CN108842005A - 同时检测鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的mgb探针及其配套引物以及方法 - Google Patents

同时检测鸭腺病毒c型和鸭腺病毒b型的mgb探针及其配套引物以及方法 Download PDF

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朱春华
刘斌琼
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Abstract

本发明涉及一种同时检测鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的探针及其配套引物以及方法，所述探针的序列为：FAM‑TCACCTCCTCCGAAGAC‑MGB；所述引物包括引物对A以及引物对B，所述引物对A包括上游引物qF‑B：5’‑GAGGAGGAGGACGGGGATCT‑3’和下游引物qR‑B：5’‑GGTAGGTGGCACGGCTAGTT‑3’；所述引物对B包括上游引物qF‑C：5’‑AGGACGTGGATCTGGAAGGG‑3’和下游引物qR‑C：5’‑GTAGGTGGTGGAGCGGTGAG‑3’；本发明仅需一条探针配合一组引物就能有效地对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别检测。

Description

同时检测鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的MGB探针及其配套引 物以及方法
技术领域
本发明涉及一种动物传染病学领域，具体涉及一种同时检测鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的MGB探针及其配套引物以及方法。
背景技术
根据国际病毒分类委员会(ICTV)分类，腺病毒科(Adenoviridae)下设5个属(Genus)：禽腺病毒属(Aviadenovirus)、富AT腺病毒属(Atadenovirus)、唾液酸酶腺病毒属(Siadenovirus)、哺乳动物腺病毒属(Mastadenovirus)和美洲白鲟腺病毒属(Ichtadenovirus)。腺病毒为双链DNA无囊膜病毒，呈二十面体对称，衣壳由252个壳粒组成，其中240个为六邻体(非顶点壳粒)，12个则是五邻体基底(顶点壳粒)，每个五邻体基底结合着1根至2根纤突。不同腺病毒的基因组大小有所差异，一般在26-45kb之间。按照腺病毒DNA复制的起始时间不同，其基因组可以划分为早期转录基因(E)和晚期转录基因(L)。早期转录基因包含有El(E1A和E1B)、E2(E2A和E2B)、E3和E4四个区，主要负责调节控制病毒的增殖复制。晚期转录基因包括Ll、L2、L3、L4和L5共五个区，主要功能为负责编码病毒的结构蛋白。
鸭腺病毒A型(Duck atadenovirus A，DAdV-A)属于腺病毒科(Adenoviridae)、富AT腺病毒属，也称为产蛋下降综合征病毒(Egg drop syndrome virus，EDSV)，其基因组大小约为33.2kb。当鸭群免疫力降低时，感染EDSV，会出现呼吸道症状。鸭腺病毒B型(Duckaviadenovirus B，DAdV-B)属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，基因组大小约为43.7kb。该病毒于1977年从法国爆发疾病的番鸭中分离得到，发病鸭临床表现为消瘦、跛行。鸭腺病毒C型(Duck aviadenovirus C，DAdV-C)是近年来新发现的鸭源腺病毒，属于腺病毒科(Adenoviridae)、禽腺病毒属(Aviadenovirus)，该病毒感染主要引起鸭出现肝脏肿大、出血及坏死，其基因组大小约为43.8kb。
鸭腺病毒B型和C型都属于禽腺病毒属(Aviadenovirus)，两者之间全基因组的核苷酸同源性高达91％，常规分子生物学方法(如普通PCR)不容易区分，亟待一种既能同时检测又能鉴别鸭腺病毒B型和C型的方法。
发明内容
本发明的目的之一在于提供一种仅需一条探针配合一组引物就能快速、有效的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行鉴别检测的方法。
本发明的目的之二在于提供一种检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P。
本发明的目的之三在于提供一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物对A。
本发明的目的之四在于提供一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒C型实时荧光定量PCR检测的引物对B。
本发明的目的通过如下技术方案实现：
一种检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P，它的序列为5’-TCACCTCCTCCGAAGAC-3’，所述序列5’端标记有荧光基团(FAM)，3’端标记有非荧光性的淬灭基团(NFQ)以及MGB。
一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物对A，它包括上游引物qF-B以及下游引物qR-B，所述上游引物qF-B以及下游引物qR-B的序列分别为：
上游引物qF-B：5’-GAGGAGGAGGACGGGGATCT-3’，
下游引物qR-B：5’-GGTAGGTGGCACGGCTAGTT-3’。
一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒C型实时荧光定量PCR检测的引物对B，它包括上游引物qF-C以及下游引物qR-C，所述上游引物qF-C以及下游引物qR-C的序列分别为：
上游引物qF-C：5’-AGGACGTGGATCTGGAAGGG-3’，
下游引物qR-C：5’-GTAGGTGGTGGAGCGGTGAG-3’。
一种同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法：将引物对A、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系A；引物对B、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系B；反应体系A与反应体系B同时进行实时荧光定量PCR反应，两反应体系反应结束后分别获得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行检测。
较之现有技术而言，本发明的优点在于：
1.本发明的探针P与引物对A以及引物对B均具有极好的匹配性，加之探针P、引物对A以及引物对B均具有良好的特异性，所以探针P既能与引物对A配合进行鸭腺病毒B型实时荧光定量PCR检测，又能与引物对B配合进行鸭腺病毒C型实时荧光定量PCR检测，实现了仅凭一条探针就能对多种病毒进行实时荧光定量PCR检测的效果，这对于制作检测相应病毒的试剂盒而言，大大节约了研发成分以及生产成本，进而降低了病毒检测的成本。
2.本发明根据鸭腺病毒B型和C型的22K基因序列，设计了2对引物(4条引物)和1条探针，建立了MGB TaqMan实时荧光定量PCR方法，既能同时检测又能鉴别鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型。该方法简单，方便高效、准确率高，可用于鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的快速检测和鉴别。
3.本发明的2对引物共用1条探针，可精确对鸭腺病毒B型和C型进行检测并有效区分，当前国内外未见相关研究报道，本发明可填补相关领域空白。
4.本发明的探针P及其配套的引物对A和引物对B可用于检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的试剂盒的制备中。
附图说明
图1是鸭腺病毒B型和C型序列的比较图。
图2是鸭腺病毒B型的扩增曲线。
图3是鸭腺病毒C型的扩增曲线。
图4是鸭腺病毒B型与鸭腺病毒C型共染的扩增曲线。
图5是鸭腺病毒B型的标准曲线。
图6是鸭腺病毒C型的标准曲线。
图7是特异性试验的扩增曲线。
图8是目的片段测序结果分析图。
具体实施方式
下面结合说明书附图和实施例对本发明内容进行详细说明：
一种检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P，它的序列为5’-TCACCTCCTCCGAAGAC-3’，所述序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光性的淬灭基团以及二氢环化吲哚卟啉-三肽。
所述的检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为NFQ，所述二氢环化吲哚卟啉-三肽为小沟结合物(MGB)。
一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物对A，它包括上游引物qF-B以及下游引物qR-B，所述上游引物qF-B以及下游引物qR-B的序列分别为：
上游引物qF-B：5’-GAGGAGGAGGACGGGGATCT-3’，
下游引物qR-B：5’-GGTAGGTGGCACGGCTAGTT-3’。
探针P与引物对A相配合能够对鸭腺病毒B型进行高效、特异性检测。
一种与所述探针P相配合进行鸭腺病毒C型实时荧光定量PCR检测的引物对B，它包括上游引物qF-C以及下游引物qR-C，所述上游引物qF-C以及下游引物qR-C的序列分别为：
上游引物qF-C：5’-AGGACGTGGATCTGGAAGGG-3’，
下游引物qR-C：5’-GTAGGTGGTGGAGCGGTGAG-3’。
探针P与引物对B相配合能够对鸭腺病毒C型进行高效、特异性检测。
一种同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：将引物对A、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系A；引物对B、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系B；反应体系A与反应体系B同时进行实时荧光定量PCR反应，两反应体系反应结束后分别获得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行检测。
实时荧光定量PCR反应结束后，一个待检测样本，若仅在反应体系A形成的扩增曲线中出现阳性扩增信号，那么这个待检测的样本感染了鸭腺病毒B型；若仅在反应体系B形成的扩增曲线中出现阳性扩增信号，那么待检测的样本感染了鸭腺病毒C型；若反应体系A与反应体系B形成的扩增曲线中均出现阳性扩增信号，那么待检测的样本为鸭腺病毒B型和C型共感染；若在反应体系A与反应体系B形成的扩增曲线中均不出现阳性扩增信号，那么待检测的样本既没有感染鸭腺病毒B型也没有感染鸭腺病毒C型。
本发明的检测方法特异性好。本发明的发明人在引物对与探针的设计上需付诸创造性的努力，除了保证所用的引物要具有特异性外，所用的探针也要具有良好的特异性，此外，引物、探针分别与目的基因的特异性以及引物与探针彼此之间的匹配性都要好，只有以上3个条件同时具备的情况下才能扩出扩增曲线。加之鸭腺病毒B型与鸭腺病毒C同源性高，要想设计出能分别检测鸭腺病毒B型与鸭腺病毒C的2对引物对，且2对引物对又要与同一条探针配合，基于这样的要求，在引物对以及探针的设计上就需要付出极大的创造力，并不是筛选出的所有引物对以及探针都有效。
所述的同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，它包括以下步骤：
(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；
(2)实时荧光定量PCR反应：
利用引物对A，以步骤(1)得到的DNA作为模板，以探针P作为探针建立反应体系A；利用引物对B，以步骤(1)得到的DNA作为模板，以探针P作为探针建立反应体系B；反应体系A与反应体系B置于不同的检测孔中同时进行实时荧光定量PCR反应，两反应体系反应结束后分别获得扩增曲线；
(3)分析扩增曲线。
其中，所述反应体系A为：在20μL体系中含有以下成分：
所述反应体系B为：在20μL体系中含有以下成分：
所述实时荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃2min，预变性；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
下面结合具体实施例对本发明的内容作更细致的表述：
实施例1：
1.材料
1.1实验试剂与耗材：实时荧光定量八排管(Axygen)购自Corning公司；实时荧光定量试剂Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)和T载体购自宝生物工程(大连)有限公司；病毒核酸提取试剂盒EasyPure Viral DNA/RNA Kit、细菌基因组提取试剂盒EasyPure BacteriaGenomic DNA Kit均购自北京全式金生物技术有限公司；胶回收试剂盒和质粒提取试剂盒购自Omega公司；引物和探针由宝生物工程(大连)有限公司合成。
1.2毒株：鸭腺病毒C型(GD01株)、减蛋综合征病毒(EDSV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)、鸭源大肠杆菌(E.coli)、鸭疫里默氏杆菌(R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)均由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存。由于未获得鸭腺病毒B型病毒株，所以鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。
2序列分析与引物设计
2.1鸭腺病毒B型和C型基因序列特征分析
通过分子生物学软件分析鸭腺病毒B型和C型的22K基因序列发现，两个序列之间存在多个变异区和保守区，选择155-171位保守区序列作为鸭腺病毒B型和C型的共同探针的目标序列(见图1)。
2.2引物设计
利用引物设计软件Oligo7，针对鸭腺病毒B型(GR株)和C型(CH-GD-12-2014株)的22K基因序列设计引物，引物序列如下：
引物对A的序列为：
上游引物qF-B：5’-GAGGAGGAGGACGGGGATCT-3’，
下游引物qR-B：5’-GGTAGGTGGCACGGCTAGTT-3’；
引物对B的序列为：
上游引物qF-C：5’-AGGACGTGGATCTGGAAGGG-3’，
下游引物qR-C：5’-GTAGGTGGTGGAGCGGTGAG-3’。
TaqMan MGB探针P：FAM-TCACCTCCTCCGAAGAC-MGB
这些引物满足以下特征：①引物qF-B和qR-B可扩增鸭腺病毒B型，不能扩增鸭腺病毒C型，扩增鸭腺病毒B型的片段大小为132bp。②引物qF-C和qR-C可扩增鸭腺病毒C型，不能扩增鸭腺病毒B型，扩增鸭腺病毒C型的片段大小为124bp。③引物qF-B和qR-B与引物qF-C和qR-C共用同一条TaqMan MGB探针P，探针P与引物对A以及引物对B均具有极好的匹配性。
3 TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立
3.1核酸的制备：
核酸的提取：利用北京全式金生物技术有限公司的Viral DNA/RNAKit核酸提取试剂盒，按照说明书的操作方法提取鸭腺病毒C型(GD01株)、减蛋综合征病毒(EDSV)、番鸭细小病毒(MDPV)、鹅细小病毒(GPV)、鸭瘟病毒(DPV)的核酸。利用北京全式金生物技术有限公司的细菌基因组提取试剂盒EasyPure Bacteria Genomic DNA Kit，按照说明书的操作方法提取鸭源大肠杆菌(E.coli)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)、鸭疫里默氏杆菌(Rimerella anatipstifer，R.A.)、鸭源禽多杀性巴氏杆菌(P.M.)的核酸。
鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)的合成：由于未获得鸭腺病毒B型病毒株，所以鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)由生工生物工程(上海)股份有限公司直接合成。
3.2阳性标准品的构建
针对鸭腺病毒B型和C型22K基因特征，设计一组引物(CF：5’-GACCCAAAAGCAAGTGGACG-3’，CR：5’-CCCGCAGTGCYTGRTAAATG-3’)对获得的鸭腺病毒B型和C型DNA模板分别进行PCR扩增，将PCR扩增的目的片段分别进行胶回收后克隆到T载体上，获得含有鸭腺病毒B型和C型的阳性重组质粒(T-B和T-C)，测定其浓度后，分别作为实时荧光定量PCR方法的标准品。
其中，PCR扩增的最佳反应体系为：在50μL体系中含有以下成分：
PCR扩增的最佳反应条件为：94℃5min，预变性；94℃30s，53.5℃30s，72℃40s，共35个循环；72℃10min；12℃hold。
3.3 TaqMan实时荧光定量PCR反应
将引物对A、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系A；引物对B、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系B；反应体系A置于标记有1号的PCR管1中，反应体系B置于标记有2号的PCR管2中，以ddH2O替代待检病毒样本的模板DNA分别配制反应体系A和反应体系B作为阴性对照，并分别置于标记有3号和4号的PCR管，所有PCR管放置于荧光PCR仪中同时进行实时荧光定量PCR反应。
本发明使用的实时荧光定量试剂Premix Ex TaqTM(Probe qPCR)购自宝生物工程(大连)有限公司，在结合试剂盒推荐的反应体系配置的基础上对实时荧光定量PCR反应体系进行了优化，优化出的20μL最佳反应体系A的具体配置方法见表1，优化出的20μL最佳反应体系B的具体配置方法见表2，实时荧光定量PCR反应的最佳反应条件为：95℃2min，预变性；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
表1实时荧光定量PCR反应体系A的配置
表2实时荧光定量PCR反应体系B的配置
3.4 TaqMan实时荧光定量PCR结果判定
实时荧光定量PCR反应结束后，反应体系A和反应体系B的阴性对照(3号和4号的PCR管)应不出现阳性扩增信号，对于待检测样本，可能出现4种结果，具体结果及判定方法如下：
①若仅在PCR管1形成的扩增曲线中出现阳性扩增信号，则这个待检测的样本感染了鸭腺病毒B型，如图2所示，图2为以鸭腺病毒B型阳性重组质粒T-B作为模板的实验结果；
②若仅在PCR管2形成的扩增曲线中出现阳性扩增信号，则这个待检测的样本感染了鸭腺病毒C型，如图3所示，图3为以鸭腺病毒C型阳性重组质粒T-C作为模板的实验结果；
③若PCR管1与PCR管2形成的扩增曲线中均出现阳性扩增信号，则待检测的样本为鸭腺病毒B型和C型共感染，如图4所示，图4为以鸭腺病毒B型和C型的阳性重组质粒T-B和T-C混合液(1:1混合)作为模板的实验结果；
④若在PCR管1与PCR管2形成的扩增曲线中均不出现阳性扩增信号，则待检测的样本既没有感染鸭腺病毒B型也没有感染鸭腺病毒C型。
3.5实时荧光定量PCR标准曲线的建立
将鸭腺病毒B型的阳性重组质粒T-B和鸭腺病毒C型的阳性重组质粒T-C分别进行10倍连续倍比稀释。用优化后的实时荧光定量PCR方法的最佳反应条件，以不同稀释浓度的质粒DNA为模板，进行实时荧光定量PCR扩增反应，获得扩增动力学曲线。以实时荧光定量PCR反应体系中标准品(质粒DNA)起始浓度的常用对数(lgC)为横坐标，以循环数阈值(cycle threshold，Ct值)为纵坐标，分别绘制出检测鸭腺病毒B和C型的实时荧光PCR方法的标准曲线如图5和图6所示。鸭腺病毒B型的直线方程为y＝–3.319log(x)+34.95，相关系数R2＝0.998，扩增效率E＝100％；鸭腺病毒C型的直线方程为y＝–3.442log(x)+35.55，相关系数R2＝0.999，扩增效率E＝95％。根据待检测样本荧光定量PCR反应结果的CT值(曲线中用y表示)，结合标准曲线方程，可以计算出待检测样本中目的基因的量。
4实时荧光定量PCR的特异性试验：
取18根PCR管均分成2组，第1组编号分别为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9，第二组编号分别为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8、B9，将第1组的PCR管分别按照反应体系A的标准加入试剂且9根PCR管中加入的模板DNA为步骤3.1制备的核酸，即依次为合成的鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)、提取的鸭腺病毒C型、EDSV、MDPV、GPV、DPV、E.coli、R.A.以及P.M.的核酸；将第2组的PCR管分别按照反应体系B的标准加入试剂且9根PCR管中加入的模板DNA为步骤3.1制备的核酸，即依次为合成的鸭腺病毒B型的22K基因(DNA)、提取的鸭腺病毒C型、EDSV、MDPV、GPV、DPV、E.coli、R.A.以及P.M.的核酸；
2组PCR管均放置于荧光PCR仪中，利用最佳的反应条件进行TaqMan实时荧光定量PCR检测，反应结束后可得扩增曲线如图7所示，图7中A1为鸭腺病毒B型，B2为鸭腺病毒C型，因其它病原未出现阳性扩增信号所以图中未将它们依次标出。从图7的扩增曲线分析可见，仅鸭腺病毒B型和C型可见特异性阳性扩增信号；对家禽常见病原(EDSV、MDPV、GPV、DPV、E.coli、R.A.、P.M.)进行检测，没有出现阳性扩增信号，说明引物对A、引物对B以及探针P的特异性好。
5临床应用
使用本研究提供的一组实时荧光定量PCR引物和MGB TaqMan探针对前期鉴定的鸭腺病毒C型ZZ03株、AH06株、FJ06株和人工合成的鸭腺病毒B型的22K基因进行检测，均和预期的相符，经特异性的PCR检测引物F2：5’-ACCCAAAAGCAAGTGGACGC-3’，R2:5’-CGGARTCACCACCTTCCTCG-3’检测，也为鸭源禽腺病毒阳性，阳性符合率为100％。将目的片段进行克隆测序，序列分析也符合上述特征，均含有探针的目标序列，如图8所示。
对临床送检的125份鸭源病料样品进行检测后发现，鸭腺病毒C型有3份阳性，阳性率为2.4％。未检测到鸭腺病毒B型阳性样品。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
序列表
<110> 福建省农业科学院畜牧兽医研究所
<120> 同时检测鸭腺病毒C型和鸭腺病毒B型的MGB探针及其配套引物以及方法
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 1
tcacctcctc cgaagac 17
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 2
gaggaggagg acggggatct 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 3
ggtaggtggc acggctagtt 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 4
aggacgtgga tctggaaggg 20
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial sequence)
<400> 5
gtaggtggtg gagcggtgag 20

Claims (9)

1.一种检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P，其特征在于：它的序列为5’-TCACCTCCTCCGAAGAC-3’，所述序列5’端标记有荧光基团，3’端标记有非荧光性的淬灭基团以及二氢环化吲哚卟啉-三肽。
2.根据权利要求1所述的检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测的探针P，其特征在于：所述荧光基团为FAM，所述淬灭基团为NFQ。
3.一种与权利要求1所述探针P相配合进行鸭腺病毒B型实时荧光定量PCR检测的引物对A，其特征在于：它包括上游引物qF-B以及下游引物qR-B，所述上游引物qF-B以及下游引物qR-B的序列分别为：
上游引物qF-B：5’-GAGGAGGAGGACGGGGATCT-3’，
下游引物qR-B：5’-GGTAGGTGGCACGGCTAGTT-3’。
4.一种与权利要求1所述探针P相配合进行鸭腺病毒C型实时荧光定量PCR检测的引物对B，其特征在于：它包括上游引物qF-C以及下游引物qR-C，所述上游引物qF-C以及下游引物qR-C的序列分别为：
上游引物qF-C：5’-AGGACGTGGATCTGGAAGGG-3’，
下游引物qR-C：5’-GTAGGTGGTGGAGCGGTGAG-3’。
5.一种同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：将引物对A、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系A；引物对B、探针P以及待检病毒样本的DNA结合配制反应体系B；反应体系A与反应体系B同时进行实时荧光定量PCR反应，两反应体系反应结束后分别获得扩增曲线，根据扩增曲线有无出现阳性扩增信号，特异性的对鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型进行检测。
6.根据权利要求5所述的同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：它包括以下步骤：
(1)核酸的制备：制备病毒样本的DNA；
(2)实时荧光定量PCR反应：
利用引物对A，以步骤(1)得到的DNA作为模板，以探针P作为探针建立反应体系A；利用引物对B，以步骤(1)得到的DNA作为模板，以探针P作为探针建立反应体系B；反应体系A与反应体系B置于不同的检测孔中同时进行实时荧光定量PCR反应，两反应体系反应结束后分别获得扩增曲线；
(3)分析扩增曲线。
7.根据权利要求5或6所述的同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述反应体系A为：在20μL体系中含有以下成分：
8.根据权利要求5或6所述的同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述反应体系B为：在20μL体系中含有以下成分：
9.根据权利要求5或6所述的同时检测鸭腺病毒B型和鸭腺病毒C型的实时荧光定量PCR检测方法，其特征在于：所述实时荧光定量PCR反应的反应条件为：95℃2min，预变性；95℃15s，60℃1min，共40个循环。
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