CN107630110A - 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 - Google Patents
一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 Download PDFInfo
- Publication number
- CN107630110A CN107630110A CN201711125171.7A CN201711125171A CN107630110A CN 107630110 A CN107630110 A CN 107630110A CN 201711125171 A CN201711125171 A CN 201711125171A CN 107630110 A CN107630110 A CN 107630110A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- virus
- sheep
- primer
- orfv020
- probe
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的引物和探针，所述引物序列为上游引物：5’‑CATCGACATCATGACTCA‑3’，下游引物：5’‑CGTCATCATACAGAACTC‑3’，所述探针序列为：5’‑AAAGTCTTAACCCGGTCAGCG‑3’。本发明根据GenBank登录的KF666563.1的ORFV020基因序列，设计特异性引物，首次针对羊口疮病毒ORFV020基因建立TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法特异性好、灵敏度高、重复性好，可用于羊口疮病毒的诊断和流行病学调查。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的引物和探针，属于分子生物学领域。
背景技术
羊口疮是由羊传染性脓疱病毒引起的羊接触性、嗜上皮性、人兽共患的传染病，各个年龄段的羊群都能感染发病，主要临床症状表现为嘴唇、口腔黏膜、外阴等出现丘疹或水疱，其中羔羊的危害最严重。羊口疮病毒属于痘病毒科副痘病毒属成员，病毒的核酸为双线DNA，基因组全长约145Kb。目前广泛存在世界各国养羊国家和地区，我国新疆、内蒙、甘肃、吉林、山西、青海、宁夏、四川、黑龙江、福建等十几个省份均有该病发生和流行的报道，给养羊业造成较大的经济损失。
关于羊口疮病毒的诊断还没有通用标准，主要根据临床症状和实验室手段进行确诊。该病易于口蹄疫、羊痘等相混淆，同时容易引起激发感染。由于当前的疫苗免疫效果不理想，导致该病的防控异常困难。因此很有必要研制一种快速有效的早期诊断试剂盒。国内外有一些关于羊口疮病毒实时荧光定量PCR的报道，然所使用的基因多为B2L、F1L及DNA聚合酶基因，未见有使用ORFV020基因建立的TaqMan实时荧光定量PCR方法的报道，本发明根据羊口疮病毒ORFV020基因序列设计特异性的引物和探针，首次建立了针对羊口疮病毒ORFV020基因的TaqMan实时荧光定量PCR方法，以期为羊口疮在临床早期诊断和防治提供技术支持，填补了羊口疮病毒ORFV020基因TaqMan实时荧光定量PCR检测方法的空白。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的引物和探针。
为达到上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的TaqMan实时荧光定量PCR引物，引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- CATCGACATCATGACTCA -3’，
下游引物：5’- CGTCATCATACAGAACTC -3’。
种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的探针，序列为：
5’- AAAGTCTTAACCCGGTCAGCG -3’。
所使用的探针为两端分别标记荧光报告基团（R）和荧光淬灭基团（Q）的寡核苷酸。
利用本发明的引物可用于检测羊口疮病毒ORFV020基因，尤其适用于基于TaqMan荧光定量PCR技术的检测。通过对反应体系和反应条件的优化，建立了一套可用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的TaqMan荧光定量PCR 方法。
具体操作方法如下：
1、引物设计：根据GenBank上公布的羊口疮病毒KM666563.1基因序列，针对ORFV020基因序列设计特异性的引物和探针，探针合成同时进行两端荧光标记，探针5’端标记的荧光报告基团是FAM，3’端标记的荧光淬灭基团为Eclipse。
2、反应体系的优化：优化出的25μM最佳反应体系为： Premix Ex Taq TM （ProbeqPCR） 12.5μL、上、下游引物（10μM）各0.5μL、探针（5μM）1μL、模板2μL、双蒸水补足至25μL。最佳反应条件为：95℃，30s 预变性；95℃，5s，55℃，30s，72℃，20s，共40 个循环。
3、阳性标准品的制备：以提取的羊口疮病毒DNA为模板，按照常规PCR方法进行扩增，将扩增的产物经胶回收，连接到pMD19-T载体上，转化，提取质粒，得到阳性标准品。
4、标准曲线的建立：以优化的反应体系进行PCR扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct值为纵坐标建立标准曲线。
该方法可用于羊口疮病毒的病原诊断和流行病学调查，为疾病的早期预防奠定技术基础。
有益效果
本发明根据GenBank登录的KM666563.1的ORFV020基因序列，设计特异性引物和探针，首此针对羊口疮病毒ORFV020基因建立TaqMan实时荧光定量PCR方法，该方法灵敏度高，最低可检测到10copies,特异性好、重复性好，可用于羊口疮病毒的临床诊断和流行病学调查。
附图说明
图1 羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR方法的特异性扩增曲线。
图2 为羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR的标准曲线。
图3 为羊口疮病毒TaqMan实时荧光定量PCR的敏感性扩增曲线。
具体实施方式
实施例1 羊口疮病毒的TaqMan荧光定量PCR方法的建立
一、材料：
沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、羊口疮病毒均购自中国药品监察局。
二、步骤
1、仪器与试剂： Premix Ex Taq TM （Probe qPCR）、DL2000 Marker均购自宝生物工程（大连）有限公司；荧光定量PCR管购自Axygen（美国）公司； Mastercycler ep realplex荧光定量PCR 仪，eppendorf（德国）公司产品。
2. 引物的特异性
引物的特异性是本实验所建立方法的重要因素。根据GenBank登录的KM666563.1的ORFV020基因序列，利用Beacon Designer 7.9软件设计引物和探针，通过BLAST软件比对分析，初步验证其特异性。
3、阳性标准品的制备
利用设计的特异性引物对羊口疮病毒的DNA进行ORFV020基因的PCR扩增。20μL PCR扩增体系为：Premix Taq TM Version 2.0 plus dye 10μL、上下游引物(10μM)各1μL 、模板2μL、无菌去离子水补足至20μL。反应条件：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s、55℃ 15 s、72 ℃ 15 s，37个循环；72 ℃ 10 min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，胶回收目的片段连接至pMD19-T载体上，并转化至大肠杆菌DH5a感受态细胞，挑取阳性克隆进行扩增培养，用小量质粒提取试剂盒提取后，分别进行PCR鉴定和酶切鉴定，并送至宝生物工程（大连）有限公司进行测序。经鉴定正确的阳性重组质粒作为标准品置于-70 ℃冰箱保存备用。
4. 反应条件的优化
采用25条件反应体系Premix Ex Taq TM （Probe qPCR） 12.5μL，PCR上游引物（10μM）0.5μL，PCR 下游引物（10μM）0.5μL，探针（5μM）1μL，倍比稀释后的阳性标准品2μL，补水至终体积25μL，以出现最小的Ct 值和最高荧光值为指标，分别对退火温度（51～61℃）和引物浓度（0.2～1.0μM）进行优化。
5、建立标准曲线
用EASY Dilution将构建的标准品梯度稀释(107、106、105、104、103、102copies/μL)作为模板，以优化的条件进行扩增，以拷贝数为横坐标，以Ct 值为纵坐标建立标准曲线。
对阳性标准品的标准曲线和敏感性扩增曲线显示，TaqMan荧光定量PCR方法对羊口疮病毒的最低检测限为10copies，且Ct与拷贝数在1×102 ～1×107 copies/μL，反应范围内有很好的线性关系，相关系数R2为0.999，扩增效率为103%。标准曲线见图2，敏感性扩增曲线见图3。
6 特异性检测
6.1 特异性检测
用优化的条件分别对羊口疮病毒、沙门氏菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌核酸样品进行检测，对该方法的特异性进行评价。检测结果显示，只有羊口疮病毒核酸样品为阳性，其余核酸样品检测结果均为阴性。见图1。
6.2 重复性评估
对同一阳性标准品设3个重复管，用实时荧光定量PCR 进行检测，评价其重复性，计算组内变异系数；将阳性标准品置于-20℃保存，分别于第7、14、21d 重检，评价其再现性，计算其组间变异系数。计算得组内变异系数为0.79 %～1.65%，组间变异系数为1.14%～1.79%，可重复性好。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 林裕胜
<120> 一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的引物和探针
<130> 3
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
catcgacatc atgactca 18
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
cgtcatcata cagaactc 18
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaagtcttaa cccggtcagc g 21
Claims (3)
1.一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列为：
上游引物：5’- CATCGACATCATGACTCA -3’，
下游引物：5’- CGTCATCATACAGAACTC -3’。
2.一种用于检测羊口疮病毒ORFV020基因的探针，其特征在于，所述探针序列为：5’-AAAGTCTTAACCCGGTCAGCG -3’。
3.一种用于检测羊口疮病毒的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含权利要求1和2所述的引物和探针。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711125171.7A CN107630110A (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201711125171.7A CN107630110A (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN107630110A true CN107630110A (zh) | 2018-01-26 |
Family
ID=61107785
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201711125171.7A Pending CN107630110A (zh) | 2017-11-14 | 2017-11-14 | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN107630110A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942528A (zh) * | 2010-10-20 | 2011-01-12 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针 |
| CN103225003A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-07-31 | 贵州省畜牧兽医研究所 | 羊传染性脓疱病毒pcr诊断试剂盒 |
| CN107299155A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-10-27 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 |
-
2017
- 2017-11-14 CN CN201711125171.7A patent/CN107630110A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101942528A (zh) * | 2010-10-20 | 2011-01-12 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种用于检测鹅圆环病毒的引物和探针 |
| CN103225003A (zh) * | 2013-05-17 | 2013-07-31 | 贵州省畜牧兽医研究所 | 羊传染性脓疱病毒pcr诊断试剂盒 |
| CN107299155A (zh) * | 2017-08-18 | 2017-10-27 | 福建省农业科学院畜牧兽医研究所 | 一种鹅星状病毒实时荧光定量pcr检测的引物和探针 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| RAMESH A等: "Confirmatory diagnosis of contagious ecthyma by amplification of the GIF/IL-2 gene by PCR", 《TAMILNADU J. VETERINARY & ANIMAL SCIENCES》 * |
| 侯宏艳等: "安徽地区羊口疮病毒VIR 基因PCR 检测及遗传进化分析", 《中国草食动物科学》 * |
| 李前瑞: "羊口疮病毒PCR检测方法的建立与应用", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库 农业科技辑》 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN112646934B (zh) | 一种鉴别非洲猪瘟野毒株和基因缺失株的三重荧光定量pcr检测引物及试剂盒 | |
| CN110760620A (zh) | 一种猪瘟病毒与非洲猪瘟病毒双重荧光pcr检测试剂、试剂盒和检测方法 | |
| CN107099605B (zh) | 一种用于检测丝状支原体山羊亚种的引物和探针 | |
| CN111074000A (zh) | 一种区分asfv野毒株与双基因缺失株的三重荧光定量pcr检测材料及试剂盒 | |
| CN105969914A (zh) | 一组区分鸭圆环病毒基因型的实时荧光定量pcr引物 | |
| CN111304371B (zh) | 非洲猪瘟病毒野毒株的锁核酸探针荧光定量pcr检测组合物、检测方法及检测试剂盒 | |
| CN105907890B (zh) | 一种快速区分HP-PRRS疫苗GDr180株与野毒株的引物、探针及方法 | |
| CN113462820A (zh) | 实时荧光定量检测四种猪腹泻病毒的多重rt-pcr引物探针组、试剂盒及其检测方法 | |
| CN108004350A (zh) | 番鸭细小病毒和鹅细小病毒双重实时荧光定量pcr检测引物 | |
| CN107142331A (zh) | 一种用于检测绵羊肺炎支原体的引物和探针 | |
| CN110408727B (zh) | 一种检测j亚群禽白血病病毒的cpa引物组、cpa核酸试纸条试剂盒及其应用 | |
| CN113913559B (zh) | 一种荧光定量检测prrsv的试剂、其应用于prrsv分型的检测方法 | |
| CN108048600A (zh) | 一种牛传染性鼻气管炎病毒的荧光定量pcr检测方法 | |
| CN103805719B (zh) | 鸡新城疫病毒、h9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒三重rt-pcr试剂盒及其应用 | |
| CN107312875A (zh) | 检测猪圆环病毒3型的环介导等温扩增方法的引物组 | |
| CN106967840A (zh) | 用于山羊支原体山羊肺炎亚种的实时荧光定量pcr检测引物 | |
| CN112458208B (zh) | 检测牛结节性皮肤病病毒的试剂盒及方法 | |
| CN107794313A (zh) | 一种用于检测羊口疮病毒vir基因的荧光定量pcr引物 | |
| CN108588276A (zh) | D型流感病毒荧光定量pcr引物对及试剂盒 | |
| CN103937908A (zh) | 甘薯褪绿矮化病毒西非株系的实时荧光定量pcr检测方法及应用 | |
| CN107630110A (zh) | 一种用于检测羊口疮病毒orfv020基因的引物和探针 | |
| CN116004925A (zh) | 用于鉴别非洲猪瘟病毒野毒株和基因缺失株的三重荧光pcr引物探针组、试剂和方法 | |
| CN103805720B (zh) | H9亚型禽流感病毒和禽肺炎病毒二重rt-pcr试剂盒及其应用 | |
| CN104388593A (zh) | 一种用于检测猪圆环病毒的Taqman Real-time PCR试剂盒 | |
| CN109136409B (zh) | 基于k196r基因的非洲猪瘟病毒检测试剂盒和检测方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20180126 |
|
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |