reverse：5’-TCCTGAGCCTTGGTGTC-3’；
TBEV-NS5-2探针：5’-FAM-TGAACACTCGCTGCTGTCCAAAG-BHQ1-3’；
C组.TBEV-NS5-3Forward：5’-CGAATGGCCATGACTGA-3’；
TBEV-NS5-3Reverse：5’-CCTGTTCTGCTCATCAG-3’；
TBEV-NS5-3探针：5’-FAM-AGGTTGACACCAAGGCTCAGGA-BHQ1-3’；
D组.TBEV-NS5-4Forward：5’-TATGGTGAGACCTGGC-3’；
TBEV-NS5-4Reverse：5’-CTTTGAACACTCGCTG-3’；
TBEV-NS5-4探针：
5’-FAM-TGGCCATGGAACGCGCGTGAGGA-BHQ1-3’。
进一步的，森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阳性标准品为从森林脑炎病毒中提取的RNA逆转录的cDNA经稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cDNA；森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阴性标准品为胎牛血清提取的RNA逆转录而成的cDNA。
一种如上述所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒在制备检测森林脑炎病毒产品中的应用。
进一步的，所述检测森林脑炎病毒产品应用于森林脑炎病毒样本检测、蜱虫样本中森林脑炎病毒检测和森林脑炎病毒感染动物检测。
进一步的，所述森林脑炎病毒感染动物包括蜱虫、牛、山羊、狗和鹿。
进一步的，所述森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
分别以待测样品提取的RNA经逆转录制成的cDNA、按梯度稀释的6支不同浓度的阳性标准品、阴性标准品为模板，利用森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒配制qPCR反应体系，进行qPCR检测；
建立标准曲线：以不同浓度的阳性标准品的浓度对数值为横坐标，qPCR扩增所得相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的qPCR扩增所得Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的森林脑炎病毒核酸定量结果。
进一步的，所述qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5 min；每个循环95℃变性5s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明根据森林脑炎病毒远东亚型具有代表性的19种不同的毒株设计出四种引物探针组合，能检测出流行的远东亚型毒株；本发明在应用于森林脑炎病毒的检测、蜱虫中森林脑炎病毒的检测及森林脑炎病毒感染动物的早期检测具有实际意义，可利用简单的步骤就能实现检测的目的，灵敏度和准确性较高，且用时较短；本发明利用探针法qPCR检测，检出下限可达到100核酸拷贝。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。
本发明一个实施例提供了一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qPCR反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qPCR反应液包括Taq DNA聚合酶（Taq酶）、dNTPs、MgCl2、KCl和Tris-HCl。
作为本发明的一种优选实施例，森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阳性标准品为森林脑炎病毒提取的RNA逆转录的cDNA经梯度稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cDNA；阴性标准品为胎牛血清提取的RNA逆转录而成的cDNA。
作为本发明的一种优选实施例，本发明对森林脑炎病毒远东亚型的具有代表性的几种不同的毒株：MDJ-01，MDJ-02，MDJ-03，Primorye-1285，Primorye-633，Primorye-2239，Primorye-86，Primorye-90，JL-T75，Senzhang，SofjinKSY，Oshima 5-10，Oshima 08-As，DXAL-T83，DXAL5，DXAL-12，DXAL-13，Khekhtzir 17-13，Sapporo-17-Io1的NS5基因进行序列比对，找出保守区并设计四组所述引物探针混合液（荧光染料报告基团为FAM，淬灭基团为BHQ1），引物名称及序列如表1所示：
除qPCR方法之外，本发明还根据保守区设计了巢氏PCR引物，便于对qPCR方法辅助验证。引物名称及序列如表2所示：
一种如上述所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒在制备检测森林脑炎病毒产品中的应用。
作为本发明的一种优选实施例，所述森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
分别以待测样品提取的RNA经逆转录制成的cDNA、6支不同浓度的阳性标准品、阴性标准品为模板，利用森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒进行qPCR检测，反应体系中加入10 μL qPCR反应液、1 μL引物探针混合液（四种中任意一种）、1 μL待测样品cDNA/阳性标准品/阴性标准品和8 μL无菌水，总体系为20 μL。qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5min；每个循环95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环；
建立标准曲线：以不同浓度的阳性标准品的浓度对数值为横坐标，qPCR扩增所得相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的qPCR扩增所得Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的森林脑炎病毒核酸定量结果。
实施例 1、引物探针的设计及引物探针组合的扩增效率检测；
为实现对待测样本的定量研究，本发明对阳性标准品进行灵敏度检测并绘制标准曲线。本发明首先根据森林脑炎病毒远东亚型MDJ-01，MDJ-02，MDJ-03，Primorye-1285，Primorye-633，Primorye-2239，Primorye-86，Primorye-90，JL-T75，Senzhang，SofjinKSY，Oshima 5-10，Oshima 08-As，DXAL-T83，DXAL5，DXAL-12，DXAL-13，Khekhtzir 17-13，Sapporo-17-Io1不同株型NS5基因的序列比对找出保守区（8436 nt-8920 nt），共484 bp（见SEQ ID NO.17），将该保守区以EcoRⅤ平末端插入到PUC57载体中，设计含有该保守区序列的质粒，质粒DNA委托南京金斯瑞生物科技有限公司进行合成，质粒全长为3194 bp。合成后的质粒浓度为4 μg/μL，根据拷贝数=6.02×1023×质粒浓度 (ng/μL) / (质粒全长×109×660)，得到质粒的拷贝数浓度为1.14×1012 copies/μL，之后将其稀释为107 copies/μL、106 copies/μL、105 copies/μL、104 copies/μL、103 copies/μL、102 copies/μL、101 copies/μL、100 copies/μL，共8个稀释度。
分别用TBEV-NS5-1F/TBEV-NS5-1R/ TBEV-NS5-1探针；TBEV-NS5-2F/
TBEV-NS5-2R/TBEV-NS5-2探针；TBEV-NS5-3F/TBEV-NS5-3R/TBEV-NS5-3探针及TBEV-NS5-4F/TBEV-NS5-4R/ TBEV-NS5-4探针（在表3中分别用1，2，3，4代替）对上述8种不同浓度的质粒进行qPCR检测，使用Premix Ex Taq™ (Probe qPCR)试剂盒（Takara BioInc.），反应体系中加入10 μL qPCR反应液、1 μL引物探针混合液（四种中任意一种）、1 μL质粒cDNA和8 μL无菌水，总体系为20 μL。n=2，使用无菌水作为阴性对照。qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5 min；每个循环95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环，在CFX96 PCR扩增仪（Bio-Rad Laboratories）上进行。根据不同浓度的阳性标准品的浓度对数值为横坐标，qPCR扩增所得相应的Ct值为纵坐标，以107 copies/μL~100 copies/μL浓度的质粒及对应Ct值绘制标准曲线，所得Ct平均值及四种标准曲线如表3所示。
为了鉴定各组引物和探针的扩增效率，以103 copies/μL浓度的质粒为模板，分别用四种引物探针对其进行qPCR检测，n=3，方法同上，使用无菌水作为阴性对照，所得Ct平均值及标准偏差SD如表4所示。结果显示，四种引物探针组合均能有效扩增。
实施例 2、森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒阳性标准品、阴性标准品及标准曲线的建立；
利用EasyPure® Viral DNA/ RNA Kit（北京全式金生物技术有限公司）分别对森林脑炎病毒样品（4.03×106 TCID50/mL）和胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司）提取RNA，步骤按说明书进行。提取得到的RNA分别经EasyScript® One-Step gDNA Removaland cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）逆转录反应得到cDNA，步骤按说明书进行。利用TBEV-NS5-1F/ TBEV-NS5-1R/TBEV-NS5-1探针；TBEV-NS5-2F/TBEV-NS5-2R/TBEV-NS5-2探针；TBEV-NS5-3F/ TBEV-NS5-3R/ TBEV-NS5-3探针及TBEV-NS5-4F/TBEV-N
S5-4R/TBEV-NS5-4探针四种引物探针组合对森林脑炎病毒cDNA和胎牛血清cDNA进行Taqman-qPCR扩增，n=3。qPCR反应体系同实施例1，其中cDNA模板加入量为1 μL；反应条件和仪器同实施例1。同时进行以质粒为模板的Taqman-qPCR扩增，绘制标准曲线（参照实施例1）。结果中，胎牛血清cDNA作为模板无扩增；将以森林脑炎病毒cDNA所得Ct值分别代入以质粒为模板的标准曲线中，计算得到森林脑炎病毒核酸拷贝数，如表5所示。
根据表中四组引物探针组合扩增所得森林脑炎病毒拷贝数，再计算平均值得出森林脑炎病毒拷贝数为1.07×105 copies/μL。
将上述森林脑炎病毒 cDNA用无菌水梯度稀释成6个不同浓度，分别为1×105 copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102 copies/μL、1×101 copies/μL、1×100 copies/μL，作为森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中的阳性标准品。胎牛血清提RNA后经逆转录得到的cDNA为森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中的阴性标准品。
采用上述6个森林脑炎病毒cDNA阳性标准品作为模板，采用上述四种引物探针组合进行Taqman-qPCR扩增，n=2。qPCR反应体系、反应条件和仪器同实施例1。以标准品1×105copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102 copies/μL、1×101 copies/μL、1×100 copies/μL中各标准品浓度的对数值为横坐标其相应的Ct值为纵坐标，所得qPCR扩增Ct平均值及标准曲线分别如表6和表7所示，6个浓度的阳性标准品均具有良好的线性扩增特征；本森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒检测的最低检测下限为1×100 copies。
实施例 3、四组引物探针组合的特异性检测；
选择待测病毒为森林脑炎病毒（4.03×106 TCID50/mL）、同为黄病毒科的登革病毒（3.12×105 TCID50/mL）、寨卡病毒（3.98×106 TCID50/mL），分别对这3种病毒提RNA并逆转录，实验方法参照实施例2。得到的三种病毒cDNA作为模板，采用上述四组引物探针组合进行Taqman-qPCR检测，qPCR反应体系、反应条件和仪器同实施例1，n=3。四种引物探针组合对这三种病毒扩增的Ct值平均值如表8所示，可以看出这四种引物探针组合均具有良好的特异性，仅对森林脑炎病毒cDNA有扩增，对寨卡病毒cDNA和登革病毒cDNA无扩增，且阴性标准品均无扩增。
实施例 4、四组引物探针组合的重复性检测；
为确保森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒反应的精确性，排除偶然性及其他的相关因素，本发明选择1×103 copies/μL、1×102 copies/μL的森林脑炎病毒cDNA为模板，以上述四种引物探针组合进行qPCR检测，qPCR反应体系、反应条件和仪器同实施例1。批内实验每个梯度模板的qPCR反应设置n=6，所得数据如表9所示；此外，批间实验分别于三天内每天进行一次qPCR反应，共计3次，每次每个梯度模板的qPCR反应设置n=6，所得数据如表10所示。并计算SD（标准偏差）及CV（变异系数），由结果数据可知，该森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒反应具有良好的重复性，且CV较小。
实施例 5、森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒的组成和用法；
森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒包括如下独立包装的试剂：
第一容器包括引物探针混合液，为四组引物探针混合液中的任意一组，具体包括TBEV-NS5-1F/TBEV-NS5-1R/TBEV-NS5-1探针；TBEV-NS5-2F/TBEV-
NS5-2R/TBEV-NS5-2探针；TBEV-NS5-3F/TBEV-NS5-3R/TBEV-NS5-3探针；TBEV-NS5-4F/TBEV-NS5-4R/ TBEV-NS5-4探针，探针及引物浓度各10 μM。
第二容器为qPCR反应液，包括50 mM KCl、10 mM Tris-HCl、2.5 mM MgCl2、dNTPs（各50 μM）和5 U/μL的热启动Taq酶，pH为 8.3。
第三容器包括试剂盒阴性标准品，即胎牛血清中提取的RNA逆转录而成的cDNA，浓度为1 μg/μL。
第四~第九容器分别包括试剂盒阳性标准品，即森林脑炎病毒cDNA梯度稀释液，其中所含的森林脑炎病毒cDNA拷贝数浓度分别为1×105 copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102 copies/μL、1×101 copies/μL、1×100 copies/μL。
第十容器包括无菌水。
对待测样品进行qPCR检测时，反应体系的配制包括10 μL qPCR反应液、1 μL引物探针混合液（四种中任意一种）、1 μL待测样品cDNA、8 μL无菌水，总体系为20 μL。作为对照，阳性标准品及阴性对照组采用相同反应体系，作为模板的阳性标准品及阴性标准品加入量均为1 μL。
qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5 min；每个循环中，95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s；共45个循环；荧光信号采集通道选用FAM，于65℃采集荧光信号。
标准曲线的建立：采用上述6个不同浓度的森林脑炎病毒cDNA阳性标准品作为模板，采用四种引物探针组合之一进行Taqman-qPCR扩增，n=2。qPCR反应体系、反应条件同上。以6个阳性标准品1×105 copies/μL、1×104 copies/μL、1×103 copies/μL、1×102copies/μL、1×101 copies/μL、1×100 copies/μL中浓度的对数值为横坐标，其相应的Ct值为纵坐标，建立标准曲线。
结果判定：若阴性对照无扩增，且待测样品Ct值在阳性标准品1×105 copies/μL和阳性标准品1×100 copies/μL的Ct值范围之间，则认为该样品阳性，将样品Ct值代入标准曲线，可计算出待测样品中森林脑炎病毒cDNA拷贝数/μL。
实施例6、采用森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒对森林脑炎病毒、蜱虫、牛血清、山羊血清、狗血清、鹿血清样本进行森林脑炎病毒核酸检测；
对实验室保存的森林脑炎病毒、长白山林区采集到的蜱虫、长白山林区养殖场饲养并可见蜱虫叮咬的牛的血清、平原地区养殖场饲养的健康牛的血清、长白山林区活动并可见蜱虫叮咬的山羊的血清、平原地区饲养的健康山羊的血清、长白山林区活动并可见蜱虫叮咬的狗的血清、城市中饲养的健康狗的血清、长白山林区养殖场饲养并可见蜱虫叮咬的鹿的血清、平原地区养殖场饲养的健康鹿的血清进行检测，所得动物血清的采集均经过主人同意。具体包括以下步骤：
样本类型：森林脑炎病毒，蜱虫研磨液，血清样本；
森林脑炎病毒（5.12×106 TCID50/mL）共3支，用于病毒 RNA 的提取。
蜱虫研磨操作在生物安全柜内进行，随机挑取全沟硬蜱30只，以10只/管分装，共3管，加入500 μL、4℃预冷的1640 PRIM培养液，每管中放入3颗不锈钢珠，使用全自动样品研磨仪（广东睿科TG 20组织研磨仪）在70 HZ下研磨5 min，研磨液配平后12000 rpm离心10min，收集上清液并进行分装，400 μL /管，用于病毒 RNA 的提取。
将抽取出的牛、山羊、狗、鹿静脉血（每种动物血液包括从各3只独立个体中收集的血液）置于离心管或普通试管内静置30 min后放入离心机中，2000-
2500 rpm离心1-2 min，试管最上层透明液体即为血清。收取上层透明液体分装，400 μL /管，用于病毒 RNA 的提取。
核酸提取和逆转录：样品获得后保存于2-8℃，在2 h内使用EasyPure®
Viral DNA/ RNA Kit (北京全式金生物技术有限公司)进行核酸提取(方法参考核酸提取试剂盒说明书进行)，获得30μL RNA。提取的核酸样本8 μL做为模板用于逆转录反应，使用TransScript®Ⅱ One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）进行逆转录反应，方法参照说明书进行，逆转录所用引物为随机引物，共获得20 μL cDNA。
核酸检测：使用森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒检测待测样本中森林脑炎病毒的核酸。Taqman-qPCR反应操作参照试剂盒用法（实施例5）。表11-表14中数据为四组引物探针组合对森林脑炎病毒、蜱虫研磨液及各种动物血清cDNA样本扩增后的Ct平均值，1号、2号、3号为不同的待测样本。
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巢氏PCR检测：为了验证森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒检测的准确性，对上述3个蜱虫研磨液样本的cDNA进行巢氏PCR检测，采用TBEV-NS5-外Forward（SEQ IDNO.13）及TBEV-NS5-外Reverse（SEQ ID NO.14）这一对引物使用Ex Taq™酶（Takara BioInc.）在PCR扩增仪（Bio-Rad Laboratories）上进行第一轮PCR，cDNA模板用量5 µL，用无菌水补齐至50 µL反应体系，反应体系配制参照PCR试剂盒说明书。反应条件为：98℃预变性5min；每个循环98℃变性10 s，50℃退火30 s，72℃延伸2 min；共30个循环；最后72℃孵育7min。随后将第一轮的产物作为第二轮PCR的模板，采用TBEV-NS5-内Forward（SEQ IDNO.15）及TBEV-NS5-内Reverse（SEQ ID NO.16）这一对引物进行第二轮PCR，第一轮PCR产物作为模板用量5 µL，用无菌水补齐至50 µL，反应条件同上。PCR产物电泳后均可见目的条带，长度为约866 bp。使用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（天根生化科技(北京)有限公司）将目的条带进行切胶回收，按试剂盒说明书操作。回收的DNA委托第三方公司测序，测得序列通过Genebank比对，1号蜱虫研磨液样本与Senzhang株匹配率达到98.4%，2号蜱虫研磨液样本与JL-T75株匹配率达到99.1%，3号蜱虫研磨液样本与Senzhang株匹配率达到97.7%。此结果能够验证森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒的检测结果，证明森林脑炎病毒 Taqman-qPCR检测试剂盒的准确性较好。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些均不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。
Claims (7)
1.一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，包括四组引物探针混合液中的任意一组、qPCR反应液、阴性标准品、按梯度稀释的6支阳性标准品和无菌水；所述qPCR反应液包括Taq DNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、KCl和Tris-HCl。
2.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，四组所述引物探针混合液分别为：
A组.TBEV-NS5-1Forward：5’-CGTACAGGACCTGGCAGTA-3’；
TBEV-NS5-1Reverse：5’-GAGCCTTGGTGTCAACCTT-3’；
TBEV-NS5-1探针：5’-FAM-TTTGAACACTCGCTGCTGTCCAA-BHQ1-3’；
B组.TBEV-NS5-2Forward：5’-TTGGCTGAGGACAAGGT-3’；
TBEV-NS5-2Reverse：5’-TCCTGAGCCTTGGTGTC-3’；
TBEV-NS5-2探针：5’-FAM-TGAACACTCGCTGCTGTCCAAAG-BHQ1-3’；
C组.TBEV-NS5-3Forward：5’-CGAATGGCCATGACTGA-3’；
TBEV-NS5-3Reverse：5’-CCTGTTCTGCTCATCAG-3’；
TBEV-NS5-3探针：5’-FAM-AGGTTGACACCAAGGCTCAGGA-BHQ1-3’；
D组.TBEV-NS5-4Forward：5’-TATGGTGAGACCTGGC-3’；
TBEV-NS5-4Reverse：5’-CTTTGAACACTCGCTG-3’；
TBEV-NS5-4探针：
5’-FAM-TGGCCATGGAACGCGCGTGAGGA-BHQ1-3’。
3.根据权利要求1所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒，其特征在于，森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阳性标准品为从森林脑炎病毒中提取的RNA逆转录的cDNA经稀释而成的6支不同浓度的森林脑炎病毒cDNA；森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒中阴性标准品为胎牛血清提取的RNA逆转录而成的cDNA。
4.一种根据权利要求1-3任一所述的森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒在制备检测森林脑炎病毒产品中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，所述检测森林脑炎病毒产品应用于森林脑炎病毒样本检测、蜱虫样本中森林脑炎病毒检测和森林脑炎病毒感染动物检测。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述森林脑炎病毒Taqman-
qPCR检测试剂盒的使用方法包括如下步骤：
分别以待测样品提取的RNA经逆转录制成的cDNA、按梯度稀释的6支不同浓度的阳性标准品、阴性标准品为模板，利用森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒配制qPCR反应体系，进行qPCR检测；
建立标准曲线：以不同浓度的阳性标准品的浓度对数值为横坐标，qPCR扩增所得相应的Ct值为纵坐标，绘制标准曲线；
将待测样本的qPCR扩增所得Ct值代入对应的标准曲线中，得到待测样本的森林脑炎病毒核酸定量结果。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述qPCR检测的反应条件为：95℃预变性5min；每个循环95℃变性5 s，60℃退火延伸30 s，共45个循环。
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