CN102618634B - 鼠伤寒沙门氏菌特异性pcr检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法，包括如下步骤：根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID：1设计扩增引物对序列SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3；提取样品DNA，PCR法扩增；凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：若电泳结果在456bp出现单一扩增条带，则说明样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；若未出现相应的扩增条带，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本低，检测结果特异，结果判定简单。
Description
技术领域
本发明涉及一种禽类及其制品安全检验领域的PCR检测方法及其中的核酸和引物对，具体是一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法。
背景技术
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium)是沙门氏菌致病常见的血清型之一，以婴幼儿感染最常见，临床症状主要为发热、恶心、呕吐和腹泻。该菌为革兰氏阴性杆菌，属沙门氏菌B群，不形成芽孢，无荚膜，但有鞭毛。该菌在自然界分布广泛，在外界环境中抵抗力较强，常温下可迅速繁殖，耐低温、干燥，不耐热，对酸、紫外线和各种化学消毒剂均敏感。该菌可分608个噬菌体型，20个不同的生化型，在自然界进化过程中，形成了哥本哈根变种、宾斯变种及O型变种三个变种。该菌的检测主要依靠传统的培养方法(参见国标GB/T4789.4-2008)，该方法需经选择性增菌培养，并通过生化反应及血清学测试鉴定，虽然结果可靠，但操作复杂，通常要3～5天才能得出检测结果，不利于及时诊断病因，查找病源，控制病情的蔓延。之后，许多研究学者建立了如荧光抗体技术、免疫磁珠富集法、ELLSA、自动酶联免疫荧光法、免疫组化、显色培养基法、DNA探针技术等检测方法，但在实践中都有不同程度的局限性。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，逐步应用于沙门氏菌的检疫之后，对沙门氏菌病诊断和防治工作起到了积极作用。有学者先后以鼠伤寒沙门氏菌fimA、fimY、fliC、fljB等基因为目的基因，对鼠伤寒沙门氏菌进行特异性PCR检测，但是由于靶位点特异性不强，PCR结果产生假阳性，因而产生判断困难。另外，有学者根据鼠伤寒沙门氏菌16S DNA、spvC、invB、fimA基因设计4对引物，通过多重PCR方法检测鼠伤寒沙门氏菌，但与普通PCR相比，多重PCR的成本、实验技术等要求都相对较高。
经对现有技术的文献检索发现，尚未发明与本发明的鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法、核酸及引物有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法。采用本发明的检测方法检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，成本低，更加具有实用性，检测结果特异，结果判定简单。
本发明是通过以下技术方案实现的。
本发明设计一种鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法，包括如下步骤：
步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO：1设计扩增引物对；所述引物对具体为：正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物序列如SEQ ID NO：3所示。
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；PCR检测体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；PCR检测体系扩增参数具体为：95℃预变性5min后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：凝胶电泳检测扩增产物，紫外灯照射下观察，若在456bp位置存在单一扩增条带，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若没有，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明检测鼠伤寒沙门氏菌，检测时间短，检测成本低；避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、检出率底、假阳性较多等缺点。同时，本发明可用于检测某些抗血清不能检测出的菌株，如抗原不表达的菌株，弥补免疫检测的缺陷，更具实用性；本发明检测的靶点具有单一特异性，检测结果特异，结果判定简单。
附图说明
图1为实施例2中鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果图；
图2为实施例3中鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法灵敏性评价实验凝胶电泳结果图；
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor LaboratoryPress，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1 鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法的建立
步骤一，设计特异性扩增鼠伤寒沙门氏菌的引物对
通过生物信息学分析，从鼠伤寒沙门氏菌基因组DNA序列中筛选出保守且特异的STM4493基因，将之作为检测鼠伤寒沙门氏菌的靶基因，基因序列如SEQ ID NO：1所示；
将STM4493基因DNA序列输入软件Primer Premier 5.0中设计扩增引物对，设置GC％范围为40％～60％，产物大小范围为100～500bp，从备选引物对中选择引物对，引物对序列如下(引物由上海基康生物技术有限公司合成)
上游引物：5-’AAATGTGCTTGAGGCGTTAG-3’ (SEQ ID NO：2)；
下游引物：5-’CGTGCGGCGATGTTAGTT-3’ (SEQ ID NO：3)
步骤二，DNA模板制备
将鼠伤寒沙门氏菌接菌至10ml的LB液体培养基中，在37℃增菌8h后，取1ml菌液，放入1.5ml离心管中；12,000r/min离心10min，弃上清液，加入200μL无菌双蒸水重新悬浮菌体，12,000r/min离心5min，弃上清液，收集菌体。用100μL无菌双蒸水重新悬浮菌体，在沸水浴中煮15min，立即取出，在-20℃放置30min。在37℃解冻后，12,000r/min离心5min，取上清液放置-20℃备用。
步骤三，鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法的建立
PCR检测的25μL反应体系具体为，10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol/L的Mg2+2.0μL，2.5mmol/L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液1μL，最后用双蒸水补至25μL；PCR检测体系扩增参数具体为：95℃预变性5min；之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束。
步骤四，结果判定
所述判断具体为：取PCR扩增产物5μL，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，如果电泳结果在456bp位置出现单一扩增条带，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；如果电泳结果在456bp位置没有出现456bp单一扩增条带，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
结果：取PCR扩增产物5μL，2％的琼脂糖凝胶电泳后，紫外灯照射下，在456bp位置可观察到单一扩增条带，说明所建立的PCR能成功检测出鼠伤寒沙门氏菌。
实施例2 鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价实验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例1步骤二分别提取鼠伤寒沙门氏菌(S.Typhimurium)、甲型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi A)、乙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi B)、丙型副伤寒沙门氏菌(S.Paratyphi C)、猪霍乱沙门氏菌(S.Choleraesuls)、鸡白痢沙门氏菌(S.Pullorosis)、鸭沙门氏菌(S.Anatis)、鸡沙门氏菌(S.Gallinarum)、都柏林沙门氏菌(S.Dublin)、肠炎沙门氏菌(S.Enteritidis)、海德尔堡沙门氏菌(S.Heidelberg)、山夫登堡沙门氏菌(S.Senftenberg)基因组DNA模板。
步骤二，鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价试验
按照实施例1步骤三中PCR反应体系，取步骤一中制备各菌株的DNA模板1μL作为PCR反应模板分别添加到PCR反应体系中，空白对照以1μL的无菌双蒸水为模板；然后按照实施例1步骤三中PCR循环参数进行PCR扩增反应。
步骤三，结果判定
取PCR扩增产物5μL，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察，若电泳结果在456bp位置出现单一扩增条带，则说明样品中含鼠伤寒沙门氏菌；若出现在456bp位置没有出现456bp单一扩增条带，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
结果：图1及表1为鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法特异性评价实验凝胶电泳结果。
| 菌株 | 编号 | 菌数 | 结果 |
| Salmonella Typhimurium | 50115-13 | 1 | + |
| Salmonella choleraesuls | AS1.1190 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi A | ATCC 9150 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi B | CMCC 50004 | 1 | - |
| Salmonella Paratyphi C | CMCC 50118 | 1 | - |
| Salmonella Pullorosis | CVCC 1878 | 1 | - |
| Salmonella Anatis | CMCC 50774 | 1 | - |
| Salmonella Gallinarum | CMCC 50770 | 1 | - |
| Salmonella Dublin | CMCC 50042 | 1 | - |
| Salmonella Senftenberg | CMCC 50050 | 1 | - |
| Salmonella Heidelberg | CICC 21487 | 1 | - |
| Salmonella Enteritidis | CMCC 50335 | 1 | - |
表1：-：PCR结果为阴性；+：PCR结果为阳性
图1中：泳道1：ddH2O；泳道2-13：鼠伤寒沙门氏菌、猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鸡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、肠炎沙门氏菌；泳道M：2000bp分子量标准。
从图1及表1中可以看出，PCR扩增鼠伤寒沙门氏菌DNA，凝胶电泳检测后，在紫外灯照射下可在456bp位置观察到单一扩增条带。而PCR扩增猪霍乱沙门氏菌、甲型副伤寒沙门氏菌、乙型副伤寒沙门氏菌、丙型副伤寒沙门氏菌、鸡白痢沙门氏菌、鸭沙门氏菌、鸡沙门氏菌、都柏林沙门氏菌、海德尔堡沙门氏菌、山夫登堡沙门氏菌、肠炎沙门氏菌的DNA及空白对照，凝胶电泳检测后，在紫外灯照射下均未在456bp位置观察到单一扩增条带。以上结果说明引物对具有良好的特异性，建立的PCR检测方法可以特异性的检测鼠伤寒沙门氏菌。
实施例3 鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法敏感性评价实验
步骤一，DNA模板制备
按照实施例一步骤二提取分别鼠伤寒沙门氏菌DNA基因组模板，经OD260/280检测，鼠伤寒沙门氏菌DNA溶液的浓度为24.85μg/ml，用无菌水做10倍梯度稀释，共稀释6个梯度。
步骤二，鼠伤寒沙门氏菌PCR检测方法敏感性评价试验
每个梯度分别取2μL加入PCR反应体系，按照实施例1步骤三中方法对DNA模板进行PCR扩增检测。
步骤三，结果判定
取PCR扩增产物5μL，在2％的琼脂糖凝胶进行电泳分析，在紫外灯照射下进行观察。若电泳结果在456bp位置出现单一扩增条带，则说明可以检测出样品中含的鼠伤寒沙门氏菌；若出现在456bp位置没有出现456bp单一扩增条带，则说明未能检出样品中含的鼠伤寒沙门氏菌。
结果：图2：泳道1-6：DNA模板浓度分别为：49.7ng、4.97ng、497pg、49.7pg、4.97pg、497fg；泳道M：2000bp分子量标准。
由图2可知，在第1～5泳道可以看到清晰的条带，所对应DNA浓度分别为49.7ng、4.97ng、497pg、49.7pg、4.97pg，在第5条泳道之后看不到扩增条带。因此，判定PCR检测灵敏度为4.97pg，具有较高的灵敏度。
实施例4 鼠伤寒沙门氏菌疑似菌株的检测
利用实施例1建立的鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法对30株疑似鼠伤寒沙门氏菌的沙门氏菌菌株进行检测，。
结果：经PCR检测发现15株疑似菌株呈阳性结果。将这15株疑似菌株进行血清学分型实验，其血清型为4，5:i:-或4，1:i:-，与鼠伤寒沙门氏菌抗原式(1，4，5，12:i:1，2)相符合，之后经Microbial Characterization System鉴定，结果表明这15株疑似菌株为鼠伤寒沙门氏菌。而对PCR检测方法为阴性的其它疑似菌株，进行血清学分型实验，其血清型结果与鼠伤寒沙门氏菌抗原式不符，经
Microbial Characterization System鉴定证实其不是鼠伤寒沙门氏菌。本实施例证明，所建立的鼠伤寒沙门氏菌的特异性PCR法具有非常高的可靠性。
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (1)
1.一种非诊断和治疗目的的鼠伤寒沙门氏菌特异性PCR检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，根据鼠伤寒沙门氏菌全基因组DNA序列中保守且特异的STM4493基因序列SEQ ID NO：1设计扩增引物对；所述引物对为：正向引物序列如SEQ ID NO：2所示，反向引物序列如SEQ ID NO：3所示；
步骤二，提取样品DNA，PCR法扩增；PCR检测体系具体为：10×PCR反应缓冲液2.5μL，25mmol／L的Mg2+2.0μL，2.5mmol／L的dNTP1.0μL，5μM引物对1μL，Taq酶1U，模板溶液0.5～2μL，最后用双蒸水补至25μL；PCR检测体系扩增参数具体为：95℃预变性5min；之后开始扩增循环，每个循环的程序为：95℃变性30s，52℃退火30s，72℃延伸30s；共35个循环；最后72℃延伸10min，降温至16℃，结束；
步骤三，凝胶电泳检测扩增产物，判断样品是否含有鼠伤寒沙门氏菌；所述判断具体为：凝胶电泳检测，紫外灯照射下观察扩增产物在456bp位置是否存在单一扩增条带，若存在，则说明样品中含有鼠伤寒沙门氏菌；若没有，则样品中不含鼠伤寒沙门氏菌。
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