CN107201345A - 一种鲫鱼冠状病毒hb93及rt‑pcr检测引物及应用 - Google Patents

一种鲫鱼冠状病毒hb93及rt‑pcr检测引物及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于病毒检测领域，具体公开了一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT‑PCR检测引物及应用，发明人首次从鲫鱼中分离出了一种鲫鱼冠状病毒，该病毒为鲫鱼冠状病毒（Crucian Carp Bafinivirus）HB93，针对该病毒序列设计引物，F1：5'‑CAAAGTAAACCCTGGAGA‑3'，R1：5'‑ATCAATGATGGTGCAGTT‑3'；F2：5'‑TGAAACAATCCAAGAAGA‑3'，R2：5'‑ACAAGTTATAGCCGGTGT‑3'，可对鲫鱼冠状病毒进行检测，该引物的特异性好，灵敏度高。

Description

一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用
技术领域
本发明属于病毒分子检测技术领域，具体涉及一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用。
技术背景
国际病毒分类委员会(International Committee on Taxonomy of Viruses,ICTV)于2012年发表了最新的病毒分类第九次报告，将套式病毒目(Nidovirales)中的冠状病毒科(Coronavi ridea)中新设冠状病毒亚科(Coronavirinea)和环曲病毒亚科(Torovirinae)。
冠状病毒科是一类线形单股正链RNA病毒，最早于1937年从鸡身上分离出来，Almeida等对这些病毒进行了形态学研究，电子显微镜观察发现这些病毒的包膜上有形似日冕的棘突，故提出命名这类病毒为冠状病毒[1]。1975年，国际病毒命名和分类委员会正式命名了冠状病毒科。2002-2003年期间，自我国局部地区发生的非典型肺炎，即由冠状病毒属的严重急性呼吸综合征病毒(SARS-CoV)引起，世界上有30多个国家和地区相继报道出现病例，病死率超过10％。2012年，中东地区开始出现新型冠状病毒，病死率超过50％，引起了世界范围的广泛关注，造成社会对冠状病毒的恐慌。因此，对冠状病毒进行深入研究具有重要意义。
目前对冠状病毒科的研究主要集中在冠状病毒亚科，而对环曲病毒亚科研究甚少。其中，2006年鳊鱼病毒属(Bafinivirus)的中的鳊鱼病毒(White bream virus)由Schütze H等科学家在鳊鱼体内发现，这也是目前ICTV分类中确定的唯一以水生动物为宿主的冠状病毒。
目前鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus,CCBV)尚无公开报道，更也无有效的检测方法。
发明内容
本发明的目的在于提供了一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。
本发明的另一个目的在于提供了基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。
本发明的还有一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
本发明还有一个目的在于提供了鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。
本发明的最后一个目的在于提供一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物的应用，包括利用所述的应用制备成鲫鱼冠状病毒检测试剂盒。
为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
一种鲫鱼冠状病毒HB93，所述的病毒分离自鲫鱼病变细胞，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian CarpBafi nivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。
将鲫鱼冠状病毒HB93(本发明或称为CCBV-HB93)接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2。
鲫鱼冠状病毒HB93的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符。
鲫鱼冠状病毒HB93的应用，所述的应用包括利用该病毒制备成鲫鱼冠状病毒病疫苗，或是制备成鲫鱼冠状病毒的实验室对照品。
本发明的保护内容还包括基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物，所述的引物包括基于该差异序列，利用现有技术设计的诸如荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，利用该引物可用于检测鲫鱼冠状病毒HB93。
一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，包括F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物的应用，包括利用上述引物制备成用于检测鲫鱼冠状病毒检测试剂盒，或直接用于鲫鱼冠状病毒的检测。
优选的，当制备成试剂盒时，该试剂盒的非诊断性检测方法包括：
一种鲫鱼冠状病毒的RT-PCR检测方法，步骤包括：
1)提取待测样品的RNA并逆转录为cDNA；
2)PCR体系
采用25μl反应体系：浓度为40μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入两只PCR反应管，两个PCR反应管中再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl2 1.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
3)检测结果判定
聚合酶链式反应扩增的最终反应产物取4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示343bp和389bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
1.本发明首次自鲫鱼中分离出了冠状病毒，对于鲫鱼冠状病毒的研究具备开拓性的意义。
1.本发明的方法快速简便：本发明所建的RT-PCR方法只需数小时，相比较传统病毒分离方法数天时间，极大的提高了检测效率。
2.本发明的方法特异性强：两对引物对靶序列的特异序列区的识别，保证了PCR方法扩增的高度特异性。
附图说明
图1为本发明提供的引物的灵敏度的实验结果示意图；
其中，泳道1：原始模板、泳道2：10倍稀释、泳道3：100倍稀释、泳道4：1000倍稀释、泳道5：10000倍稀释、泳道6：100000倍稀释、泳道7：1000000倍稀释。
图2为利用本发明提供的引物对感染鲫鱼冠状病毒HB93的鲫鱼组织进行检测的结果示意图；其中泳道P：阳性对照；M：marker
泳道1：待测样品1；
泳道2：待测样品2；
泳道3：待测样品3；
泳道4：待测样品4。
具体实施方式
本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。
实施例1：
一种鲫鱼冠状病毒HB93，其分离过程如下：
1)将携带病毒的鲫鱼肝、脑、脾、肾等组织取出并碾磨后，培养基稀释100倍，2000rpm离心后取上清过滤，接种到草鱼性腺细胞(Grass carp ovary cell line,GCO)单层，25℃培养7天，产生细胞病变效应(CPE)，可见GCO细胞收缩变圆、折光度增加，部分细胞开始脱落，细胞单层开始破裂。
培养基：M199，10％胎牛血清，pH 7.0～7.2
2)收集病变细胞，利用透射电镜进行形态学鉴定。
3)收集病毒，对其进行全基因组测序，序列为SEQ ID NO.1所示。
鲫鱼冠状病毒的形态特征：病毒呈棒状，四周有明显的日冕状棘突结构，与典型的冠状病毒形态相符，该病毒已于2017年5月11日送至中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：鲫鱼冠状病毒(Crucian Carp Bafinivirus)HB93，保藏编号：CCTCC NO：V201722，地址：中国武汉武汉大学。
实施例2：
基于鲫鱼冠状病毒HB93的全序列(SEQ ID NO.1所示)与其他病毒的全序列的差异设计的引物：
本发明以普通PCR为例进行说明，基于该差异序列设计的其他引物，荧光定量引物，LAMP引物，数字PCR引物等，也能完成鲫鱼冠状病毒HB93的检测。
一种鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物，包括F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
实施例3：
利用鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物对鲫鱼冠状病毒HB93的检测，方法包括：
1.鲫鱼组织或感染细胞总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取待测样品的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer 1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dN TPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为40μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入两只PCR反应管，再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl2 1.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；
F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(E B)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。若F1和R1能扩增出343bp且F2和R2能扩增出389bp特征性条带，则该样品为阳性；如无任何条带，则为阴性。
实施例4：
鲫鱼冠状病毒RT-PCR检测引物特异性试验
利用实施例3所述的方法，对表1中的待检病毒样品进行检测，同时设置阴性对照组(双蒸水)和阳性对照组(CCBV-HB93)，待检病毒样品具体为：鲤春病毒血症病毒(SVCV)，草鱼呼肠孤病毒873(GCRV-873)，草鱼呼肠孤病毒9014(GCRV-9014)，传染性造血器官坏死病毒(IHNV)。
表1鲫鱼冠状病毒RT-PCR检测试剂盒特异性试验
试验编号 名称 扩增结果
1 CCBV-HB93 +
2 SVCV －
3 GCRV-873 －
4 GCRV-9014 －
5 IHNV －
结果如表1所示，仅阳性对照组(CCBV-HB93)可检测到343bp和389bp特征性条带，其余组均无特征条带，说明鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物具备很强的特异性。
实施例5：
鲫鱼冠状病毒RT-PCR检测引物的灵敏度
将浓度为1785ng/μL的CCBV-HB93cDNA模板10倍梯度稀释，利用实施例3的方法，检测利用本发明提供的引物PCR的检测限，结果如图1所示，可见105倍稀释还可检测到目的条带，也就是最低可检测17.85pg/μL的cDNA模板。
实施例6：
鲫鱼冠状病毒HB93RT-PCR检测引物在制备鲫鱼冠状病毒检测试剂盒中的应用：
1.鲫鱼组织总RNA的提取及cDNA的合成：采用提取感染鲫鱼冠状病毒HB93的鲫鱼的肝脾肾等内脏组织的总RNA。配置逆转录反应体系：3μL总RNA，Oligo(dT)18primer1μL，灭菌双蒸水8μL，混匀65℃5min后立刻冰浴；将5×Reaction Buffer 4μl，RNase抑制剂1μl，5mM dNTPs 2μL，M-MLV逆转录酶1μL加入冰浴的反应液中，混匀后，42℃1h，95℃5min，将获得cDNA模板-20℃保存备用。
2.聚合酶链式反应扩增：
采用25μl反应体系：浓度为40μM的两对引物F1、R1或F2、R2分别各取0.5μL加入两只PCR反应管，再分别加入2.5mM dNTPs 2μL，25mM MgCl2 1.5μL，5U Taq聚合酶0.5μL，模板cDNA 1μl，10×ThermoPol Reaction Buffer 2.5μl，用灭菌双蒸水将两管反应体系均补齐至25μL。反应条件，95℃预变性5min；95℃30s、48℃30s、72℃30s，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存。
F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；
F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
3.聚合酶链式反应扩增产物分析：
取聚合酶链式反应扩增的最终反应产物4μL，加入至含有0.5μg/mL溴化乙锭(EB)染料的2％的琼脂糖凝胶中，于100V电压下电泳30min，在凝胶成相系统上成像观察扩增产物的图谱。电泳图片显示343bp和389bp特征性条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
结果如图2所示，阳性对照(鲫鱼冠状病毒HB93)显示389bp和343bp特征性条带，阴性(水)对照无明显条带，1-4号感染了鲫鱼冠状病毒HB93的鲫鱼组织样品显示343bp和389bp特征性条带，说明样品1-4为鲫鱼冠状病毒阳性，与实际情况相符。
实施例7：
鲫鱼冠状病毒HB93在制备鲫鱼冠状病毒的实验室对照品中的应用：
即将本发明提供的鲫鱼冠状病毒HB93作为对照品，将待确认的其他鲫鱼冠状病毒与本发明的病毒进行生理生化上的比较，并且将待测样品跟SEQ ID NO.1所示序列进行比较。
SEQUENCE LISTING
<110> 湖北出入境检验检疫局检验检疫技术中心
<120> 一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用
<130> 一种鲫鱼冠状病毒HB93及RT-PCR检测引物及应用
<160> 5
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 26000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ttgaattacc aataaactac cacccgctat catagcacta gacactagcg aactgctagc 60
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aacgctgaag gcttagttat gtgcatgcca gaaggttttg ccctcatctc tggttgcatt 2880
cctcatccac ttgcttacta tgctgacaag tacggtcaaa cactcgtacc tgaattcaaa 2940
gtgacaagaa ctcacgttga acgcggcccc attccaccat cacggtccat ttactacaca 3000
ttcatcccaa ttaatgtaga ctccatccca cccttcggac acacctacaa atccctcgcc 3060
aaacttaaca catttaacct gggttgggaa gatcaagaca tgttagataa cgctgacacc 3120
ctccttccat gtctcttaga aaatgaaaac atgaaacttc acctaacatg gaaaatcatc 3180
gcccgtgact tctcagataa caccactgaa acagccctta ctacctacac tgattttaca 3240
actagtgatt tcaccccagc caaccaaaca ggatccagct ctcaatccct tagctctcca 3300
cctctttccc aactctcttc ccacaaatct cttgctaacc tctcagaaac tggctcaata 3360
gataacatcc cggaaaacac ccctgaaaca atccaagaag aagaagatat cgaagaggaa 3420
gtaacatctc ctgttcaacc cacactcaac acactccaag aacaagctac tctcaacgaa 3480
tccattcaat cactcgttga atcagttgat tctgatgtcc cttacacctg ggaacaacgt 3540
gttgaagaaa gtgaggttgc aactattgat ttacaagctg tagaattaga tcaaacaccc 3600
actcccacca ctctctcaac agaagcagtg caagaatggg tcaacgcaac atcacctgac 3660
cttgctacag tagactggaa cagtgcaata actgaacagg aaaccacagt aacttcacta 3720
atagaagaaa tctccctacg ccccaacacc aacaacaccg gctataactt gtttaaacct 3780
aaccaacgta acaacaacag cccatcagac tacctatcac gaacaacatc agcaaccaaa 3840
cactgcttaa ttaacggtct tacttcaggt tccaccatcc ttgaagtcgg atgcggatat 3900
ggtaaagaat tccacaaata caagaactct aacatcaaag tcgttgcttt ggaacctcac 3960
catgaacgct acaccgaagc cgcgaagaaa ctaccaccaa attctaccat ttacaacaag 4020
accctagaag aatacaacca aattgtcatt aaagaacaaa ttgacgccct agtttccttt 4080
aacgccattc attacagtac agttactgaa gctcttaaag catgtaacct tgccaaagat 4140
caagttgtca ttttaacacc aaatcatgat aaacttaaag ctcttcacga tagtaacaca 4200
accatcacaa attacaaaat tgaacttgct aataacaaat ttacatttac aatcggccaa 4260
aacacctaca gcgaaaacta cttctcactt caggatttca tgattggaat gcatgccagc 4320
aacttcatgc tttcttcccg ctcttgtact ctgcttgaac atgttaacac cttcaatgcc 4380
cacctcttaa ttgacgccac aacagaaaca actaccctgc tagacgccta tgaagtactc 4440
gtcttcataa aatttagacc actgctcctc acctactcca acaccgctct tgcaactaac 4500
aactcaagaa caatccgcag tgcactctca cgtcttatta acttccgtgt cgcaccttct 4560
aaaacaacat cacaggtaca tgttcacatc ctcacccgca acgaccacgc aaccacagaa 4620
caagaacatc tagacttagc aaatattgaa attgcccaca tgaacccaaa accagtaatt 4680
atctttgtaa cttcttcccg atccaaacat aactacacca ccccaactgt cttcttcgac 4740
tttgctacac tatcagcccc caccctccca gaacagctta aaccactcac tgatctagcc 4800
ctcgcaatcc aacacactgc taccaaaact ccaacaacag tacttacaac tgccccagag 4860
gacccaaaaa ccctcccagc agcacccacc tcctttacaa aaccttcccg taaacgctac 4920
cactgcttcc acgatttaac caccctacca gttaacaaaa atttcatctt agttaacgca 4980
ggtaaccccc acttaaaatc aggtggtgga ataactaaag ccgtctataa tcgctacggc 5040
caaggattca tgcaaactaa caacagcatg catgctacac aattacctct tgaagttggt 5100
gacgtcttgg aatacccctc tgaccgtaac aacctgatta acgtgacagc cccctgcatc 5160
aacatcaaac acgcagatta caaaggccca caaccagccc acgcactact agcaacatat 5220
aacgcaatta tcaactacgt tgaacgtaag tacgataatg gtgacgagaa acacgtcttc 5280
attcctctac ttggtgctgg atactacggt tggtcacaga tccaaagcct tcaagctttt 5340
ctatccgcga ctgataatag tttccgcaac acatatgttc tactcctaca cccatcatct 5400
gtagatgttg aaacagctga agtatttgca aaaatgctcg ccactactaa cccacactac 5460
taccatgttg agggcatagc taaagttaat gccaactctt gcgttctgcg tgcccacatt 5520
gaccttgccc gcaaaacatc ttaccctcaa cctagcttag gattaatcgg cgcttactgg 5580
atgtacacct gccccaccct ggccgcccca ttgatacaag ctggcatgca cggtcccaac 5640
acctggactc ctggcagctt tattgatact agtattgctg aaatgactgc tcgcgcttac 5700
aaaataaatc ttgtttgcga cggttgcttc actgatatca tcaatttcaa tcccgaccaa 5760
ggtttaatct gcaatacctg taagacacct gtcactctcc ggacaaacta ttatcgccca 5820
cgcctcccac acatgattaa aaatagtcac ggacaaccca tccctaacat tattctggat 5880
ggaatctacc acatggccac gcaccaattg ttcctaaatt cggtactctt taaaaattca 5940
catgctttca caattaacaa cctaagtgaa tgtgatctcc caacaactac agcagtagca 6000
acctactttt acaaaccttc agatgcttta aacttcttcc tgaactttaa ctctgctatt 6060
tctgctaacg taacttatac atcagaacag ataacacaag ctcaaaccac ccctcaactc 6120
accactgatg atgactactc ggacttggac attgacacaa ttaaccctac acctactact 6180
ttaccacgcg tcccaacacc gctttcaatt agtgatagta gcgaagatat ctcactctcc 6240
gatgacaccc acaccgtagc atcccatcac gcttcacaaa tgtccataac agccgacata 6300
actagtgata gatatagctc tacaaactct ctagctatct cagaagatat aacatttcaa 6360
acaggtgacg gtgaaacaac aacttcactt ctgactgatt cggtcctata ctactctgtc 6420
gttacagtct tacaactacg taaagcagag gattgtgtag aacctgctgt agaaactatt 6480
aacctaagac ccaactcatc acttcatacc ttgacacatg acacaaacgc catcgaccaa 6540
ctttacatcc aagtggcttc tgatgcttca aatcacactg taatcaataa caccacactt 6600
gaatctattt ctaaaacgat gtgtgtgaaa aactccttgt acacccttct tactaactca 6660
aagtgtataa gtcaccacat catagttaca ggatatgacc aacatgctca tgaaacacat 6720
accattaaaa gcgtcacgcg ccaaactatg ctcgccatcc aacctctcgt acaactcacg 6780
cccacacacg tttacagcac acttgaagaa gatatttcca ccatctttca aactgtcgtc 6840
ctagaacatg tcaaccacac taagctttcc acttataaca ccaagctaca ctacgcaact 6900
acagtaccaa caaacctact catcgatgga acaatcgaag atgttcaagg taagctgcgc 6960
gaagttgatt tcggcattgt tgttccttac cagtgtgaag ttgacgagca aattgaatac 7020
acaaatgcaa ttggcgactt actctaccaa aacacaaatc accactcacc actagtgacc 7080
tttgtttcta tcgacaaatc ttttactaaa cgtattttta attctttaaa gtttcaaact 7140
ctacagaacc tatggctcta ccttattacc ctacaagtat ttttcacagt taaaggaatt 7200
ggcttcggct tcagctcaac ggaaccaaac acacaactca tgaacggtct ctggatacaa 7260
tacggcatct tctacttcca agtacacctc caaaccctca tcacccaccc agtgaaaaat 7320
ggctacagac tactttcatt accaatcatg ctatacaaca aaggcaaaag attcaccgaa 7380
cgttcagtcc aaacaatgac gggagaaatc gttaacatac gaaaaccctc gccatcaaac 7440
gctgtacaaa aatacggcat taacacccga cttgaatacg ttgacatctt cgatctcctc 7500
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ctctctaaac acctttacac agtctcaaaa ctcactacct tcctctcgaa attcaaaaca 7680
gcaaccaccc gccacgtctt gtacgcaact aatcaagtaa ataaccgttc cctccacctt 7740
acccttggat ccacaacagt tgacttactt agctttacaa gcaaagcagt ttttctcgcc 7800
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gaagactact ctcgaccacc ctaccatgca atatttcaac acgcactccg cactttcgga 7920
cttatccctc ctaaagaaca ttactatagc tacccttccc tagcttcagc ttgcgcagac 7980
tcctcagctc cactttgctt cctgggaaca ccatttaact ttcacttccc atcatcctac 8040
acacaagcag catccatgac tactgaacac gtagtaccat tttggattca actaatcatc 8100
ctagccccac catcgctttt cctagttgtc atcccgtggc tgatcacaat gttcatctca 8160
ccagtattaa catttaacca acttttgctc cctgcactcg ccgtacattt cttagctatc 8220
tatgtaagtt acctttacta ttttaagaaa tcatgctgtc attctcacac atgccttaaa 8280
cacgctaaat tagaccgccc catccaaatt aaaggcctct ttgatttatc catgtacttc 8340
aatcacaata aactttgccc ccgccacaac ttctactgta ataatgctga cgaacccggc 8400
cacacacttg gacccgtcct agcagctcac atcactgaat tttaccatct taaacctggc 8460
actattaagc ccgatgtcgc cctagtacac acagaacacc acgcttctct gagtcgcaaa 8520
gaattgaaga aacacgacga cccaaccgat tgtgtctgga ccgccccaca aggcgctgct 8580
gatactctcg tctacgaagc ttacgctcat ttgaaaggag tccaaattcg cattgatgcc 8640
aacaccgata caacaactcg tagcatgcct attcccatgg gcgctaagac aacatcttct 8700
ccagctacag gtgttatcaa cacaaaagtt ctcggccatc ttaaaagaca ttgtaaaaac 8760
ccggctctcc aatcttacct atcaggatac gtcggcgccc ctaacgccaa aaccactatc 8820
atgcccatta cgctctttaa acatttgcct gaaggcctta agaaatacgc catcaaaaac 8880
atcaccttct caattaacat gctaaccgat aactctaact caggtttcat tccagaaggc 8940
atacacaacc caaacaacct cccaaccaag actttcctgg tcaaatctat tgatcaaaca 9000
atctttgacc aactccaccc tgaaacacaa gctatgctta aagacgaata ccacattaaa 9060
cttcatgaca taacatctca attttacgaa gttatttctt caatgatgtc ctacgaaagt 9120
ttcatcttcg cactcatcat cgtcttatcc gtctttctcg gtttcatctc ctacagctct 9180
accattactg ccaccacatc cctacatgcc ggcttgaacc ccaccatgcg cggatccacc 9240
acaggtaaac cattcatcca accagttact taccccaact ccattctaat ccctctgaca 9300
tcttcccaat ataatgtatt cagactacaa aacggaactc tctacttcac ttctcaaata 9360
actgctccaa cctgtaccgt taaactacca aacccctaca ttggcttaac cacagaaaaa 9420
ttctatgaat gctcatctgc cctcctccac atgcccttca tggttcatct tggcggtgtg 9480
aaaattgctt accttagagc cggtgttgcc tataacatgc caacatactc agagacacca 9540
caaactagta aactctgtgt tctcactgca ctctcaaaga cgaaatgctt taacatccta 9600
ccaggcggtt tccacacccc agtgctagcc atcctcgttt caacttgtgc acttctggca 9660
acggtcctct tctaccttta cctactccag atctttaaat tctacaccaa ctcagtcttg 9720
atggtggttg ccattcaaat tgcaactatc ttcctcttca tgctatcccc agctcttgct 9780
ctaacacttc aactggtctg tctcatgtac ctttaccata actggatggt tgccatgatt 9840
aacatcgcaa acctcgcagt tctagcccac acaacatttg gcatggtact catcttcatc 9900
tacgcgctct acagacttta caaagtctac caagttacat caaccgctgc agttacaatt 9960
aacgcaactg gtgaaatgcg cttccacgga actcttgatg aagttgctct ctgcaccttt 10020
ccaattagct ctgcaagtgt ttaccaaatc atgtctgacc tcagcttaga ttacattaaa 10080
ctggccagct acaaaacatc ttataaccgt gctacccgta acctggttaa catgatgcaa 10140
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tactccaaca tctgcaaaat tttatcaaca acccactcac gatcaacatt ctgcgtcgga 10320
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atcacaattc ttaaactcac aacaccaaac tccgcaatca ctcacaccat cgagtgccat 10500
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cacttctttg ctatcggaac tgaatctggc gaatctggca gtccctactt ctttaacaac 10680
aaacttgtag gaattcacta cggagttaac acctgtgatc aatttatgct cgcctctaaa 10740
cctgatggca gttactacat cccagagatc caacacaaca tctccacaca accatctttt 10800
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cacgatgcta tcaccaaagc ccttgcccaa acaacacgct cagcttacac caacgattta 10920
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aataaattag gccctaagac actccacgac tacatggcaa catccatcca agttcaatct 11040
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ctctactatc taatggttat catttttgac atcatcgcat tcttcttaac ccccggttct 11160
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tacttcaaca tcgtctatct tttcacaatc attcaatcct ataaaccaat tgaaatgtca 11340
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ctagttgttg gttgtgtgct ttgcatccac gtcttcttca gctacagatc ctttacatct 11520
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gtcatcagcg caaccctgat cttagcaatc gtgccatctc ccctcctcgc agcaacagtc 11700
tactctttct atctcattga ccaagatgtc ctctgcctcc taatctttct cctgcttaca 11760
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attctctcac cctctgctta cgctcaatgg ctcatggcaa aatctgaagg taaagaatac 11880
ggtctctttt tcgctgtcat tcaatcagtc tttgatttta catctcaaca cgaagttgaa 11940
ttgacacttg aagcacaaga gattacacag caagtccgtg ttgaaattca taacaccgaa 12000
cctaaagata ccaaggatga cacctgctac atcacaccca ctactattat taacccaatt 12060
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ccagatcctg aacctccaca catcgggata agttccacct taactggcga agaactgatt 13800
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ataaaccgat acctcgtatc ttttacatta acgttgcaac acgtaatgac acaaaattag 13980
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gctgaaattc tcgatgacaa aaatcgtgtc gtcttgaaag tcactcttga tacaaagtca 17040
gtactaacac ctactgtcta ccatgtaaca tcttgtcgtg gtacacttta cactcgctac 17100
aataaaatcc gcagagttca gcacaaacct tcaatagttc ctagatcaac cctagcctac 17160
tttaacaacg cacaattcat aattggacca ccaggaacag gaaaaactac tttcgtcatc 17220
aagaactaca ttgacagagc agaaccaact aacaaaatag cctacattgc cccaacacac 17280
gcactcgtac aagctatgga tcaagccatc ttcgaagctc acggatatgc agctagtgtc 17340
aacatcgtta aatcagaact taacaacaag acctacaact acaaagcaaa catgcctgga 17400
tgcgatatca tgctcgggac acccggagct gtatcagcgc acactggttg taccatgatc 17460
ttcgatgaga tgtcacttgt acagttgaat actgctatga ctgcaattgc tcgagtaaaa 17520
ccatctaaac tcatccttct cggtgaccca tttcaattag gcccagtagt tcacttcaga 17580
aactttcagt acaactacga agacttcccc tatcttcatt tcgccccaac aataacatct 17640
ctccgcgtat gcttccgatg cccaacccaa atctttaacg tatggagtca ctactacacc 17700
aaacatgaca tcccactcaa tgcctttaaa gacggcggct catttgaaat cattaaacac 17760
cactcatgcg ccagagtttc agaaacagct caccctctgg tcacaagact ctcagaagaa 17820
aatccagact ccatgatcct ttgtaactac aaagctccag tctcctgcct cgaaaacgct 17880
ctaacaattg actcaagtca aggcagaacc taccgagacg tcatagtcgt gttgctcgga 17940
aacacaaatt tcacccgtgt acccaaccga tttattgtcg ctgcttcaag agctacacat 18000
tctctcaaag tttacctttc tgaagagatg tacgaccact actccacact attcaattgg 18060
ccacacttag aaacaccaca aatccagcca caaaacgcct tcacaacacc taacaactta 18120
gaagaaacaa atctcacaat ggccgctaat aacatcagct ctctcgtcat ctgtgatata 18180
gaattcttcc atcaagttcg cagccttgaa cccaaagttt gcacacttga agtcggtgac 18240
attaccatcc atacatcaac aagcgccaaa cagatcatcg ttccacgcgt ttcatcaaca 18300
tctagtgaaa tttttccaaa atactttgct cataacatgc caaccctcac tctccccaaa 18360
ccaacaccaa aaggagattg ggactacatg aaacctcacc gtggaatttc tcgccgcatc 18420
aacatcgaca gaactcacaa actcttctcc catatggctt gcacaacaac tggaactccc 18480
atctatgttc tctacggtgc ccgcaacgat atcctagccc tttctaaatt aaatatcgtt 18540
ggtgactata aatgtttctg caatctacca gctaactact tcaccctaga tgcccaagat 18600
aacatcaaat actactgcac ccaacacgcc aaaccagcag cacctctcgc tggaaccatc 18660
aatgctaaat acattgacat ccaaacagaa aagatcactc ttgccaaacg ccatgctgaa 18720
atttgtgatc accaccatgg tgcagcacac acatctgatg tcgacaccat tatgaccgga 18780
tgcatcttag gcaatgaatt gacactagca actcaacatc tcagccagct tctcttcacg 18840
gaacccttca gccactactc aagtgtaatt tctccagata tgcaccttac agtttcaacc 18900
cgcccttgca ggacactcgg acaacttatc ataactaaca tcaatggtaa gaactacaga 18960
ttctcaatcc aaccacacct ggatcttaaa acacactttt ttaacatcgt tgctaaacaa 19020
ggccactcct ctgttttagt caacgttcca gaaacagttc cgacctgtac taaaattcgc 19080
ggtgaaacct gcgctacatg ctacaacacc tggcttatcc tccaagaact tcatgctgaa 19140
ctagctaaca caggtctcgc cctggtcaac ccactccaac gccaatacac tcaacgagaa 19200
acacaaattt taaccaaggt aatgtctgtc actccaacat ctacaggcaa aatcatggtc 19260
catctcgaca acacactctc cttccccttc ctactcgatt taccaacaag tatccaaaca 19320
tactgtaaca agatcgataa accaatccct aaccctgcaa ttttcacttc ccttaaaatt 19380
acacacactt acggattcgg aacaccattt gtccctatga caaacaaccc actcattcca 19440
tctatcctca gtaaccaaaa acttgctgac aacccagact actactacat cacacatcaa 19500
ccatcaaaca gtgaacttcc tttcatgact tcttcaccaa ctgctggctt ctattgctat 19560
gacacccctt tgattaactt ctcggaacgt accattaaca aaccacccta ctatatcaca 19620
cgaattgtcc gtggccaact acaaaaacct gatattggcc tcttctccac taatagactt 19680
ttcaccaacc aatacgtacc tttacctaat gaacaacaag cgtacgaaga ctttggtaaa 19740
catgtctcac ttggcgaaac aacatcaaca tcctggacaa tcggtggcat gcatctactc 19800
ccagccttcc aaaccacaac caattggcag atcacatcag aacatacacc aattctctca 19860
attaccatag ctcgcgatcg cggggtcaaa ctaggaacaa cagccctaga tgtacctgct 19920
gaccaactac ttgaattaat cgactataaa aacatcacag tctcaaaagt aatagctatt 19980
aagatcgacg gccaaaaagt aaacatgatg gttttcactc aaaacggtaa aatccaaaca 20040
gcctacccag tacaacaagc aaagatgcac gatgtgacaa aacaccacgt cactcctgac 20100
tacataatct ggcctaaaat tttcagcgac tcacctgtcg ataaatggga tcttcctaat 20160
tacaaccaac cacctaaagg tctcacatcc aacgtcaaca tccataaata cgatcaaatg 20220
tgtgcattct ttgacaaaca cctaaccatt ccaacaaatg gccacgtaca ccatcttggt 20280
catgccggac aagtttacag ccctggtgat atagttttaa aaagctattt cacaaaagct 20340
cgtttaacat catacgactt gcgtgattgc atatcaacca gcgaaacagc tcaccctgat 20400
gacaactggc gtgcacactt catcctgtca gatgcatact gtcccaacac cgactttaca 20460
tctctctgca aagactacat gactaaacac ctacgtcttg gcggaagcat gctctggaag 20520
atgacagaaa cctgtaacat cgacgctgaa tccattctac catactttgg atctttcact 20580
ttcgtcacct tcgctgtcaa ctactcatca tctgaaactt acgctttcct taagggatac 20640
atgggtgaac ctaactacaa caccacactt ccagctaaca tcatgggtca actcggcgcg 20700
tacagacaaa acctattgta cgtcccctat gctagtgagt ataccggtac cagagtttat 20760
aaagattctg gtgctgttaa agtcattccg gccatgtatg cagatcgtct gaatacttcc 20820
cactatgctc tcggctgcat ctacagcact tagacatggc aaacttgcta tggctaactc 20880
ttctcatcac tctcagtctc gtgtccgctc aaattaacac gacacttcca gactgtccta 20940
ccccaacctg cacctacaca ccaccaacaa cgaccccatt tgaccacaca tcactacact 21000
cttttttcac acatgacaca aactatgctt tccttcttgc tcttaagtat aatggtactt 21060
tcattcctgc cactatggct atgcctgcta acaacctttc gcaaacatat acactcaact 21120
ataaaaatgt ctttgtcaac gtacctgatt ctcaactccc tcctcctcaa agaagtaata 21180
ctcagttggc tgttgttgca accacagatt cctgtcttac tgcaacgtat caagcgattc 21240
ctggtactat tcctggcctt tcaactaatc acatgtattg tgtgaaattt actcagtcgt 21300
ccaactttgt gtacttgtac gataccactg tgaaaacccc tgttggcgta cttttaaaaa 21360
acccaactgc cccagtagtt acaactatcc tatccactat catggttaac cgccctacaa 21420
cagtttcaac ctcacagctg ctagctaata tctactccct tatgagaacg agaagcaacg 21480
tgattcaaca acaattcact tgcacatctt gcctctttgc catcgacgca tctacaggaa 21540
gagcagctac ctcaccaact acttacctcc taaacaactg gtccccatcc ttctttgaaa 21600
ctaaaacagc tatgttggac cacgtctcta tgaacaccat ctaccaaaca gcacgtggtg 21660
ttactcgtga aaccttcact ggttacatcc ttaacgcagc taaaaccgct gcctacgctc 21720
gtggttctcc cgcctattac atcttttcat tcgcagccat tgcacgctac catcaagcaa 21780
tggttactcc ttataactat aacatcggaa aactttgtga agcaacagct gcttgctgct 21840
tatcaaatgg cattgaacat tttgacatct atacctggct atttcactac tacggcttta 21900
tgaaatccaa agtctacagt gaaactttta caacaaaccc agtactaaca tcagttatta 21960
acttagccac atcaattaaa ggtaaacatt ccgtgtactg tgacctaaca ccttacagtt 22020
catttactgc ctataatttg atcatgcttc aagacgttgt cgaacaatac caagggacac 22080
gtacaacatc cacatacgct aacaattttc tcaacctcac tgatattaac ggatacctac 22140
cctattccac cgataccccc ctcccacaaa actaccaaaa ctacatgcct tttgcaacct 22200
acctacttgc aacattttac tcttctttca ctttacaaca gaaatttgac ttccacagat 22260
tcctccaatc tgtctgttat tatgactctg gtttcatttc tcgtaaccaa gcctaccatt 22320
ctatctgtca cataatcact ctgaaaacat catcttcagt accttacccc gcagaactcc 22380
aatggccctt tactgctctc ccttcctctg gttatgactc ttatccagtt tctacagatt 22440
taggcacagt agctgttggc aacacaaatc cacttgatta ccctggaatt tgttaccaat 22500
cagtttgctt gactcatcct actattaact tcagactttt gttatcagaa ttaccaatta 22560
aatgggaagt ccgacctgaa ggtatctatg taacatctag aaacgatcct acatgcctga 22620
atttcaaaac atcacagttg ggaacagttt tcattacact ctacgattct accactacat 22680
gcacaattca acagactact tactctcgct ctgctgtcct gcgccaagtc aacacgttta 22740
caccaaatgc tactgattta gtcgtgccct acggcaaaac accaatatac aatggagcct 22800
ataatattaa ttccactgca tctggtgctg tctctctctc taccaacaca cactacattc 22860
cacgtctcct cacttcagtt ttaacaccgc aaagtgacta caagattaca cctacaacca 22920
ctaatcttga accattcgtg gaaattaatg gcacaacctt ttactacgat gctaatcaag 22980
cctacgttaa tacatcggac gtttatcaag ctaacgttga ttttggactc ccccaaacat 23040
tttctcttga taccagcttc cttaattgca cagctttcct ctgcgcttct gactacaaat 23100
gtatcgccga cttttcacca atctgctcag ctacacaacc actaatcgac gccctactcc 23160
aaacctacac actgtacaat caacaactta cactgtacaa ttcttccctg ctcacaattc 23220
aagccgctgc aaactacctc tacgacacaa gaacacgtac tagacgatca ctcctatcta 23280
ctgtcaacct tggctacggt gacgtttttc aacaaccagc ctgggtctac gaaataggtg 23340
caacagctgc aattcctatg atcggccctg cagtctcagt cggtttgtta gccagtagag 23400
tagcatctat tgaatcaacc ctctatcaaa ttacccaagg agtgaaggag tctattatgg 23460
ctatgaacac caagcttgat aagattgcca acattttaca ctcagacatc gaaagattag 23520
gattaacagt taacacatta gcctcttcat tcaacacatt cactaaacaa gtaacagata 23580
aatttgcctc tgttgatgtt gcatttaacg acttatcaac atcactgaac acactcacca 23640
caacaacaac tgttggtgcc tcttatgcag ctcaaattaa cttcgcaaca accacgctaa 23700
ccaatttaga agttcaaatc tctcaaacaa cagatcacgc tctatcttgc atcgctgcgc 23760
ttaatgaaca tgttctttct ccacactgca tttccgtttc acaacttagc gcttacacac 23820
ctaatgctct ctctaacatt ggtgaaaaac tagtactaac tcactacatc aacggatcac 23880
tcatcacatt ctaccatctc attgctagca agggagttta cagacccctg ccaaaaatgt 23940
ataattctac acaccattta gttgcaacaa ctggcttcta tgacggccat tgtatcttct 24000
gtggtgaaca ttattgtgat atcagcgttt ctgtaccatg tgattatgcg tacgaaccac 24060
ttaaatccac tgtactagca gcttacccac taacaactgg tgtagccctt ctcactcttg 24120
actctacagc tactaacttc gttattaact ataataatgc ccctctcatt tcatcaagcg 24180
ttccaaaacc acctatcatc aataacaccg atggtacagt tattacgctc caacaacaag 24240
taatccagct ccaaactcaa ttcgatcact ttaacatctc gtcgaatttt cacgtgtcag 24300
aaatccaacc agtcatagac tactacaatg cacaaatcaa ctcatctcta aaccagatag 24360
ttgatttcgg aaatggctca acatctaatg taggaacaat catcctcatt gtaactatag 24420
ttgcccttgc tcttgcatca gctatcgcca tcatctgtgg attaaagcac taaagaccaa 24480
caagttgcaa tggcttccac cggtaaaaac accaccgcag gagatcccaa ccttgggttt 24540
cacttacaac ttaatgatgt ccttaacacc ctggacatct ccggcttcag catctcaaat 24600
tctcatttga tgagtgcgat gctgaccctt aaccttctct ggagcgctat ctttctagtc 24660
tccttctatc taatcttgga catggttatg tactacgttc ccctgctcaa taagattcca 24720
ctgctgccaa caatcaaaaa cctttgttgg tttatctcga ctctgcttgt tgctgtttcc 24780
atttacgctt caggaactct gctgatcatc aaaatcttcg gaggcgtagt cttgctcctt 24840
gcttttctcg gcatggtgaa gactttctat atgctcattg caatggcgct gtcctactac 24900
cgacaccgta acatcgcagt ggcattgaac ggccctaatg tcgttatggt taacggcaca 24960
gcagtccact ctgatttcat ccccacgtct gtgacactgg tgaagaaaga tggtgaactc 25020
tattttcaag gaacaaaggt ccccggaaac aacttgattg atgcaaccgt gaagatcttc 25080
actttcaacg aatcgtttga atgcctcccc atcgcactct cacgttacac taaaggttcc 25140
tacgctagat ttgagctcaa gtcgaccaac acccactatg aactccaaac tttctatcct 25200
tcgcaaacag aaactaaatc tgtttgaaac actagcgaaa acaaattaca atggcattct 25260
acggacaacc aatgatgcct atgcctatgc ctgcttcctt tcctcctcgt cgccgtgccc 25320
ctaaaaagcg cccgccacag aagaaacaag ccaagcccca acctaaacct ctcaatgacc 25380
aacagaaaac agctgttgcg aaagaggcta ttgccaaaac caatactgtg ccaatgccac 25440
ccatggccac agtagtgaag acaaacctgc gcgttcaggt tgtaaaaagc aaacgcggtg 25500
acctcctaga tgctcgaggg cgtcttacac aatcagagat caaccagctg tatttccaaa 25560
tcgccactgc cctcaacaac ggcctcggag aaattggaat acataatgct tcaacgcagg 25620
acggcgttcg tctcatcgtg cgcctcaatt tagcccctcc taatcctatt gctgagaaac 25680
tctacaaatc tcacgcggcg gctaatctca actcagaaat tctggtttct aaacaaaagg 25740
aactggagcg agaccccatt tttcatgttt cctcgactga gtaaactgac ttcacctcaa 25800
aactgaagaa agtatatata atcacatctc tcacactatc ctttataaac tatatattgg 25860
ggtggcatta ggccattcca aagaattctc taagatcaca ctcctcgata cctgactagt 25920
catcacgttt cctggggtct gctctttaac attctactat cctataagat ctaaaactat 25980
ccaaaaaaaa aaaaaaaaaa 26000
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
caaagtaaac cctggaga 18
<210> 3
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
atcaatgatg gtgcagtt 18
<210> 4
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgaaacaatc caagaaga 18
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
acaagttata gccggtgt 18

Claims (6)

1.一种鲫鱼冠状病毒，所述的鲫鱼冠状病毒为鲫鱼冠状病毒（Crucian CarpBafinivirus）HB93。
2.权利要求1所述的鲫鱼冠状病毒HB93的RT-PCR检测引物，所述的引物为F1：5'-CAAAGTAAACCCTGGAGA-3'，R1：5'-ATCAATGATGGTGCAGTT-3'；F2：5'-TGAAACAATCCAAGAAGA-3'，R2：5'-ACAAGTTATAGCCGGTGT-3'。
3.权利要求1所述的鲫鱼冠状病毒HB93的全序列，其序列为SEQ ID NO.1所示。
4.权利要求1所述的鲫鱼冠状病毒HB93在制备鲫鱼冠状病毒病疫苗中的应用。
5.权利要求1所述的鲫鱼冠状病毒HB93在制备鲫鱼冠状病毒对照品中的应用。
6.权利要求2所述的引物在制备鲫鱼冠状病毒检测试剂盒中的应用。
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