CN113416798A - 用于扩增或检测人腺病毒dna的引物组及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于扩增或检测人腺病毒DNA的引物组及其应用。该引物组包括针对Penton基因设计的第一引物对、针对Hexon基因设计的第二引物对和针对Fiber基因设计的第三引物对。这三个引物对能够针对人腺病毒的不同基因进行扩增，并且扩增产物片段短，特异性强，能够对中人腺病毒基因型进行分析，能够广泛用于对人腺病毒进行分型和研究过程中；另外利用该引物组进行扩增，其反应最低检测量达到pg级，灵敏度强。

Description

用于扩增或检测人腺病毒DNA的引物组及其应用
技术领域
本发明涉及人腺病毒分型技术领域，尤其涉及用于扩增或检测人腺病毒DNA的引物组及其应用。
背景技术
人腺病毒(Human Adenovirus,HAdV)属于哺乳动物腺病毒属，主要感染人类呼吸道、消化道、泌尿生殖道。呼吸道腺病毒感染引起的呼吸系统疾病主要包括：急性呼吸道感染(Acute Respiratory Disease,ARD)。咽炎、支气管炎、肺炎等。
迄今为止，在HAdV病毒的A-G种中已鉴定出超过105个HAdV基因型。B种(HAdV-3、HAdV-7、HAdV-14、HAdV-21和HAdV-55)和E种(HAdV-4)通常与急性呼吸道疾病(acuterespiratory disease,ARD)有关，在儿童和成人呼吸道疾病中占很高比例。C种(HAdV-1、HAdV-2和HAdV-5)通常与轻度呼吸道疾病有关，而物种D的类型则导致眼病和胃肠炎。A、F和G种的细菌与胃肠炎有关。因此，快速而准确地对HAdVs进行流行病学调查和临床诊断是非常重要的。
传统的病毒中和试验可以鉴定腺病毒的血清型，但通过全基因组测序及生物信息学分析发现，HAdVs存在基因组重组现象，自HAdV-52以来鉴定的HAdV致病基因型中，几乎都是重组型。全基因组测序仍然相对昂贵，而且无法用于大规模的分子流行病学研究，也无法在疫情爆发时快速识别病毒病原体。因此，为了克服仅使用六进子采样腺病毒病原体的局限性，急需开发了一种简单、快速、经济、实用的分型方法用于HAdVs的流行病学监测。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种快速扩增或检测人腺病毒DNA的引物或试剂盒。本发明的技术方案如下：
本发明第一方面提供用于扩增或检测人腺病毒DNA的引物组，其特征在于，包括针对Penton基因设计的第一引物对、针对Hexon基因设计的第二引物对和针对Fiber基因设计的第三引物对；所述第一引物对包括：Penton-F如SEQ ID NO.1所示，Penton-R和如SEQ IDNO.2所示；所述第二引物对包括：Hexon-F如SEQ ID NO.3所示，Hexon-R如SEQ ID NO.4所示；所述第三引物对包括：Fiber-F如SEQ ID NO.5所示，Fiber-R如SEQ ID NO.6所示，Fiber-CR如SEQ ID NO.7所示。
上述技术方案中，所述引物组用于对人腺病毒进行分型，所述分型的基因型包括对B、C、D和E型人腺病毒。
本发明第二方面提供包括所述引物组的人腺病毒DNA扩增的反应体系。
上述技术方案中，所述反应体系还包括rTaq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs中的至少一种。
本发明第三方面提供利用所述引物组或者所述反应体系进行扩增或检测人腺病毒DNA分子的方法。
上述技术方案中，分别利用所述第一引物对、所述第二引物对和所述第三引物对进行PCR扩增；
使用所述第一引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用所述第二引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸100s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用所述第三引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min。
上述技术方案中，所述方法还包括对依据扩增反应判断待测样品中是否存在目标DNA分子的步骤；所述步骤包括：
当使用所述第一引物对进行扩增时，其扩增产物经电泳检测出现1.2kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性；
当使用所述第二引物对进行扩增时，其扩增产物经电泳检测出现1.6kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性；
当使用所述第三引物对进行扩增时，其扩增产物电泳检测出现1.0kb、1.5kb或2.0kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性。
本发明第四方面还提供所述引物组、或者所述反应体系在制备检测或分型人腺病毒试剂盒中的应用。
本发明第五方面还利用所述方法对人腺病毒进行基因分型的方法。
有益效果：
利用本发明提供的引物组进行扩增，扩增产物片段短，特异性强，能够对中人腺病毒基因型进行分析，能够广泛用于对人腺病毒进行分型和研究过程中；另外利用该引物组进行扩增，其反应最低检测量达到pg级，灵敏度强。
附图说明
图1为本发明实施例提供的引物与人腺病毒各型别代表株比对结果图。
图2为本发明实施例提供的通用型引物扩增产物大小与位置。
图3为本发明实施例提供的第一引物对检测人腺病毒各型代表株的结果图；M泳道代表Marker，其他各泳道依次代表B3、B7、B11、B14、B21、B55、C5、D19、E4、F41、NTC人腺病毒各型。
图4为本发明实施例提供的第二引物对检测人腺病毒各型代表株的结果图；M泳道代表Marker，其他各泳道依次代表B3、B7、B11、B14、B21、B55、C5、D19、E4、F41、NTC人腺病毒各型。
图5为本发明实施例提供的第三引物对检测人腺病毒各型代表株的结果图；M泳道代表Marker，其他各泳道依次代表B3、B7、B11、B14、B21、B55、C5、D19、E4、F41、NTC人腺病毒各型。
图6为本发明实施例提供的第一引物对检测临床样品的结果图；M为DL2000 DNAladder(TAKARA)，1-24为HAdV阳性的咽拭子样本，其中，1-18为HAdV-7，19-24为HAdV-3。
图7为本发明实施例提供的第二引物对检测临床样品的结果图；M为DL2000 DNAladder(TAKARA)，1-24为HAdV阳性的咽拭子样本，其中，1-18为HAdV-7，19-24为HAdV-3。
图8为本发明实施例提供的第三引物对检测临床样品的结果图；M为DL2000 DNAladder(TAKARA)，1-24为HAdV阳性的咽拭子样本，其中，1-18为HAdV-7，19-24为HAdV-3。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
引物组设计与合成
根据Genbank公布的不同型别的HAdV病毒株基因组序列(GenBank号为别为：HAdV-A18(NC_001460),HAdV-B3(DQ099432),HAdV-B7(KJ019879),HAdV-B11(AY163756),HAdV-B14(JQ824845),HAdV-B16(AY601636),HAdV-B21(KF528688),HAdV-B34(AY737797),HAdV-B35(AY271307),HAdV-B50(AY737798),HAdV-B55(JX491639),HAdV-B66(JN860676),HAdV-B68(JN860678),HAdV-C1(AC_000017),HAdV-C2(KX384959),HAdV-C5(AC_000008),HAdV-C6(HQ413315),HAdV-D9(AJ854486),HAdV-D19(AB448774),HAdV-D37(AB448776),HAdV-E4(KF006344),HAdV-F41(AB728839),和HAdV-G52(DQ923122))，使用BioEdit软件分别进行对序列比对分析Penton、Hexon和Fiber三个基因中的保守区域并作为特异性检测靶标，经过对所设计的大量引物进行人工合成(上海生物工程技术服务公司)和实验筛选后，选择效果最好的通用型检测引物，并命名为HVR-F、HVR-R、Fiber-F、Fiber-R、Fiber-CR、Penton-F、Penton-R，如图1所示，这些引物具有较高的通用性，引物序列如下表1所示。
表1
Figure BDA0003159049750000051
Figure BDA0003159049750000061
病毒DNA提取
NP-40裂解法提取人腺病毒DNA：取10μL病毒液(HeLa细胞扩增病毒)或0.5ml咽拭子标本(10000r/min离心5～10min，弃上清)，加入60μL NP-40裂解液(吐温20(终浓度0.5％)，NP-40(终浓度0.5％)、蛋白酶K(终质量浓度200mg/L))，55℃作用30～60min，95℃保温10min(灭活蛋白酶K)，10000r/min离心5min，取上清液即为DNA提取液。
引物有效性
NP-40法裂解得到的DNA提取液，用所设计的引物进行PCR扩增。PCR反应体系：20μl，包括2x rTaq 10μl，DNA模板1μl(≥10ng/μl)，10μmol/L上游引物0.5μl，10μmol/L下游引物0.5μl，上游引物与下游引物用量比例为1:1，用ddH2O补足至20μl。
使用第一引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用第二引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸100s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用第三引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min。
扩增产物进行2％琼脂糖凝胶电泳，浪化乙锭(EB)染色，ChampgelTM 3200凝胶图像处理系统观察结果并拍照，检验引物的有效性。
结果如图3-5所示，使用此三对通用引物对HAdV-B3，HAdV-B7，HAdV-B11，HAdV-B14，HAdV-B21，HAdV-B55，HAdV-C5，HAdV-D19，HAdV-E4和HAdV-F41进行PCR检测。所有这些HAdV类型均通过PCR扩增检测到。PCR产物单一特异且符合预期大小，靶向Penton的扩增产物为1.2kb，HVR为1.6kb，Fiber为1kb；其中有两个例外，一个是HAdV-E4纤维蛋白fiber(1519bp)，另一个是HAdV-C5纤维蛋白fiber(2027bp)，两种基因型病毒的扩增产物都比其他HAdV类型的产物长。
引物灵敏度
将NP-40法得到的病毒DNA提取液采用上述方法进行扩增，模板液中的DNA浓度进行10倍梯度稀释至10-8，采用上述实施例同样的扩增条件进行扩增，产物进行电泳检测。结果表明，选用的三组引物对均能检测到10-6梯度，即达到pg级的检测限。
临床样品检测
NP-40法裂解咽拭子样品，用所设计的引物进行PCR扩增。每批样品(24个)，检测时均设阳性对照(人3型腺病毒)及阴性对照(以去离子水代替模板DNA)，阴性结果的样品重复检测1次。PCR反应体系同上述实施例。扩增产物经2％琼脂糖凝胶电泳检测，出现特异性条带的即为阳性样品。并对阳性样品进行DNA测序和BLAST(blastn)分析。
如图6-8所示，琼脂糖凝胶电泳表明临床样品为PCR阳性。随后的DNA测序和BLAST(blastn)分析证实，18个样品为HAdV-B7，八个样品为HAdV-B3，四个样品为HAdV-B55。GenBank号如下：KY511640至KY511665，AKQ24920，AKQ24959，AKQ24998和AKQ25037(Pentonbase)；KY549654，KY511666-KY511679，KY511681至KY511691，AKQ24925，AKQ24964，AKQ25003和AKQ25042(HVR)；和KY511613至KY511629，KY511631至KY511639，AKQ24941，AKQ24979，AKQ25019和AKQ25058(Fiber)。
其中，四个被鉴定为HAdV-B55的样品显示HAdV-B14序列高度相似的Penton base和Fiber序列，以及与HAdV-B11序列高度相似的Hexon序列。这证实了这四种临床分离株为HAdV-B55型(一种在HAdV-B11和HAdV-B14之间重组的新兴呼吸道病原体)，并突出了该方法相对于仅六邻体检测的优势，即三种蛋白同时检测能辨别出临床样本中的腺病毒有无出现基因组重组。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.用于扩增或检测人腺病毒DNA的引物组，其特征在于，包括针对Penton基因设计的第一引物对、针对Hexon基因设计的第二引物对和针对Fiber基因设计的第三引物对；
所述第一引物对包括：Penton-F如SEQ ID NO.1所示，Penton-R和如SEQ ID NO.2所示；
所述第二引物对包括：Hexon-F如SEQ ID NO.3所示，Hexon-R如SEQ ID NO.4所示；
所述第三引物对包括：Fiber-F如SEQ ID NO.5所示，Fiber-R如SEQ ID NO.6所示，Fiber-CR如SEQ ID NO.7所示。
2.如权利要求1所述的引物组，其特征在于，所述引物组用于对人腺病毒进行分型，所述分型的基因型包括对B、C、D和E型人腺病毒。
3.包括权利要求1或2所述的引物组的人腺病毒DNA扩增的反应体系。
4.如权利要求3所述的反应体系，其特征在于，还包括rTaq DNA聚合酶、Mg2+和dNTPs中的至少一种。
5.利用权利要求1或2所述的引物组、或者权利要求3或4所述的反应体系进行扩增或检测人腺病毒DNA分子的方法。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，分别利用所述第一引物对、所述第二引物对和所述第三引物对进行PCR扩增；
使用所述第一引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸80s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用所述第二引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，53℃退火30s，72℃延伸100s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min；
使用所述第三引物对进行扩增反应的条件为：94℃条件下预变性2min，然后94℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸60s，扩增循环次数为35～40次，72℃延伸10min。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，还包括对依据扩增反应判断待测样品中是否存在目标DNA分子的步骤；所述步骤包括：
当使用所述第一引物对进行扩增时，其扩增产物经电泳检测出现1.2kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性；
当使用所述第二引物对进行扩增时，其扩增产物经电泳检测出现1.6kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性；
当使用所述第三引物对进行扩增时，其扩增产物电泳检测出现1.0kb、1.5kb或2.0kb条带时为阳性，不出现条带或者只出现片段小于100bp的引物二聚体条带时为阴性。
8.权利要求1或2所述的引物组、或者权利要求3或4所述的反应体系在制备检测或分型人腺病毒试剂盒中的应用。
9.利用权利要求5-7任一项所述的方法对人腺病毒进行基因分型的方法。
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