CN112646926A - 一种非洲猪瘟病毒lamp-lfd可视化检测方法、试剂盒及其使用方法 - Google Patents

一种非洲猪瘟病毒lamp-lfd可视化检测方法、试剂盒及其使用方法 Download PDF

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李宗杰
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邵东华
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Abstract

本发明涉及一种运用环介导等温扩增技术与横向流动试纸条法结合的方法即时检测非洲猪瘟病毒的检测方法，属于传染病检测领域。为了克服现有非洲猪瘟病毒检测方法的不足，本发明提供一种非洲猪瘟病毒的即时可视化检测方法，其是运用环介导等温扩增方法同时联合横向流动试纸条检测ASFV，建立LAMP‑LFD方法检测ASFV。LAMP与LFD相互结合的技术，使LAMP扩增产物的检测可视化，检测结果明显直观，并具有高特异性、高灵敏度、操作简单的特点，适用于基层和现场使用。

Description

一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使 用方法
技术领域
本发明涉及一种非洲猪瘟病毒的即时可视化检测方法，具体涉及一种运用环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条法(LFD)结合的方法即时检测非洲猪瘟病毒的检测方法，属于传染病检测领域。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever，ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus，ASFV)引起地家猪和野猪的一种急性的高度接触性传染病。ASFV是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)、非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)的唯一成员，为双股DNA病毒，病毒粒子呈二十面体对称，直径为20nm，外包囊膜，内部含有数个共同轴心的同心圆结构。不同日龄的猪群均易感，潜伏期一般为5-15天，发病过程短。临床症状与猪瘟(Classical swine fever，CSF)极为相似，表现为高热、皮肤发绀、淋巴结和胃肠黏膜等内脏实质器官出血、呼吸障碍和神经症状。
该病传播速度快，死亡率可高达100％，在我国被列为一类动物疫病，世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须报告的动物疫病，已引起世界范围的广泛关注。ASF于1921年首次在非洲肯尼亚发现，随即在非洲、欧洲和美洲等几十个国家爆发。2018年8月3日，我国第一起ASF疫情在辽宁省沈阳市某养殖场被确诊，截至11月23日，我国已经确诊85起家猪ASF疫情；从首例确诊到85起疫情，短短112天，纵跨大半个中国，我国ASF疫情形势严峻。但目前ASF没有特效的疫苗和药物用于防控和治疗，一旦确诊，防止疫情扩散的唯一有效方法就是扑杀并无害化处理。因此建立一种简单快速、准确有效的ASFV诊断方法显得尤为重要。
目前常用的ASFV检测技术有红细胞吸附试验(HAD)、直接免疫荧光试验(DIF)、聚合酶链式反应(PCR)、荧光定量PCR(qRT-PCR)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。HAD具有敏感性和特异性，适用于较宽范围的检测，因此目前常用此方法检测ASFV并用以评估疑似暴发疫情，但HAD法检测耗时长、操作不便，且部分毒株不能产生红细胞吸附现象。DIF检测急性ASF敏感性高，且快速经济，但检测亚急性或慢性的ASF时敏感性差。而基于PCR方法的核酸检测技术常用的有常规PCR和荧光定量PCR，虽然两者都能够准确诊断，但对于人员和设备要求很高，需要在实验室进行诊断，且需要昂贵的PCR仪和专门的实验耗材，对于猪场现场检测和偏远地区早期疫情的监控并不实用。
LAMP是日本学者Notomi于2000年在Nucleic Acids Res杂志上发表的一种新的适用于基因诊断的恒温核酸扩增技术。无需高端仪器和复杂反应程序，反应条件为恒温(60℃～65℃)、反应时间为30min到60min，即可将所需目的基因扩增到109拷贝数。LFD检测方法是结合免疫层析技术和分子生物学手段，在试纸条上形成有颜色的检测线，可以特异性地检测出目标产物。
有鉴于此，本发明提供一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使用方法。
中国专利申请CN201911216202.9本发明提供了一种非洲猪瘟TaqMan实时荧光定量PCR检测试剂，本发明建立基于ASFV p17蛋白的编码基因D177L的TaqMan实时荧光定量PCR检测体系，通过条件优化得到较为理想的扩增曲线和检测效果，与传统PCR检测方法相比，具有特异性更强、灵敏度更高、重复性更好、自动化程度更高反应更快等优点，且不需要电泳及紫外检测耗时更短、结果更加直观。但其操作过程相对复杂，检测要求相对苛刻，不适于实验条件较差区域的病毒快速检测。
中国专利申请CN201910889362.3提供了一种表达非洲猪瘟病毒(African SwineFever Virus,ASFV)p30蛋白的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)重组质粒的构建方法，以及根据该重组质粒构建的基因工程疫苗及构建方法。对rPRRSV-p30感染孔进行间接免疫荧光，发现视野下出现了抗PRRSV N蛋白的特异性荧光及抗ASFV p30蛋白的特异性荧光。该表达非洲猪瘟病毒p30蛋白的重组PRRSV可以保证外源蛋白ASFV的p30蛋白得到良好的高效的稳定的表达，其主要关注非洲猪瘟病毒的治疗方法，与本发明研究方向不同。
发明内容
为了克服现有非洲猪瘟病毒检测方法存在的检测结果不准确、操作复杂且耗时较长的不足，本发明提供一种非洲猪瘟病毒的即时可视化检测方法，其是运用环介导等温扩增技术同时联合横向流动试纸条技术建立的LAMP-LFD方法可视化检测ASFV。LAMP与LFD相互结合的技术，使LAMP扩增产物的检测可视化，检测结果明显直观，并具有高特异性、高灵敏度、操作简单的特点，适用于基层和现场使用。
本发明通过下属技术方案实现上述技术效果：
一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其具体包括如下步骤：
(1)质粒构建：将人工合成的GenBank中收录的ASFV P72核酸序列插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；
(2)环介导等温扩增反应：将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应，扩增反应体系中包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTP Mix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示，内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示，外引物B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No5所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；
(3)LFD检测：向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入1μL(10μM)经异硫氰酸荧光素标记的探针Flc在63℃下杂交5min，其中探针Flc序列如SEQ.No 6所示；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中静置5min后肉眼观察结果。
如上所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，所述的LAMP反应最佳体系中聚合酶浓度为320U/mL、甜菜碱浓度为1.0M、MgSO4浓度为8mM。
如上所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，环介导等温扩增反应的反应温度为63℃至65℃，优选为63℃。
如上所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法中，环介导等温扩增反应的反应时间为60min。
本发明还请求保护一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测试剂盒，其包括：
(1)PMD18-T质粒；
(2)环介导等温扩增反应体系25μL，包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTP Mix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示、内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示、外引物F3B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No 3所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；
(3)异硫氰酸荧光素标记的探针F1c；
(4)横向检测试纸条。
本发明还请求保护上述试剂盒的使用方法，其具体包括如下步骤：
(1)将样本DNA提取后插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；
(2)将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应；
(3)向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入经异硫氰酸荧光素标记的探针Flc在63℃下杂交5min；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中静置5min后肉眼观察结果。
其中样本DNA的提取可以采用DNA提取试剂盒提取或者采用常规DNA提取方法进行提取。如可以采用下述方法提取样本DNA，这对于本领域技术人员而言是容易做到的。所述的DNA提取方法包括下属步骤：
取2.5g样本与7.5mL 0.1M PBS(pH 8.0)混合，加入0.5g acid-water PVPP；150r/min进行混匀，混匀1min，冰上冷却1min，进行3个循环；加入终浓度为1％的SDS，混合10s，冰上冷却后，500g、4℃离心10min，将上清液转移到新的离心管中；向沉淀中再加入7.5mLPBS，但是不加SDS，重复上述步骤2次，将所有上清液混合，10000g、4℃离心20min；取上清液过0.22μm滤膜，滤液与1％的CTAB(向50mL pH为8.0的Tris-10mM EDTA中加入1％的CTAB)等体积混合，65℃温育30min；5000g、4℃离心10min，弃上清；向沉淀中加入适量的TE buffer以熔解DNA，再加入0.6倍体积预冷的异丙醇，冰上培育1h，10000g、4℃离心15min，弃上清；应用10mM Tris-HCl-0.1mM EDTA(pH＝8.0)重悬沉淀，加入等体积的phenol-chloroform-isoamyl(25:24:1)，10000g、4℃离心5min；上清与chloroform-isoamyl alcohol(24:1)等体积混合，10000g、4℃离心5min；上清液加入终浓度70％的乙醇和0.2M氯化钠，-20℃培育1h，10000g、4℃离心15min，应用乙醇清洗2次沉淀，室温晾干，之后用无菌水溶解。
实验例：本发明LAMP反应条件的优化
a、LAMP反应体系优化
经过多次对反应体系进行优化，最终确定LAMP反应最佳体系中聚合酶浓度为320U/mL、甜菜碱浓度为1.0M、MgSO4浓度为8mM。
b、LAMP反应温度的确定
优化后反应体系为：10x Buffer 2.5μL，MgSO4 2μL，dNTP Mix 3.5μL，内引物F2、B2各1μL，外引物F3、B3各1μL，环引物Loop B 1μL，Bst DNA聚合酶1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL。设置8个温度梯度分别为58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃，同时设置水对照。
将扩增后的反应体系产物纯化后进行琼脂糖凝胶电泳，不同温度下非洲猪瘟病毒LAMP反应体系扩增后琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示。实验结果表明，在一定范围内随着温度升高，扩增效率增大；反应温度在63℃至65℃时，扩增效率无明显差异，因此选择LAMP最适反应温度为63℃。
c、LAMP反应时间的确定
从电泳结果观察，反应时间对LAMP产物扩增有较明显的影响。反应时间为20min时即有扩增条带，随着反应时间的递增，扩增条带越明显，其中反应时间在60min时LAMP产物扩增最多。不同反应时间下非洲猪瘟病毒LAMP反应体系扩增后琼脂糖电泳结果如图2所示。
本发明运用环介导等温扩增技术(LAMP)与横向流动试纸条法(LFD)相互结合的技术，设计LAMP引物并对其中一条引物进行生物素标记，进行LAMP反应时，无需设置PCR反应的变性、退火与延伸的温度变化和多循环数扩增，只需要在63℃时保温60min，即可获得大量的目的基因。LAMP反应结束后在反应液中加入探针与LAMP反应产物进行特异性杂交，反应后的杂交液用LFD检测，在检测线位置有条带的即为目的基因阳性。LAMP与LFD的结合，使得扩增产物的检测可视化，检测结果明显直观，并具有高特异性、高灵敏度、操作简单的特点，为偏远地区与猪场现场检测提供了一定的方法。
附图说明
图1不同温度下非洲猪瘟病毒LAMP反应体系扩增后琼脂糖凝胶电泳结果。
图2不同反应时间下非洲猪瘟病毒LAMP反应体系扩增后琼脂糖电泳结果。
图3为不同浓度的模板反应后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图4不同浓度的模板的LFD检测结果。
图5不同病毒株反应后的琼脂糖凝胶电泳结果。
图6不同病毒株的LFD检测结果。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明做进一步阐述，但所述实施例并不以任何方式限定本发明专利保护的范围。本领域技术人员在本发明的基础上做出的等同替换均包括在本发明专利保护范围之内。
实施例1本发明LAMP-LFD的灵敏性实验
取构建好的PMD18-T-P72质粒，原始浓度为1198.8ng/μL，以10倍梯度稀释，选取2x108、2x107、2x106、2x105、2x104、2x103、2x102、2x101、2x100九个稀释度的模板，同时用LAMP实验用纯净水设置空白对照，用上述优化后的反应条件进行生物素标记的LAMP反应，反应产物经LFD检测；同时将反应产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，判断LFD实验结果。不同浓度的模板反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图3所示。不同浓度的模板的LFD检测结果如图4所示。
实验结果显示，LFD能检测到的最低模板浓度为2x102，1％凝胶电泳同样能检测到的浓度为2x102。
实施例2本发明LAMP-LFD的特异性实验
分别以非洲猪瘟病毒(ASFV)、伪狂犬病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪细小病毒(PPV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、日本乙型脑炎病毒(JEV)的基因组为模板，用上述已优化好的反应体系进行生物素标记的LAMP反应，设置空白对照，反应产物经LFD检测；同时将反应产物用1％琼脂糖凝胶进行电泳，判断LFD实验结果。不同病毒株反应后的琼脂糖凝胶电泳结果如图5所示。不同病毒株的LFD检测结果如图6所示。
用ASFV基因组和其他常见猪病如CSFV、PRRSV、PCV2等的基因组进行LAMP-LFD方法的特异性分析，用优化后的反应条件63℃孵育60min。反应产物经LFD检测，结果显示，以ASFV基因组为模板的反应呈阳性，以其他猪病基因组为模板的反应结果呈阴性，同时设置蒸馏水为对照的结果也为阴性。用1％琼脂糖凝胶电泳验证，结果显示只有用ASFV基因组为模板的有条带，其他猪病基因组和水对照均无条带。
序列表
<110> 中国农业科学院上海兽医研究所（中国动物卫生与流行病学中心上海分中心）
<120> 一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法、试剂盒及其使用方法
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ttatcgataa gattgatacc atgag 25
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
cacgcagaga taagctttca 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tgcagaactt tgatggaaat 20
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
taacgccatt atgcagcc 18
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gaagagctgt atctctatcc 20
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ccgttacgta tccgatcaca ttacc 25

Claims (7)

1.一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其具体包括如下步骤：
(1)质粒构建：将人工合成的GenBank中收录的ASFV P72核酸序列插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；
(2)环介导等温扩增反应：将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应，扩增反应体系中包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTP Mix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，BstDNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示，内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示、外引物F3B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No5所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；
(3)LFD检测：向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入1μL(10μM)经异硫氰酸荧光素标记的探针F1c，其中探针F1c序列如SEQ.No 6所示；在63℃下杂交5min；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中，混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中，静置5min，肉眼观察结果。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应最佳体系中聚合酶浓度为320U/mL、甜菜碱浓度为1.0M、MgSO4浓度为8mM。
3.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，环介导等温扩增反应的反应温度为63℃至65℃。
4.根据权利要求1所述的非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测方法，其特征在于，环介导等温扩增反应的反应时间为60min。
5.一种非洲猪瘟病毒LAMP-LFD可视化检测试剂盒，其包括：
(1)PMD18-T质粒；
(2)环介导等温扩增反应体系25μL，包括10x Buffer 2.5μL，MgSO4(100μM)1.5μL，dNTPMix(10μM)3.5μL，内引物F2、B2(40μM)1μL，外引物F3、B3(5μM)1μL，环引物Loop B(10μM)1μL，Bst DNA聚合酶(8000U/mL)1μL，甜菜碱1μL，模板1μL，ddH2O补足至25μL；其中内引物F2的序列如SEQ.No 1所示、内引物B2的序列如SEQ.No 2所示，外引物F3序列如SEQ.No 3所示、外引物F3B3序列如SEQ.No 4所示，环引物Loop B如SEQ.No 3所示；其中环引物Loop B的5’端进行生物素标记；
(3)异硫氰酸荧光素标记的探针F1c；
(4)横向检测试纸条。
6.一种权利要求5所述试剂盒的使用方法，其特征在于，其包括如下步骤：
(1)将样本DNA提取后插入载体PMD18-T质粒构建得到PMD18-T-P72质粒，置于-20℃保存备用；
(2)将获得的PMD18-T-P72质粒在扩增反应体系中进行环介导等温扩增反应；
(3)向反应后的环介导等温扩增反应体系中加入经异硫氰酸荧光素标记的探针Flc在63℃下杂交5min；反应结束后取5μL反应产物加入95μL无菌PBS溶液中混匀，将横向检测试纸条检测端垂直插入待测液中静置5min后肉眼观察结果。
7.根据权利要求6所述的试剂盒的使用方法，其特征在于，样本DNA的提取可以采用DNA提取试剂盒提取或者采用常规DNA提取方法进行提取。
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