CN115521995A - 一种多病原体的联合检测试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种病毒检测试剂盒，可以同时检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒，试剂盒中包括SEQ ID NO:1‑13所示的序列组成的脑炎病原体检测组合物。本发明的试剂盒检测时只需进行一次PCR检测，就能得出4个检测结果，且PCR过程无干扰，检测结果准确。提高了检测效率、缩短了检测周期，降低了检测成本，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。

Description

一种多病原体的联合检测试剂盒
技术领域
本发明属于病毒检测领域，具体涉及脑炎致病微生物的核酸诊断，更具体涉及日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒及检测方法。
背景技术
日本乙型脑炎病毒(Japanese encephalitis virus，JEV)简称乙脑病毒，是一种造成人类乙型脑炎(俗称大脑炎)的病原体。在分类学上，乙脑病毒属于披膜病毒科(Togaviridae)，黄病毒属第1亚群(Flavivirus belongs to subgroup 1)，为单股RNA病毒，它会造成高热、意识障碍、抽搐、呼吸衰竭及脑膜刺激征等，通过蚊虫媒介快速传播，且病死率高。
森林脑炎病毒是一种能够引起森林地区的自然疫源性疾病即森林脑炎的病原体，为单股正链RNA病毒，属黄病毒科黄病毒属，因为蜱虫是其主要传播媒介，又称蜱传脑炎病毒(tick-borne encephalitis virus，TEV)。森林脑炎病毒感染主要表现为高热、头痛、意识障碍、脑膜刺激征等，严重者可在数小时内因昏迷、抽搐、延髓麻痹而死亡。
西尼罗病毒(West nile virus，WNV)属黄病毒科黄病毒属，为单股正链RNA病毒，能够导致急性传染的人畜共患病西尼罗病毒病。感染西尼罗病毒后会伴有头痛、发热、皮疹、淋巴结肿大等症状，少数人可表现为西尼罗病毒性脑炎、脑膜脑炎和脑膜炎。
登革病毒(Dengue virus，DENV)属于黄病毒科黄病毒属的一个血清型亚群，为单股正链RNA病毒，以抗原性为依据可将其分为1、2、3、4共四个血清型，主要通过埃及伊蚊和白纹伊蚊进行传播，能够引起人类登革热以及发病率和致死率都较高的登革出血热和登革休克综合征。
病毒性脑炎是指一大类能够导致中枢神经系统感染性疾病，累及脑膜和脑实质的炎症，导致病毒性脑炎的病原体种类多种多样，其中主要的病原体有肠道病毒、疱疹病毒、虫媒病毒、副黏病毒、弹状病毒以及腺病毒等，临床上常见的有肠道病毒71型、柯萨奇病毒A16型、脊髓灰质炎病毒、日本乙型脑炎病毒、登革病毒、西尼罗病毒、圣路易脑炎病毒、森林脑炎病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、麻疹病毒、风疹病毒等。该类病原体引起的疾病临床表现大致相似，患者均表现为发热、头痛、意识障碍、抽搐以及肢体活动障碍等症状，单从临床表现和体征很难区分感染病原体，不同病原体引起的感染，其治疗方案不同。
病毒性脑炎病原体可以通过粪便、飞沫、蚊虫、鸟类进行传播，引起严重病毒性脑炎的病原体具有感染力强、传播范围广、发病率和病死率较高等特点，可引起广泛的脑炎和脑膜炎疾病，早诊断、早治疗、早隔离是防治的根本。但由于病毒型脑炎致病原种类繁多，给疾病诊断和预防带来巨大的挑战，建立一种准确快速的鉴别诊断方法意义重大。在实验室诊断手段中，一般采取对单个病原体或少数几个病原体进行核酸检测或者病毒分离和鉴定，这样时间较长，不利于对疫情快速采取应对措施。因此亟需一种不但准确性高、病原体覆盖广的快速检测方法。
申请号为CN201710204099.0的中国专利中公开了一种用于病毒性脑炎快速诊断的多重PCR试剂盒，能够快速检测六种病毒性脑炎：单纯疱疹病毒1型(HSVⅠ)、单纯疱疹病毒2型(HSVⅡ)、水痘带状疱疹病毒(VZV)、EB病毒(EBV)、肠道病毒71型(EV71)及巨细胞病毒(CMV)；其中的6对引物能够特异性扩增HSVⅠ、HSVⅡ、EBV、CMV、EV71、VZV，引物之间互不干扰，构建的mPCR体系敏感性为102-103拷贝，针对临床疑似病毒性脑炎患者15例脑脊液标本，检出6份阳性标本，其中HSVⅠ5例，CMV1例。但其针对的病毒种类有限，因此实际应用时，很多其他病毒引起的病症无法进行检测。
发明内容
为了解决上述问题，本发明提供了用于同时检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒的引物和探针及检测方法，涉及一种用于生物样本中上述四种病原体的多重核酸PCR检测的引物、探针及方法。采用上述引物和探针可通过多重PCR技术对日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒同时进行检测。
一方面，本发明提供了一种脑炎病原体检测引物组合物。
所述脑炎病原体检测引物组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示序列的引物。
所述的引物使用浓度可以为0.05μM-5μM。
优选地，所述的引物组合物中各引物的检测靶点和使用浓度如下：
Figure BDA0003854578970000031
本发明引物组合物在PCR反应中使用时至少进行一个循环步骤，这个循环步骤可以包括扩增步骤和/或染料结合步骤。扩增步骤通常包括将样本与某一对上述4种病原体引物接触，以便在样品中存在病原体核酸分子时产生病原体扩增产物。扩增产物的检测和分辨可以采用多种方法(如对扩增产物的测序、琼脂糖凝胶电泳分析、SYBR荧光染料法、TaqMan探针法等)。
另一方面，本发明提供了一种脑炎病原体检测组合物。
所述的脑炎病原体检测组合物中包括前述的引物组合物和探针序列。
优选地，所述的探针序列选自SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ IDNO:13中的一种或多种。
所述的引物使用浓度可以为0.05μM-5μM。
优选地，所述的探针序列的检测靶点和使用浓度如下：
检测靶点 探针序列 使用浓度
日本乙型脑炎病毒 探针SEQ ID NO:3 0.25pmol/μL
森林脑炎病毒 探针SEQ ID NO:6 0.0625pmol/μL
西尼罗病毒 探针SEQ ID NO:9 0.0625pmol/μL
登革病毒 探针SEQ ID NO:13 0.0625pmol/μL
再一方面，本发明提供了前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物在制备日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒中的应用。
优选地，所述的试剂盒为PCR检测试剂盒。
所述的试剂盒中包括前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物。
优选地，所述的试剂盒中包括前述的脑炎病原体检测组合物。
所述的脑炎病原体检测组合物通过单管PCR反应完成扩增。
所述的脑炎病原体检测组合物在试剂盒中可以分开提供，也可以混合提供。
所述的试剂盒中还包括酶混合液，所述的酶混合液中包括Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶。
优选地，所述的Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶的用量比为1：2-1：5，优选为1：3。
进一步优选地，所述的混合酶为将H-Taq酶(5U/μL)和Neoscript RT酶(5U/μL)按照一定比例混合而成，每人份为3μL H-Taq酶与1μL Neoscript RT酶混合。
优选地，所述的试剂盒中还包括阴性对照品和阳性对照品。
所述的阴性对照品为无菌生理盐水，所述的阳性对照品为灭活后的检测范围内的日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒病原体阳性的临床样本。
所述的检测范围为≥400.0copies/mL。
所述的试剂盒中还包括其他用于PCR反应的试剂，包括但不限于：PCR buffer、DNA聚合酶、dNTPs、催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子。
又一方面，本发明提供了一种病毒检测试剂盒。
所述的试剂盒为日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒。
优选地，所述的试剂盒为PCR检测试剂盒。
所述的试剂盒中包括前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物。
优选地，所述的试剂盒中包括前述的脑炎病原体检测组合物。
所述的脑炎病原体检测组合物通过单管PCR反应完成扩增。
所述的脑炎病原体检测组合物在试剂盒中可以分开提供，也可以混合提供。
所述的试剂盒中还包括酶混合液，所述的酶混合液中包括Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶。
优选地，所述的Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶的用量比为1：2-1：5，优选为1：3。
优选地，所述的混合酶为将H-Taq酶(5U/μL)和Neoscript RT酶(5U/μL)按照一定比例混合而成，每人份为3μL H-Taq酶与1μL Neoscript RT酶混合。
优选地，所述的试剂盒中还包括阴性对照品和阳性对照品。
所述的阴性对照品为无菌生理盐水，所述的阳性对照品为灭活后的检测范围内的日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒病原体阳性的临床样本。
所述的检测范围为≥400.0copies/mL。
所述的试剂盒中还包括其他用于PCR反应的试剂，包括但不限于：PCR buffer、DNA聚合酶、dNTPs、催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子。
又一方面，本发明提供了一种用于非诊断目的检测脑炎病原体的方法。
所述方法包括以下步骤：
1)使用前述的引物组合物和/或脑炎病原体检测组合物、试剂盒对病原体核酸进行荧光定量PCR；
2)获得并分析结果。
优选地，所述荧光定量PCR为单管荧光定量PCR。
在本发明中，采用TaqMan探针检测扩增产物中有无病毒核酸，当有荧光信号增长时表明样品中存在上述4种病原体，当无荧光信号增长时表明样品中不存在上述4种病原体。对于区分检测的日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒，可以使用不同的荧光基团标记到不同的探针上来进行信号的区分。
由于碱基互补配对原则，引物和(或)探针之间会形成二聚体，在设计之初已排除掉。但多种病原体联合检测时，引物和探针众多，引物和引物、探针和探针或者引物和探针之间容易发生二聚体，要保证设计的保守性(保守性对检测的准确性至关重要)，又要考虑不同引物探针之间的相互干扰，需要精心对引物探针进行设计，本发明的脑炎病原体检测组合物可以避免相互干扰的问题。
本发明的有益效果：
(1)本发明采用多重PCR技术，通过对各病原体的保守序列设计引物探针，且确保各引物探针之间不存在互相干扰，在一管反应液中能同时检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒。一个标本，只需进行一次核酸提取和同时进行一次PCR检测，就能得出4个检测结果，且PCR过程无干扰，检测结果准确。可以很大程度上提高检测效率、缩短检测周期，降低检测成本，为临床医生提供较为充分的快速诊断以及排除不同病原体感染的依据，缩短临床医生对患者病情诊断的时间，加快对患者实施治疗措施。
(2)本发明中的检测方法可基于实时荧光PCR，把PCR、分子杂交和光化学融为一体，将PCR敏感性与探针特异性相结合，在很大程度上改变了传统PCR的缺陷，缩短了反应时间，简化了操作步骤。使PCR扩增和产物分析的全过程均在封闭条件下进行，避免了由于样本间交叉引起的假阴性和环境污染。
附图说明
图1为本发明建立的试剂盒对检测范围内的四种病原体检测图。
图2为日本乙型脑炎病毒灵敏度400copies/mL检测图。
图3为森林脑炎病毒灵敏度400copies/mL检测图。
图4为西尼罗病毒400copies/mL检测图。
图5为登革病毒400copies/mL检测图。
图6为本申请以外的引物和探针组成了不同的检测体系对日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒的检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明实施例基于聚合酶链式反应(PCR)，本领域技术人员知晓，常见的PCR反应体系组成至少含有如下组份：PCR buffer、DNA聚合酶、dNTPs、引物和/或探针以及催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子。常见的PCR buffer由Tris-HCl、MgCl2、KCl、Triton X-100等缓冲体系构成。一般单个PCR反应管中总体积为20-200μL，PCR buffer中加入合适浓度的DNA聚合酶、dNTPs、金属阳离子等组份，其中引物和/或探针的使用浓度可以为0.05μM-5μM不等。
实施例1日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测方法
本实施例中PCR反应体系如下：
组份 每一个反应中的体积/浓度
PCR buffer 22.825μL
dNTPs(100mM) 0.40μL
1mol/L MgCl<sub>2</sub> 0.80μL
引物SEQ ID NO:1(50pmol/μL) 0.40μL
引物SEQ ID NO:2(50pmol/μL) 0.40μL
引物SEQ ID NO:4(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:5(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:7(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:8(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:10(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:11(50pmol/μL) 0.10μL
引物SEQ ID NO:12(50pmol/μL) 0.10μL
探针SEQ ID NO:3(50pmol/μL) 0.20μL
探针SEQ ID NO:6(50pmol/μL) 0.05μL
探针SEQ ID NO:9(50pmol/μL) 0.05μL
探针SEQ ID NO:13(50pmol/μL) 0.05μL
RNasin(核糖核酸酶抑制剂) 0.125μL
TE缓冲液 10μL
酶混合液的配制：
酶混合液由Neoscript RT逆转录酶和H-Taq酶组成。将H-Taq酶(5U/μL)和Neoscript RT酶(5U/μL)按照一定比例混合而成(每人份为3μL H-Taq酶与1μL NeoscriptRT酶混合)。
本实施例具体的检验步骤及反应条件如下：
1、试剂准备：
根据待测样本、阳性对照、阴性对照的数量，按比例(PCR反应液36μL/人份+酶混合液4μL/人份)取相应量的PCR反应液和酶混合液，充分混匀成PCR混合液，2000rpm离心10s后备用。
2、样本处理与加样
取200μL待测样本、阴性对照、阳性对照到1.5mL离心管中，使用圣湘生物科技股份有限公司的核酸提取或纯化试剂按其说明书操作进行核酸提取。
吸取上述处理好的样本、阴性对照及阳性对照各10μL分别加入对应的0.2mL PCR反应管中，每管加入40μL PCR混合液，盖上管盖。
3、PCR扩增
在ABI 7500荧光定量PCR仪、Life Technologies Quant StudioTM 5荧光PCR仪、SLAN-96P全自动医用PCR分析系统等PCR仪器上，按照一定的温度、时间设置程序进行PCR扩增。本实施例为优选方案，如下：
Figure BDA0003854578970000081
4、检验结果判定
如果该样本FAM、HEX(或VIC)、ROX、CY5通道有明显S型扩增曲线，且Ct值≤40，则判为阳性；如果该样本FAM、HEX(或VIC)、ROX、CY5通道无扩增曲线(No Ct)或Ct值>40，则判为阴性。具体如下：
Figure BDA0003854578970000082
对不同浓度的样本进行检测，检出率结果如下：
Figure BDA0003854578970000083
Figure BDA0003854578970000091
实施例2特异性实验
采用实施例1的方法对常见病毒性脑炎病原体(肠道病毒、黄热病病毒、基孔肯雅病毒、腮腺炎病毒、寨卡病毒、水痘-带状疱疹病毒、人细小病毒、腺病毒等)进行实验，检测结果示例见图1。结果表明，本发明方法对上述病毒性脑炎病原体无交叉反应。具体见下表：
Figure BDA0003854578970000092
实施例3灵敏度实验
常规方法分析实施例1试剂盒的灵敏度，试验结果表明，本试剂盒对日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒100％检测限为400.0copies/mL(见图2-5)，最低检测限为100.0copies/mL。
实施例4抗内、外源性干扰物效果测试
对实施例1的试剂盒采用常规方法分析干扰物，实验结果表明，一定浓度的地塞米松(50μg/mL)、盐酸头孢甲肟(50μg/mL)、扎那米韦(100μg/mL)、利巴韦林(100μg/mL)、阿奇霉素(100μg/mL)、盐酸组胺(200μg/mL)、倍氯美松(50μg/mL)、莫匹罗星(50μg/mL)、妥布霉素(50μg/mL)、莫米松(50μg/mL)、氟替卡松(50μg/mL)、布地奈德(50μg/mL)、曲安奈德(100μg/mL)、血红素(10μg/mL)、纯化粘蛋白(20μg/mL)、无水乙醇(20％V/V)等潜在的PCR抑制物/干扰物质对本试剂盒无明显影响。具体见下表：
Figure BDA0003854578970000101
实施例5稳定性实验
常规方法检测实施例1试剂盒的稳定性，结果表明：本试剂盒在实际储存条件(-20±5℃)下储存11个月后检测，性能稳定；37℃加速破坏稳定性实验结果表明，试剂盒在37℃恒温箱中保存24小时，结果符合质量要求；冻融稳定性试验表明，不同盒试剂盒在实际储存温度下在每次检测时间点经过一次冻融，连续检测4次，结果均符合质量要求。
对比例
将其他引物和探针组成不同的检测体系，序列见下表：
Figure BDA0003854578970000102
Figure BDA0003854578970000111
以上序列同样参照实施例1的方法用于检测日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒。具体检测结果如图6，从图中可以看出检测只出现部分扩增曲线，整体检测效果差。

Claims (10)

1.一种脑炎病原体检测引物组合物，其特征在于，所述脑炎病原体检测引物组合物包括SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQID NO:10、SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12所示序列的引物。
2.一种脑炎病原体检测组合物，其特征在于，包括权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物，还包括序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:13的探针中的一种或多种。
3.权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物或权利要求2所述的脑炎病原体检测组合物在制备日本乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒、西尼罗病毒和登革病毒联合检测试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述脑炎病原体检测组合物通过单管PCR反应完成扩增。
5.一种病毒检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物或权利要求2所述的脑炎病原体检测组合物。
6.根据权利要求5所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述脑炎病原体检测组合物在试剂盒中分开提供或混合提供。
7.根据权利要求6所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述病毒检测试剂盒还包括PCR buffer、逆转录酶、DNA聚合酶、dNTPs、催化DNA聚合酶所需要的金属阳离子中的一种或多种。
8.根据权利要求7所述的病毒检测试剂盒，其特征在于，所述逆转录酶为Neoscript RT酶，所述DNA聚合酶为H-Taq酶。
9.一种用于非诊断目的检测脑炎病原体的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
1)使用权利要求1所述的脑炎病原体检测引物组合物或权利要求2所述的脑炎病原体检测组合物或权利要求5-8任一项所述的试剂盒对病原体核酸进行荧光定量PCR；
2)获得并分析结果。
10.根据权利要求9所述的非诊断目的检测脑炎病原体的方法，其特征在于，所述荧光定量PCR为单管荧光定量PCR。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117802274A (zh) * 2024-02-27 2024-04-02 吉林大学 一种森林脑炎病毒Taqman-qPCR检测试剂盒及其应用

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