ES2599003T3 - Diagnóstico y tratamiento de preeclampsia - Google Patents

Abstract

Alfa-1-microglobulina para su uso en la profilaxis o el tratamiento de preeclampsia.

Description

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DESCRIPCION

Diagnostico y tratamiento de preeclampsia Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a biomarcadores para preeclampsia. En particular, la invencion se refiere a metodos para el diagnostico o la ayuda en el diagnostico de preeclampsia de un mamifero hembra embarazado para detectar niveles elevados de sustancias particulares. Esto facilita y hace posible el diagnostico temprano y la intervencion clinica cuando se encuentra un estado preeclamptico. Ademas, la invencion se refiere a un metodo para tratar mamiferos hembra con preeclampsia con el proposito de revertir los estados patologicos asociados con esta enfermedad.

Antecedentes de la invencion

La preeclampsia (PE), hipertension proteinurica gestacional, complica el 3-7% de todos los embarazos, y es un trastorno materno multisistemico. Cada ano se notifican 8.500.000 casos en todo el mundo, de los cuales 5.000 son en Suecia. Actualmente es la causa mas comun de muerte para tanto los ninos como las madres durante el embarazo.

La PE se ha denominado la enfermedad de las teorias [Roberts, 2001] y se describio tan pronto como hace 3000 anos por los antiguos egipcios [Stevens, 1975]. La PE es todavia una de las complicaciones obstetricas dominantes que provocan morbimortalidad perinatal y materna. Las manifestaciones clinicas, es decir, hipertension y proteinuria, aparecen desde las 20 semanas de gestacion en adelante, pero los mecanismos subyacentes pueden empezar tan pronto como en el momento de la implantacion. A medida que la enfermedad progresa, el angiospasmo en el cerebro y el edema cerebral pueden provocar convulsiones epilepticas graves-eclampsia [Lipstein et al., 2003].

La etiologia para la PE se desconoce todavia; sin embargo datos recientes sugieren que la enfermedad evoluciona en dos fases:

Fase 1. Durante la placentacion, se ha mostrado una invasion defectuosa de las celulas placentarias, trofoblastos, al interior de las capas musculares de las arterias espirales [Brosens et al., 2002; pagina, 1939]. Un conjunto creciente de pruebas sugiere que el estres oxidativo (vease a continuacion) agrava adicionalmente la funcion vascular en la placenta [Roberts, 1999], lo que a su vez [Shennan et al., 2001] da lugar a perfusion sanguinea alterada [Hung et al., 2002]. Siguen como consecuencia vasoconstriccion y resistencia elevada al flujo sanguineo. Los resultados de la matriz muestran participacion de genes tanto en la regulacion redox como en la inflamacion [Hansson et al., 2005].

Fase 2. La perfusion placentaria disminuida, en combinacion con el estres oxidativo, provoca dano de celulas endoteliales general dentro de la placenta. En la ultima parte de la fase 2, la inflamacion endotelial tambien dana el sistema vascular materno, los rinones en particular, lo que es un hallazgo histologico tipico en la PE [Roberts et al., 1989; de Groot y Taylor, 1993; Granger et al., 2001; Strevens et al, 2003]. Hasta la fecha no se conoce el vinculo entre la fase uno y dos.

En general, la preeclampsia se produce en mujeres durante su primer embarazo, y mas comunmente afecta a adolescentes y mujeres de mas de 35 anos de edad. Mujeres con enfermedades subyacentes que las predisponen a hipertension tambien estan entre las que corren mayor riesgo para el desarrollo de este estado. La preeclampsia es la causa principal de morbimortalidad materna. Representa el 12-18% de todas las muertes maternas relacionadas con el embarazo (alrededor de 70 muertes maternas al ano en los Estados Unidos y una estimacion de 50.000 muertes maternas al ano en todo el mundo). Tambien se asocia con una alta morbimortalidad perinatal, debido principalmente a prematuridad iatrogenica. Son comunes manifestaciones neurologicas en la preeclampsia, e incluyen de cefaleas, aberraciones visuales a manifestaciones mas graves tales como convulsiones, accidente cerebrovascular y ceguera cortical. El parto del feto y la eliminacion de la placenta es el unico tratamiento curativo para la preeclampsia, un hecho que ha conducido a la teoria generalmente aceptada de que la patologia placentaria es fundamental para el desarrollo de preeclampsia. A pesar de intensos esfuerzos de investigacion, la etiologia de la preeclampsia sigue siendo en gran parte desconocida.

Tal como se menciono anteriormente, se cree que una placentacion inadecuada, que da como resultado perfusion placentaria reducida, es una etapa temprana en el desarrollo de PE. La perfusion reducida asociada con el aumento de la resistencia vascular puede detectarse con ultrasonido Doppler, y mujeres con pruebas de resistencia aumentada en las arterias uterinas de manera temprana en sus embarazos (“incisura”) corren un riesgo superior de desarrollo de PE que mujeres sin este hallazgo. A medida que la PE progresa, el lecho vascular materno se ve afectado, y se observa una inflamacion endotelial general. La mala perfusion placentaria parece para dar como resultado una cascada de cambios patologicos: disminucion del suministro de oxigeno, estres oxidativo, formacion de especies reactivas de oxigeno, dano endotelial, aumento de la permeabilidad vascular e inflamacion (vease la figura 1).

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Los sintomas de preeclampsia aparecen normalmente en el tercer trimestre de embarazo y habitualmente se detectan mediante monitorizacion de rutina de la orina y tension arterial de la mujer. Sin embargo, estos metodos de monitorizacion son ineficaces para el diagnostico del sindrome en una fase temprana. El diagnostico temprano podria reducir el riesgo para el sujeto o feto en desarrollo y podrian monitorizarse mas especificamente pacientes de alto riesgo. Ademas, un tratamiento eficaz, del que actualmente todavia se carece, seria ideal en combinacion con una deteccion temprana.

Se han descrito algunos metodos de diagnostico en la tecnica anterior pero ninguno de ellos se ha usado aun satisfactoriamente en la practica clinica a gran escala. Por ejemplo pueden mencionarse: los documentos US 5.079.171 y US 5.108.898, que dan a conocer que la preeclampsia, hipertension inducida por el embarazo, y la eclampsia pueden diagnosticarse identificando la presencia de un marcador de celulas endoteliales, fibronectina celular, en una muestra de sangre, plasma o suero de una mujer embarazada, por ejemplo, usando un inmunoensayo de competicion o de tipo sandwich. La fibronectina celular se deriva de celulas endoteliales que se rompen o alteran durante el proceso patologico. El documento US 5.238.819 da a conocer el diagnostico de preeclampsia usando un ensayo para medir un factor mitogenico en la sangre. El factor mitogenico es un compuesto proteinico de aproximadamente 160 kDa y puede estimular la mitosis de fibroblastos. Su presencia se detecta detectando la captacion de timidina radiomarcada por celulas activadas mediante los sueros o el plasma de un sujeto preeclamptico. Este marcador aparece despues que ya se haya producido el dano al lecho vascular materno, por tanto de manera tardia en la progresion de la enfermedad.

El documento WO 05/093413 (Yale University and Brigham and Women’s Hospital) da a conocer un metodo de diagnostico de preeclampsia grave en una mujer embarazada, que comprende medir el nivel de hemoglobina libre en una muestra de liquido cefalorraquideo. No se menciona ningun compuesto especifico como util para el tratamiento de preeclampsia.

Lodberg y Akerstrom (Scand. J. Immunol. 13, 383-390, 1981) se refieren a estudios in vitro de alfa-1-microglobulina. Los autores indican que la alfa-1-microglobulina tiene propiedades inmunosupresoras. Sin embargo, como mucho pueden demostrarse un efecto supresor de la alfa-1-microglobulina sobre la estimulacion de linfocitos inducida por antigeno asi como un efecto inhibidor de la migracion. En ningun punto en el documento se proporciona ninguna indicacion de que la alfa-1-microglobulina sea una sustancia farmacologica. En los experimentos se emplea una disolucion de alfa-1-microglobulina.

Actualmente, no hay curas conocidas para la preeclampsia. La preeclampsia puede variar en gravedad desde leve hasta potencialmente mortal. Una forma leve de preeclampsia puede permanecer leve con reposo en cama y monitorizacion frecuente. Para casos de moderados a graves, es necesaria hospitalizacion y se prescriben medicacion para la tension arterial y medicamentos anticonvulsivos para prevenir las convulsiones. Si el estado se vuelve potencialmente mortal de la madre o el bebe, la unica cura es terminar el embarazo dando como resultado a menudo un bebe nacido prematuramente.

Claramente, la falta de terapia para la preeclampsia acoplada con la falta secular de capacidad de diagnosticarla hasta que la enfermedad ha progresado a una forma mas grave, da lugar a la necesidad de enfoques novedosos para diagnosticar y tratar la preeclampsia, que es un problema de salud publica significativo.

Descripcion de la invencion

Por consiguiente, hay una necesidad de identificar biomarcadores que puedan identificar de manera fiable i) sujetos embarazados que corren el riesgo de desarrollar preeclampsia, ii) sujetos embarazados que padecen preeclampsia en fase temprana, y/o iii) sujetos embarazados que padecen preeclampsia (independientemente de si se ha diagnosticado o no). Ademas, hay una necesidad de desarrollar regimenes de tratamiento para mujeres embarazadas en cualquiera de los grupos i)-iii) mencionados anteriormente.

La presente invencion se refiere a alfa-1-microglobulina (A1M) y a composiciones farmaceuticas que comprenden A1M para su uso en la profilaxis o el tratamiento de preeclampsia asi como a composiciones farmaceuticas especificas que comprenden A1M.

Tambien se proporciona en el presente documento un biomarcador, concretamente hemoglobina fetal, que se ha mostrado que entra en el sistema circulatorio materno en mujeres embarazadas que padecen preeclampsia.

La presente invencion se basa en el conocimiento de los inventores y la realizacion de que niveles elevados de hemoglobina fetal libre en una mujer embarazada estan asociados con un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia. Por tanto, puede usarse hemoglobina fetal libre como biomarcador para el diagnostico de preeclampsia y tambien es una diana candidata para el tratamiento de preeclampsia.

Este biomarcador permite la deteccion de un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia en una fase temprana, ofreciendo por tanto mas esperanza de tratamiento significativo. Ademas, los metodos para el diagnostico de preeclampsia segun la presente invencion pueden evitar la hospitalizacion innecesaria de mujeres embarazadas que

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no estan en el grupo de riesgo. Ademas, el metodo para monitorizar la progresion o regresion de preeclampsia puede ayudar a planear el parto del feto y disminuir el riesgo de nacimiento prematuro.

Se ha descrito brevemente la preeclampsia antes en el presente documento. En mujeres, ya despues de 12 semanas de gestacion, se establece el flujo de sangre utero-placenta. La barrera placentaria mantiene la circulacion de sangre fetal bien separada de la materna (vease la figura 2). Las unidades funcionales mas pequenas de la placenta, concretamente las vellosidades, proporcionan al feto la nutricion y el oxigeno, transportados a traves de la barrera. Sin embargo, en la PE, la perfusion placentaria disminuida da como resultado menos sangre oxigenada a la placenta. La falta de oxigeno y la perfusion de sangre desigual dan lugar a estres oxidativo dentro de la placenta. El estres oxidativo induce apoptosis en las celulas placentarias, lo que a su vez provoca inflamacion y dano de celulas endoteliales general dentro de la placenta (vease la figura 3). Cuando se dana la barrera placentaria, las celulas fetales pueden transferirse a la circulacion materna. El conocimiento de la transferencia de celulas fetales a la circulacion materna ha estado disponible durante aproximadamente diez anos pero nadie hasta ahora ha observado hemoglobina libre (es decir, hemoglobina encontrada fuera de las celulas (por ejemplo en el plasma) y, por consiguiente, no unida en las celulas. Sobre todo se ha examinado el analisis de ADN fetal libre.

Soportado por los hallazgos notificados en la seccion experimental en el presente documento, las presentes invenciones han encontrado niveles elevados de hemoglobina fetal libre (o de sus subunidades, la cadena alfa y/o gamma) en pacientes que padecen PE. En mujeres que no padecen PE, el nivel de hemoglobina fetal libre debe ser de aproximadamente 0,038 pg/ml [Turpeinen et al, 1992] mientras que los hallazgos indican un aumento en 20 veces hasta niveles de aproximadamente 1 pg/ml, o mas dependiendo de la gravedad de la enfermedad.

Aunque ha habido indicaciones de que mujeres que padecen PE tienen un nivel aumentado de hemoglobina total, ningun informe ha mostrado hasta ahora que la hemoglobina fetal libre es un indicador fiable. Ademas, la medicion de un aumento creciente en el nivel de hemoglobina fetal libre en vez de un aumento creciente en la hemoglobina total proporciona resultados mucho mas seguros y fiables. El motivo es que el nivel normal de hemoglobina total es mucho mas alto que el de hemoglobina fetal. Si el nivel de hemoglobina fetal en plasma en una mujer embarazada normal es de 0,05 pg/ml y en una paciente con PE de 1 pg/ml, entonces el aumento es (1-0,05)/0,05 x 100 = 2000% (o 21 veces). En comparacion, los niveles de hemoglobina total en pacientes normales y con PE son de 3 pg/ml y 4,5 pg/ml, respectivamente (vease el ejemplo 5.1), lo que corresponde a un aumento de (4,5-3)/3 x 100 = 50% (o 1,5 veces).

Tal como se muestra en la figura 1, los resultados indicados en los ejemplos en el presente documento indican que la hemoglobina fetal (Hb-F) es el vinculo entre la fase 1 y la fase 2. Una toxina de la placenta ha sido una hipotesis durante muchos anos como indicador para PE. Se sabe que la fase I tiene lugar en la placenta como consecuencia de hipoxia debida a perfusion alterada. Entonces la reaccion de la placenta afecta al sistema materno pero no se ha identificado ningun factor especifico. Basandose en los resultados presentados en la seccion experimental, los presentes inventores sugieren que un factor de ese tipo es Hb fetal segun los mecanismos anteriores. El diagnostico temprano puede ayudar a seguir a mujeres que corren el riesgo de desarrollar PE, “salud temprana”. Pueden monitorizarse mujeres con signos clinicos de PE como paciente ambulatoria suponiendo que puede monitorizarse la progresion especificamente, siguiendo por tanto los niveles de Hb fetal y/o la razon de Hb fetal/Hb total. La necesidad de un nuevo tratamiento es obvia y el beneficio del mismo seria enorme.

El nivel de hemoglobina fetal puede usarse solo para la evaluacion de si una paciente corre el riesgo de o ya ha desarrollado preeclampsia, pero tambien puede usarse en combinacion con el nivel total de hemoglobina o el nivel de hemoglobina de adulto presente en la muestra corporal especifica como indicador de la progresion de la enfermedad.

Se encontro sorprendentemente que niveles elevados de hemoglobina libre, notablemente hemoglobina fetal, en una mujer embarazada estan asociados con un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia. Por tanto, puede usarse hemoglobina fetal como biomarcador para el diagnostico de preeclampsia y tambien es una diana candidata para el tratamiento de preeclampsia.

Basandose en esta observacion, la presente invencion se refiere a lo siguiente:

i) un metodo para diagnosticar PE

ii) un metodo para evaluar la progresion o regresion de PE

iii) un metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento de PE

iv) un kit para su uso en uno de los metodos mencionados anteriormente

v) sustancias y composiciones para su uso en el tratamiento de PE

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vi) antfgeno leucocitario humano DPA1 (HLA-DPA1) como biomarcador.

Definiciones

En esta memoria descriptiva, a menos que se especifique lo contrario, “un” o “una” significa “uno o mas”.

Tal como se usa en esta memoria descriptiva, el termino “preeclampsia” se define segun criterios establecidos por el comite de terminologia del Colegio Americano de Obstetricia y Ginecologia, es decir, hipertension mas proteinuria, edema manifiesto o ambos. Por ejemplo, puede definirse la preeclampsia como tension arterial > 140/90 mm Hg y proteinuria > 0,3 g/l.

Existen diferentes formas de hemoglobina. La hemoglobina de adulto (hemoglobina A) consiste en dos cadenas polipeptidicas alfa y dos beta (Hba, Hbp), que contienen cada una un grupo hemo no peptidico que se une de manera reversible a una molecula de oxigeno individual. La hemoglobina A2, otro componente de hemoglobina de adulto, esta compuesta por dos cadenas alfa y dos cadenas delta (Hba, HbS). La hemoglobina fetal (hemoglobina F), por otro lado, es el componente principal de hemoglobina en el feto. Esta hemoglobina tiene dos cadenas polipeptidicas alfa y dos gamma (Hba, Hby).

El termino “hemoglobina libre”, en esta memoria descriptiva se refiere a hemoglobina libre en general e incluye hemoglobina libre total, hemoglobina A libre, hemoglobina A2 libre, hemoglobina F libre, cualquier subunidad de hemoglobina libre (por ejemplo cadena Hba, Hbp, HbS o Hby), o cualquier combinacion de las mismas. Incluye ademas estas entidades de hemoglobina en una forma o bien de polipeptido (proteina) o bien de nucleotido (ARN), excepto cuando se aplica como una diana para el tratamiento. El termino “hemoglobina fetal libre” se refiere a hemoglobina F libre o cualquier subunidad de hemoglobina F e incluye las entidades de hemoglobina F en una forma de polipeptido (proteina) o nucleotido (ARN), excepto cuando se aplica como una diana para el tratamiento.

En esta memoria descriptiva, el termino “libre” tal como se usa, entre otros, en las expresiones “hemoglobina libre”, “hemoglobina fetal libre” o “subunidades de hemoglobina libre (por ejemplo cadenas Hba, Hbp, HbS o Hby)” se refiere a hemoglobina, hemoglobina fetal o subunidades de hemoglobina que circulan libremente en un liquido biologico, en contraposicion a hemoglobina celular que se refiere a las moleculas que residen dentro de las celulas. Por tanto el termino “libre” en este sentido se usa principalmente para distinguir la hemoglobina libre de la hemoglobina que esta presente en eritrocitos intactos.

Los terminos “marcador” o “biomarcador”, en esta memoria descriptiva, se refieren a una biomolecula, preferiblemente, un polipeptido o proteina, que esta presente de manera diferencial en una muestra tomada de una mujer que tiene preeclampsia o una mujer que corre un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia en comparacion con una muestra comparable tomada de una mujer, denominada una mujer/sujeto “normal” que no tiene preeclampsia ni corre un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia.

El termino “muestra biologica de mamifero hembra embarazado” o equivalentes del mismo pretende indicar una muestra del propio mamifero; por consiguiente, la muestra no se obtiene de por ejemplo el feto o el liquido amniotico.

Re i) Metodo para diagnosticar PE

Segun un primer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para el diagnostico o la ayuda en el diagnostico de preeclampsia que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biologica de un mamifero hembra embarazado; (b) medir el nivel de hemoglobina fetal libre o medir el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en dicha muestra biologica; y (c) comparar el nivel de hemoglobina fetal libre en la muestra con un valor de referencia o comparar la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la muestra con un valor de referencia, para determinar si dicha hembra embarazada tiene o no tiene preeclampsia, o corre o no un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia.

La etapa de obtener una muestra biologica de dicho mamifero hembra embarazado incluye el procedimiento de dotarse de una muestra biologica obtenida con metodos convencionales bien conocidos en la tecnica.

La muestra biologica podria ser, por ejemplo, sangre, suero sanguineo, plasma, orina, secreciones vaginales, lagrimas, tejido, suero, heces, esputo, liquido amniotico y liquido cefalorraquideo. En realizaciones especificas, la muestra biologica es sangre, orina, liquido amniotico o tejido de la placenta.

En determinadas realizaciones, la muestra biologica es sangre, plasma, orina o tejido de la placenta.

El tamano de muestra de la muestra biologica recogida varia segun las necesidades y sensibilidades individuales. La cantidad recogida puede variar ampliamente, dependiendo del tipo de pruebas que estan usandose, el sitio de recogida y la posibilidad de cualquier efecto adverso para la madre o el feto. En una realizacion especifica, un

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tamano de muestra de sangre esta en algun punto en el intervalo de desde aproximadamente 5 hasta aproximadamente 75 ml, preferiblemente desde aproximadamente 20 hasta aproximadamente 40 ml.

Se contempla que los metodos de esta invencion son aplicables a cualquier animal que sea un animal “placentario”, es decir, uno que nutre al feto no nacido a traves de una placenta. Tales animales incluyen, entre otros, seres humanos, otros primates, animales de alimentacion mamifera. Un animal preferido para el diagnostico es un ser humano o un animal o ganado valioso comercialmente.

En una realizacion preferida, el mamifero es un ser humano.

En una determinada realizacion, se recogen muestras de mujeres embarazadas. La mujer embarazada puede ser un individuo que se ha determinado que corre un alto riesgo de preeclampsia basandose en su historia personal o familiar. Otras pacientes, entre otros, incluyen mujeres embarazadas que se sabe que tienen preeclampsia y para las que esta usandose la prueba para determinar la eficacia de la terapia o el tratamiento que estan recibiendo. Ademas, las pacientes podrian incluir mujeres embarazadas sanas que estan sometiendose a una prueba como parte de un examen de rutina.

Si se desea, puede prepararse la muestra para potenciar la capacidad de deteccion de hemoglobina fetal libre. Normalmente, la preparacion de la muestra implica el fraccionamiento de la muestra y la recogida de fracciones que se determina que contienen hemoglobina libre. Los metodos de fraccionamiento previo incluyen, por ejemplo, centrifugacion, extraccion de ARN/ADN, cromatografia de exclusion molecular, cromatografia de intercambio ionico, electroforesis en gel y cromatografia de liquidos.

La etapa de medir el nivel de hemoglobina fetal libre puede realizarse mediante, por ejemplo, un ensayo inmunologico (por ejemplo, un ELISA u otro inmunoensayo basado en fase solida tal como SPRIA o ELlSA amplificado denominado IMRAMP), un ensayo de chip de proteinas, amplificacion por PCR en tiempo real cuantitativa, desorcion/ionizacion laser potenciada en superficie (SELDI), cromatografia de liquidos de alta resolucion, espectrometria de masas, hibridacion in situ, inmunohistoquimica, quimioluminiscencia, nefelometrfa/turbometrfa, flujo lateral o electroforesis o fluorescencia pura o polarizada. Sin embargo, resultaria evidente para un experto en la tecnica que esta lista de tecnicas no es completa y estas tecnicas no son los unicos metodos adecuados que pueden usarse en la presente invencion para medir el nivel de hemoglobina fetal libre.

Las sustancias que se detectan y/o se miden en los metodos de la invencion incluyen hemoglobina total, hemoglobina A, hemoglobina A2, hemoglobina F, cualquiera de las cadenas de hemoglobina (Hba, Hbp, HbS y Hby), o cualquier combinacion de las mismas. En una realizacion especifica de la invencion, se detecta y/o se mide la cadena gamma de la hemoglobina (Hby) en el metodo de la invencion. Claramente, la hemoglobina F y sus subunidades son las mas importantes ya que los hallazgos se basan en niveles aumentados de hemoglobina fetal libre y su impacto en el desarrollo de PE. Tal como se comenta en el presente documento, la cadena gamma es indicativa de hemoglobina fetal, mientras que por ejemplo la cadena beta y delta son indicativas de hemoglobina de adulto. Basandose en la descripcion en el presente documento, un experto en la tecnica sabra que cadena(s) de hemoglobina debe(n) medirse.

Puede usarse un ensayo inmunologico (inmunoensayo), segun la presente invencion, para medir el nivel de hemoglobina libre. Un inmunoensayo es un ensayo que usa un anticuerpo para unir especificamente un antigeno (por ejemplo, hemoglobina). El inmunoensayo se caracteriza por el uso de propiedades de union especifica de un anticuerpo particular para aislar, seleccionar como diana y/o cuantificar el antigeno. Por tanto, en condiciones de inmunoensayo designadas, los anticuerpos especificados se unen a una proteina particular al menos dos veces el fondo y no se unen sustancialmente en una cantidad significativa a otras proteinas presentes en la muestra. Usando los marcadores purificados o sus secuencias de acido nucleico, pueden prepararse anticuerpos que se unen especificamente a un marcador (por ejemplo, hemoglobina) usando cualquier metodo adecuado conocido en la tecnica [vease por ejemplo, Coligan, 1991].

En una determinada realizacion del primer aspecto, se mide el nivel de hemoglobina fetal libre usando por ejemplo un ensayo inmunologico. Particularmente, el ensayo inmunologico es un ELISA. Sin embargo, tal como se demuestra en los ejemplos en el presente documento, tambien puede emplearse inmunotransferencia de tipo Western.

En una determinada realizacion del primer aspecto, se determina el nivel de hemoglobina fetal libre midiendo el ARN de hemoglobina fetal libre. Particularmente, se mide el ARN de hemoglobina fetal libre usando PCR en tiempo real. En los casos en los que tambien se determina el nivel de hemoglobina total, este nivel tambien puede determinarse midiendo el ARN de cadena alfa de hemoglobina, usando por ejemplo PCR en tiempo real.

En general, puede ponerse en contacto una muestra obtenida de un sujeto con el anticuerpo que se une especificamente al marcador. Opcionalmente, el anticuerpo puede fijarse a un soporte solido para facilitar el lavado y posterior aislamiento del complejo, antes de poner en contacto el anticuerpo con una muestra. Los ejemplos de soportes solidos incluyen vidrio o plastico en forma de, por ejemplo, una placa de microtitulacion, una barra, una

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perla o una microperla.

Tras incubar la muestra con anticuerpos, se lava la mezcla y puede detectarse el complejo de anticuerpo-marcador formado. Esto puede lograrse incubando la mezcla lavada con un reactivo de deteccion. Este reactivo de deteccion puede ser, por ejemplo, un segundo anticuerpo que se marca con un marcador detectable. Los marcadores detectables a modo de ejemplo incluyen perlas magneticas, tintes fluorescentes, radiomarcadores, enzimas (por ejemplo, peroxido del rabano, fosfatasa alcalina y otras comunmente usadas en un ELISA) y marcadores calorimetricos tales como oro coloidal o vidrio coloreado o perlas de plastico.

Alternativamente, el marcador en la muestra puede detectarse usando un ensayo indirecto, en el que, por ejemplo, se usa un segundo anticuerpo marcado para detectar el anticuerpo especifico de marcador unido y/o en un ensayo de competicion o inhibicion en el que, por ejemplo, un anticuerpo monoclonal que se une a un epitopo distinto del marcador se incuba simultaneamente con la mezcla.

Metodos para medir la cantidad o presencia de un complejo de anticuerpo-marcador incluyen, por ejemplo, deteccion de fluorescencia, luminiscencia, quimioluminiscencia, absorbancia, reflectancia, transmitancia, indice de refraccion (por ejemplo, resonancia de plasmones superficiales, elipsometria, un metodo de espejo resonante, un metodo de guia de ondas de acoplador direccional o interferometria) o radioactividad. Los metodos opticos incluyen microscopia (tanto confocal como no confocal), metodos de obtencion de imagenes y metodos de no obtencion de imagenes. Los metodos electroquimicos incluyen metodos de voltametria y amperometria. Los metodos de radiofrecuencia incluyen espectroscopia de resonancia multipolar.

Se conocen bien en la tecnica ensayos utiles, incluyendo, por ejemplo, un inmunoensayo enzimatico (EIA) tal como ensayo inmunoabsorbente unido a enzimas (ELISA), radioinmunoensayos tales como RIA y SPRIA; un ensayo de inmunotransferencia de tipo Western; o un ensayo de transferencia por ranuras.

En una realizacion especifica, un ELISA es el metodo preferido para medir el nivel de hemoglobina libre.

La etapa de medir el nivel de hemoglobina fetal libre, segun la presente invencion, tambien puede lograrse mediante la deteccion y medicion de ARN libre que codifica para polipeptidos de hemoglobina en la muestra, por ejemplo deteccion de secuencias de ARN que codifican para la cadena gamma de la hemoglobina (Hby), o fragmentos de la misma, en el plasma sanguineo.

Segun una realizacion especifica, se cuantifica el ARN de hemoglobina libre usando PCR en tiempo real.

En la etapa de comparar el nivel de hemoglobina libre en la muestra con un valor de referencia o comparar la razon entre el nivel de la subunidad de hemoglobina libre y el nivel de hemoglobina libre total en la muestra con un valor de referencia, el termino “valor de referencia” en relacion con la presente invencion, segun una realizacion, se refiere a un nivel medio o de referencia determinado de hemoglobina libre, es decir, el mismo tipo de hemoglobina libre que esta midiendose en la etapa (b), o la razon entre el nivel de la subunidad de hemoglobina libre y el nivel de hemoglobina libre total, en muestras de un grupo control. Preferiblemente, el grupo control comprende mamiferos hembra embarazados no diagnosticados con preeclampsia.

Cuando se usa un grupo control, se realiza la determinacion del valor de referencia de hemoglobina fetal libre usando metodos convencionales de analisis bien conocidos en la tecnica. Por supuesto, el valor variara dependiendo de, por ejemplo, el tipo de ensayo usado, la forma de hemoglobina libre que esta midiendose, la clase de muestra biologica y el grupo de sujetos. Por ejemplo, niveles en sangre promedio normales de hemoglobina libre total en un grupo de mujeres embarazadas no diagnosticadas con preeclampsia, y medidos con un ELISA, estan normalmente en el intervalo de 2,5 a 3,5 pg/ml, pero por supuesto pueden variar dependiendo de la edad, el peso, el numero de embarazos tempranos etc.

En el caso de que dicho valor de referencia sea el nivel de hemoglobina fetal libre o la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en muestras de un grupo control, un nivel superior de hemoglobina fetal libre o un valor superior de dicha razon en la muestra con respecto al valor de referencia indica que dicha hembra embarazada tiene preeclampsia o corre un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia.

En una determinada realizacion del primer aspecto, el valor de referencia es el nivel de hemoglobina fetal libre o la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en muestras de un grupo control, en el que un nivel superior de hemoglobina fetal libre o un valor superior de dicha razon en la muestra con respecto al valor de referencia indica que dicha hembra embarazada tiene preeclampsia o corre un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia. Los resultados preliminares, usando un metodo de inmunotransferencia de tipo Western para la determinacion de la hemoglobina fetal libre, indican que mujeres que tienen un nivel en plasma de aproximadamente 5 pg/ml o mas o, alternativamente un nivel en orina de 1 pg/ml o mas estan sujetas a PE o a desarrollar PE. Sin embargo, se espera que estos valores se identifiquen mejor usando un metodo mas sensible como por ejemplo ELISA. A partir de la bibliografia, se ha notificado un nivel en plasma normal de hemoglobina fetal de aproximadamente 0,3-76 pg/l, es decir, 0,0003-0,076 pg/ml (vease Turpeinen et al, 1992) con un valor medio de

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0,038 pg/ml. Por consiguiente, se han observado niveles pronunciados de hemoglobina fetal en mujeres que desarrollan PE o que ya padecen PE. Por consiguiente, se contempla que mujeres que tienen un nivel en plasma de hemoglobina fetal 5-10 veces o mas por encima del nivel normal (es decir, 0,3 pg/ml o mas) corren el riesgo de desarrollar PE. Sin embargo, tambien se espera que este valor se identifique mejor usando un metodo mas sensible como por ejemplo ELISA. En realizaciones especificas, se contempla que si el nivel en plasma de hemoglobina fetal es de aproximadamente 20 veces o mas, aproximadamente 50 veces o mas, aproximadamente 75 veces o mas o aproximadamente 100 veces o mas entonces la mujer o bien corre el riesgo de desarrollar PE o bien padece PE en estadio o bien 1 o bien 2. Visto de otro modo y siempre que se aplique el intervalo normal mencionado anteriormente, una mujer corre el riesgo de o padece PE si el nivel en plasma de hemoglobina fetal libre es de aproximadamente 0,5 pg/ml o mas tal como, por ejemplo, aproximadamente 0,75 pg/ml o mas, aproximadamente 1 pg/ml o mas, aproximadamente 1,25 pg/ml o mas, aproximadamente 1,5 pg/ml o mas, aproximadamente 1,75 pg/ml o mas, aproximadamente 2 pg/ml o mas, aproximadamente 2,5 pg/ml o mas, aproximadamente 3 pg/ml o mas, aproximadamente 3,5 pg/ml o mas, aproximadamente 4 pg/ml o mas, aproximadamente 4,5 pg/ml o mas o aproximadamente 5 pg/ml. Se contempla que cuanto menor es el nivel de hemoglobina fetal menos grave es la enfermedad en su presente estadio. Entonces la progresion (o regresion) de la enfermedad puede seguirse mediante la medicion frecuente del nivel de hemoglobina fetal de la misma mujer.

Los resultados de los ejemplos en el presente documento apoyan las consideraciones anteriores. Por tanto, usando el metodo de inmunotransferencia de tipo Western, aproximadamente el 20% de las mujeres en el grupo II (es decir, el grupo que ya padece PE) tuvieron un nivel en plasma de 5 pg/ml o mas. Con respecto al nivel en orina, aproximadamente el 20% de las mujeres que padecen PE tuvieron un nivel en orina de Hb fetal de 1 pg/ml o mas (vease el ejemplo 5.2). Por consiguiente, con respecto a los niveles en orina parece como si el nivel fuese un poco mas bajo que el nivel en plasma y, por consiguiente, se aplican todos los niveles mencionados anteriormente para el plasma, pero los niveles inferiores se reducen hasta aproximadamente 0,06 pg/ml o mas, aproximadamente 0,1 pg/ml o mas, aproximadamente 0,2 pg/ml o mas, 0,4 pg/ml o mas etc., en orina.

Otro modo diferente a observar el nivel en plasma u orina exacto de hemoglobina fetal con el fin de juzgar si una mujer corre el riesgo o ya tiene una indicacion de PE, es observar la desviacion estandar para la prueba llevada a cabo cuando se determina el nivel en plasma u orina (o de hecho el nivel en cualquier otro liquido corporal adecuado). Se contempla en el presente documento que un parametro relevante es un aumento del nivel normal (por ejemplo en plasma u orina etc.) con 5 veces la desviacion estandar o mas tal como, por ejemplo 10 veces la desviacion estandar o mas, 25 veces la desviacion estandar o mas, 50 veces la desviacion estandar o mas o 100 veces la desviacion estandar o mas.

Con respecto a la medicion de la razon (R) entre Hb fetal libre (Hb F) y Hb total libre (Hb total), la razon de una mujer normal (es decir, que no padece PE) es de aproximadamente 0,038 pg/ml/3 pg/ml = 0,012 cuando los dos parametros se miden mediante ensayo inmunofluorometrico de resolucion temporal tal como se describe por Turpeinen et al., y ELISA tal como se describe a continuacion (ejemplo 5). Por consiguiente, se contempla que una razon R de 0,12 o mas indica que la mujer corre el riesgo o ya ha desarrollado PE en un determinado estadio. En determinadas realizaciones, se indica enfermedad o riesgo de PE en una determinada fase si R es 0,15 o mas tal como, por ejemplo, 0,2 o mas, 0,3 o mas, 0,4 o mas, 0,5 o mas o 0,6 o mas. Teoricamente, R=1 cuando toda (el 100%) la Hb total libre es Hb fetal. Por tanto, este es el limite superior.

La presente invencion tambien contempla el uso de los metodos descritos en el presente documento en combinacion con otros metodos de diagnostico. Los metodos de diagnostico que pueden usarse en combinacion con los metodos de la invencion incluyen metodos actuales para el diagnostico o la ayuda en el diagnostico de preeclampsia conocidos por profesionales medicos expertos en la tecnica, como ejemplos de tales metodos pueden mencionarse medir el nivel de urato o el nivel de cistatina C en suero. En primer lugar puede analizarse una muestra biologica por los metodos descritos en el presente documento. Entonces la muestra biologica puede someterse a prueba mediante otros metodos para corroborar la observacion. Por tanto, la precision del metodo de diagnostico de la presente invencion puede mejorarse combinandolo con otros metodos de diagnostico.

Re ii) Evaluacion de la progresion/regresion de PE

En realizaciones adicionales de la invencion, puede emplearse la hemoglobina fetal libre, por ejemplo subunidades de hemoglobina fetal libre, para determinar el estado de preeclampsia (por ejemplo, preeclampsia grave) o para el pronostico, es decir, la prediccion del desenlace de la enfermedad, de la paciente. Por ejemplo, la concentracion de hemoglobina libre se correlaciona con la gravedad de la preeclampsia (por ejemplo, preeclampsia leve o grave). Se sabe que manifestaciones neurologicas, tales como convulsiones o coma (eclampsia), accidente cerebrovascular, encefalopatia hipertensiva, cefaleas y aberraciones visuales (escotoma, diplopia, amaurosis, hemianopsia homonima), son comunes en preeclampsia grave [Douglas y Redman, 1994].

Por tanto, segun el segundo aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para monitorizar la progresion o la regresion de preeclampsia, que comprende: (a) medir el nivel de hemoglobina fetal libre o medir el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en una primera muestra biologica aislada de un

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mamifero hembra embarazado; (b) medir el nivel de hemoglobina fetal libre o medir el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en una segunda muestra biologica aislada de dicho mamifero hembra embarazado en un momento posterior; y (c) comparar los valores medidos en la etapa (a) y (b), en el que un aumento en el nivel de hemoglobina fetal libre en la segunda muestra con respecto al nivel de hemoglobina fetal libre en la primera muestra o un aumento en la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la segunda muestra con respecto a la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la primera muestra indica progresion de preeclampsia; y una disminucion en el nivel de hemoglobina fetal libre en la segunda muestra con respecto al nivel de hemoglobina fetal libre en la primera muestra o una disminucion en la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la segunda muestra con respecto a la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la primera muestra indica regresion de preeclampsia.

Se realizo la parte de campo del estudio en el hospital Muhimbili en Dar es Salaam, la principal ciudad de Tanzania (vease el ejemplo 5). El hospital Muhimbili es un centro de referencia de tercer nivel, que recibe pacientes predominantemente de los hospitales municipales. La Muhimbili University of Health and Allied Sciences (MUHAS) es la unica universidad publica en el pais que ofrece educacion superior de formacion en ciencias de la salud. Los altos numeros de embarazos complicados por PE y eclampsia en Tanzania hacen que sea un entorno adecuado para el estudio. En el hospital Muhimbili, se encontro PE en el 16% de las mujeres que se trataron en la clinica prenatal. La incidencia de eclampsia basada en el hospital fue de 200/10.000 partos basandose en un estudio durante 1999-2000. Esto puede compararse a la incidencia de 5/10.000 maternidades en Europa. Se incluyeron diez pacientes con eclampsia o PE grave y diez controles correspondidos en el estudio (vease la siguiente tabla).

Tabla 1: Caracteristicas clinicas en el parto de pacientes que participaron en este estudio.

PE Control

Numeroa

10 10

Edad (anos)

28,5 (19-40) 21,5 (18-30)

Paridad

1,6 ± 2,3 0,6 ± 1,4

Edad gestacional (dias)

256 (217-266) 280 (231-287)

Tension arterial sistolica (mmHg)***

191 ± 34 115 ± 9

Tension arterial diastolica (mmHg)***

124 ± 18 74 ± 7

Proteinuria (g/l)***.b

2,6 ± 0,8 0,3 ± 1,0

Peso al nacer (g)

2005±717 3040 ± 398

Peso de la placenta (g)

335±120 506 ± 68

Seccion (n)

6 4

IUFD (n)

5 0

Eclampsia (n)

4 0

PE=Preeclampsia Se uso Anova de una via con prueba de Bonferroni post-hoc para evaluar estadisticamente diferencias entre los grupos. Se considero un valor de p < 0,05 estadisticamente significativo. *** La prueba mostro una diferencia significativa entre PE frente al control (p<0,001). a Un caso de muerte materna en el plazo de 24 horas tras el parto en el grupo de PE. b Los valores para la proteinuria son inexactos debido a limitaciones del metodo. El valor medible mas alto fue 3 g/l

Se seleccionaron pacientes durante un periodo de seis semanas, septiembre - octubre de 2007, en el departamento de ginecologia y obstetricia en el hospital Muhimbili. Se selecciono el grupo preeclamptico de la sala de cuidados intensivos eclampticos, en la que se admitio un promedio de dos pacientes con PE al dia. Los criterios de inclusion fueron o bien PE grave (tension arterial diastolica > 110 mmHg en dos ocasiones) o bien eclampsia. Se excluyeron del estudio todas las pacientes con hipertension cronica documentada antes del embarazo. Se entrevistaron a las pacientes usando una hoja de preguntas traducida a swahili. Se estudiaron las historias clinicas para cada paciente participante con el fin de obtener informacion adicional. Las mujeres incluidas en el estudio tenian una elevacion persistente de la tension arterial durante las 24 horas iniciales de hospitalizacion y una proteinuria >1 g/l. Se indicaron la edad, la paridad, el numero de visitas prenatales, el modo de parto, la admision a intervalo de parto, los resultados maternos y fetales.

Las muestras de orina recogidas antes del parto mostraron una diferencia estadisticamente significativa en los niveles de hemoglobina total entre los grupos de PE y control (figura 21). Se realizaron calculos estadisticos mediante una prueba U de Mann-Whitney no parametrica, que mostro un valor de p de 0,0093. La mediana del valor para el grupo preeclamptico fue de 31,0 mg/ml en comparacion con 2,5 mg/ml en el grupo control. El alto valor del grupo control se debe lo mas probablemente a la alta incidencia de malaria. Tambien se analizaron las muestras de orina recogidas tras el parto.

En realizaciones especificas se contempla que un aumento en el nivel de hemoglobina fetal libre correspondiente a dos desviaciones estandar o mas tal como, por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 7 o mas o 10 o mas desviaciones estandar es indicativo de un riesgo aumentado para el desarrollo de PE y/o la progresion de la

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enfermedad. En un tema analogo, una disminucion en el nivel de hemoglobina fetal libre correspondiente a dos desviaciones estandar o mas tal como, por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 7 o mas o 10 o mas desviaciones estandar es indicativa de un riesgo disminuido para el desarrollo de PE y/o la regresion de la enfermedad. Otra medida puede ser la razon (Rt) entre la Hb F en el momento t2 y Hb F en el momento ti, en el que ti es el tiempo en el que se tomo la primera muestra y t2 es el tiempo en el que se tomo la segunda muestra. Un aumento en Rt es indicativo de una progresion de la enfermedad y una disminucion en Rt es indicativa de una regresion de la enfermedad. Puesto que se espera que la variacion individual sea minima debido al hecho de que es la misma mujer la que se somete a las pruebas, se cree que incluso un pequeno aumento o disminucion es un indicador valido. Se espera que un valor de Rt de 1,1 o mas sea indicativo de una progresion de la enfermedad, mientras que un valor de Rt de 0,9 o menos sea indicativo de una regresion de la enfermedad.

En los casos en los que se emplea la razon R (es decir, la razon entre Hb F y Hb total) la medida es normalmente la razon entre R (R2) obtenido en un segundo punto en el tiempo y R obtenido en un primer punto en el tiempo (R1). Un aumento en R2/R1 es indicativo de una progresion de la enfermedad y una disminucion en R2/R1 es indicativa de una regresion de la enfermedad. Puesto que se espera que la variacion individual sea minima debido al hecho de que es la misma mujer la que se somete a las pruebas, se cree que incluso un pequeno aumento o disminucion es un indicador valido. Se espera que un valor de la razon R2/R1 de 1,1 o mas sea indicativo de una progresion de la enfermedad, mientras que un valor de la razon R2/R1 de 0,9 o menos sea indicativo de una regresion de la enfermedad.

Los detalles mencionados en el primer aspecto tambien se aplican a este y los siguientes aspectos.

Re iii) Un metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento especifico de PE

Segun el tercer aspecto de la presente invencion, se proporciona un metodo para evaluar la eficacia de un tratamiento para preeclampsia que comprende las siguientes etapas: (a) medir el nivel de hemoglobina fetal libre o medir el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en una primera muestra biologica obtenida de un mamifero hembra embarazado antes del tratamiento; (b) medir el nivel de hemoglobina fetal libre o medir el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total, en una segunda muestra biologica del mismo mamifero embarazado tras el tratamiento; y (c) comparar el nivel o los niveles determinado(s) en (a) con el nivel o los niveles determinado(s) en (b), en el que una disminucion en el nivel de hemoglobina fetal libre en la segunda muestra con respecto al nivel de hemoglobina fetal libre en la primera muestra o una disminucion en la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la segunda muestra con respecto a la razon entre el nivel de hemoglobina fetal libre y el nivel de hemoglobina libre total en la primera muestra indica que el tratamiento es eficaz para el tratamiento de preeclampsia.

En realizaciones especificas se contempla que la eficacia del tratamiento puede evaluarse determinando cualquier disminucion en el nivel de hemoglobina fetal libre. Si la disminucion corresponde a dos desviaciones estandar o mas tal como, por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 7 o mas o 10 o mas desviaciones estandar es indicativa de que el tratamiento es eficaz en la reduccion de la progresion de PE y/o el tratamiento de la enfermedad y/o alivio de los sintomas asociados con la enfermedad. En un tema analogo un aumento en el nivel de hemoglobina fetal libre correspondiente a dos desviaciones estandar o mas tal como, por ejemplo, 3 o mas, 4 o mas, 5 o mas, 7 o mas o 10 o mas desviaciones estandar es indicativo de un tratamiento ineficaz. Otra medida puede ser la razon (Rt) entre la Hb F en el momento t2 y Hb F en el momento t1 en el que t1 es el tiempo en el que se tomo la primera muestra y t2 es el tiempo en el que se tomo la segunda muestra. Un aumento en Rt es indicativo de una progresion de la enfermedad, es decir, el tratamiento no es suficiente, mientras que una disminucion en Rt es indicativa de una regresion de la enfermedad y un tratamiento eficaz. Puesto que se espera que la variacion individual sea minima debido al hecho de que es la misma mujer la que se somete a las pruebas, se cree que incluso un pequeno aumento o disminucion es un indicador valido. Se espera que un valor de Rt de 1,1 o mas sea indicativo de una progresion de la enfermedad, mientras que un valor de Rt de 0,9 o menos sea indicativo de una regresion de la enfermedad.

En los casos en los que se emplea la razon R (es decir, la razon entre Hb F y Hb total) la medida es normalmente la razon entre R (R2) obtenido en un segundo punto en el tiempo y R obtenido en un primer punto en el tiempo (R1). Un aumento en R2/R1 es indicativo de una progresion de la enfermedad, es decir, el tratamiento no parece que sea suficiente, y una disminucion en R2/R1 es indicativa de una regresion de la enfermedad, es decir, el tratamiento parece que tiene el efecto deseado. Puesto que se espera que la variacion individual sea minima debido al hecho de que es la misma mujer la que se somete a las pruebas, se cree que incluso un pequeno aumento o disminucion es un indicador valido. Se espera que un valor de la razon R2/R1 de 1,1 o mas sea indicativo de una progresion de la enfermedad, mientras que un valor de la razon R2/R1 de 0,9 o menos sea indicativo de una regresion de la enfermedad.

Re iv) Kit de diagnostico

Segun el cuarto aspecto, se proporciona un kit de ensayo para el diagnostico o la ayuda en el diagnostico de preeclampsia, segun la presente invencion, que comprende medios para medir el nivel de hemoglobina fetal libre en una muestra biologica de un mamifero hembra embarazado e instrucciones para el uso de dichos medios de

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deteccion.

En el presente documento tambien se dan a conocer kits para el diagnostico o la ayuda en el diagnostico de preeclampsia. Se usan los kits para detectar o examinar la presencia de hemoglobina libre que esta presente de manera diferencial en muestras de sujetos con preeclampsia.

En una realizacion, el kit comprende medios para detectar en una muestra biologica de un mamifero hembra embarazado niveles de hemoglobina libre (por ejemplo cadena alfa de hemoglobina (Hba), cadena beta de hemoglobina (Hbp), cadena delta de hemoglobina (HbS), cadena gamma de hemoglobina (Hby) y hemoglobina libre total), o bien individualmente o bien en combinacion con otros medios de deteccion e instrucciones para el uso de dichos medios de deteccion. Alternativa o adicionalmente, un kit comprende medios para medir ARNm de Hb fetal.

En una realizacion preferida, el kit comprende medios para detectar el nivel de hemoglobina fetal libre, por ejemplo medios para medir el nivel de cadena gamma de hemoglobina (Hby) en una muestra. En otra realizacion, comprende ademas medios para detectar el nivel de hemoglobina libre total.

En una realizacion, los medios para detectar comprenden anticuerpos especificos para la hemoglobina, preferiblemente para la hemoglobina fetal (por ejemplo un anticuerpo anti-Hby humana).

En una realizacion adicional, dichas instrucciones comprenden parametros operativos adecuados en forma de una etiqueta o prospecto separado. Por ejemplo, las instrucciones pueden informar a un consumidor de como recoger la muestra y como lavar la sonda. Especialmente debe tenerse cuidado para minimizar la hemolisis de muestras de sangre para evitar valores falsos de Hb total.

Un kit que va a usarse en el metodo de la invencion puede comprender ademas patrones de analitos, reactivos etc.

En una determinada realizacion del cuarto aspecto, el nivel de hemoglobina fetal libre se determina midiendo el nivel de cadena gamma de hemoglobina (Hby).

En una determinada realizacion del cuerpo aspecto, el kit de ensayo comprende ademas medios para detectar el nivel de hemoglobina libre total por ejemplo para determinar razones de Hb total frente a Hb fetal y/o frente a ARNm de Hb fetal.

Mas especificamente, un kit de diagnostico puede comprender por ejemplo todos los componentes (excepto agua) que se necesitan para realizar un ELISA disenado para medir la concentracion de hemoglobina fetal en una muestra

0 dos ELISA disenados para medir las concentraciones de tanto la hemoglobina fetal como la hemoglobina total en una muestra. Un modo preferido de medir las concentraciones de hemoglobina fetal es la variante competitiva de ELISA descrita a continuacion en el presente documento:

Se recubren placas de microtitulacion de 96 pocillos con hemoglobina-F, diluida a 1-5 pg/ml en una disolucion acuosa, mediante incubacion durante la noche. Se proporcionaran placas recubiertas previamente listas para su uso en el kit. Deben incubarse los pocillos de las placas de microtitulacion en la clinica con una mezcla, que contiene 50 pl de anticuerpo anti-hemoglobina-F de conejo, diluido 1000-10000 veces con disolucion acuosa A (por ejemplo NaCl al 0,9% que contiene el 0,1% de un detergente, por ejemplo Tween 20, y 0,1% de albumina serica bovina), mas o bien 50 pl de una serie de muestras de oxihemoglobina-F patron, diluida con disolucion acuosa A a las concentraciones 1-10000 ng/ml, o bien 50 pl de las muestras del paciente (diluidas 100-10000x con disolucion acuosa A). Esta mezcla debe dejarse en los pocillos de la placa de microtitulacion durante un periodo de tiempo de entre 30 minutos y 3 horas a temperatura ambiente. Entonces deben lavarse las placas 3 veces con disolucion acuosa A, e incubarse cada pocillo durante 30 minutos con 100 pl de anticuerpo anti-IgG de conejo-fosfatasa alcalina (ALP) porcino, diluido 1000-10000x en disolucion acuosa A. Entonces deben lavarse las placas 3 veces con disolucion acuosa A y finalmente se incuban con un sustrato con el que ALP puede reaccionar especificamente, convirtiendolo en un producto coloreado. La disolucion de sustrato puede ser, por ejemplo, fosfato de p-nitrofenilo

1 mg/ml en dietanolamina 1 M + MgCl2 0,5 mM, pH 9,8. La concentracion del producto (=intensidad de color) en un pocillo es entonces proporcional a la cantidad de anticuerpo anti-hemoglobina-F en ese pocillo, y la cantidad de anticuerpo es, a su vez, inversamente proporcional a la cantidad de hemoglobina-F en el paciente o muestra control. La intensidad de color puede determinarse exactamente por un lector de placas de microtitulacion de tipo de absorbancia de luz, o incluso se estima a simple vista.

La enzima peroxidasa del rabano (HRP), en lugar de ALP, es la eleccion obvia del par de enzimas para los anticuerpos secundarios para un experto en la tecnica. Sin embargo, en este contexto, no puede usarse HRP debido a que la hemoglobina, que estara presente en los mismos pocillos de placa de microtitulacion, tambien es una enzima peroxidasa y proporcionara valores falsamente altos del producto coloreado.

Hasta donde conocen los inventores, no se ha usado previamente un ELISA competitivo usando un antisuero de conejo policlonal en combinacion con ALP para medir la hemoglobina-F fetal.

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Se proporcionara con el kit un manual, que contiene instrucciones referentes al procedimiento, los volumenes exactos, las diluciones, las concentraciones, las veces de incubacion y las temperaturas de cada etapa y reactivo. Tambien se proporcionan placas de microtitulacion recubiertas previamente, disoluciones de oxihemoglobina-F u oxihemoglobina “total” para el recubrimiento y una serie de dilucion patron, una disolucion de anticuerpo anti- hemoglobina-F de conejo o anticuerpo anti-hemoglobina total de conejo, una disolucion de anticuerpo anti-IgG de conejo-ALP porcino, una disolucion de sustrato de ALP y disolucion acuosa A.

Se prepararan oxihemoglobina-F y oxihemoglobina “total” en los laboratorios tal como sigue. Se aislan globulos rojos a partir de 50 ml de sangre de cordon humano (preparacion de Hb-F) o sangre de adulto (preparacion de Hb total) mediante centrifugacion (1200 xg, 10 minutos) y se lavan 4 veces con 10 volumenes de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato 10 mM, pH 7,4; NaCl 120 mM y KCI 3 mM). Entonces se lisan las celulas sanguineas mediante resuspension en tampon hipotonico (20 volumenes de H2O:1 volumen de PBS) en hielo. Se separan las membranas del citosol mediante centrifugacion (14000 xg, 20 minutos) y se dializa el sobrenadante 3 veces frente a Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 en 4°C. Se empaquetan doscientos ml de DEAE-Sepharose (GE Healthcare) en una columna y se aplica el sobrenadante dializado al gel y se separa mediante un gradiente que consiste en Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 y Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 + NaCl 0,2 M. Se recogen las fracciones y se mide la absorbancia a 280 nm, 577 nm y 630 nm para identificar y determinar la concentracion de oxihemoglobina-F u oxihemoglobina total [Winterbourn, 1990]. Se preparan la disolucion para el recubrimiento y las series patron mediante dilucion en disolucion acuosa A.

Se compra anticuerpo anti-hemoglobina total de conejo de Dako, Dinamarca y se prepara anticuerpo anti- hemoglobina-F de conejo mediante inmunizacion de conejos con cadena y de hemoglobina purificada (Hb-Y) y sangria de los conejos segun protocolos convencionales. Se realiza la inmunizacion y sangria en un instituto comercial (“servicio externo”). Se purifica Hb-Y a partir de Hb-F en el laboratorio disociando y separando las cadenas a y y, principalmente siguiendo los protocolos de Kajita et al. y Noble [1971].Se anaden fosfato de potasio (0,1 ml de KH2PO4 1 M) y cloruro de sodio (0,2 ml de NaCl 2 M) a 10 ml de una disolucion al 3% (p/v) de hemoglobina-F. Se disuelven cincuenta mg de p-mercuribenzoato en 0,2 ml de NaOH 1 M y se anade 1 ml de agua anadida a lo mismo. Se mezclan estas dos disoluciones, se titula cuidadosamente con acido acetico 1 M hasta pH 4,5 y se deja durante la noche moviendo suavemente en frio. La siguiente manana, se ajusta el pH a 7 con NaOH 1 M y se centrifuga (5000xg, 10 minutos, 10°C). Se descarta el sedimento y se dializa el sobrenadante frente a Tris-HCl 10 mM, pH 7,5. Entonces se aplica la muestra dializada a una columna de 10 ml de DEAE-Sepharose (GE Healthcare), que se ha equilibrado previamente con Tris-HCl 10 mM, pH 7,5. Tras la aplicacion de la muestra, se enjuaga la columna con 50 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y luego con un gradiente de tampon salino que consiste en 100 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 y 100 ml de Tris-HCl 10 mM, pH 7,5 + NaCl 0,2 M. Se realiza la aplicacion de la muestra, el lavado y la elucion en gradiente a un flujo de 40 ml/hora y se recogen fracciones de 3 ml. Entonces se evaluan las concentraciones de las cadenas a y y de cada fraccion eluida mediante absorbancia de luz a 415 nm, SDS-PAGE, PAGE nativa y secuenciacion de aminoacidos aminoterminal. Se combinan las fracciones que contienen cadena y pura, se anade 2-mercaptoetanol hasta 50 mM para disociar el p-mercuribenzoato de la mitad de las cistinas. Entonces se elimina el p-mercuribenzoato de la proteina desalando en una columna Sephadex G-25 (PD-10, GE Healthcare), eluyendo con fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,5 + 2-mercaptoetanol 50 mM. Finalmente, se dializan las fracciones de proteina eluidas frente a fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,5.

Se compra el anticuerpo anti IgG-ALP de conejo porcino de Sigma, mientras que se preparan la disolucion de sustrato y disolucion acuosa A en el laboratorio a partir de productos quimicos disponibles comercialmente.

Alternativamente, el ELISA de hemoglobina fetal puede ser un ELISA de tipo sandwich usando un anticuerpo monoclonal o policlonal especifico para Hb-Y para el recubrimiento, la muestra clinica a una dilucion apropiada o una serie de hemoglobina fetal patron en la etapa 1 de la incubacion y un anticuerpo anti-hemoglobina-ALP de conejo en la segunda etapa de la incubacion.

Alternativamente, puede usarse un chip de proteinas recubierto con un anticuerpo monoclonal que reacciona especificamente con Hb-Y en el kit de diagnostico como medio para medir la concentracion de hemoglobina fetal en las muestras clinicas.

Re v) Sustancias y composiciones para su uso en la prevencion y/o el tratamiento de PE

Segun los hallazgos notificados en el presente documento de que la hemoglobina fetal libre es un indicador de PE y que una reduccion en el nivel de Hb F (o nivel de Hb en general) es probable que reduzca cualquier progresion de la enfermedad, se contempla que cualquier sustancia que tiene i) la capacidad de inhibir la formacion de Hb libre (Hb F libre o cualquier otra Hb), ii) la capacidad de unirse a Hb libre (Hb F libre o cualquier otra Hb) o iii) la capacidad de reducir la concentracion de Hb libre circulante (Hb F libre o cualquier otra Hb) seria una posible sustancia para el tratamiento eficaz y/o la prevencion de PE. Por consiguiente, en un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un uso de al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en agentes de union a hemoglobina; agentes de degradacion/union a grupo hemo; agentes de union a hierro; agentes que estimulan la

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degradacion de hemoglobina, degradacion de grupo hemo y/o secuestro de hierro; y/o agentes que inhiben la hematopoyesis placentaria para el tratamiento de PE. Ademas, en un aspecto adicional de la invencion se proporciona el uso de una sustancia de ese tipo para la fabricacion de una preparacion farmaceutica para el tratamiento o profilaxis de preeclampsia.

Los terminos “tratamiento o profilaxis” en sus diversas formas gramaticales en relacion con la presente invencion se refieren a la prevencion, cura, reversion, atenuacion, alivio, mejora, inhibicion, minimizacion, supresion o detencion (1) de los efectos nocivos de la preeclampsia, (2) la progresion del trastorno o (3) el agente que causa el trastorno.

La hemoglobina es critica para la oxigenacion, pero la hemoglobina libre en la circulacion es toxica para los tejidos al alterar el equilibrio redox vascular durante la auto-oxidacion del grupo hemo desde su estado ferroso a ferrico [Motterlini et al., 1995] y posiblemente a traves de la induccion de radicales libres centrados en globina [Svistunenko et al., 1997].

Los solicitantes proponen que los niveles aumentados de hemoglobina libre en la sangre de mujeres con preeclampsia no solo sirven como marcador para la enfermedad, sino que tambien son responsables, o parcialmente responsables, de las manifestaciones de la enfermedad comunmente observadas en tales pacientes. Por tanto, la hemoglobina libre tambien es una diana candidata para el tratamiento de preeclampsia. Incluso si se considera la hemoglobina fetal libre como marcador para PE, se contempla que la reduccion de hemoglobina libre en general (es decir, hemoglobina fetal asi como hemoglobina mas inespecifica tal como, por ejemplo, hemoglobina de adulto) minimizara el progreso de o tratara la PE.

En una determinada realizacion de este aspecto, los agentes de union a hemoglobina y/o agente de union a grupo hemo es alfa-1-microglobulina. A partir de ahora, este agente se denominara alfa-1-microglobulin o a1- microglobulina y se abreviara a1m. Otros nombres para esta sustancia que se han usado en la bibliografia cientifica son proteina HC (heterogenea en carga; formadora de complejo humano), AMBP-proteina y alfa-1- microglicoproteima pero estos nombres son sinonimos de a1m.

En una determinada realizacion de este aspecto, los agentes de union a hemoglobina y/o agente de union a grupo hemo es un anticuerpo especifico para la hemoglobina y/o el grupo hemo.

Por consiguiente, la presente invencion tambien proporciona un metodo para el tratamiento o la profilaxis de preeclampsia, metodo que comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento o profilaxis una cantidad eficaz de uno o mas de tales agentes mencionados anteriormente incluyendo al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en agentes de union a hemoglobina y/o agentes de degradacion/union a grupo hemo y/o agentes de union a hierro; agentes que estimulan la degradacion de hemoglobina y/o degradacion de grupo hemo y/o secuestro de hierro; y agentes que inhiben la hematopoyesis placentaria. El agente puede administrarse normalmente en forma de una composicion farmaceutica que comprende el agente activo en combinacion con uno o mas excipientes farmaceuticamente aceptables.

Ademas, la presente invencion proporciona el uso de al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en agentes de union a hemoglobina y/o agentes de degradacion/union a grupo hemo, agentes que estimulan la degradacion de hemoglobina y/o degradacion de grupo hemo y/o secuestro de hierro, y agentes que inhiben la hematopoyesis placentaria para la fabricacion de una preparacion farmaceutica para el tratamiento o la profilaxis de preeclampsia; y un metodo para el tratamiento o la profilaxis de preeclampsia, metodo que comprende administrar a un sujeto que necesita tal tratamiento o profilaxis una cantidad eficaz de una preparacion farmaceutica que comprende al menos un elemento seleccionado del grupo que consiste en agentes de union a hemoglobina y/o agentes de degradacion/union a grupo hemo y/o agentes secuestrantes de hierro, agentes que estimulan la degradacion de hemoglobina y/o degradacion de grupo hemo y/o secuestro de hierro, y agentes que inhiben la hematopoyesis placentaria. En estos aspectos el objetivo es disminuir la cantidad de hemoglobina libre y su producto de degradacion grupo hemo, en por ejemplo sangre materna, prevenir el dano tisular y ademas el progreso de la enfermedad.

Los agentes de union a hemoglobina y/o agentes de degradacion/union a grupo hemo son compuestos que presentan propiedades de degradacion/union a hemoglobina y/o grupo hemo. Los agentes secuestrantes de hierro son compuestos que se unen a hierro libre e impiden que participen en las reacciones redox.

Segun la presente invencion, los agentes de union a hemoglobina y/o agente de degradacion/union a grupo hemo es a1m. Esta pequena proteina tisular y plasmatipa es una molecula de union a grupo hemo [Allhorn et al., 2002; Larsson et al., 2004] y eliminador de radicales [Akerstrom et al. 2007] y una forma de degradacion de grupo hemo, t- a1m, se induce mediante eliminacion proteolitica de un tetrapeptido C-terminal, LIPR cuando se mezcla a1m con hemoglobina libre [Allhorn et al., 2002]. Tambien puede unirse a hemoglobina en placentas (vease a continuacion). La hemoglobina libre y especies reactivas de oxigeno provocan una produccion aumentada de a1m en celulas hepaticas y celulas sanguineas [Olsson et al. 2007]. Por tanto, a1m es un posible antagonista de grupo hemo y hemoglobina que puede proteger frente al dano inducido por grupo hemo y hemoglobina a celulas y componentes

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tisulares. Los ejemplos 5.4-5.7 proporcionan pruebas adicionales de esto. Por tanto, el ejemplo 5.4 muestra que pacientes preeclampticas responden a la enfermedad aumentando los niveles de aim, el ejemplo 5.5 muestra que aim inhibe y repara el dano oxidativo inducido por grupo hemo en celulas y tejidos, el ejemplo 5.6 describe un modelo in vitro de placenta en el que pueden tomarse pruebas de agentes de terapia una etapa mas cerca a pruebas in vivo, y el ejemplo 5.7 muestra que aim se une a hemoglobina en placenta-tejido.

Otros agentes que se contempla que son posibles agentes activos para el tratamiento o la prevencion de PE son los siguientes:

Moleculas de union a hemoglobina:

Anticuerpos

Pueden desarrollarse anticuerpos monoclonales con fuerte union de hemoglobina y bloqueo de actividad enzimatica redox de hemoglobina. Los anticuerpos pueden producirse mediante inmunizacion in vivo o in vitro o seleccionarse a partir de bibliotecas preexistentes. Los anticuerpos pueden seleccionarse por especificidad frente a cadenas de globina alfa, beta, delta o gamma, o frente a partes comunes de estas cadenas de globina. Los anticuerpos pueden modificarse para hacerlos adecuados para la terapia en seres humanos, es decir, dotados de un entramado de inmunoglobulina humana. Puede usarse cualquier parte de anticuerpos: fragmentos Fv, Fab o inmunoglobulina completa.

Haptoglobulina

La haptoglobulina es una glicoproteina encontrada en el plasma sanguineo. Existen tres formas de haptoglobina, Hpl -1, Hp2-1 y Hp2-2. Todas las formas se unen a hemoglobina y forma un complejo de Hp-Hb. El complejo de Hb- Hp tiene una actividad enzimatica redox mas debil que la hemoglobina libre y por tanto provoca menos dano oxidativo. La union a Hb previene, por ejemplo, la perdida de hierro del grupo hemo.

CD163

CD163 es un receptor eliminador, encontrado en macrofagos, monocitos y sistema reticuloendotelial que reviste los vasos sanguineos. El receptor reconoce el complejo de Hp-Hb y media en la endocitosis y el suministro de este a los lisosomas, la degradacion mediante HO-1 (vease a continuacion) y el secuestro de hierro libre mediante ferritina celular. Por tanto CD163 contribuye a la eliminacion del estres oxidativo inducido por hemoglobina.

Degradadores/moleculas de union a grupo hemo:

Hemopexina

La hemopexina es una glicoproteina (60 kDa) encontrada en el plasma sanguineo humano, y que elimina grupo hemo libre del plasma sanguineo uniendolo fuertemente (Kd aprox. 1 pmol/l) y transportando el grupo hemo al higado para la degradacion en el sistema reticuloendotelial.

Hemo-oxigenasa

La hemo-oxigenasa es un complejo enzimatico de degradacion y union a grupo hemo celular que convierte el grupo hemo en biliverdina, monoxido de carbono y hierro libre. Se secuestra este ultimo mediante ferritina celular y se reduce la biliverdina mediante biliverdina reductasa para dar bilirrubina que se excreta finalmente en la orina. Se han descrito tres formas de genes de hemo-oxigenasa, con estructuras muy diferentes, HO-1, HO-2 y HO-3. HO-1 es el mas importante. Este gene se regula por incremento en practicamente todas las celulas en el organismo por hemoglobina, grupo hemo libre, hipoxia, radicales libres, ROS (especies reactivas de oxigeno) y muchos signos inflamatorios diferentes. El HO-1 es un anti-oxidante fuerte porque elimina los oxidantes grupo hemo y hierro, pero tambien porque produce bilirrubina, que tiene efectos antioxidantes frente a algunos oxidantes.

Albumina

La albumina es una proteina de 66 kDa en el plasma sanguineo humano que puede unirse a grupo hemo. No hay pruebas de captacion celular y degradacion del complejo de albumina-grupo hemo, y el efecto de la albumina es probablemente actuar como deposito de grupo hemo impidiendo por tanto que el grupo hemo entre en las membranas celulares endoteliales, membranas basales de los vasos, etc.

Moleculas de union a hierro:

Transferrina

La transferrina es el transportador de hierro mas importante en la sangre. Se reconoce el complejo de transferrina-

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hierro y se une por receptores celulares que internalizan y disocian el complejo. Ferritina

Esta proteina multimerica, que consiste en 24 subunidades de dos tipos, es el principal deposito intracelular de hierro libre. Tiene una alta capacidad de almacenamiento de hierro, 4500 atomos de hierro/molecula de ferritina. Unido a ferritina, se impide ampliamente que el hierro participe en reacciones de oxidacion y reduccion, y por tanto que provoque dano oxidativo.

En una realizacion adicional, el agente de union a hemoglobina es un anticuerpo especifico para la hemoglobina y/o el grupo hemo.

En realizaciones especificas, la preparacion farmaceutica comprende una combinacion de agentes de union a hemoglobina y/o agentes de union a grupo hemo y/o agentes secuestrantes de hierro. Los agentes que estimulan la degradacion de hemoglobina y/o degradacion de grupo hemo incluyen, pero no se limitan a, proteinas como haptoglobina, hemopexina y hemo-oxigenasa.

Las preparaciones farmaceuticas de la presente invencion pueden administrarse a un animal “placentario”, tal como ser un humano, otro primate o animal de alimentacion mamifera. Un animal preferido para la administracion es un ser humano o un animal o ganado valioso comercialmente.

La administracion puede realizarse de diferentes maneras dependiendo de que animal va a tratarse, del estado del animal que necesita dicho tratamiento y la indicacion especifica que va a tratarse. La via de administracion puede ser oral, rectal, parenteral o a traves de un tubo nasogastrico. Ejemplos de vias de administracion parenteral son intravenosa, intraperitoneal, intramuscular o inyeccion subcutanea.

La formulacion de la preparacion farmaceutica debe seleccionarse dependiendo no solo de propiedades farmacologicas del principio activo sino tambien de sus propiedades fisicoquimicas y el tipo de via de administracion. Los expertos en la tecnica conocen bien diferentes metodos de formulacion de preparaciones farmaceuticas.

Para las composiciones parenterales, se prefieren composiciones liquidas o composiciones solidas disenadas para reconstituirse con por ejemplo un medio acuoso antes de su aplicacion. Los excipientes adecuados incluyen: disolventes (por ejemplo agua, medio acuoso, alcoholes, aceites vegetales, lipidos, disolventes organicos como propilenglicol y similares), ajustadores de la presion osmotica (por ejemplo cloruro de sodio, manitol y similares), solubilizantes, agentes de ajuste del pH, conservantes (si es relevante), potenciadores de la absorcion etc.

Para composiciones orales, las composiciones pueden estar en forma solida, semisolida o liquida. Las composiciones adecuadas incluyen formas farmaceuticas solidas (por ejemplo comprimidos incluyendo todos los tipos de comprimidos, sobres y capsulas), polvos, granulos, grageas, perlas, jarabes, mezclas, suspensiones, emulsiones y similares.

Los excipientes adecuados incluyen por ejemplo cargas, aglutinantes, disgregantes, agentes lubricantes etc. (para formas farmaceuticas solidas o composiciones en forma solida), disolventes tales como, por ejemplo, agua, disolventes organicos, aceites vegetales etc. para formas liquidas o semisolidas. Ademas, pueden anadirse aditivos como agentes de ajuste del pH, agentes enmascaradores del sabor, aromatizantes, agentes estabilizantes etc.

Ademas, pueden incluirse portadores especificos para dirigir el principio activo a una parte especifica del cuerpo. Por ejemplo un complejo de anticuerpo-aim en el que el anticuerpo se dirige a la placenta (“direccionamiento”) por su especificidad para un epitopo de placenta; una celula madre o una celula recombinante con propiedades de direccionamiento a la placenta, por ejemplo receptores de integrina especificos para placenta y con la capacidad artificial o natural de secretar grandes cantidades de aim. El tratamiento seria mas eficaz ya que el farmaco se concentraria en la placenta.

El termino “cantidad eficaz” en relacion con la presente invencion se refiere a la cantidad que proporciona un efecto terapeutico para un regimen de administracion y estado dados. Esta es una cantidad predeterminada de material activo calculada para producir un efecto terapeutico deseado en asociacion con los aditivos y diluyentes requeridos; es decir, un portador, o vehiculo de administracion. Ademas, se pretende que signifique una cantidad suficiente para reducir y lo mas preferiblemente prevenir un deficit clinicamente significativo en la actividad y respuesta del huesped. Alternativamente, una cantidad terapeuticamente eficaz es suficiente para provocar una mejora en un estado clinicamente significativo en un huesped. Tal como se aprecia por los expertos en la tecnica, la cantidad de un compuesto puede variar dependiendo de su actividad especifica. Cantidades de dosificacion adecuadas pueden contener una cantidad predeterminada de composicion activa calculada para producir el efecto terapeutico deseado en asociacion con los diluyentes requeridos; es decir, portador o aditivo. Ademas, la dosificacion que va a administrarse variara dependiendo del principio o los principios activos que van a usarse, la edad, el peso etc. del paciente que va a tratarse pero en general estara dentro del intervalo de desde 0,001 hasta 1000 mg/kg de peso corporal/dia. Ademas, la dosis depende de la via de administracion.

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Re vi) HLA-DPA-1 como biomarcador

Un aspecto adicional se refiere a la observacion de que las celulas fetales pueden desencadenar la respuesta inmunitaria materna ya que son diferentes. El papel de la familia genica HLA es presentar el antigeno foraneo al sistema inmunitario materno. Mujeres que expresan el gen de HLA-DPA1 pueden “observar” las celulas fetales en una fase temprana, lo que podria ayudarlas a protegerse del dano adicional. (En los estudios notificados en el presente documento, se ha observado que mujeres con incisura, pero que no desarrollan PE, expresaban HLA- DPA1.)

Por consiguiente, puede usarse HLA-DPA1 como un indicador indirecto para hemoglobina fetal y/o para PE. Por tanto, en un aspecto adicional de la presente invencion, se proporciona un metodo de pronostico para la preeclampsia que comprende las siguientes etapas: (a) obtener una muestra biologica de un mamifero hembra embarazado; (b) medir el nivel de antigeno leucocitario humano DPA1 (HLA-DPA1), en dicha muestra biologica; y (c) comparar el nivel de HLA-DPA1 en la muestra con un valor de referencia. Se contempla que si las composiciones de HLA mencionadas anteriormente estan presentes, la hembra probablemente corre menos riesgo de desarrollar PE (con o sin HB fetal libre), mientras que si la hembra no tiene este HLA protector, entonces ella corre mayor riesgo, especialmente si tambien aumenta el nivel de Hb fetal libre.

En una determinada realizacion de este aspecto, se realizan las etapas (a) a (c) para determinar si dicha hembra embarazada corre o no un riesgo aumentado de desarrollar preeclampsia o corre o no un riesgo aumentado de desarrollar una forma grave de preeclampsia.

En una determinada realizacion de este aspecto, una expresion o una alta expresion de HLA-DPA1 indica un mejor pronostico que la no expresion de HLA-DPA1.

En un ultimo aspecto, se proporciona un kit de ensayo para el pronostico o la ayuda en el pronostico de preeclampsia, segun el metodo de pronostico para la preeclampsia segun la invencion, que comprende medios para detectar, en una muestra biologica de un mamifero hembra embarazado, los niveles de HLA-DPA1 e instrucciones para el uso de dichos medios de deteccion.

La presente invencion se describira ahora en mas detalle.

Breve descripcion de los dibujos

La figura 1 muestra un modelo extendido de desarrollo de preeclampsia, basado en los hallazgos de Hb-F y Hb-A en el plasma sanguineo materno, destacando la aparicion de Hb-F y Hb-A y su posible uso como marcadores de diferentes estadios de la enfermedad.

La figura 2 A muestra la placenta en el embarazo temprano (ultrasonido), B muestra la circulacion fetal en las vellosidades, que se sumergen en el espacio entre vellosidades lleno de sangre materna y C muestra la vellosidad unitaria funcional mas pequena con la circulacion fetal.

La figura 3 A muestra la circulacion fetal en las vellosidades, que se sumergen en el espacio entre las vellosidades lleno de sangre materna menos oxigenada (mas oscuro), B muestra que se induce apoptosis (puntos ovalados) en las celulas placentarias-trofoblastos, mediante especies reactivas oxidativas (ROS) y C muestra que se dana la barrera sangre-placenta.

La figura 4 muestra resultados de la cuantificacion por PCR en tiempo real de Hba, Hby, Hbp y ARNm de HLA-DPA1 en la placenta.

La figura 5 muestra imagenes de hibridaciones in situ de placenta humana y muestras de lecho de placenta.

La figura 6 es una imagen representativa de la expresion de proteina Hby en la placenta.

La figura 7 muestra un grafico de dispersion de los niveles de ARNm de Hby en el plasma materno tomado antes del parto de mujeres con PE cuantificados por PCR en tiempo real. El grafico muestra el valor de Ct en el eje izquierdo, que proporciona una estimacion de la cantidad de niveles de ARNm de Hby en la muestra.

La figura 8 muestra imagenes de geles representativos para HbS. A) Muestra de PE en la que el punto de HbS es claramente visible (flecha). B) Gel de una muestra control en la que el punto de HbS esta ausente (circulo).

La figura 9 muestra los valores de ARNm de HbS en la placenta cuantificados con qPCR presentados en un grafico de dispersion.

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La figura 10 muestra imageries in situ de una placenta preeclamptica que expresa ARNm de HbS.

Figura 11. Hibridaciones in situ de placenta y muestras de lecho de placenta (panel izquierdo). Imagen de campo oscuro de la expresion de ARNm de hemoglobina en una muestra de placenta preeclamptica representativa y control. Se observo especialmente expresion de ARNm de hemoglobina en y alrededor de los vasos sanguineos (puntas de flecha). Se observan varias celulas dispersadas en el espacio entre las vellosidades en PE. La inmunohistoquimica (panel derecho) muestra la acumulacion de hemoglobina fetal libre (flecha) en la luz (lu) de la vasculatura placentaria.

Figura 12. Concentraciones de hemoglobina total en el plasma de mujeres con embarazos preeclampticos (n=30) y embarazos normales (n=30). Se midieron las concentraciones mediante ELISA usando anticuerpos frente a hemoglobina de adulto (Hb-A), diluyendo el plasma 1000x.

Figura 13. Determinacion de Hb-F mediante inmunotransferencia de tipo Western en el plasma de dos pacientes con preeclampsia (PE 1 y 2) y dos individuos control con embarazos normales (control 1 y 2). Se trataron las muestras de plasma con perlas de extraccion de albumina tal como se describe y luego se aplicaron (15 pl), no diluidas, al procedimiento de SDS-PAGE/inmunotransferencia de tipo Western. Para permitir la estimacion de las concentraciones en pg/ml, se aplicaron 0,1 pg de Hb-F purificada en un carril separado (“Hb-F purificada”).

Figura 14. La circulacion fetal con celulas que sintetizan hemoglobina (ovalos blancos con un punto negro). Debido al dano a la barrera placentaria, las celulas fetales se escapan al espacio entre las vellosidades y por tanto a la circulacion materna.

Figura 15. Concentraciones de a1m total en el plasma de mujeres con embarazos preeclampticos (n=30) y embarazos normales (n=30). Se midieron las concentraciones mediante RIA, diluyendo el plasma 500x.

Figura 16. A. Propiedades protectoras de celulas de a1m frente a la oxidacion inducida por grupo hemo y ROS. Se marcaron celulas K562 con la sonda sensible a oxidacion H2DCFDA, se lavaron y se incubaron con a1m (2, 5 o 10 pM), AGP (2, 5 o 10 pM) o ascorbato (10 pM) antes de la adicion de grupo hemo 10 pM. Se incubaron las celulas durante 2 h y se analizaron con FACS. B. Se cultivaron celulas K562 con a1m (2, 5 o 10 pM) o una proteina control (arglicoprotefna acida, AGP) (10 pM) antes de la adicion de grupo hemo 200 pM y se cultivaron durante 4 h. Se recogio la suspension de celulas, se mezclo con yoduro de propidio y se analizo con FACS.

Figura 17. Reduccion de grupos carbonilo en colageno oxidado mediante a1m. Se oxido el colageno, recubierto sobre placas de microtitulacion, mediante incubacion con grupo hemo 50 pM durante 17 h. Tras lavar, se anadio a1m, ovoalbumina o ascorbato 0,1, 0,3 o 1 pM, y se incubaron durante 2 h. Se midieron los grupos carbonilo mediante ELISA. Cada columna representa la media de triplicados +/- EE.

Figura 18. La eliminacion de grupo hemo celular mediante a1m. Se cultivaron celulas eritroleucemicas humanas (K562) con o bien tampon o bien grupo hemo 10 pM durante 30 minutos, se lavaron y se resuspendieron en medio de cultivo nuevo. A: Entonces se incubaron las celulas con a1m (2 o 10 pM) durante 2 horas, tiempo tras el que se guardo el medio de cultivo. Se lavaron las celulas y se solubilizaron suspendiendo en un tampon que contiene NP-40 al 1%. Entonces se analizaron espectrofotometricamente el medio de cultivo y la suspension celular leyendo los espectros de absorbancia (300-700 nm). B: Tambien se analizaron visualmente los diversos cultivos. Se incubaron las celulas con o bien tampon o bien grupo hemo 10 pM durante 30 min. (etapa 1), se lavaron y entonces se incubaron con tampon, a1m 10 pM o AGP 10 pM durante 2 horas (etapa 2), se lavaron y se solubilizaron tal como se describio anteriormente.

La figura 19 muestra la perfusion in vitro de una placenta “sana” durante 120 min. con una disolucion de Hb-A (2 mg/ml) en el lado fetal (simbolos blancos) y tampon solo para el lado materno (simbolos negros) (“1a perfusion”) y durante 120 min. en ambos lados con tampon solo (“2a perfusion”). Se tomaron muestras regularmente y se midieron las concentraciones de Hb-A mediante ELISA (diagrama izquierdo), de a1m con RIA (diagrama derecho) y de Hb-A fetal con inmunotransferencia de tipo Western (fotografia derecha).

La figura 20 muestra la SDS-PAGE e inmunotransferencia de tipo Western de un complejo de hemoglobina-a1m aislado del tejido de la placenta. Se homogenizo una placenta de una donante sana y se centrifugo a 100.000 G durante 60 min. Se aplico el sobrenadante a una columna Affigel anti-a1m que se enjuago y se eluyo con glicina 0,1 M-HCl, pH 2,3. Se separo el eluato mediante SDS-PAGE que se tino o bien con Coomassie (dos carriles izquierdos) o se transfirio a membranas de PVDF y se inmunotransfirio con anticuerpo anti-a1m o anti-Hb-A.

La figura 21 muestra el resultado del estudio en Tanzania. Se muestra la hemoglobina total (pg/ml) en la orina antes del parto.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para ilustrar la presente invencion. Sin embargo, debe entenderse que la

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invencion no pretende limitarse a las condiciones y los detalles especificos descritos en estos ejemplos.

Ejemplo 1

Deteccion de ARN de Hb y proteina en placenta

Se realizaron RT-PCR cuantitativa, hibridacion in situ e inmunohistoquimica para analizar ARNm de Hba, Hbp y Hby y la expresion de proteina en muestras de placenta en sujetos con PE frente a control.

Recogida de muestras

Se recogio tejido placentario en el Department of Obstetrics and Gynaecology, Lund University Hospital. La toma de muestras, realizada con consentimiento por escrito, se aprobo por la Junta de Revision del Comite Etico para estudios en sujetos humanos. Se incluyeron en el estudio tejido placentario de 10 embarazos preeclampticos, 15 normales, 5 pacientes con incisura bilateral y 5 pacientes con incisura bilateral asi como preeclampsia. Tambien se recogieron muestras de lecho placentario (vease a continuacion) de 5 de las pacientes con PE y 5 de las controles. Se definio preeclampsia como tension arterial > 140/90 mmHg y proteinuria > 0,3 g/l. Se excluyeron pacientes con hipertension esencial u otras enfermedades sistemicas. Se recogieron muestras de placenta en el nacimiento, se congelaron inmediatamente y se almacenaron a -80°C.

Toma de muestras y manipulacion de tejido

Se recogieron muestras de la placenta inmediatamente tras el parto. Se extrajo un cubo de 10x10x10 mm de tejido velloso de la parte central de la placenta evitando areas macroscopicas de necrosis e infarto. Se extrajeron cubos de 10x10x10 mm de tejido miometrial de mujeres que se sometieron a cesarea. Se congelaron inmediatamente las muestras en nieve carbonica, y se almacenaron a -80°C hasta que se extrajo el ARN. No se descongelo el tejido antes de la extraccion de ARN o crioseccionamiento para garantizar la integridad de ARN mas alta posible.

Extraccion de ARN

Se extrajo ARN total a partir de tejido congelado usando Trizol® (Invitrogen) segun las instrucciones del fabricante. Se retiraron proteoglicano y polisacarido realizando una precipitacion con alto contenido en sal con citrato de sodio 0,8 M y cloruro de sodio 1,2 M. Se determino la integridad de ARN mediante electroforesis en gel de agarosa al 1% desnaturalizante con formalina al 6,7% y 1X tampon MOPS. Se almacenaron muestras en agua libre de ARNasa a -80°C hasta su uso. Antes del uso se precipitaron las muestras una vez mas y se lavaron con etanol al 70% para eliminar residuos de Trizol.

Amplificacion mediante PCR en tiempo real

Se sintetizo ADNc con transcriptasa inversa segun protocolos de Applied Biosystems. Se uso una reaccion de 50 pl que contenia 0,5 pg de ARN total, 1X tampon TaqMan RT, MgCl2 5,5 mM, dNTP 500 pM, hexameros al azar 2,5 pM, inhibidor de ARNasa 0,4 U/pl y transcriptasa inversa MultiScribe 1,25 U/pl. Se incubaron las reacciones a 25°C durante 10 minutos, a 48°C durante 30 minutos y finalmente 5 minutos a 95°C. Se almacenaron las muestras a -20°C hasta el analisis.

Se sometieron a ensayo transcritos genicos por medio de PCR en tiempo real usando un sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems). Se disenaron cebadores y sondas usando el programa de software Primer Express® o se ordenaron de Assays on-Design/Demand™ (Applied Biosystems). Los cebadores seleccionaron como diana diferentes exones de los genes de interes para evitar la amplificacion del ADN genomico contaminante. Se llevaron a cabo reacciones en un volumen final de 25 pl que contenia: 1 x Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), sonda 0,25 pmol/l, 0,9 pmol/l de cebadores directo e inverso respectivamente, y 1 pl de 10 ng/pl de una alicuota de ADN. Se iniciaron las condiciones de ciclacion termica mediante activacion de UNG a 50°C durante 2 minutos y una desnaturalizacion inicial a 95°C durante 10 minutos. Entonces se ejecutaron 40 ciclos: 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto. Se incluyeron dos controles negativos sin molde en cada conjunto de amplificaciones. Se uso p-actina como referencia para normalizar la senal de la muestra. Se logro la cuantificacion realizando una curva de calibracion usando diluciones de 4 veces en serie de ADN de molde (0,0880 ng). Se expresan los resultados como razones con p-actina como el denominador.

Hibridacion in situ (ISHH)

Se realizaron las hibridaciones tal como se describio anteriormente en [Hansson et al., 2005]. Se montaron por descongelacion secciones de criostato en portaobjetos sialinizados, que se almacenaron a -80°C hasta que se usaron. Se empleo tejido congelado reciente para maximizar la deteccion de ARNm. Se fijaron las secciones, se deshidrataron, se dilipidaron y se hibridaron tal como se describio anteriormente [Bradley et al., 1992]. Se llevaron a cabo hibridaciones durante 20-24 horas a 55°C con 2x106 cpm de sonda de 35S-ARNc desnaturalizada por 80 pl de

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tampon de hibridacion (Tris-HCl 20 mM (pH 7,4), EDTA 1 mM (pH 8,0), NaCI 300 mM, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, 1x ARNt de levadura 25 mg/ml de Denhardt, ADN de esperma de salmon 100 pg/ml, ARN de levadura total 250 pg/ml (fraccion XI, Sigma), ditiotreitol 150 mM (DTT), tiosulfato de sodio (NTS) al 0,15% y dodecilsulfato de sodio (SDS) al 0,15%. Tras los lavados, se colocaron los portaobjetos en Kodak Hyperfilm Biomax MR durante 2 dias, tras lo cual se recubrieron con emulsion nuclear (NTB-3, Kodak). Se expusieron los portaobjetos durante 3 (Hba2, Hby2) o 4 (Hbp) semanas respectivamente a 4°C, tras lo cual se revelaron en Dektol (Kodak), se fijaron y se contratineron con un tinte Giemsa.

Inmunohistoauimica

Se fijaron secciones congeladas recientes de 14 pm de espesor de las muestras de placenta mediante inmersion en formaldehido tamponado al 4% durante 10 min. a temperatura ambiente. Entonces se incubaron las secciones en una disolucion de bloqueo (Powerblock; Zymed) durante 30 minutos a TA. Tras los lavados con PBS se transfirieron las secciones a una dilucion 1:500 de un anticuerpo anti-Hb fetal humana (Bethyl Laboratories) que se preparo en ovejas. Tras una hora de incubacion a TA se aclararon las secciones y se transfirieron a una dilucion 1:1000 de un anticuerpo anti-CY3 de oveja preparado en burro (Jackson laboratories) durante una hora a TA. Entonces se aclararon las secciones, se cubrieron con Tris 0,1 M y se visualizaron con un microscopio fluorescente invertido Leica DMA 6000. Se tomaron fotografias usando el software Volocity.

Resultados

La figura 4 muestra la cuantificacion mediante PCR en tiempo real de Hba, Hby y Hbp en la placenta. Todos los valores se normalizan frente a la cantidad de p-actina y se presentan como graficos de dispersion. (A) Expresion de ARNm de Hba en la placenta. Se encontraron cambios significativos entre PE frente a los controles (p=0,004) y entre PE\incisura (PE con incisura) frente a los controles (p=0,03). (B) Valores de ARNm relativos a Hby que muestran cambios significativos entre PE frente a los controles (p=0,003) y entre PE\incisura frente a los controles (p=0,03). (C) Hbp mostro sobreexpresion significativa en PE frente a los controles (p=0,02) y en PE\incisura frente a los controles (p=0,04).

Para resumir, se encontro que los niveles de ARNm de Hba (p=0,004), Hby (p=0,003) y Hbp (p=0,02) estaban significativamente aumentados en muestras de PE frente a los controles (figura 4 A, B, C) y tambien en muestras de PE con incisura en comparacion con los controles (Hba p=0,02, Hby p=0,03 y Hbp p=0,04). (No se represento Hbp en la matriz, pero se examino debido a los cambios detectados en Hba y Hby.)

La figura 5 muestra resultados de hibridaciones in situ de muestras de placenta y de lecho placentario. Muestra imagenes de la placenta humana que muestran la seccion vellosa (V) de la placenta y debajo una seccion de lecho placentario (M) con arterias espirales (S) entre ellos. (A) Imagen de campo claro de la expresion de ARNm de Hba en una muestra de placenta preeclamptica representativa. Se observo especialmente la expresion de Hba en y alrededor de los vasos sanguineos. Sin embargo, tambien se observan varias celulas dispersadas en el espacio intervelloso. (B) Imagen de campo oscuro de la misma seccion. (C) Imagen de campo oscuro de la expresion de ARNm de Hba de una placenta control representativa. En comparacion con placentas con PE, las placentas control muestran menos celulas que expresan Hba en el espacio intervelloso. (D) Imagen de campo claro de una muestra miometrial representativa de una paciente con PE. Solo se observa la expresion de Hba en las arterias espirales, no se observa expresion en el tejido miometrial. (E) La misma seccion miometrial en el campo oscuro. (F) Una muestra miometrial de una placenta control. La expresion de ARNm de Hba es similar a la expresion observada en el miometrio de PE.

Para resumir, la hibridacion in situ revelo celulas que expresaban Hba y Hby nucleadas que estaban dispersadas por todo el espacio intervelloso tanto en muestras con PE como control. Las placentas de pacientes con PE parecian tener mas celulas que contenian Hb que las muestras control (Hb fetal), y las senales por celula parecieron ser mas intensas que en los controles. En varias de las muestras estudiadas, las celulas positivas para Hb estaban asociadas con las paredes de los vasos sanguineos, con varias celulas libres en la luz. Se encontraron muchas celulas individuales en el espacio intravelloso. Basandose en su morfologia, ubicacion y distribucion, no son trofoblastos.

La figura 6 es una imagen representativa de la expresion de la proteina Hby en la placenta. Se muestra la expresion de proteina con un marcador fluorescente rojo. En la placenta con PE hay una expresion fuerte de Hby en la luz (lu) vascular, pero tambien se expresa Hby en el endotelio vascular (flecha) (A). Sin embargo, la placenta de controles normotensivos no mostro expresion de Hby en la luz vascular (B) pero Hby (es decir hemoglobina fetal libre) se expresa en el endotelio vascular (flecha). Las barras de escala en las imagenes son de 25 pm.

Para resumir, se detecto expresion de Hby especialmente dentro de la luz de vasos sanguineos placentarios en muestras de placenta con PE pero tambien cerca de las celulas endoteliales en las paredes vasculares. Las muestras de placenta control mostraron la expresion de Hby en el endotelio vascular, sin expresion en la luz

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vascular.

Discusion

La RT-PCR cuantitativa mostro una expresion aumentada de ARNm de Hba y Hby en PE frente a los controles. La hibridacion in situ mostro un numero aumentado de celulas que expresan Hb en muestras de la placenta con sujetos con PE frente a control. El hecho de que las celulas que expresan Hb estaban ubicadas en asociacion con las paredes del los vasos puede indicar o bien que las celulas estan migrando al interior o al exterior de los vasos, o bien que hay sitios de union en las paredes de los vasos para estas celulas. El hecho de que los vasos miometriales son pobres en celulas nucleadas que expresan ARNm de Hb frente a los vasos placentarios, que son ricos en las mismas, sugiere que estas celulas no pueden ser de origen materno. Este hallazgo de que ARNm de Hby (fetal) esta presente en las celulas positivas para Hb placentaria, asi como el numero menor de celulas que expresan Hb en la luz de vasos sanguineos miometriales, indica que son las celulas fetales las que son responsables de la expresion de Hb aumentada observada en placentas con PE y en la sangre.

Si las celulas que producen Hb fetal que se han descrito se renuevan rapidamente, pueden liberar altos niveles de grupo hemo en el espacio extravelloso y los vasos sanguineos placentarios. De hecho, la inmunohistoquimica muestra altos niveles de hemoglobina en la luz de vasos sanguineos de placenta con PE. La placenta control, por otro lado, no mostro liberacion de hemoglobina en los vasos sanguineos. Para empeorar las cosas, la hemolisis en areas necroticas y tromboticas de la placenta con PE puede anadirse a la cantidad de grupo hemo libre en las mismas.

El grupo hemo libre es un agente redox potente que puede provocar dano grave a traves de la creacion de especies reactivas de oxigeno (ROS). El grupo hemo oxida varios lipidos incluyendo lipoproteinas de baja densidad (LDL), convirtiendolas en peroxidos citotoxicos que provocan dano endotelial. Ademas, el grupo hemo puede danar directamente las membranas celulares rompiendolas y oxidando proteinas de membrana conduciendo a permeabilidad de membrana aumentada y citolisis.

Por tanto, la infiltracion de la placenta en grandes numeros de celulas positivas para Hb (es decir celulas fetales) es un signo de preocupacion. El grupo hemo liberado de estas celulas podria ser muy perjudicial y puede ser responsable de gran parte de la patologia placentaria asociada con PE.

En conclusion, sin querer restringirse a ninguna teoria, se cree que estos hallazgos sugieren que los genes de Hb se sobreexpresan en una subpoblacion de celulas en la placenta preeclamptica. La produccion de agentes que estimulan hematopoyesis mediante celulas placentarias en respuesta a perfusion reducida y posiblemente hipoxia local puede contribuir a la formacion, reclutamiento y distribucion de las celulas. Aunque parecen estar presentes en la placenta de sujetos que tuvieron embarazos normales, su aumento en la placenta de pacientes con PE es un motivo de preocupacion. Si se renuevan rapidamente y liberan su Hb (y grupo hemo) excesivamente, pueden danar a estructuras adyacentes incluyendo el endotelio vascular.

Ejemplo 2

Deteccion de Hb fetal en la sangre materna

Se realizo RT-PCR cuantitativa para analizar ARNm de Hby en muestras de sangre en sujetos con PE.

PCR en tiempo real

Se extrajo ARN usando el minikit de ARN viral QIAamp (Qiagen) segun las instrucciones del fabricante. En resumen, se mezclaron 3,6 ml de tampon de AVL con 36 pl de portador-ARN (Qiagen) invirtiendo el tubo 10 veces. Se centrifugo 1 ml de la muestra de plasma a 1150 g durante 10 minutos. Se anadieron 900 pl del plasma y 3,6 pl de etanol al 99% a la disolucion de tampon de AVL. Se anadieron aproximadamente 650 pl de la disolucion a una columna QIAamp y se centrifugaron a 6000 g durante 1 minuto. Se repitio esto hasta que se ha anadido el volumen de plasma total a la columna. Se lavo la columna una vez con tampon AW1, entonces se centrifugo a 6000 g durante 1 minuto, seguido por un lavado con tampon AW2, entonces se centrifugo a 20.000 g durante 3 minutos. Se eluyo el ARN con 50 pl de agua libre de ARNasa.

Se cuantifico ARN de Hb fetal con PCR en tiempo real.

Resultados

La figura 7 muestra un grafico de dispersion de niveles de ARNm de Hby fetal en el plasma materno tomado antes del parto de mujeres con PE cuantificado mediante PCR en tiempo real. El grafico muestra el valor de Ct en el eje izquierdo, proporcionando una estimacion de la cantidad de niveles de ARNm de Hby en la muestra. Esta muestra que no solo es posible medir los niveles de proteina de hemoglobina y en muestras de sangre materna, sino tambien

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las cantidades de ARNm.

Ejemplo 3

Obtencion de perfiles de expresion de proteina de la placenta preeclamptica usando electroforesis en gel 2D

Con el fin de examinar proteinas expresadas de manera diferencial en la placenta con PE en comparacion con placentas control, se recogieron muestras de placenta en el parto de mujeres con PE (n=30) y controles sanos (n=30). Usando tecnologia proteomica (electroforesis en gel bidimensional) se compararon los niveles de expresion de hemoglobina delta (HbS) en las diferentes muestras de placenta.

Pacientes y recogida de muestras

Se incluyeron 60 mujeres admitidas en el Department of Obstetrics and Gynaecology, Lund University Hospital, y se asignaron a dos grupos; PE (n=30) y control (n=30) (tabla 2). Se definio PE como tension arterial de >140/90 mmHg y proteinuria de >0,3 g/l o aumento en la tension arterial por encima de 20 mmHg desde el primer trimestre de embarazo. Se extrajo inmediatamente un cubo de 10x10x10 mm de tejido placentario tras la extraccion de la placenta. Se congelaron las muestras inmediatamente en nieve carbonica y se almacenaron a -80°C. Se excluyeron del estudio las pacientes con otras enfermedades sistemicas. El estudio se aprobo por la Junta de Revision del Comite Etico para estudios en sujetos humanos, y todas las mujeres proporcionaron sus consentimientos informados por escrito.

Tabla 2

Control PE

n

30 30 ns

Edad materna (anos)

31,7 ± 5,2 30,9 ± 5,3 ns

Edad gestacional (dias)

271,3 ± 10,8 266,6 ± 11,2 ns

Tension arterial sistolica (mmHg)

116,3 ± 11,3 149,8 ±12,1f

Tension arterial diastolica (mmHg)

67,3 ± 4,4 103,3 ± 7,9f

Proteinuria (g/L)

ND 1,4 ± 2,0f

Peso de la placenta (g)

686,8 ± 144,8 630,9 ± 128,0 ns

PE = Preeclampsia ND = No detectado

ns - sin diferencia significativa entre los grupos

f La prueba de Mann-Whitney mostro una significancia de p < 0,0001 entre los grupos Extraccion de proteina

Se extrajo proteina usando Trizol® (Invitrogen) segun instrucciones del fabricante. En resumen, se homogenizo tejido placentario en Trizol en hielo y entonces se centrifugo a 12000 g durante 10 min. a 4°C. Se separo la fraccion de proteina usando cloroformo y se precipito usando 2-propanol. Se lavo el sedimento de proteina tres veces en 1,5 ml de clorhidrato de guanidina 0,3 M y una vez en 1,5 ml de etanol al 75%. Se disolvieron los sedimentos de urea 0,8 M y chaps al 2% y se midio la concentracion de proteina usando un procedimiento espectrofotometrico. Se almacenaron las proteinas a -20°C hasta su uso.

Precipitacion de proteina

Antes del isoelectroenfoque (IEF), se precipitaron muestras con acetona para inactivar enzimas proteoliticas, para retirar sal y las sustancias de interferencia. Se mezclo la proteina extraida de cada placenta, 400 ^g, con acetona enfriada con hielo hasta concentracion final de acetona al 80%. Se incubaron las muestras durante 1 h a -20°C seguido por centrifugacion a 9000 x g durante 2 min. Se retiro la acetona y se dejaron secar al aire los sedimentos de proteina.

Electroforesis en gel bidimensional

Se rehidrataron tiras secas Immobiline (180 x 3 x 0,5 mm, pH 3-10 NL, GE Healthcare Life Sciences) en 350 ^l de la disolucion de solubilizacion que contenia urea 8 M, CHAPS al 2%, ditiotreitol 10 mM (DTT) y tampon IPG 3-10 al 2% junto con 400 u 800 ^g de muestras a temperatura ambiente durante la noche. Se realizo la etapa de IEF a 20°C usando un sistema Multiphor II y se ejecuto segun el siguiente programa: (1) 150 V durante 1 h, (2) 300 V durante 3 h y (3) 3000 V hasta que se alcanzaron aproximadamente 60.000 vhrs. Se equilibraron las tiras durante 10 min. en una disolucion que contenia DTT 65 mM, urea 6 M, glicerol al 30% (p/v), dodecilsulfato de sodio (SDS) al 2% (p/v) y Tris-HCl 50 mM pH 8,8. Tambien se llevo a cabo una segunda etapa de equilibrio durante 10 min. en la misma disolucion excepto por DTT, que se reemplazo por yodoacetamida 259 mM. Se empaparon las tiras en tampon de electroforesis (base Tris 24 mM, glicina 0,2 M y SDS al 0,1%) justo antes de la segunda dimension. Se aplicaron las

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tiras a gel de plano Duracryl homogeneo al 12,5% (240 x 190 x 1 mm, o 290 x 245 x 1 mm). Se recubrieron las tiras con una disolucion de agarosa al 1% en tampon de electroforesis (mantenido a 60°C). Se llevo a cabo la electroforesis o bien usando un aparato de gel Hoefer DALT (Amersham Pharmacia Biotech, San Francisco, CA, EE.UU.) a 20°C y 80 V constantes durante 19 h o bien usando un aparato de gel usando el mismo tampon de electroforesis que anteriormente y ejecutando a 20°C a 18 mA hasta que el frente del tinte alcance la parte inferior del gel. El tiempo de ejecucion fue de aproximadamente 17 h.

Tincion del gel

Se tineron los geles con plata, y tras la tincion se secaron los geles usando un secador de geles (Slab gel Dryer SGD2000, Savant)

Analisis de puntos

Se barrieron los geles usando CanoScan 995OF (Canon). Se realizo el analisis de puntos usando el sistema de analisis de gel bidimensional PDQUEST (version 7.1.0) (Bio-Rad discovery series, Bio-Rad Laboratories, Sundbyberg, Suecia).

Identificacion por espectrometria de masas

Se lavaron los puntos de interes con 0,5 ml de agua Milli-Q durante 1 h seguido por cuatro lavados de 0,5 ml de acetonitrilo (ACN) al 40% en bicarbonato de amonio 25 mM durante 30 minutos cada uno. Entonces se secaron los trozos de gel en un concentrador SpeedVac antes de que se degradasen las proteinas en fragmentos caracteristicos con tripsina (calidad para secuenciacion, Promega) en bicarbonato de amonio 25 mM durante la noche a 37°C. Se termino la digestion mediante la adicion de 20 pl de acido trifluoroacetico al 2%, lo que tambien extrajo los peptidos del gel. Tras 2 horas a temperatura ambiente se purificaron los peptidos a partir del tampon de digestion usando C18 Ziptips (Millipore). En resumen, se condiciono la fase solida usando 2 x 10 pl de ACN al 50%, TFA al 0,1% en agua Milli-Q. Se elimino el disolvente organico mediante lavado con dos lavados de 10 pl de TFA al 0,1%. Se aspiraron las muestras y se dispensaron varias veces seguido por dos lavados de TFA al 0,1% para eliminar las sales y el material no unido. Se eluyeron los peptidos purificados directamente sobre la diana de muestra (Anchorchip target, Bruker Daltonik) en la que se habian anadido 0,7 pl de matriz, acido 2,5-dihidroxibenzoico (3 mg/ml en ACN al 30%). Se registraron espectros de masa de iones cargados positivamente en un instrumento Bruker Reflex III (Bruker Daltonik) que se hizo funcionar en el modo reflector. Se acumulo un total de 160 - 210 espectros de disparo individual de cada muestra. Se usaron los paquetes de software XMASS 5.0 y MS Biotools proporcionados por los fabricantes para el procesamiento de datos. Se usaron los productos de auto-proteolisis conocidos de la tripsina para la calibracion interna.

Analisis de EM/EM

A partir de cada uno de los extractos peptidicos, se transfirieron 0,5 pl directamente sobre una diana MALDI de acero inoxidable y se dejaron secar. Se anadieron 0,5 pl de una disolucion de matriz que contenia acido a-ciano-4- hidroxicinamico 5 mg/ml, acetonitrilo al 50%, TFA al 0,1% y acido citrico 50 mM y se dejaron secar. Se adquirieron espectros MALDI-TOF-EM y EM/EM usando un espectrometro de masas 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems, Framingham, CA, EE.UU.) en modo reflector positivo. Se calibraron internamente los espectros EM obtenidos usando dos peptidos de autoproteolisis de tripsina con los valores de m/z 842,51 y 2211,097. Se realizo la identificacion de proteina usando el software GPS Explorer, con un motor de busqueda Mascot interno (Matrix Science, Londres, RU) {Perkins, 1999 n.° 132} buscando en la base de datos no redundante de NCBI. Los parametros especificados en la busqueda fueron: taxon, mamiferos; ausencia de escisiones, 1; tolerancia de masa de peptido, +/- 30 ppm; tolerancia de masa de iones de fragmento, +/- 0,15 Da; modificaciones variables, ninguna.

Busqueda en base de datos

Para la identificacion de proteina, se buscaron secuencias de proteinas humanas en la base de datos de NCBI usando los sofwtare ProFound Peptide Mapping (version 4.10.5, The Rockefeller University Edition) y Mascot (Matrix Science Ltd).

Inmunotransferencia de tipo Western

Se ejecuto inmunotransferencia de tipo Western en geles Bis-Tris al 12% (Invitrogen, EE.UU.) segun las instrucciones del fabricante. En resumen, se cargaron 20 pg de proteina con 2,5 ml de tampon de muestra de LDS (Invitrogen, EE.UU.) en el gel y se ejecuto durante 50 min. a 200 V en 1x tampon de ejecucion MOPS. Tras la electroforesis se transfirio el gel a una membrana de PDVF (Bio-Rad, EE.UU.) durante 1 h a 30V, tras lo cual se incubo la membrana con solucion salina tamponada con Tris (TBS) que contenia Tween20® al 0,1% (ICN Biomedichals Inc., Ohio, EE.UU.) y leche en polvo al 2% (Bio-Rad, EE.UU.) durante la noche a 4°C.

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Se incubo la transferencia con anticuerpo IgG1 monoclonal de raton primario (anti-Hby humana (diluido 1:8000 en TBST con leche en polvo al 2%)) (Nordic Biosite AB, Suecia) durante 1 h, tras lo cual se lavo la membrana una vez durante 15 min. en TBST y 3x5 min. en TBS-T. Tras los lavados, se incubo la transferencia con anticuerpo secundario de cabra anti-IgG1 de raton-HRP (diluido 1:5000 en TBS-T) (SDS Santa Cruz Biotechnology, EE.UU.) durante 1 h, tras lo cual se lavo la membrana como anteriormente. Posteriormente, se expuso la membrana a quimioluminiscencia potenciada ECL+ (GE Healthcare Biosciences, RU) durante 3 min. Se aplico una pelicula autorradiografica (Hyperfilm ECL, Amersham, EE.UU.) a la transferencia durante 1 minuto para obtener una exposicion satisfactoria.

Extraccion de ARN

Se extrajo ARN total segun las instrucciones del fabricante usando RNEasy (Qiagen) de 10 muestras con PE y 10 muestras control de las mismas pacientes que anteriormente. En resumen, se homogenizaron las muestras de placenta usando TissueLyzer en un tampon de lisis RNEeasy (RLTbuffert y p-mercaptoetanol) (Qiagen). Se precipitaron las muestras en etanol al 70% y entonces se separaron usando mini columnas RNEasy segun el protocolo del fabricante. Se eluyeron muestras en 50 pl de H2O libre de ARNasa.

PCR en tiempo real (igual que anteriormente)

Se sintetizo ADNc usando transcriptasa inversa segun el protocolo del fabricante (Applied Biosystems). En resumen, se uso una mezcla de reaccion de 50 pl (0,5 pg de ARN total, 1 x tampon TaqMan RT, MgCl2 5,5 mM, dNTP 500 pM, hexameros al azar 2,5 pM, inhibidor de ARNasa 0,4 U/pl y transcriptasa inversa MultiScribe 1,25 U/pl). Se incubaron las reacciones a 25°C (10 min.), a 48°C (30 min.) y finalmente a 95°C (5 min). Se almacenaron las muestras a -20°C hasta el analisis.

Se cuantificaron transcritos genicos adquiridos por medio de RT-PCR cuantitativa usando un sistema de deteccion de secuencias ABI PRISM® 7000 (Applied Biosystems). Se ordenaron cebadores y sondas para TF (ID de ensayo: Hs00169070m1) y HbS (ID de ensayo: Hs00426283m1) de Assays-on-Demand™ (Applied Biosystems). Los cebadores recubrieron al menos un limite de exon para evitar la amplificacion de ADN genomico contaminante. Se llevaron a cavo las reacciones en un volumen final de 25 pl que contenia concentraciones finales: 1x Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems), sonda 0,25 pmol/l, 0,9 pmol/l de cebadores directo e inverso respectivamente, y 2,2 pl de alicuota de ADN. Se inicio la ciclacion termica mediante activacion de UNG a 50°C durante 2 minutos y una desnaturalizacion inicial a 95°C durante 10 minutos. Tras la desnaturalizacion, se ejecutaron 40 ciclos: 95°C durante 15 segundos, 60°C durante 1 minuto. Se incluyeron dos controles negativos, que no contenian molde, en cada conjunto de amplificaciones. Se uso p-actina como referencia para normalizar la senal de la muestra. Se logro la cuantificacion haciendo una curva de calibracion usando diluciones en 4 veces en serie del ADN de molde (0,0880 ng). Se expresan los resultados como razones con p-actina como denominador.

Hibridacion in situ (igual que anteriormente)

Se realizo la hibridacion in situ en 18 muestras de PE y 19 muestras control. Se montaron por descongelacion secciones de criostato en portaobjetos sialinizados, que se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se uso el tejido congelado reciente con el fin de maximizar la deteccion de ARNm. Se fijaron las secciones, se deshidrataron, se dilipidaron y se hibridaron. Se llevo a cabo la hibridacion durante 20-24 horas en 55°C con 2x106 cpm de sonda de 35S-ARNc desnaturalizada por 80 pl de tampon de hibridacion (Tris 20 mM-HCl (pH 7,4), EDTA 1 mM (pH 8,0), NaCl 300 mM, formamida al 50%, sulfato de dextrano al 10%, 1x ARNt de levadura 25 mg/ml de Denhardt, ADN de esperma de salmon 100 pg/ml, ARN de levadura total 250 pg/ml (fraccion XI, Sigma), DTT 150 mM, tiosulfato de sodio (NTS) al 0,15% y SDS al 0,15%. Tras los lavados, se colocaron los portaobjetos en Kodak Hyperfilm Biomax MR durante 2 dias, tras lo cual se recubrieron con emulsion nuclear (NTB, Kodak). Se expusieron portaobjetos durante 4 semanas a 4°C, tras lo cual se revelaron en Dektol (Kodak), se fijaron y se contratineron con un tinte Giemsa.

Resultados

Se separaron las proteinas de placenta extraida mediante 2D-PAGE para estudiar las diferencias en la expresion de proteina entre pacientes con PE y controles sanos. En la primera configuracion experimental, se cargaron 400 pg de las muestras a la tira IPG y se ejecuto la segunda dimension usando el aparato de gel Hoefer DALT. Solo un punto se presento de manera diferencial entre los dos grupos. Con el fin de identificar el punto, se cargaron 800 pg de muestras en los geles, y se ejecutaron un total de cuatro muestras, dos muestras de PE y dos de control. Para el analisis cualitativo se ejecuto la segunda dimension. Al hacer esto, se detecto a simple vista un segundo punto expresado de manera diferencial en las muestras de PE (figura 8). Se extrajeron los dos puntos de proteina de interes mediante perforacion de los geles, se digirieron enzimaticamente y se identificaron usando MALDI-TOF EM. Se identifico la primera proteina como transferrina y la segunda como hemoglobina.

No fue posible establecer la subclase de hemoglobina con los datos de MALDI. Por tanto se sometio adicionalmente

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este punto a analisis de secuencia usando analisis de EM-EM. Los datos de EM-EM mostraron que las secuencias obtenidas pertenecian a la cadena delta de hemoglobina (HbS). De acuerdo con el analisis de proteina, la PCR en tiempo real tambien mostro una expresion genica significativamente aumentada para HbSQen las placentas con PE (p=0,04) frente a los controles (figura 9).

La hibridacion in situ mostro celulas individuales que expresaban ARNm de HbS en todo el espacio intravelloso. Se observaron particularmente celulas que expresaban ARNm de HbS en y alrededor de vasos sanguineos de la placenta. Las placentas con PE parecian tener celulas mas dispersadas fuera de los vasos que expresaban ARNm de HbS que los controles. No se detecto ninguna senal en las celulas de trofoblastos. Se oculto la morfologia celular de las celulas que expresaban HbS mediante los granos platas que recubrian las celulas positivas (figura 10).

Discusion

Los presentes hallazgos soportan la hematopoyesis placentaria, demostrando en el presente documento la expresion aumentada de proteina HbS, asi como la correspondiente expresion genica, en PE.

En la placenta, los niveles aumentados de ARNm de HbS se traducen en la proteina que en el presente documento se muestra que se acumula en la placenta con PE. Sin embargo, no es cierto que las cadenas de Hb que se producen se dispongan en moleculas de Hb funcionales con anillos de porfirina unidos e ion Fe. El transporte y la captacion celular de hierro se facilita mediante transferrina (TF). Estos geles 2D en este caso tambien muestran que la placenta con PE carece de TF intracelular. Esta falta de proteina TF en la placenta con PE puede reflejar un transporte de hierro alterado en la poblacion celular que expresa HbS. Por tanto, las celulas que producen Hb pueden por lo tanto ser deficientes en su suministro de hierro, conduciendo a la acumulacion de cadenas de Hb y/o moleculas de Hb disfuncionales en la placenta con PE. De manera interesante, no hubo acumulacion de hemoglobina en las placentas control aunque la hibridacion in situ mostro la expresion de ARNm para HbS. La placenta sana, a diferencia de la placenta con PE, puede regular la produccion de Hb o bien mediante la regulacion de la traduccion de ARNm, degradacion de proteina, o simplemente por ser un sitio extramedular de hematopoyesis. La sintesis de Hb defectuosa puede conducir a eritroblastos defectuosos, estos seran entonces menos resistentes y se separaran mas facilmente, lo que a su vez conduce a mas Hb libre.

Ejemplo 4

Deteccion de la expresion de ARN de HLA-DPA1

Se realizo RT-PCR cuantitativa para analizar la expresion de ARN de HLA-DPA1.

Se realizo la recogida de muestras; la toma de muestras y manipulacion de tejido; la extraccion de ARN; y la amplificacion mediante PCR en tiempo real tal como se describio en el ejemplo 1 con modificaciones necesarias.

Resultados

El complejo mayor de histocompatibilidad, clase II, DP alfa 1 (HLA-DPA1) estaba regulado por incremento de manera significativa en el grupo con incisura en comparacion con todos los demas grupos (p = 0,01 frente a PE sin incisura, p = 0,02 frente a PE con incisura, y p = 0,01 frente al control) (vease la figura 4 D).

Discusion

Las mujeres con diagnostico de incisura corren un riesgo mas alto de desarrollar PE posteriormente en sus embarazos. Sin embargo, el hecho de que no todas las mujeres con incisura desarrollan PE implica que pueden expresar genes que protegen o reprimen los genes que las danan. Tanto la micromatriz como qPCR mostraron expresion aumentada de HLA-DPA1 en el grupo con incisura frente a todos los demas grupos. HLA-DPA1 es parte de la familia del complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) de clase II, miembros de la cual son responsables de presentar antigenos foraneos como parte de la respuesta inmunitaria adaptiva. Solo moleculas de CMH de clase I, tipos G y E de HLA, se expresan en celulas de trofoblastos. Se piensa que se alteran la respuesta inmunitaria materna en el limite feto-madre, que protege al feto de una respuesta inmunitaria materna. Por tanto HLA-DPA1, una molecula de CMH de clase II, puede no prepararse por trofoblastos. En vez de eso, puede ser una reaccion materna a la presencia de celulas fetales en la placenta.

Se sabe que las celulas fetales entran en la circulacion materna durante el embarazo, y sus niveles aumentan en el transcurso de un embarazo normal lo que sugiere un flujo continuo de celulas fetales a traves de la barrera placentaria y al interior del sistema materno. En PE, el numero de celulas fetales en la circulacion materna esta aumentado frente a los embarazos normotensivos. Tal como se observo anteriormente, la expresion aumentada de HLA-DPA1 en el grupo con incisura sugiere que el sistema inmunitario materno puede estar reaccionando frente a antigenos “foraneos” en la placenta, especificamente, las celulas fetales en la misma. Por tanto, HLA-DPA1 puede contribuir a la construccion de una barrera inmunologica que previene que entren celulas fetales en los sistemas

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maternos identificando las celulas y marcandolas para su destruccion. Si las celulas que expresan Hb observadas en los experimentos son de originen fetal, HLA-DPA1 tambien puede prevenir que estas celulas se escapen al interior de la placenta, protegiendo de ese modo la placenta frente a una produccion en exceso de hemoglobina y grupo hemo libre.

Ejemplo 5

Concentraciones de hemoglobina y ai-microglobulina en plasma y orina, antioxidacion mediante ai-microglobulina y perfusion de placenta in vitro

Materiales y metodos

Hemoglobina

Se adquirio hemoglobina de Sigma. Se preparo oxihemoglobina-A en el laboratorio tal como sigue. Se aislaron globulos rojos de 50 ml de sangre humana mediante centrifugacion (1200 xg, 10 minutos) y se lavaron 4 veces con 10 volumenes de solucion salina tamponada con fosfato (PBS, fosfato 10 mM, pH 7,4; NaCl 120 mM y KCI 3 mM). Entonces se lisaron las celulas sanguineas mediante resuspension en tampon hipotonico (20 volumenes de H2O:1 volumen de PBS) en hielo. Se separaron las membranas del citosol mediante centrifugacion (14000 xg, 20 minutos) y se dializo el sobrenadante 3 veces frente a Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 a 4°C. Se empaquetaron doscientos ml de DEAE-Sephandex A-50 (Amersham Biosciences AB, Uppsala, Suecia) en una columna y se aplico el sobrenadante dializado al gel y se separo mediante un gradiente que consistia en Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 y Tris-HCl 15 mM, pH 8,0 + NaCl 0,2 M. Se recogieron fracciones y se midio la absorbancia a 280 nm, 577 nm y 630 nm para identificar y determinar la concentracion de oxihemoglobina-A. Se preparo oxihemoglobina F a partir de sangre de cordon umbilical humano usando el mismo protocolo.

Proteinas y anticuerpos

Se expreso a1-microglobulina (a1m) humana recombinante en E.coli, se purifico y se replego tal como se describe [Kwasek et al., 2007]. Se adquirieron inmunoglobulina de conejo anti-raton, anticuerpo de conejo anti-hemoglobina e inmunoglobulina porcina anti-conejo-fosfatasa alcalina (ALP) de Dako (Dinamarca). Se adquirio anticuerpo monoclonal de raton anti-cadena gamma de hemoglobina de Santa Cruz Biotechnologies Inc (n.° de cat. sc-21756). Se prepararon anticuerpo de conejo anti-a1m humana e inmunoglobulina de cabra anti-conejo tal como se describe, respectivamente [Elbashir et al. 1990, Bjorck et al. 1977]. Se prepararon anticuerpos de raton monoclonales frente a a1m humana (BN11.10) tal como se describe [Babiker-Mohamed et al., 1991].

Marcaje con yodo

Se marcaron las proteinas con 125I (Bio-Nuclear AB, Estocolmo, Suecia) usando el metodo cloramina-T [Greenwood et al, 1963]. Se separaron las proteinas marcadas de yoduro libre mediante filtracion de gel en columna Sephadex G-25 (PD-10, GE Healthcare). Las actividades especificas fueron de aproximadamente 0,3 MBq por pg de proteina para a1m y 0,5 MBq por pg de proteina para inmunoglobulinas.

Pacientes y toma de muestras

Se recogieron muestras de placenta y sangre de mujeres admitidas en el Lund University Hospital (30 controles, 30 con PE). Se tomaron muestras con consentimiento por escrito y se aprobo por la Junta de Revision del Comite Etico de Suecia. Se definio preeclampsia como una tension arterial por encima de 140/90 mmHg y proteinurea por encima de 0,3 g/l {Milne, 2005 n.° 89}. Solo se tomaron muestras de pacientes con incisura bilateral para el grupo con incisura sin PE. Se extrajo un cubo de 10x10x10 mm de tejido velloso tras el parto y se coloco inmediatamente en nieve carbonica. Se almacenaron las muestras a -80°C hasta su uso. Se recogieron muestras de sangre antes del parto y se almacenaron usando sistema de ARN de sangre Paxgene (Qiagen, Valencia, EE.UU.) a -20°C hasta su uso. Se describen diversos parametros de estos grupos en la tabla 2, paginas 37-38. Ademas, se investigaron muestras de las 10 pacientes y 10 sujetos control del estudio en Tanzania en los ejemplos 5 (vease la tabla 1, paginas 14-15).

ELISA

Se midieron concentraciones de hemoglobina-A usando ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzimas (ELISA) competitivo tal como se describe para radioinmunoensayo en fase solida (SPRIA) y usando tampones, procedimiento de lavado y veces de incubacion tal como se describe [Nilson et al., 1986]. Se recubrio hemoglobina (Sigma) a 4 pg/ml, se lavaron las placas y se incubaron con una mezcla de anticuerpo de conejo anti-hemoglobina y o bien oxihemoglobina-A convencional o bien muestras desconocidas, se lavaron, se incubaron con IgG porcina anti- conejo-ALP (Dako), se lavaron y finalmente se incubaron con sustrato. Se titularon por separado diluciones apropiadas de cada etapa y reactivo. Se leyo la absorbancia a 415 nm (Bio-Rad Model 550, lector de microplacas). El volumen usado para cada etapa de incubacion fue de 100 pl. Se prepararon todos los experimentos por triplicado.

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RIA

Se determinaron concentraciones de aim mediante radioinmunoensayo (RIA) tal como se describe [Plesner et al. 1975; Akerstrom, 1985]. En resumen, se mezclo antisuero de cabra frente a aim humana (0,2 ml, dil. 1:6000) con aim marcada con 125I (0,1 ml, aprox. 0,05 pg/ml) y muestras desconocidas o concentraciones de a1m convencionales (0,2 ml). Se prepararon las diluciones en fosfato de sodio 0,1 M, pH 7,5 + BSA al 0,1% (tampon de RIA). Tras la incubacion durante la noche a temperatura ambiente, se precipito a1m unida a anticuerpo anadiendo 0,3 ml de suero bovino y 1,6 ml de polietilenglicol al 15% en tampon de RIA, centrifugando a 1500xG durante 40 min. y analizando la actividad de 125I de los sedimentos en un contador gamma Wallac Wizard 1470 (Perkin Elmer Life Sciences).

Determinacion de concentraciones de Hb-F

Se determinaron las concentraciones en plasma de hemoglobina F mediante inmunotransferencia de tipo Western tras la retirada de albumina de plasma usando el kit de deplecion de albumina Montage (n.° de cat. LSKAD0024; Millipore). En resumen, se combinaron las perlas de diez columnas en un lote, se lavaron con PBS y se separaron en 50 alicuotas identicas. Tras la centrifugacion, se descarto el sobrenadante de cada alicuota y se anadieron 40 pl de plasma (diluido 1:1 con PBS) y se incubaron dos veces durante 1 h a TA. Se centrifugaron los tubos, se guardo el sobrenadante y se lavaron las perlas secuencialmente con 1 ml de glicina-HCl 0,1 M, pH 2,3 y 1 ml de Tris-HCl 0,1 M, pH 8. Tras la centrifugacion y retirada del sobrenadante, se anadio el plasma y se incubo de nuevo durante 1 h a TA. Tras la centrifugacion y descarte del sedimento, se separaron 10 pl del plasma asi sometido a deplecion de albumina mediante SDS-PAGE (T=13,5%; C=3,3%) y se transfirieron con anticuerpo de raton anti-cadena F/y de Hb humana, diluida 600x, seguido por Ig de conejo anti-raton (1 pg/ml) y la IgG de cabra anti-conejo marcada con 125I tal como se describe a continuacion. Se logro la cuantificacion de hemoglobina F mediante densitometria de las bandas positivas usando el software Image Gauge V4.0 (Fuji, Tokio, Japon) y hemoglobina F convencional (15 y 75 ng/pocillo). Se determinaron las concentraciones en orina de hemoglobina F usando el mismo protocolo, pero omitiendo las etapas con el kit de deplecion de albumina Montage.

Inmunotransferencia de tipo Western

Se realizo SDS-PAGE (T = 12%, C = 3,3%) tal como se describe [Laemmli, 1970]. Se ejecutaron los geles en condiciones de reduccion usando un patron de alto peso molecular (Rainbow markers, Amersham Biosciences, Buckinghamshire, Inglaterra). Se transfirieron las proteinas separadas a membranas de poli(difluoruro de vinilideno) (PVDF) (Immobilon, Millipore, Bedford, MA, EE.UU.) tal como se describe [Matsudaira, 1987]. Entonces se incubaron las membranas con los anticuerpos apropiados y se realizo inmunotransferencia de tipo Western usando inmunoglobulinas de cabra secundarias anti-conejo marcadas con 125I tal como se describio anteriormente por Wester et al [1997], y revelando las imagenes en las membranas usando el sistema de obtencion de imagenes con fosforo Fuji FLA 3000 (Fujifilm Suecia AB, Estocolmo, Suecia).

Extraccion y preparacion de tejido placentario de moleculas de a1m

Se purificaron moleculas que contenian a1m de tejido placentario tal como se describe [Berggard et al., 1999]. Se homogenizaron aproximadamente 200 g de una placenta humana a termino aparentemente normal, tomados en el plazo de 3 horas tras el parto, en 200 ml de Tris-HCl 50 mM, pH 8,0, sacarosa 0,25 M, EDTA 2 mM, pepstatina, 1 mg/l, antipaina, 5 mg/l, y leupeptina, 10 mg/l, usando un aparato Potter-Elvehjem con una mano de almirez de teflon de ajuste hermetico. Se centrifugo el homogeneizado a 10.000 G durante 10 min. Se lavo ese sedimento mediante suspension repetida 1:1 en el tampon de homogenizacion y recentrifugacion a 10.000 G durante 10 min. Se centrifugo el sobrenadante a 100.000 G durante 90 min. Se disolvio este sedimento, que contenia las membranas de la placenta y proteinas unidas a la membrana, en 40 ml de tampon de homogenizacion que contenia tambien Nonidet P-40 al 0,5% (p/v) (BDH Chemicals) y se centrifugo a 20.000 G durante 30 min. para retirar el material particulado. Se realizaron todas las etapas en hielo o a 4°C. Se realizo cromatografia de afinidad por inmunoabsorcion con anticuerpo de raton monoclonal anti-a1m, BN11.10, inmovilizado en Affigel Hz (20 mg/ml) segun las instrucciones del fabricante (Bio-Rad Laboratories, Richmond, CA, EE.UU.).

Perfusion de placenta in vitro

Hasta la fecha no hay modelos animales adecuados para PE. Con el fin de estudiar los efectos de hemoglobina libre esta estableciendose el modelo de perfusion placentaria dual en colaboracion con Henning Schneider, Greifswald, Alemania. La perfusion de placenta dual es un modelo bien establecido para estudiar el flujo de sangre placentaria in vitro [Schneider et al., 1985]. Recientemente, se uso el modelo para imitar PE induciendo la formacion de ROS con xantina y xantina-oxidasa [Di Santo et al., 2007]. Datos muy recientes indican que las placentas perfundidas con xantina tienen un perfil genico similar a placentas con PE.

Se perfunde artificialmente placenta humana con medios oxigenados. Se perfunde la circulacion tanto materna como

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fetal (por tanto “dual”) usando bombas peristalticas. Se monitorizan los medios de los dos circuitos separados para detectar fugas. Se analizan los medios y tejido placentario con la tecnologfa mencionada anteriormente.

Ejemplo 5.1

La hemoglobina-A esta elevada en el plasma preeclamptico Resultados

Se muestran los resultados en las figuras 11-12. La determinacion de concentraciones de hemoglobina total en el plasma de 30 pacientes con preeclampsia y 30 embarazos control mediante ELISA mostro un aumento de casi dos veces en el grupo de preeclampsia. El valor medio +/- DE en las pacientes fue de 3,01 +/- 0,39 ug/ml y en el grupo control de 4,44 +/- 1,0. Esta diferencia es significativa (P<0,05).

Ejemplo 5.2

La hemoglobina-F esta elevada en la orina y plasma preeclamptico

Se observo hemoglobina fetal en plasma y orina con inmunotransferencia de tipo Western como una banda de 15 kDa que reaccionaba con anticuerpo anti-cadena gamma. La figura 13 muestra un ejemplo del metodo de inmunotransferencia de tipo Western aplicado al plasma de dos pacientes (PE 1 y 2) y dos sujetos control (control 1 y 2). El lfmite de deteccion del metodo fue aproximadamente de 5 pg/ml en plasma y 1 ug/ml en orina. Se estimaron las concentraciones de Hb-F mediante densitometrfa y la tabla 1 muestra las frecuencias de Hb-F en las muestras de plasma y orina de los grupos con PE y control. Se observo la banda en el plasma de 9 pacientes, mientras que ninguno de los individuos control fue positivo. Por tanto, 9 pacientes y ninguna mujer control tuvieron mas de 5 pg/ml de hemoglobina fetal en plasma. Suponiendo que las concentraciones en plasma de las mujeres control fueron de 0,04 ug/ml como sugiere el estudio de Turpeinen et al., es decir la concentracion en plasma normal, los resultados muestran un aumento de 125 veces de hemoglobina fetal en el 20% de las pacientes con PE. La orina de 8 pacientes contenfa la banda y 2 de los controles (tabla 3). Se encontraron estos dos individuos control entre las mujeres de Tanzania, con alta incidencia de infecciones por malaria. Se observo una banda debilmente positiva a 67 kDa, que representa lo mas probablemente la albumina en intensidad igual en todas las muestras.

Tabla 3. Frecuencias de individuos con > 5 pg/ml de Hb-F en plasma y >1 pg/ml en orina.

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Ejemplo 5.3

Dependencia del tiempo de hemoglobina-A y F en plasma

Un factor patogenico temprano posible de preeclampsia es hipoxia, provocada por ejemplo por perfusion alterada, implantacion anomala o inanicion. La hipoxia puede regular por incremento la expresion de Hb-F en celulas progenitoras y madre hematopoyeticas adultas y fetales [Narayan et al., 2005]. Junto con la lesion en las barreras ifsicas de la placenta, esto puede conducir a fuga de celulas fetales asf como Hb-F libre en la circulacion materna entre las fases 1 y 2 (vease la figura 15). A medida que la enfermedad progresa el numero aumentara, lo que puede monitorizarse como niveles aumentados de hemoglobina fetal libre. Cuando se danan las paredes vasculares maternas mediante hemoglobina fetal libre, las celulas sangufneas maternas tambien empezaran a morir. Esto conducira a niveles aumentados de hemoglobina materna libre, impulsando adicionalmente la espiral negativa de la enfermedad. La hipotesis es que Hb-F precede a la Hb total.

Ejemplo 5.4

a1m esta elevada en la orina y plasma preeclamptico

La protefna tisular y de plasma pequena, a1-microglobulina (a1m), es una molecula de union a grupo hemo [Allhorn et al., 2002; Larsson et al., 2004] y eliminador de radicales [Akerstrom et al. 2007] y una forma de degradacion de grupo hemo, t-a1m, se induce mediante retirada proteolftica de un tetrapeptido C-terminal, LIPR, cuando se mezcla a1m con hemoglobina libre [Allhorn et al., 2002]. La hemoglobina libre y especies reactivas de oxfgeno provocan una produccion aumentada de a1m en celulas hepaticas y celulas sangufneas [Allhorn et al., 2002]. Por tanto, a1m es un posible antagonista de grupo hemo y hemoglobina que puede proteger frente al dano inducido por grupo hemo y hemoglobina a celulas y componentes tisulares.

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De acuerdo con esta hipotesis, se ha encontrado que las concentraciones de aim estan elevadas en el plasma y la orina de pacientes con preeclampsia en comparacion con embarazos control con una significancia de P<0,01 tanto en el plasma como en la orina (figura 15). La concentracion de aim en plasma media (+/- DE) en pacientes fue de 19,1 (+/- 5,5) ug/ml y en controles de 16,1 (+/- 3,7) pg/ml. La concentracion de a1m en orina media (+/- DE) en pacientes fue de 9,4 (+/- 5,5) pg/ml y en controles de 5,3 (+/- 4,6) pg/ml. Estos resultados indican 1) que el organismo responde al ataque preeclamptico aumentando la produccion de a1m elevando de ese modo la concentracion en plasma y 2) que la hemoglobina, grupo hemo, hierro y/o ROS son componentes del ataque ya que a1m se regula por incremento en celulas mediante hemoglobina, grupo hemo, hierro y/o ROS aumentados. Por tanto, lo mas probablemente a1m es una reaccion de defensa del organismo frente al ataque preeclamptico. Por consiguiente, el aumento de las concentraciones de a1m a niveles incluso mas altos, por ejemplo 32 pg/ml, que es dos veces la concentracion normal, debe tener efectos anti-preeclampticos, y por tanto a1m es un posible farmaco para el tratamiento de la enfermedad.

Ejemplo 5.5

a1m protege las celulas y los componentes tisulares mediante anti-oxidacion y union a grupo hemo

Las propiedades de anti-oxidacion de a1m se ilustran en las figuras 16 y 17. En primer lugar, se mostro que a1m anadida de manera extracelular puede reducir la carga redox de citosol celular y grupos tiol de proteinas de citosol, e inhiben la oxidacion de estos componentes mediante grupo hemo y ROS. a1m anadida de manera extracelular tambien inhibe la lisis celular (es decir muerte celular) inducida por grupo hemo (figura 16). La modificacion oxidativa de colageno y lipoproteinas de baja densidad (LDL) participan en la patogenesis de muchas enfermedades y tambien pueden ser dianas de oxidacion inducida por Hb en preeclampsia. a1m inhibio la oxidacion inducida por grupo hemo y ROS de colageno, LDL, lipidos de la membrana y celulas completas. a1m tambien elimino los productos de oxidacion formados previamente en el colageno y LDL (figura 17). Un posible mecanismo para estas acciones puede ser las propiedades reductasa de a1m, que reduce los oxidantes, las modificaciones de oxidacion, o ambos.

Para estudiar los mecanismos del efecto citoprotector de a1m, se realizo una serie de experimentos que intentan analizar las interacciones entre la proteina y grupo hemo unido a celula. En primer lugar, se incubaron celulas con grupo hemo 10 pM durante 30 minutos, se elimino por lavado el grupo hemo en exceso y se anadio a1m o proteinas control hasta una concentracion de 2 o 10 pM y se incubo durante 2 h. Se guardaron los medios de cultivo, se lavaron las celulas y se solubilizaron, y se analizaron tanto los medios como las celulas solubilizadas mediante espectrofotometria (figura 18A) y visualmente (figura 18B). Se observo grupo hemo como una fuerte coloracion de color marron de las celulas y el espectro de absorbancia tipico con un pico no nitido alrededor de 400 nm. Cuando se anadio a1m, se elimino casi completamente el grupo hemo de las celulas y en su lugar se encontro en el medio. La lipocalina AGP control no tuvo ningun efecto sobre el grupo hemo unido a celula. Se espera que los niveles de grupo hemo libre en preeclampsia puedan alcanzar 10 pM y mas, al menos localmente, y que las celulas afectadas por los efectos toxicos de grupo hemo libre incluyen celulas endoteliales que revisten los vasos sanguineos.

Tal como se describio en varias ocasiones anteriormente, se cree que los ataques oxidativos por hemoglobina libre, grupo hemo libre y ROS producidos mediante autooxidacion de hemoglobina y grupo hemo constituyen factores patologicos principales del progreso de preeclampsia. El colageno y las membranas de celulas endoteliales y citosoles son por supuesto dianas importantes de los ataques oxidativos. Los resultados en este ejemplo hacen probable que a1m pueda inhibir y reparar el dano realizado por la hemoglobina libre, grupo hemo y ROS tambien in vivo, y por tanto puede actuar como un agente terapeutico en preeclampsia.

Ejemplo 5.6

La perfusion in vitro con hemoglobina induce fuga de placenta y regulacion por incremento de a1m

Se estudio preeclampsia usando un modelo de perfusion de placenta in vitro con dos sistemas de circulacion separados, en los lados fetal y materno, respectivamente. En primer lugar se aclararon ambos sistemas de circulacion. Entonces se perfundio la placenta durante 120 min. con una disolucion de Hb-A (2 mg/ml) en el lado fetal y tampon solo para en el lado materno durante 120 min. (“1a perfusion”) y durante 120 min. en ambos los lados con tampon solo (“2a perfusion”). Se tomaron regularmente pequenas alicuotas de ambas circulaciones y se midieron las concentraciones de Hb-A, Hb-F y a1m. Tal como se muestra en la figura 19 (lado izquierdo), Hb-A aparecio rapidamente en el lado materno durante la 1a perfusion y, en un menor grado, durante la 2a perfusion. Esto puede ser el resultado de fuga o produccion endogena de Hb-A en el tejido placentario, o ambos. Tambien aparecio a1m en el lado materno durante ambos periodos de perfusion en la figura 19 (lado derecho). Esto sugiere que se produce a1m en el tejido placentario como resultado de la perfusion de hemoglobina. Finalmente, Hb-F aparecio en la circulacion materna al final de la 1a perfusion (120 min.), lo mas probablemente como resultado de la produccion en la placenta y fuga al interior de la circulacion materna.

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Por tanto, el modelo de perfusion in vitro por lo tanto puede usarse para estudiar el efecto de hemoglobina libre en la circulacion fetal sobre la funcion de barrera placentaria, los efectos protectores de a1m y la respuesta celular protectora del tejido.

Ejemplo 5.7

Una nueva molecula en la placenta que consiste en aim y hemoglobina unidas entre si

Se mostro previamente que aim puede “robar” el grupo hemo de la hemoglobina cuando se mezclan las dos moleculas en disolucion [Allhorn et al., 2002; Larsson et al., 2004]. Para lograr esto in vivo, las moleculas de hemoglobina y aim deben entre si. Se observaron evidencias de una molecula de aim-hemoglobina de ese tipo en extractos de placenta, tras el aislamiento de especies moleculares que contenian aim, seguido por analisis con inmunotransferencia con anticuerpos anti-Hb (figura 20). Una banda de proteina de 43 kDa reacciono con anticuerpos frente tanto a aim como a Hb-A. Se mostro mediante mapeo de peptido Maldi-EM que la banda contenia aim y las cadenas tanto alfa como beta-globina (no mostradas). El tamano de la molecula sugiere que la molecula esta compuesta por una cadena de cada una de aim y otra cadena que puede ser o bien Hba o bien Hby. No pudo observarse la banda tras la adicion de mercaptoetanol, lo que indica que las cadenas se mantienen juntas mediante un enlace disulfuro.

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Claims (8)

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2. 3.

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   REIVINDICACIONES

   Alfa-1-microglobulina para su uso en la profilaxis o el tratamiento de preeclampsia.

   Composicion farmaceutica que comprende alfa-1-microglobulina para su uso en la profilaxis o el tratamiento de preeclampsia.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, para uso parenteral.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, para uso oral.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 3, via parenteral seleccionada de la lista que consiste en inyeccion y subcutanea.

   Composicion farmaceutica segun la reivindicacion 3 o 5 en forma de una composicion liquida o una composicion solida disenada para reconstituirse por ejemplo con agua antes de su administracion.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 2, que comprende ademas un anticuerpo, una celula madre o una celula recombinante que dirige dicha alfa-1 -microglobulina a la placenta.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 4, en la que la composicion esta en forma solida, semisolida o liquida.

   Composicion farmaceutica para su uso segun la reivindicacion 8, en la que la composicion es una forma farmaceutica solida, polvos, granulos, grageas, perlas, jarabes, mezclas, suspensiones o emulsiones.

   Composicion farmaceutica que comprende alfa-1-microglobulina para su uso como medicamento.

   en la que la composicion farmaceutica es

   en la que la composicion farmaceutica es

   en la que la via de administracion es una intravenosa, intraperitoneal, intramuscular