CN105785034B - 基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 - Google Patents
基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105785034B CN105785034B CN201610184376.1A CN201610184376A CN105785034B CN 105785034 B CN105785034 B CN 105785034B CN 201610184376 A CN201610184376 A CN 201610184376A CN 105785034 B CN105785034 B CN 105785034B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- fetoprotein
- alpha
- nucleic acid
- fluorescence probe
- acid aptamer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
- G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
- G01N2333/4701—Details
- G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白AFP试剂盒，同时本发明还涉及测定甲胎蛋白AFP浓度的方法、测定试剂组成及成分，属于医学检验测定技术领域。本发明的试剂盒主要成分包括：红细胞裂解液、磷酸缓冲液PBS、甲胎蛋白AFP标准品、甲胎蛋白AFP核酸适体荧光探针；通过血样裂解、混合卵育处理，结合荧光分光光度计检测，从而测算出甲胎蛋白AFP的浓度大小。本发明具有样品处理简单，操作简便，检测时间短，检测特异性强，灵敏度高，检测结果重复性高等优点。
Description
技术领域
本发明属于医学检验测定技术领域，特别是涉及基于核酸适体荧光探针AFP3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法。
背景技术
甲胎蛋白（AFP）是一种糖蛋白，正常情况下，这种蛋白主要来自胚胎的肝细胞，胎儿出生后约两周甲胎蛋白从血液中消失，因此正常人血清中甲胎蛋白的含量尚不到20微克/升。甲胎蛋白在产妇羊水或母体血浆中AFP可用于胎儿产前监测。如在神经管缺损、脊柱裂、无脑儿等时，AFP可由开放的神经管进入羊水而导致其在羊水中含量显著升高。胎儿在宫腔内死亡、畸胎瘤等先天缺陷亦可有羊水中AFP增高。AFP可经羊水部分进入母体血循环。在85%脊柱裂及无脑儿的母体，血浆AFP在妊娠16-18周可见升高而有诊断价值，但必须与临床经验结合，以免出现假阳性的错误。
检测甲胎蛋白的方法有好几种，放射免疫法测得的甲胎蛋白大于 甲胎蛋白 500微克/升、且持续4周者，或甲胎蛋白在200～500微克/升、持续8周者，在排除其它引起甲胎蛋白增高的因素如急、慢性肝炎、肝炎后肝硬化、胚胎瘤、消化道癌症后，需再结合定位检查，如B超、CT、磁共振（MRI）和肝血管造影等即可作出诊断。不过，正常怀孕的妇女、少数肝炎和肝硬化、生殖腺恶性肿瘤等情况下甲胎蛋白也会升高，但升高的幅度不如肝癌那样高。肝硬化病人血清甲胎蛋白浓度多在25～200微克/升之间，一般在2 个月内随病情的好转而下降，多数不会超过2个月；同时伴有转氨酶升高，当转氨酶下降后甲胎蛋白也随之下降，血清甲胎蛋白浓度常与转氨酶呈平行关系。如果甲胎蛋白浓度在 500 微克/升以上，虽有转氨酶升高，但肝癌的可能性大，转氨酶下降或稳定，而甲胎蛋白上升，也应高度怀疑肝癌。
甲胎蛋白在肝癌出现症状之前的8个月就已经升高，此时大多数肝癌病人仍无明显症状，肿瘤也较小，这部分患者经过手术治疗后，预后可得到明显改善，故肝硬化、慢性肝炎病人、家族中有肝癌患者的人应半年检测一次。
目前没有能够直接识别甲胎蛋白的抗体和其它分子探针。因此设计一种高度设别甲胎蛋白的分子探针，并基于此建立简单快速和廉价的检测方法将提高对肝癌和胎儿先天病等于甲胎蛋白相关的疾病的的监控。
核酸适配体是近年发展起来的一类新型识别分，是指能够高特异性和高亲和力地域靶分子结的单链核苷酸分子。核酸适体可以通过配体指数富集系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by ExponentialEnrichment，SELEX）筛选获得。SELEX 技术是指应用化学法合成大容量的随机寡核苷酸(由两端的固定序列和中间的随机序列组成) 文库,通过施加选择压力(结合靶目标，淘选与靶目标高度特异结合片段的过程), 并结合体外扩增技术, 经过多轮的循环选择富集, 获得与靶物质高度特异结合的寡核苷酸分子, 可以是RNA 也可以是DNA, 长度一般为25~ 60 个核苷酸。核酸适体主要通过发生适应性折叠，通过氢键、疏水堆积作用、范德华力与靶分子相互作用，与插入或包被的靶分子形成稳定的三维空间结构。核酸适体不与靶分子结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端相互游离。与靶分子结合时，靶分子诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 端和3' 端都将参与与靶分子特定区域（类似于与抗体结合的抗原位点）的相互作用，导致5' 和3' 两端相互靠近。这一特点使核酸适体适于分子信标探针设计。其中一种分子信标设计利用了荧光染料芘分子。当一个激发态芘分子和另一个基态芘分子近距离遭遇的时候能形成激发态二聚体，能在比芘单体波长更长的位置释放一个光子。芘激发态二聚体发射峰在 480 到 500nm，而芘单体的发射峰在 370 到 400nm 之间。另外，芘分子荧光寿命比生物样品中的非特异激发荧光的寿命长，检测时可以在非特异激发荧光消失后，再来收集激发态二聚体的荧光信号，大大提高检测的特异性和灵敏度。识别甲胎蛋白的核酸适体可以应用于甲胎蛋白的临床检测，提高检测效率，降低检测成本。
核酸适体与靶物质结合所呈现的高敏感性和高特异性, 使其在疾病诊断中具有良好的应用前景, 尽管目前成熟的临床应用报道较少, 但应用适体检测靶蛋白的研究却不断增多, 基于适体的检测新技术也不断出现。核酸适体由于其独特的化学抗体特性成为新一代针对特定蛋白的分子药物或靶向载体，以及用于检测其特异性识别的靶分子物质。但是目前基于核酸适体的针对于甲胎蛋白AFP诊断试剂还很缺乏，且针对于甲胎蛋白AFP的核酸适体荧光探针检测试剂盒的开发尚未见有报道。
发明内容
本发明的目的是针对现有的易产生操作技术误差、重复性欠佳、干扰因素很多、操作繁琐、测试成本高等不足，提供一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白AFP试剂盒及其检测方法。
本发明的方案是通过这样实现的：
一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；甲胎蛋白标准品；甲胎蛋白核酸适体荧光探针；所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gagctctgac tcgctaaggt cgtcatggaggtggataact ggatccaacc acctatgga。 该序列命名为AFP3。
以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH 7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl2。
以上任一所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、甲胎蛋白标准品、甲胎蛋白核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。
以上所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白浓度。
一种用以上任一所述基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓度的方法，其特征在于，方法步骤包括：
（1）血样裂解：将血样和含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液按1:0.5~5体积比混匀，静置5~30min，再中速离心5~10min，收集上清液；
（2）混合卵育：混合卵育：取20~100μl步骤1）得到的上清液和30~50ul的用含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液，溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5~15min，使甲胎蛋白核酸适体荧光探针与血样充分结合，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
以上所述的生物医学软件为Sigma plot软件，于市面上可以购买到。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓度的方法，其特征在于，所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂中甲胎蛋白核酸适体荧光探针浓度为200~400 nmol/L，其特性还在于,所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gagctctgac tcgctaaggtcgtcatggag gtggataact ggatccaacc acctatgga。
甲胎蛋白核酸适体荧光探针不与甲胎蛋白结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离, 荧光激发后发射波长在 370~ 400nm 之间；甲胎蛋白核酸适体荧光探针与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在480 到 500nm之间。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓度的方法，其特征在于，所述的血样为肝素抗凝全血或末梢血，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液为含有1~280 mmol/L NH4Cl, 1~34 mmol/L Tris,1~2mmol/LEDTA-Na2, pH7.0~7.2；所述含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液为含有1~10mmol/L MgCl2；所述荧光检测仪为具有时间分辨荧光测定的荧光检测仪。
以上所述的一种用基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒来检测甲胎蛋白浓度的方法，其特征在于，该检测方法用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白浓度。
本发明的原理是：在不与甲胎蛋白时，核酸适体处于比较松散的结构，5' 和3' 两端的芘分子单体相互游离, 荧光发射波长在 370 到 400nm 之间；与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导核酸适体结构发生改变，核酸适体的5' 和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，芘激发态发射波长二聚体在 480 到 500nm之间。芘激发态二聚体荧光寿命有着长达100 ns，比生物样品自发荧光寿命（约为5 ns）长，通过检测甲胎蛋白核酸适体探针和样品混合后的荧光强度和荧光寿命，计算样品中甲胎蛋白的浓度。
本发明的实质性特点和显著进步是：
（1）检测操作简单快速，无需复杂样品加工和分离，将核酸适体探针直接加入裂解后的血样液，用荧光分光光度计短时间内就可以检测480~500nm处的荧光值；
（2）本试剂盒及其检测方法具有灵敏度高，检测结果重复性高，样品检测误差在0.01~0.1%之间，特异性强，甲胎蛋白核酸适体荧光探针不与甲胎蛋白结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离, 荧光激发后发射波长在 370~400nm 之间；其与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导其发生改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成二聚体，荧光激发后二聚体发射波长在 480~ 500nm之间。
（3）所用的试剂可以使配制好可直接使用的液体试剂或是使用前加水溶解后使用的干粉状态，检测试剂可以常温贮存，运输方便。
具体实施方式
以下结合表1和实施例描述本发明基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白AFP试剂盒及其检测方法。
表1.实施例中的试剂盒试剂成分组成
实施例1
按照表1中实施例1所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置30min，再中速离心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取20μl步骤1）得到的上清和45ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育5min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.05±0.01%。
实施例2
按照表1中实施例2所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.5混匀，静置5min，再中速离心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步骤1）得到的上清和30ul的
用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育6min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。 样品的3个平行测定误差为0.02±0.01%。
实施例3
按照表1中实施例3所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.5混匀，静置10min，再中速离心5min，收集上清；
（2）混合卵育：取75μl步骤1）得到的上清和45ul的
用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育7min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.04±0.01%。
实施例4
按照表1中实施例4所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:0.5混匀，静置25min，再中速离心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取100μl步骤1）得到的上清和50ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育8min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.06±0.01%。
实施例5
按照表1中实施例5所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:1.0混匀，静置20min，再中速离心9min，收集上清；
（2）混合卵育：取80μl步骤1）得到的上清和30ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育9min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.07±0.01%。
实施例6
按照表1中实施例6所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将肝素抗凝全血、红细胞裂解液按体积比1:4.5混匀，静置15min，再中速离心10min，收集上清；
（2）混合卵育：取30μl步骤1）得到的上清和40ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育10min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.08±0.01%。
实施例7
按照表1中实施例7所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:3.0混匀，静置18min，再中速离心8min，收集上清；
（2）混合卵育：取50μl步骤1）得到的上清和20ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育12min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.1±0.01%。
实施例8
按照表1中实施例8所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:2.0混匀，静置26min，再中速离心6min，收集上清；
（2）混合卵育：取60μl步骤1）得到的上清和25ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育13min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.02±0.01%。
实施例9
按照表1中实施例9所需试剂成分溶解配好后，分装入瓶，进行冷冻干燥，制成干粉试剂；使用前，加入超纯水，复溶后使用。每个样品设定3个平行，检测步骤如下：
（1）血样裂解：将末梢血、红细胞裂解液按体积比1:4.0混匀，静置8min，再中速离心7min，收集上清；
（2）混合卵育：取40μl步骤1）得到的上清和35ul的用0.2M磷酸缓冲液溶解甲胎蛋白核酸适体荧光探针得到的甲胎蛋白核酸适体荧光探针试剂混合，室温下卵育15min，得到测试液；
（3）荧光检测：荧光检测仪检测步骤2）得到的测试液50ul，在荧光检测仪荧光激发后，读取荧光激发后20至100ns时间段内波长在480~500nm的荧光值；
（4）结果计算：使用生物医学作图软件，参照甲胎蛋白标准样品制作的标准曲线，结合步骤3）中检测到的荧光值计算出血样中甲胎蛋白的浓度。
样品的3个平行测定误差为0.01±0.01%。
序列表
<110> 徐大鹏
<120> 基于核酸适体荧光探针AFP3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法
<130> 2016
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
gagctctgac tcgctaaggt cgtcatggag gtggataact ggatccaacc acctatgga 59
Claims (4)
1.一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，主要成分包括：含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液；含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液；甲胎蛋白标准品；甲胎蛋白核酸适体荧光探针；所述甲胎蛋白核酸适体荧光探针为5'和3'两端分别标记荧光芘分子单体的核苷酸单链，该核苷酸单链序列为：gagctctgac tcgctaaggt cgtcatggaggtggataact ggatccaacc acctatgga；所述的甲胎蛋白核酸适体荧光探针不与甲胎蛋白结合时，核酸适体处于比较松散的结构，5'和3'两端的芘分子单体相互游离，荧光激发后发射波长在 370~400nm之间；所述的甲胎蛋白核酸适体荧光探针与甲胎蛋白结合时，甲胎蛋白诱导其发生结构改变，核酸适体5'和3'两端的芘分子单体相互靠近，形成激发态二聚体，荧光激发后激发态二聚体发射波长在 480~500nm之间。
2.根据权利要求1所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液含有1~280mmol/L NH4Cl，1~34mmol/L Tris，1~2mmol/L EDTA-Na2，pH7.0~7.2；所述含MgCl2的0.2M磷酸缓冲液含有1~10mmol/L MgCl2。
3.根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，所述含NH4Cl、Tris、EDTA-Na2的红细胞裂解液、含 MgCl2的0.2M磷酸缓冲液、甲胎蛋白标准品、甲胎蛋白核酸适体荧光探针为配制好直接使用的液体试剂或是使用前需加水溶解的干粉状态。
4.根据权利要求1或2所述的一种基于核酸适体荧光探针的甲胎蛋白试剂盒，其特征在于，该试剂盒用于检测肝素抗凝全血或末梢血中的甲胎蛋白浓度。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610184376.1A CN105785034B (zh) | 2016-03-25 | 2016-03-25 | 基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201610184376.1A CN105785034B (zh) | 2016-03-25 | 2016-03-25 | 基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105785034A CN105785034A (zh) | 2016-07-20 |
| CN105785034B true CN105785034B (zh) | 2017-10-20 |
Family
ID=56391977
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201610184376.1A Expired - Fee Related CN105785034B (zh) | 2016-03-25 | 2016-03-25 | 基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105785034B (zh) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106645053A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-05-10 | 柳州立洁科技有限公司 | 基于高灵敏度核酸适体荧光探针ins3胰岛素试剂盒及其检测方法 |
| CN106501527A (zh) * | 2016-10-17 | 2017-03-15 | 柳州立洁科技有限公司 | 基于高灵敏度核酸适体荧光探针epo3的促红细胞生成素兴奋剂试剂盒及其检测方法 |
| CN114438091B (zh) * | 2022-02-08 | 2023-12-01 | 中国科学院生态环境研究中心 | Dna荧光探针、采用dna荧光探针检测镉离子的方法 |
Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101358241A (zh) * | 2008-09-16 | 2009-02-04 | 山东亚大药业有限公司 | 一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒 |
| CN101819206A (zh) * | 2009-12-08 | 2010-09-01 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 产前筛查afp测定试剂盒(时间分辨荧光免疫法)及其制备方法 |
| CN102732606A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-10-17 | 南昌大学 | 基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒 |
| CN104131105A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-05 | 复旦大学附属中山医院 | 一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法 |
| CN104597246A (zh) * | 2014-11-30 | 2015-05-06 | 陈燕婷 | 基于核酸适体荧光探针HCy2的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法 |
| CN104931478A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 江南大学 | 基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法 |
| EP2921857A1 (en) * | 2014-03-18 | 2015-09-23 | Medizinische Universität Wien | Soluble AXL receptor tyrosine kinase in the diagnosis of cancer |
-
2016
- 2016-03-25 CN CN201610184376.1A patent/CN105785034B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101358241A (zh) * | 2008-09-16 | 2009-02-04 | 山东亚大药业有限公司 | 一种用有核红细胞进行唐氏综合症产前基因筛查的方法和试剂盒 |
| CN101819206A (zh) * | 2009-12-08 | 2010-09-01 | 广州市丰华生物工程有限公司 | 产前筛查afp测定试剂盒(时间分辨荧光免疫法)及其制备方法 |
| CN102732606A (zh) * | 2012-02-27 | 2012-10-17 | 南昌大学 | 基于核酸适配子的肝癌诊断试剂盒 |
| EP2921857A1 (en) * | 2014-03-18 | 2015-09-23 | Medizinische Universität Wien | Soluble AXL receptor tyrosine kinase in the diagnosis of cancer |
| CN104131105A (zh) * | 2014-08-11 | 2014-11-05 | 复旦大学附属中山医院 | 一种特异性结合甲胎蛋白核酸适配体的筛选方法 |
| CN104597246A (zh) * | 2014-11-30 | 2015-05-06 | 陈燕婷 | 基于核酸适体荧光探针HCy2的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法 |
| CN104931478A (zh) * | 2015-06-11 | 2015-09-23 | 江南大学 | 基于银纳米粒子三聚体的表面增强拉曼散射效应超灵敏检测甲胎蛋白的方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| An integrated microfluidic system for rapid screening of alpha-fetoprotein-specific aptamers;Chao-Jyun Huang et al.;《Biosensors and Bioelectronics》;20120222;第35卷(第1期);50-55 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105785034A (zh) | 2016-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lambrecht et al. | Prospects in non-invasive assessment of liver fibrosis: Liquid biopsy as the future gold standard? | |
| CN107893101A (zh) | 一种用于肿瘤疾病早期诊断的试剂盒、方法及应用 | |
| CN105785034B (zh) | 基于核酸适体荧光探针afp3的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN105785033B (zh) | 基于核酸适体荧光探针afp5的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN104650234B (zh) | 抗akr1b10蛋白单克隆抗体及其应用 | |
| TWI623617B (zh) | 對卵巢癌具有專一性之適合體及其應用 | |
| CN105603101A (zh) | 检测8个miRNA表达量的系统在制备诊断或辅助诊断肝细胞癌产品中的应用 | |
| CN105606582A (zh) | 基于核酸适体荧光探针afp4的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| US20140186863A1 (en) | Method for detecting pancreatic disease marker | |
| US20230358764A1 (en) | Diagnostic methods for liver disorders | |
| CN104597246B (zh) | 基于核酸适体荧光探针HCy2的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法 | |
| CN106018829A (zh) | 一种血清淀粉样蛋白a的测定试剂及其制备方法 | |
| CN108430336A (zh) | 循环细胞、蛋白质和核酸的体内收集和局部定量以及特征分析 | |
| CN105651754A (zh) | 基于核酸适体荧光探针afp2的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN105651755A (zh) | 基于核酸适体荧光探针afp1的甲胎蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN104597008B (zh) | 基于核酸适体荧光探针HCy3的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法 | |
| CN104597007B (zh) | 基于核酸适体荧光探针HCy5的同型半胱氨酸试剂盒及其检测方法 | |
| CN104833662B (zh) | 基于核酸适体荧光探针的糖化血红蛋白试剂盒及其检测方法 | |
| CN106011142A (zh) | 一种特异识别psa蛋白的寡核苷酸配基p7-26的序列和应用 | |
| KR20120111788A (ko) | 체액 내 세포밖 소포체의 단백질 또는 유전자 분석을 통한 염증성 질환 진단 방법 | |
| CN110452955A (zh) | 一种血清ctc中微小rna的检测方法 | |
| CN104568867B (zh) | 基于核酸适体荧光探针HCy1的同型半胱氨酸试剂盒 | |
| CN103229057B (zh) | 用于信号放大的方法和试剂 | |
| CN106645053A (zh) | 基于高灵敏度核酸适体荧光探针ins3胰岛素试剂盒及其检测方法 | |
| CN105602958A (zh) | 甲胎蛋白核酸适体afp5及其制备方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB03 | Change of inventor or designer information |
Inventor after: Zhang Yan Inventor after: Xia Haoqiang Inventor after: Zhou Huangkai Inventor after: Tao Yong Inventor after: Gao Chuan Inventor after: Ma Weihong Inventor after: Chen Feiqin Inventor before: Xu Dapeng |
|
| CB03 | Change of inventor or designer information | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20170920 Address after: 510000 Guangdong city of Guangzhou province Panyu District Xiaoguwei Street Outer Ring Road No. 280 (Guangzhou) and No. 1 (1 floor apartment building 5 floor) Applicant after: GUANGZHOU HIGHER EDUCATION MEGA CENTER HEALTH INDUSTRIAL SCIENCE AND TECHNOLOGY PARK INVESTMENT MANAGEMENT CO., LTD. Address before: 535004 No. 1 Eagle Avenue, Qinzhou Port Economic Development Zone, the Guangxi Zhuang Autonomous Region, Qinzhou Applicant before: Xu Dapeng |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20171020 Termination date: 20200325 |
|
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |