CN115598345A - 诊断癌症和确定癌症患者的总体生存和无病生存的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了GP88结合成分在制备鉴定癌症患者的降低的总体生存的风险的试剂盒中的应用。

Description

诊断癌症和确定癌症患者的总体生存和无病生存的方法
本申请是2009年9月8日提交的题为“诊断癌症和确定癌症患者的总体生存和无病生存的方法”的国家申请号为201710316647.9的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本申请大体上涉及癌症的诊断和监测方法和测定法，以及可用于此类方法的试剂盒。更具体地，本申请涉及GP88的表达用于预测癌症患者的转移可能性、无病生存长度和总体生存长度、以及癌症治疗结果的用途。
背景技术
乳腺癌是妇女中的癌症的主要形式，在美国是除了肺癌之外的第二位的主要癌症死亡起因。在工业化的世界，预计大约1/9的妇女在其一生中会患上乳腺癌。在美国，乳腺癌的年发生率是大约180,000例新病例，每年大约48,000例死亡(Parkin 1998；Apantaku2000)。单单生活在美国的妇女就有大约两百万人在其一生的某个点被诊断患有乳腺癌。虽然目前在该疾病的理解方面取得了进展，但是乳腺癌仍然在很大程度上对医学干预具有抗性。多数临床发明集中在早期诊断，然后是进行常规形式的干预，尤其是手术、放射、激素抑制和化疗。此类干预方式成功率有限，尤其是在肿瘤已经发生转移的患者中。迫切需要改善可获得的诊断方式和方法的集合，以提供更精确和更有效的信息，以允许通过最少可能性介入的方式进行成功治疗。具体而言，能够鉴定在初次手术之后具有极低风险的疾病复发、转移和死亡的患者的标志物将减低以昂贵的和潜在有毒性的补充方案进行的过度治疗的程度。本发明通过提供用于监测乳腺癌的新的方法和标志物而满足了该需要。
在大量的具有定位的肿瘤并且不具有向附近的淋巴结的可检测的转移的乳腺癌患者中，很多可以通过手术被治愈，因为肿瘤尚未转移至周围组织和淋巴结。但是，其它人具有隐蔽的转移性疾病，并且可以从补充放射或辅佐性抗激素治疗或化疗中获益。需要诊断标志物来区分具有低转移性转移风险的肿瘤和具有较高此等风险的肿瘤。表征低转移性疾病风险的肿瘤标志物可以直接影响关于是否使用补充放射或辅佐性激素或化疗的治疗决定。此外，此类肿瘤标志物还可以影响外科医生关于是否选择乳房保留手术或乳房切除术的推荐。
乳腺癌的诊断
所有类型的乳房疾病的确切诊断都是使用光学显微镜基于组织样品的组织学评估进行的。用于定义多数乳房损伤的组织学标准是历史性的，但是这些标准对于鉴定完全侵润的乳腺癌而言可重复性仍然很高。最近的进展包括：鉴定了少数可以帮助预测临床结果和对治疗的应答的基于组织的生物标志物(例如，S-期级分、雌激素和孕酮受体、c-erbB-2)，以及发现了与乳腺癌的家族风险相关的基因(BRCA-1和BRCA-2)(Dahiya and Deng1998；Fitzgibbons,Page等人.2000)。
癌症的分子基础仍待确定。在乳腺癌中，雌激素和孕酮的受体与哺乳动物上皮细胞分化状态相关，并且对于某些情况下的疾病结果具有预后价值。已经知道雌激素是雌激素受体(ER)阳性的人类乳腺癌细胞的体内和体外生长的主要刺激者。虽然乳腺肿瘤的建立和增殖最初需要雌激素，但是，在乳腺癌进程中雌激素非依赖性的肿瘤的产生指示差的预后。据推论，雌激素在乳腺癌细胞中的促有丝分裂效应至少部分由自分泌生长因子介导，包括由雌激素调节的生长因子。因此，雌激素响应性的基因，尤其是编码生长因子的基因的鉴定和表征，促成对雌激素在乳腺癌细胞中的效应的理解。
然而，诊断乳腺癌仍然需要一些类型的活组织检查程序。此外，目前的诊断和预后方法不能绝对区分那些能够仅通过手术即可治疗的乳腺癌和那些可能复发或已经通过转移而发生了迁徒的乳腺癌。结果是，至少50％的乳腺癌患者通过一些形式的辅助治疗来治疗。此外，可获得的方法对于预测乳腺癌对特定类型的辅助治疗的应答是不足的。
对于患有乳腺癌的个体的治疗决定通常是基于参与疾病的腋下淋巴结的数目，雌激素受体和孕酮受体(PR)状态，原发肿瘤的大小，和诊断时的疾病阶段(Tandon,Clark等人.1989)。然而，即使有这么多因素，目前还是不能精确预测疾病进程。显然需要鉴定新的标志物以区分具有良好预后的患者(其可能不需要除了手术切除恶性乳腺肿瘤之外的补充治疗)与那些患有更可能复发的癌症并且可能从另外的且更彻底的治疗形式中获益的患者。
就鉴定与乳腺癌进展相关联的标志物而言，就开发用于监测疾病进展的诊断性方法和开发用于治疗乳腺疾病和癌症的治疗性方法和组合物而言，本领域仍然存在缺陷。鉴定在乳腺癌中差别化表达或激活的标志物将对于开发迅速、便宜的用于改善乳腺癌诊断和用于预测与患者预后和对单一治疗选择的响应性相关的肿瘤行为的方法具有相当重要的意义。
GP88
88kDa的糖蛋白PC细胞衍生的生长因子(PCDGF)是自分泌的生长因子，最初是从提升了致瘤性的小鼠畸胎瘤PC细胞中分离而来的。PCDGF在本领域中也称作GP88、颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)、颗粒体蛋白前体、前颗粒体蛋白、上皮素前体、前上皮素(PEPI)和Acrogranin(下文中称作GP88)，其是富含半胱氨酸的多肽生长调节剂的颗粒体蛋白/上皮素家族中最大的成员。已经报道GP88通过刺激MAP激酶、PI-3激酶和FAK激酶途径而刺激间充质和上皮来源的数种细胞类型的增殖和存活。有趣的是，发现GP88在数种癌细胞系和/或肿瘤组织，包括乳腺癌、卵巢癌、肾细胞癌、多发性骨髓瘤和成胶质细胞瘤中过表达。
在乳腺癌细胞中，已经表明GP88在肿瘤发生中具有重要作用。GP88的过表达与雌激素非依赖性的生长、他莫昔芬抗性和肿瘤发生的获得正相关。通过反义cDNA转染MDA-MB-468细胞抑制GP88的表达后，引起裸鼠中肿瘤生长的完全抑制。此外证明，GP88阻止他莫昔芬在雌激素受体阳性的乳腺癌细胞中的细胞调亡效应。以乳腺癌活组织检查进行的病理学研究揭示出GP88在80％的浸润性导管癌中表达，与差预后标志物例如肿瘤等级、p53表达和Ki67指数相关联，而良性损伤多数是阴性的。此外，在卵巢肿瘤中进行的病理学研究表明，与具有低恶性潜力的肿瘤相比，GP88在浸润性上皮卵巢肿瘤中的表达升高。这些研究证明，除了刺激肿瘤细胞的增殖之外，GP88在侵入中具有重要作用。
颗粒体蛋白/上皮素("grn/epi")是6kDa的多肽，属于富含双半胱氨酸的多肽的新家族。美国专利号5,416,192(Shoyab等人.)涉及6kDa的上皮素，尤其是上皮素1和上皮素2。根据Shoyab，两种上皮素由共同的63.5kDa的前体编码，当所述前体被合成后即被加工成较小的形式，所以在生物样品中发现的仅有的天然产物是6kDa的形式。GP88是该上皮素的前体，并且Shoyab等人教导GP88是无生物学活性的。
与Shoyab等人的教导相反，本发明人的实验室证明：前体并不总是在合成之后即被加工。研究已经证明：前体(即GP88)事实上是以具有20kDa的N-连接的糖部分的88kDa糖蛋白的形式分泌。对GP88的N-末端序列的分析表明：GP88起始于grn/epi前体的氨基酸17，这说明从前体cDNA推导出的蛋白序列的前17个氨基酸对应于信号肽，该信号肽适于靶向膜定位或靶向分泌。与Shoyab等人的教导相反，GP88是有生物学活性的并且具有促生长活性，尤其是作为生产细胞(producer cell)的自分泌生长因子。
本领域仍然需要与癌症(例如乳腺癌和肺癌)的进展相关的标志物，以及用于基于此类标志物来预测疾病进展的诊断方法。本发明满足了这些和其它需要。
发明内容
本发明人发现，GP88表达水平的升高与患有癌症(例如乳腺癌和肺癌)的患者的转移可能性增加、总体生存降低和无病生存降低相关。这种相关性对于雌激素受体阴性(ER-)、雌激素受体阳性和淋巴结阴性(ER+/LN-)、以及雌激素受体阳性和淋巴结阳性(ER+/LN+)的乳腺癌尤其强烈。在本发明人的发现之前，此种相关性是未知的。本发明人证明：在人乳腺癌(尤其是浸润性导管癌)中存在的GP88表达升高与转移可能性增加、无病生存和总体生存降低相关，因此，GP88的表达是乳腺癌进展的新的和新型的预后标志物。患者的(一种或多种)原发肿瘤中GP88的表达水平升高是强烈的阳性预后因子。
本发明人证明，在人肺癌(尤其是非小细胞肺癌(NSCLC))中存在的GP88表达升高与转移可能性增加、无病生存和总体生存降低相关，因此，GP88的表达是肺癌进展的新的和新型的预后标志物。患者的(一种或多种)原发肿瘤中GP88的表达水平升高是强烈的阳性预后因子。
可以使用任何本领域已知的技术分析GP88的表达水平，例如使用能够结合GP88的抗体或其它成分(例如配体，等等)。因此，GP88表达的分析为目前的癌症(例如乳腺癌和肺癌)标志物增加了新的信息水平，并且是来自患有癌症的患者的样品中的可信赖的预后分子/生物化学标志物。另外，监测GP88的表达水平预示乳腺癌患者的有效治疗策略的结果。
根据本发明，提供了用于患有癌症的患者的无病生存或总体生存长度的预后的方法。在一个实施方式中，发现GP88的表达水平的升高显示出与无病和/或总体生存长度的降低之间的出乎意料的和令人惊奇的高相关性。
因此，本发明有利地提供了癌症管理中的显著进展，因为早鉴定处于肿瘤复发或转移风险的患者将允许进行积极的早期治疗从而显著增加生存可能性。
另外，本发明提供了用于预测无病和总体生存长度的方法；预测无进展生存，预测无事件生存，预测无病或总体生存降低的风险，预测患有癌症的患者复原的可能性的方法；预测具有癌性肿瘤的个体中癌症的复发和/或转移的可能性的方法；预测癌症复发的风险的方法，用于筛选患有癌症的患者以确定肿瘤转移的风险的方法；用于确定患有癌症的患者的正确疗程的方法；用于监测患有癌症的患者的疗程的有效性的方法；和用于实施本发明的方法的试剂盒。
附图说明
图1显示了在基于以抗-GP88抗体染色的预后分类之后为ER-患者产生的Kaplan-Meier曲线。
图2显示了在基于以抗-GP88抗体染色的无病生存的预后分类之后为ER+/LN-患者产生的Kaplan-Meier曲线。
图3显示了在基于以抗-GP88抗体染色的总体生存的预后分类之后为ER+/LN-患者产生的Kaplan-Meier曲线。
图4显示了在基于以抗-GP88抗体染色的无病生存的预后分类之后为ER+/LN+患者产生的Kaplan-Meier曲线。
图5显示了在基于以抗-GP88抗体染色的总体生存的预后分类之后为ER+/LN+患者产生的Kaplan-Meier曲线。
图6显示了使用抗-GP88抗体进行的正常和乳腺癌组织中的多种GP88表达水平的免疫组化检测。
图7的图显示了含有已知数量的GP88(x-轴)的样品的光密度(y-轴)。该图可用作参照以确定生物液体样品例如血清中的GP88的浓度。
图8显示了无疾病迹象和具有进行性疾病的乳腺癌患者(BC Pts)的GP88的循环水平。
图9显示了具有早期(2期)疾病、没有疾病迹象的乳腺癌患者的GP88水平。
图10显示了当具有早期疾病的患者复发至4期(转移性疾病)时的GP88的水平。
图11显示：GP88的升高的水平维持数周导致生存的下降，(A)：患者1,(B)：患者2。
图12A-C显示了小鼠GP88的核苷酸和推导的氨基酸序列。
图13A显示了人GP88 cDNA的核苷酸序列。
图13B显示了人GP88的氨基酸序列。
图14显示了针对无病生存(DFS)拟合的来自非小细胞肺癌(NSCLC)活组织检查的福尔马林固定的石蜡包埋的(FFPE)组织中的GP88染色评分，其揭示了增加的GP88表达与降低的DFS相关。生物统计分析显示GP88与复发之间的强烈关联(p＝0.0091)。
图15显示了针对总体生存(OS)拟合的来自1期和2期NSCLC活组织检查的FFPE组织中的GP88染色评分。生物统计分析显示GP88与死亡之间的强烈关联(p＝0.0038)。GP88的每一个单位的增加与65％至83％的死亡风险增加相关。
具体实施方式
根据本发明，提供了用于患有癌症的患者的预后的方法，包括测定获自所述患者的生物样品中GP88的表达水平。
在一个实施方式中，所述方法可以包括将所述生物样品与GP88结合成分(GP88binding composition)接触。
在另一个实施方式中，所述方法还可以包括将所述生物样品中的GP88表达水平与标准物进行比较，从而提供与所述的测定的GP88表达水平相关的预后。
例如，在本发明的一个实施方式中发现，GP88表达水平的升高与具有降低的生存长度的患者相关。
例如，在本发明的一个实施方式中发现，GP88表达水平的升高与具有降低的总体生存长度的患者相关。
在另一个实施方式中发现，GP88表达水平的升高与具有降低的无病生存长度的患者相关。
在本发明的一个实施方式中发现，GP88表达水平的升高与具有降低的无进展生存长度的患者相关。
在另一个实施方式中发现，GP88表达水平的升高与具有降低的无事件生存长度的患者相关。
GP88的表达水平可以用作评价疾病状态的单一因素，或者与另外的因素一起来评价疾病状态，在例如乳腺癌的情况下所述另外的因素包括，淋巴结状态、雌激素受体状态等。
本发明的方法可用于具有致瘤疾病包括实体瘤和造血系统癌症的个体的预后。示例性的致瘤疾病包括癌，例如腺癌和黑素瘤；和肉瘤，例如多种白血病或淋巴瘤。特别受关注的是乳腺癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、脑癌、卵巢癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、造血系统(淋巴和骨髓)癌、胃肠(例如结肠)癌、泌尿生殖道(例如肾、尿道上皮细胞)癌、子宫癌、头颈癌和鼻咽癌；特别是乳腺癌，更特别是浸润性导管癌。肿瘤的其它实例包括良性肿瘤，包括但不限于，血管瘤、听神经瘤、纤维神经瘤、沙眼和化脓性肉芽肿；其它的恶性肿瘤包括多数直肠癌、肾细胞癌、肺的非小细胞癌、小肠癌和食道癌。肿瘤的其它实例包括：纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨原性肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、内皮细胞肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管内皮细胞肉瘤、滑膜炎、间皮瘤、尤因瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、胃肠系统肉瘤、结肠肉瘤、泌尿生殖系统肉瘤、鳞状细胞肉瘤、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、脂肪腺癌、乳头癌、乳头腺癌、膀胱腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝细胞癌、胆管癌、绒毛膜癌、精原细胞瘤、胚胎癌、Wilms瘤、子宫颈癌、内分泌系统癌、睾丸肿瘤、肺癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、上皮细胞癌、神经胶质瘤、星细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室鼓膜瘤、松果体瘤、成血管细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑脊膜瘤、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
如本申请中使用的“预后”意思是从疾病复原的可能性，或疾病的可能的发展或结果的预测，包括但不限于预测总体生存长度、无病生存长度、无进展生存、无事件生存、癌症在患者中的复发可能性和肿瘤转移的可能性。
词语“总体生存”是本领域技术人员熟知的，是指患者在诊断后的命运，虽然存在“引起患者死亡的原因不是直接由于癌症的效应”的可能性。词语“无病生存”是本领域技术人员熟知的，意思是生存而没有监测到疾病。例如，如果GP88表达用于诊断或监测乳腺癌，则无病生存的意思是没有可检测到的乳腺癌。词语“复原的可能性”是本领域技术人员熟知的，是指：在癌症诊断之后肿瘤消失或没有肿瘤复发从而患者复原的概率，其中所述概率根据本发明的方法来确定。词语“复发的可能性”是本领域技术人员熟知的，是指：在癌症诊断之后，患者中的肿瘤复发或转移的概率，其中所述概率根据本发明的方法来确定。词语“无事件生存”是本领域技术人员熟知的，意思是：在特定处置(例如治疗)之后，生存而没有出现特定的一组限定的事件(例如癌症进展)。词语“无进展生存”是本领域技术人员熟知的，是指治疗过程中和之后的时间长度，其中患者生存而其疾病不恶化，该术语可用于临床研究或试验中以辅助发现治疗效果如何。术语“转移”是本领域技术人员熟知的，是指癌性肿瘤在不与最初的癌性肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中的生长。转移应该理解为包括微转移，其是指癌性细胞在不与最初的癌性肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中以不可检出的量存在。因此，本发明涉及一种方法，其用于确定一种或多种癌性肿瘤在不与最初的癌性肿瘤的器官直接相连的器官或身体部分中的进一步生长的风险。
如本文使用的词语“生物样品”包括获自受试者并且用于本发明程序中的多种样品类型。生物样品可以包括但不限于，固体组织样品、液体组织样品、生物液体、吸出物、细胞和细胞片段。生物样品的具体实例包括但不限于，通过手术切除获得的固体组织样品、病理样本、保存的样品或活组织检查样本、组织培养物或源于其中的细胞及其子代，以及从任意这些来源制备的切片或涂片。非限制性的实例有获自乳房组织、淋巴结和乳房肿瘤的样品。生物样品还包括源自脊椎动物的身体的任何材料，包括但不限于，血液、脑脊髓液、血清、血浆、尿液、乳头吸出物、细针吸出物、组织灌洗，例如导管灌洗，唾液、痰、腹水、肝、肾、乳房、骨、骨髓、睾丸、脑、卵巢、皮肤、肺、前列腺、甲状腺、胰腺、子宫颈、胃、肠、结肠直肠、脑、膀胱、结肠、子宫、精液、淋巴、阴道汇集物、滑液、脊髓液、头和颈、鼻咽肿瘤、羊水、乳汁、肺痰或表面物、尿、排泄物和生物来源的其它液体样品，并且可以指其中悬浮的细胞或细胞片段，或者指液体介质及其溶质。全部或部分的生物样品可以具有表征一种或多种疾病状态的GP88表达水平。
如本文使用的“标准物(standard)”是参照，其作为比较其它数据的基础。标准物可以包括生物样品、生物样品的照片或显微照片，或源自生物样品的分析的正常范围(例如，健康个体的范围内)。例如，标准物可以包括：用作阳性对照的包含在多个水平表达的GP88蛋白的正常的和/或癌症组织、无癌症组织或保存的病理样品，以及作为阴性对照样品的不显示GP88表达水平的肿瘤组织或其它组织，照片或显微照片，或源自所述样品的正常范围。例如，图6中的照片可以被认为是标准物。此类标准物可用于包括但不限于以下的方法中：用于预测无病和总体生存的长度，预测无进展生存，预测降低的无病或总体生存的风险，预测患有癌症的患者复原的可能性，预测具有癌性肿瘤的个体中的癌症的复发和/或转移的可能性，用于筛选患有癌症的患者以确定肿瘤转移的风险的方法；用于确定患有癌症的患者的正确疗程的方法；以及用于监测患有癌症的患者的疗程的有效性的方法。
“GP88结合成分”可以包括任何试剂，包括但不限于，能够特异性结合GP88的配体、抗-GP88抗体或其抗原结合片段。如本文使用的术语“结合(或能够结合)GP88的试剂”是指特异性结合GP88或其多肽片段从而检测GP88的表达水平的任意分子，包括但不限于，抗体或其抗原结合片段。此类试剂优选被标记以便使用本领域技术人员熟知的方法进行检测。标记物的实例包括但不限于，放射性标记物、发色团、荧光团、酶、结合部分(例如生物素)等。
单克隆的和多克隆的抗体或其抗原结合片段可以用作与GP88蛋白或其多肽片段结合的GP88结合成分。本文中还涉及特异性结合GP88的蛋白的任意变体作为GP88结合成分，其中所述变体可以是删除(如上所例示)、添加(例如添加GST结构域或GFP结构域)，或序列修饰(例如位点特异性诱变)等。
可用于测定生物液体样品中的GP88的浓度的抗-GP88抗体的实例可以从杂交瘤细胞系产生，包括但不限于，6B3杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5262)、6B2杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5261)、6C12杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5597)、5B4杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA5260)、5G6杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5595)、4D1杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5593)、3F8杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5591)、3F5杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5259)、3F4杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5590)、3G2(ATCC登记号PTA-5592)、2A5杂交瘤细胞系(ATCC登记号PTA-5589)和4F10(ATCC登记号PTA-8763)。保藏人对于所保藏的材料的公众可获得性所作的所有限制将会在专利授权之后不可撤销地消除。在本发明的一个实施方式中，由杂交瘤细胞系(ATCC号PTA-5262)产生的GP88单克隆抗体6B3用作免疫组化和夹心式ELISA中的一抗。
本文中的术语抗体包括但不限于人和非人多克隆抗体，人和非人单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、抗个体基因型抗体(抗-IdAb)和人源化抗体。
术语抗体还意在包括完整分子及其片段，例如，Fab、F(ab)2、Fab'、F(ab’)2、Fd、Fd'、Fv和scFv,能够结合抗原的单链抗体(天然的或重组的)。抗体或抗原结合成分可以处于溶液中或附着至支持物(板、珠子、磁珠，等等)。
抗体或抗体片段可用于免疫荧光技术，其利用荧光标记的抗体(见下文)，通过荧光显微镜、流式细胞术或荧光测定法检测。可以通过本领域熟知的免疫测定方法检测本发明的抗体与多肽的反应。本发明的抗体可以在组织学中用于光学显微镜、成像、免疫荧光或免疫电子显微镜，用于原位检测组织样品或活组织检查中的GP88蛋白。可以通过从患者中取出组织学样本并应用本发明的适当标记的抗体来完成原位检测。
生物样品可以经固相支持物或载体例如硝酸纤维素或其它能够固定细胞或细胞颗粒或可溶性蛋白的固体支持物处理。然后可以清洗所述支持物，然后以可检测的标记的抗-GP88抗体处理。然后清洗所述支持物以除掉未结合的抗体。然后可以通过常规方式检测所述支持物上结合的标记物的量。固相支持物意指能够结合抗原或抗体的任意支持物，例如但不限于玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、尼龙、修饰的纤维素或聚丙烯酰胺。或者，抗原可以处于溶液中并且抗体附着于支持物上(板、珠子、磁珠，等等)。
可以根据熟知的方法测定给定批次的抗体与GP88的结合活性。本领域技术人员将能够通过使用常规实验来确定每次测定的操作和最佳测定条件。
在一个实施方式中，本发明提供了用于一种或多种疾病的预后的方法，所述疾病的特征在于GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)，或者与GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)相关。GP88表达水平高(或升高)的疾病包括但不限于，乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌等；GP88表达水平低的疾病包括但不限于，神经退行性病症，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的预后。
本发明的优选实施方式提供了用于预测患有一种或多种疾病的患者的无病生存长度的方法，所述疾病的特征在于GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)，或者与GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)相关，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低无病生存长度的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的无病生存长度，其中升高的GP88表达水平与降低的无病生存长度相关。
本发明的优选实施方式提供了用于预测患有一种或多种疾病的患者的总体生存长度的方法，所述疾病的特征在于GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)，或者与GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)相关，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低无病生存长度的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的无病生存长度，其中升高的GP88表达水平与降低的总体生存长度相关。
本发明的优选实施方式提供了用于预测一种或多种疾病的复发可能性的方法，所述疾病的特征在于GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)，或者与GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)相关，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的所述疾病的复发可能性的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的所述疾病的复发可能性，其中升高的GP88表达水平与降低的所述疾病的复发可能性相关。
本发明的优选实施方式提供了用于预测患有一种或多种疾病的患者的无进展生存长度的方法，所述疾病的特征在于GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)，或者与GP88的差别化表达(例如异常高表达和/或异常低表达)相关，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低无病生存长度的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的无进展生存长度，其中升高的GP88表达水平与降低的无进展生存相关。
本发明的优选实施方式提供了用于预测患有癌症的患者的无病生存长度的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的无病生存长度的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的无病生存长度，其中升高的GP88表达水平与降低的无病生存长度相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患有癌症的患者的总体生存长度的方法，所述方法包括：测定获自所述样品的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的总体生存长度的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的总体生存长度，其中升高的GP88表达水平与降低的总体生存长度相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患有癌症的患者的复原可能性的方法，所述方法包括：测定获自所述样品的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的复原可能性的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的复原可能性，其中升高的GP88表达水平与降低的复原可能性相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测癌症患者的无进展生存的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低无进展的标准物进行比较，从而预测与所述GP88蛋白表达水平相关的无进展生存，其中升高的GP88表达水平与所述患者中降低的无进展生存相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测癌症患者的降低的无病生存的风险的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示降低的无病生存的较高或较低风险的标准物进行比较，从而预测与所述GP88蛋白表达水平相关的降低的无病生存的风险。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测癌症患者的降低的总体生存的风险的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示降低的总体生存的较高或较低风险的标准物进行比较，从而预测与所述GP88蛋白表达水平相关的降低的总体生存的风险。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患者的复原可能性的方法，所述方法包括：测定获自所述样品的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示癌症的较高或较低的复原可能性的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的复原可能性，其中升高的GP88表达水平与所述患者的降低的复原可能性相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患者中的癌症的复发可能性的方法，所述方法包括：测定获自所述样品的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的癌症复发可能性的标准物进行比较，从而预测与所述GP88表达水平相关的癌症复发可能性，其中升高的GP88表达水平与降低的癌症复发可能性相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患者中的癌症转移可能性的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的癌症转移可能性的标准物进行比较，从而预测与所述GP88蛋白表达水平相关的癌症转移可能性，其中升高的GP88表达水平与患者中升高的癌症转移可能性相关。
本发明的另一个实施方式提供了用于预测患者中的癌症的复发风险的方法，所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88的表达水平，将所述水平与指示健康个体或指示较高或较低的癌症复发风险的标准物进行比较，从而预测与所述GP88蛋白表达水平相关的癌症复发风险，其中升高的GP88表达水平与患者中升高的癌症复发风险相关。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于监测患有癌症的患者的疗程的有效性的方法。该方法包括：(a)在所述治疗之前测定来自所述患者的生物样品中的GP88的第一表达水平；和(b)然后在所述治疗中测定来自所述患者的生物样品中的GP88的第二表达水平。然后，所述GP88的第一表达水平与所述GP88的第二表达水平之间的比较将指征所述治疗的有效性。
本发明的另一个实施方式提供了用于筛选患有癌症的患者以确定肿瘤复发或肿瘤转移的风险的方法。所述方法包括：测定获自所述患者的生物样品中的GP88表达水平，将所述水平与标准物进行比较。发现具有相对于标准物而言升高水平的GP88的患者被归类为更可能遭受肿瘤复发或肿瘤转移。
本发明的另一个优选实施方式提供了用于确定患有癌症的患者的正确疗程的方法。该方法包括：测定获自患者的生物样品中的GP88的表达水平。然后，鉴定具有低水平的GP88表达的第一组患者，该组患者可能需要针对具有较高的生存机会或具有增加的发生肿瘤复发或转移时间的患者的正确治疗。该方法还包括鉴定具有升高的水平的GP88表达的第二组患者，该组患者可能需要针对具有较低的生存机会并更有可能遭受肿瘤复发或转移的患者的正确治疗。
在本发明的另一个实施方式中，提供了用于测定肿瘤发展的早期阶段的GP88表达水平的方法。本领域技术人员熟知肿瘤发展的多个阶段，如在例如Markman 1997,BasicCancer Medicine中所例示。
本发明还涉及用于确定治疗淋巴结阴性乳腺癌的乳房保留手术(乳房肿瘤切除术)的功效的方法，其包括：a)从需要乳房保留手术的个体获得生物样品；b)检测所述生物样品中的GP88表达水平；和c)将所述水平与标准物的水平进行比较以预测所述乳腺癌对乳房保留手术的应答性。
本发明的另一个实施方式提供了用于患有癌症的患者的预后的方法，包括：a)从需要预后的个体获得生物样品；b)检测获自所述患者的生物样品中的GP88表达水平；c)将所述样品就GP88表达水平进行评分；和d)将所述评分与获自对照样品(或标准物)的评分进行比较。
本发明还涉及用于确定抗雌激素治疗的效果的方法，其包括：a)从需要抗雌激素治疗的个体获得生物样品；b)检测所述生物样品中的GP88表达水平；和c)将所述水平与标准物进行比较以预测对抗雌激素治疗的应答性。该方法还可以包括根据上文叙述的方法确定此患者的正确疗程的步骤。
如本文使用的“抗雌激素治疗”涉及给予抗雌激素成分，目的是预防或治疗肿瘤生长。抗雌激素的实例包括雌激素受体拮抗剂或SERM(他莫昔芬和雷洛昔芬)。其它抗雌激素成分包括，芳香化酶抑制剂(例如
Figure BDA0003874217780000152
(阿那曲唑)、
Figure BDA0003874217780000151
)，以及雌激素受体下调剂(例如
Figure BDA0003874217780000153
)。他莫昔芬的抗雌激素效应可能和其与雌激素竞争结合靶组织中的位点的能力相关。其它抗雌激素例如芳香化酶抑制剂，抑制或减少可获得的雌激素的量。
本发明还涉及用于筛选化合物的方法，其包括：a)获得正性或负性地影响GP88表达的能力待筛选的化合物；b)将所述化合物与相关的生物样品接触；和c)测定所述化合物对所述生物样品中的GP88表达水平的效应。优选地，可以通过GP88的抗体与所述样品的结合相对于与标准物的结合之对比来确定所述化合物的效应。
GP88表达水平的测定
可以通过本领域普通技术人员已知的一种或多种方法进行GP88表达的测定。例如，可以通过检测(a)GP88多肽，(b)编码GP88蛋白的mRNA，(c)构成GP88基因的DNA的一部分；或(d)其任意组合，来测定GP88的表达水平。
例如，可以通过使用GP88结合成分测定GP88蛋白的水平来测定GP88的表达水平。可以使用本领域普通技术人员已知的任意方法进行GP88蛋白水平的检测，包括但不限于，化学发光方法、组织化学染色或生物化学检测(即免疫组化测定)、Western印迹分析、流式细胞术、免疫沉淀(或用于非抗体试剂的其等同物)、等离子共振吸附测定，等等。在本发明的一个实施方式中，检测GP88蛋白水平的方法是免疫测定(例如ELISA)，其包括使用至少一种抗体。在本发明的另一个实施方式中，可以使用抗-GP88抗体通过免疫组化方法进行组织样品例如福尔马林固定、石蜡包埋的组织切片中的GP88染色，并测定GP88的表达。
例如，使用OncoStain 88TMIHC试剂盒进行本发明的一个实施方式，该试剂盒使用小鼠单克隆抗体作一抗，抗小鼠IgG抗体作二抗，过氧化物酶封闭剂用于猝灭内源性过氧化物酶活性，以及发色底物。测定GP88基因编码的多肽可以包括测定多肽的片段，其中所述片段来自该基因的转录或翻译变体；或者可替代地，由于翻译后修饰(包括GP88多肽的较大部分的蛋白水解)产生大小差别的多肽。
编码GP88的mRNA的水平的检测也可以作为GP88表达的指征。用于检测mRNA水平的方法是本领域熟知的，包括检测编码GP88的mRNA的杂交或扩增。可以通过使用本领域普通技术人员已知的方法之一在体外或原位(例如组织样品中)通过分析mRNA而进行该检测，如Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley&Sons,1999)；和美国专利号5,882,864等文献中所例示。所检测的GP88 mRNA可以是GP88基因的任意RNA转录本，或其片段。
患者的分类
可以通过将获自患者的生物样品中的GP88表达水平与标准物进行比较而对患者进行分类。例如，在测定样品中的GP88表达水平之后，将所测定的水平与标准物进行比较。该标准物是用于评估患者的生物样品中的GP88表达水平的GP88表达水平。例如，在一个实施方式中，当患者样品中的GP88表达水平高于所述标准物时，患者样品被认为具有升高的GP88表达水平。相反，在另一个实施方式中，当样品中的GP88表达水平低于所述标准物时，该样品被认为具有低的GP88表达水平。
在另一个实施方式中，可以为患者分配与给定生物样品中的GP88表达相关的“评分”。可以在乳腺癌诊断或监测过程中为样品“评分”。可以通过生物样品中的GP88表达水平来确定评分。在一个实施方式中，生物样品中升高的GP88表达水平被给予较高的评分，与此对比，低水平的GP88表达被给予相对较低的评分。还可以通过免疫组化目测样品来确定评分。在另一个实施方式中，更加定量的评分包括测定两个或更多个参数，例如(i)染色强度和(ii)被取样的细胞的染色(阳性的)比例。可以基于这些多个参数分配评分，其反映增加的水平的阳性染色。
因此，在一个实施方式中，可以将获自患者的生物样品中的与GP88表达水平相关的评分与标准物中或用作对照的没有GP88表达、具有低的或升高的GP88表达水平的细胞中的与GP88表达水平相关的评分进行比较。此类比较可以为患者的更好预后提供基础。例如，在一个实施方式中，本发明的方法可以使用0至+3的级别为GP88的表达水平评分，其中0是阴性(无可检测的GP88表达)、1+和2+分别与弱的和弱至中等的染色相关，3+与10％以上的肿瘤细胞中高强度染色相关；并且其中较低的评分指示患者的较佳的预后。
可以使用单变量或多变量分析进行表达多种水平的GP88的患者的预后。这些方法确定一个或多个变性与给定结果之间的相关性的可能性。在一个实施方式中，该方法将确定GP88表达水平(或与另一个变量相关的GP88表达水平)与癌症患者的无病或总体生存之间的相关性的可能性。可以使用用于进行这些分析的本领域普通技术人员熟知的多个方法中的任一个方法。单变量分析的实例是Kaplan-Meir方法或对数秩检验(log-rank test)。多变量分析的实例是Cox比例风险回归模型。本发明的方法还可以包括分析GP88表达水平联同另外的乳腺癌标志物。Cox比率为具有不同水平的GP88表达的患者提供了风险比或无病生存和总体生存的风险性。
使用Kaplan和Meier的方法进行的生存分析是推荐用于癌症试验中的统计技术。其应用是通过分析患者参与研究后的生存时间的分布。该分析以直至参与后给定时间时仍然活着的患者的比例来表示这些。在图形形式中，患者生存比例针对时间的图像具有特征性下降(通常是指数的)，曲线的陡度表示被研究的治疗的功效。生存曲线越浅(shallow)，治疗越有效。Kaplan-Meier分析可用于测定与两种不同治疗相关的生存曲线之间的差异的统计学显著性。
在一个实施方式中，在测定了获自患者的样品中的GP88的表达水平并与标准物进行比较之后，将患者分类为具有一定的无病或总体生存可能性的组。然后，基于该组中的患者的无病或总体生存可能性来确定患者的无病或总体生存的可能性。例如，获自患者的生物样品可能被确定为相对于标准物具有升高水平的GP88表达。然后该患者将被分类为具有升高水平的GP88表达的患者组。由于根据本发明已经发现：表达升高水平的GP88的患者组具有降低长度的无病或总体生存，所以该患有癌症的特定患者将被认为具有降低长度的无病或总体生存。
试剂盒
本发明提供了用于测定生物样品中的GP88表达水平的试剂盒。此类试剂盒将包含用于检测编码GP88的mRNA、GP88多肽或其任意组合或片段的试剂。所述试剂将包括能够特异性结合编码GP88的核酸序列(DNA或RNA)或GP88多肽的一种或多种分子。
试剂盒可以包含用于检测编码GP88的mRNA(正义或反义)的一种或多种核酸试剂。所述一种或多种核酸试剂可用于编码GP88的mRNA的杂交和/或扩增。试剂盒可以包含一对或多对用于扩增编码GP88的mRNA的引物。试剂盒还可以包含源自多种生理状态(例如正常的和转移性进行性的肿瘤)的组织的总mRNA样品，以用作对照。试剂盒还可以包含缓冲液、核苷酸碱基和用于杂交和/或扩增反应的其它成分。每种溶液或成分可以包含于小瓶中或瓶子中，并且所有的小瓶紧密密封在盒子中以用于商业销售。本发明的另一个实施方式包括用于检测生物样品中的编码GP88的mRNA的试剂盒，其包含以升高的亲和性在体外或原位有效结合编码GP88的mRNA的寡核苷酸探针以及用于每个这些探针的容器。
在其它实施方式中，本发明包括用于测定生物样品中的GP88表达水平的试剂盒，其包含一种或多种试剂(agents)，例如，一种或多种特异于一种或多种GP88多肽或片段的抗体。在一个具体实施方式中，所述试剂盒包含一种或多种试剂和一种或多种核酸标志物，其中所述试剂和核酸标志物以适合于进行免疫-聚合酶链式反应测定的方式进行修饰。
本发明的一个优选的实施方式涉及用于测定哺乳动物生物样品中的GP88表达水平的试剂盒，其中所述GP88表达水平是乳腺癌预后的指征，所述试剂盒包含：a)特异性结合GP88或其抗原结合片段的抗体；b)用于检测所述抗体与GP88之间相互作用程度的试剂；c)用于抗原回收的试剂或溶液；和c)阳性和/或阴性对照样品。所述抗体可以直接连接至指征试剂，其中所述指征试剂选自荧光、比色、免疫过氧化物酶和同位素试剂。或者，所述试剂盒还可以包括连接至指征试剂的第二指征抗体，其中所述指征试剂选自荧光、比色、免疫过氧化物酶和同位素试剂。
在一个实施方式中，所述试剂盒包含至少一种一抗(例如抗-GP88单克隆抗体6B3)、至少一种标记的二抗(例如，以检测酶例如HRP标记的抗-人GP88多克隆抗体)和至少一种底物(例如TMB)。或者，所述试剂盒可以包含放射性标记的二抗而不是以酶标记的二抗。所述试剂盒还可以包含用于进行检测测定的即抛型物品(例如微量滴定板、移液管)。
应该理解，根据本文包含的教导，将本发明的教导应用于具体问题或情况将是本领域普通技术人员能力范围内的事情。通过以下非限制性实施例更完善地解释本发明。
实施例1
浸润性导管癌中的GP88表达
本方法是基于以临床病理学变量研究的福尔马林固定的石蜡包埋的人乳房损伤中的GP88染色。在乳腺癌中观察到了细胞质的GP88染色，而在良性乳房上皮中几乎总是阴性的。从203例福尔马林固定的石蜡包埋的活组织检查样品中制备了4-6微米的组织切片。使用抗-人GP88抗体通过免疫组织化学方法进行GP88染色，在正常组织、良性损伤、导管和小叶癌(表1：DCIS：导管原位癌；IDC：浸润性原位癌；LCIS：小叶原位癌；ILC：浸润性小叶癌)中检查了GP88的表达。此外，进行了IDC中的GP88表达与组织学级别、增殖系数(Ki67)、p53、ER和Her-2表达之间的相关性研究。
诊断 N 0 1+ 2+ 3+
良性 26 25(96％) 1(4％) 0 0
DCIS 27 9(33％) 8(30％) 7(26％) 3(11％)
IDC 124 25(20％) 48(39％) 33(27％) 18(15％)
LCIS 12 11(92％) 1(8％) 0 0
ILC 17 8(47％) 6(35％) 3(18％) 0
表1.GP88免疫染色的评分
观察到GP88在ER+和ER-肿瘤中均表达，并且主要在IDC中表达，与组织学级别和Ki67增殖指数具有相关性。
实施例2
ER-、ER+/LN-和ER+/LN+患者的乳腺癌组织中的GP88表达水平的分析
研究设计
以389例乳腺癌病例(关于该临床研究中所考虑的受试者特性，请参见表2)进行临床研究，具体而言是浸润性导管癌组织样品，其储存为福尔马林固定的石蜡包埋的块(blocks)，获自3个组织库。入选标准如下：诊断的年和年龄，肿瘤特征：雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)、肿瘤级别、肿瘤大小、结(nodal)的状态、最后一次随访时的状态、总体生存(OS)、复发状态、至发生首次复发的时间、治疗(ER+、LN0他莫昔芬)。将符合入选标准的病例包括进来(pulled)，以制备用于研究的载玻片。
研究方法
对于每个病例，来自库处理地点的组织学实验室新鲜切取4-6微米的组织切片，放置到带正电荷的显微镜载玻片上。由负责收集组织块(pulling the blocks)的病理学家检查载玻片上的切片是否足够。通过以Oncostain 88TM试剂盒将载玻片染色来测定GP88的表达并由经认证的病理学家评分。
材料和方法
使用Oncostain 88TM试剂盒执行本方法，该试剂盒使用小鼠单克隆抗体作一抗，抗-小鼠IgG抗体作二抗，过氧化物酶封闭剂用于猝灭内源性过氧化物酶活性，以及发色底物。小鼠一抗与乳腺癌细胞的细胞质中表达的GP88结合。该步骤之后，加入过氧化物酶缀合的二抗，其与一抗结合。然后以最佳稀释的发色底物显示特异性的一抗-二抗复合物，负染并盖上盖玻片。使用光学显微镜分析结果。
结果
分析组织样品的染色式样，并进行分类(即评分)，如表3所示。就细胞质染色而言，在超过10％的肿瘤细胞中观察到GP88的表达水平。在少于10％的肿瘤细胞中没有染色或观察到的弱的染色被评分为“0”。在超过10％的肿瘤细胞中观察到的弱的细胞质染色被评分为“1+”，在超过10％的肿瘤细胞中观察到的弱至中等的细胞质染色被评分为“2+”，在超过10％的肿瘤细胞中观察到的强烈的细胞质染色被评分为“3+”。图6显示了通过间接的免疫组化染色方法获得的抗-GP88与福尔马林固定的石蜡包埋的乳腺癌活组织检查样品的反应活性和染色式样。
将以上获得的染色式样进行进一步判读以辅助评价乳腺肿瘤的预后(见下表4)。小于3+的评分(即0,1+和2+)被分类为GP88低风险组并且被认为具有降低的或较小的复发或死亡风险；3+的评分被分类为GP88升高的风险组并且被认为具有增加的或较高的复发或死亡风险。
统计学设计和分析
由生物统计学家进行结果的统计学分析。统计学分析设计是基于通过其预测无病生存和/或总体生存的能力评估测试的效能。其设计为使用对数秩检验来确定诊断组对的性质(use the log-rank test for identity of pairs of diagnostic groups)，通过Cox比例风险模型来定量根据淋巴结状态区分的ER+群体中的风险(见下表5；OS＝总体生存，DFS＝无病生存，LNn＝淋巴结阴性；LNp＝淋巴结阳性)。此外，通过Kaplan-Meier曲线确定GP883+组和GP88<3+(GP880、1和2)组的总体和无病生存的生存函数。
在ER-患者中，GP88显示出与总体死亡率的统计学上显著的相关性(图1)。数据显示：具有ER-癌症、表达升高的GP88水平(GP883+)的患者比具有ER-癌症、具有较低GP88表达(GP880、1+或2+)的患者具有更低的总体生存概率。
升高的GP88表达(3+)是ER+/LN-群体中肿瘤复发的风险的升高的统计学上显著的指征，并且与总体死亡率显著相关。升高的GP88表达水平(细胞质染色中具有3+评分的GP88升高的风险组)与降低的无病生存(图2)和降低的总体生存(图3)相关。
升高的GP88表达(3+)也是ER+/LN+群体中复发风险和总体死亡率的升高的统计学上显著的指征。升高的GP88表达水平(细胞质染色中具有3+评分的GP88升高的风险组)与降低的无病生存(图4)和降低的总体生存(图5)相关。
Figure BDA0003874217780000211
Figure BDA0003874217780000221
患者的年龄中位数＝56(26-92)
表2：受试者特征
Figure BDA0003874217780000222
表3：染色式样评分
Figure BDA0003874217780000223
表4：染色式样的判读
实施例3
获自乳腺癌患者的生物液体中GP88表达水平的分析
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)一式三份地测定人血清样品中GP88的浓度。将重组GP88稀释于30％甘油+1％奶(milk)-PBS的溶液中，制备浓度为0、0.1、0.25、0.5、1、3、10和20ng/ml的标准GP88样品。使用10μg/ml的抗-人GP88单克隆抗体6B3(0.78mg/ml 6B3抗体溶于磷酸缓冲液(PBS)中)包被微量滴定板上的100个微孔，并在4℃温育过夜。以PBS洗涤孔，然后向每个孔中加入浓度为3μg/ml的抗-人PCDGF多克隆(IgG级分)，在37℃温育1.5小时。以PBS洗涤孔，然后向每个孔中加入检测抗体(辣根过氧化物酶(HRP)-山羊-兔子-IgG)。加入TMB(底物)并将样品温育1小时。使用ELISA分光光度计在620nm的波长测定样品的光密度。将标准GP88样品的光密度(y-轴)针对每个样品中的GP88的量(x-轴)作图，产生标准曲线(图7)。通过测定光密度并使用该标准曲线来确定未知样品中的GP88浓度(图6)以测定GP88浓度。
对具有乳腺癌的无疾病迹象的和具有进行性疾病的患者测定GP88的循环水平。观察到(图8)无疾病迹象的乳腺癌患者(BC Pts)的血清中的GP88水平(基线)处于健康个体的范围内。然而，具有进行性疾病的BC Pts具有显著较高的GP88循环水平。
研究还显示：无疾病迹象的乳腺癌患者中的GP88表达的循环水平保持在低水平并且处于健康个体的范围内。对于无疾病迹象的患者，在延长的时间段(即4年：2004年10月至2008年10月，如图9所示)内测定GP88表达水平。结果显示：具有早期疾病(2期)的无疾病迹象的患者维持稳定的GP88水平，该水平处于正常个体的范围内。
对于在早期(2期)表达升高水平的GP88而随着时间(在本例中为大约1.5年：从2006年1月至2007年5月)复发为4期疾病的患者也观察了其GP88循环水平。数据显示(图10)这些患者在晚期表达异常升高的GP88水平。
升高的GP88水平与生存丧失相关
使用标准ELISA程序测定了两位死于乳腺癌的患者血清中的GP88水平，观察到升高水平的GP88维持数周导致生存的降低。这两位患者在他们被确定为无疾病迹象(NED)时结束了研究，其中GP88水平为低水平并且处于正常个体范围内(大约20单位—20ng/ml)。然而，随着时间的进行，GP88的水平达到了160-200单位(160-200ng/ml)，在该点，患者1在1周内死亡(图11A)，患者2在3周内死亡(图11B)。
当测定乳腺癌患者血浆中的GP88表达水平时，观察到了相似的结果，即，与健康个体相比，观察到升高的GP88水平。
虽然通过参考所公开的实施方式描述了本发明，但是应该理解，可以不脱离本发明的精神而做出多种修饰。因此，本发明仅由以下权利要求限定。
实施例4
验证GP88是肺癌的预后因子的研究
如以上实施例2的材料和方法中所描述，使用Oncostain 88TM IHC试剂盒在组织微阵列中测定的GP88表达证明了在来自鳞状细胞癌和腺癌的肺癌组织中的GP88表达，以及在人类正常组织(包括人类正常肺组织)中没有GP88的表达(下表5)。
Figure BDA0003874217780000241
表5：正常和肺癌组织中GP88染色的分析
实施例5
肺癌组织中GP88表达水平的分析
为了确定I/II期肺癌组织中增加的GP88水平是否与肺癌患者中减少的无病生存(DFS)相关，计算了85例可切除的I/II期NSCLC中的GP88表达，提供了临床和结果数据。使用Oncostain 88TM IHC试剂盒将组织染色，由委员会认证的病理学家就GP88染色对得到的染色的载玻片进行评分。
使用Kaplan-Meier图分析GP88评分和生存数据之后，观察到随着GP88水平的升高，DFS的统计学上显著的降低。这是通过使用SAS PROC PHREG，将GP88水平处理为复发的区间标度(interval-scaled)预测因子，通过拟合Cox比例风险模型而正规地测定的。这产生了GP88与复发之间的高度显著的相关性(P＝0.0091)。GP88的系数是0.676，说明GP88的每个单位的升高对应于复发风险大约加倍(图14)。
同样这85个病例中GP88表达与总体生存的相关性表明：对于GP88评分的每个增加，有74％的死亡风险的增加(图15)。这些数据证明，与乳腺癌类似，GP88的表达可用作肺癌例如早期NSCLC中的复发风险预测因子。
实施例6
获自肺癌患者的生物液体中GP88表达水平的分析
通过酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定了获自肺癌患者和健康非肺癌患者的人血清样品中GP88的浓度。数据显示于下表6中。
Figure BDA0003874217780000251
*2位患者在最初测定后进展达到120ng/ml
表7：肺癌和健康非肺癌患者中GP88血清水平的比较
表7中的数据表明：血清GP88可用作肺癌的预测指示剂。此外，使用比较型盒须图(box and whisker plot)进行的数据分析显示：在获自肺癌和健康非肺癌患者的样品中存在明显的差异。Wilcoxon秩和检验确认了该视觉印象，产生了大约为0.0004的P值。
虽然为了清楚和理解的目的以详细的方式描述了上述发明，但是本领域技术人员在阅读了本公开后将认识到可以不脱离本发明的真实范围和随附的权利要求而作出形式和细节上的多种变化。本文引用的所有专利和公开物通过引用全文并入本文。

Claims (9)

1.GP88结合成分在制备鉴定癌症患者的降低的总体生存的风险的试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1的应用，其中所述癌症选自乳腺癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、脑癌、卵巢癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、造血系统（淋巴和骨髓）癌、胃肠（例如结肠）癌、泌尿生殖道（例如肾、尿道上皮细胞）癌、子宫癌、头颈癌、鼻咽癌、小细胞癌、非小细胞癌、尤因瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
3.根据权利要求1的应用，其中所述GP88结合成分选自抗-GP88抗体或其抗原结合片段。
4.GP88结合成分在制备鉴定癌症患者的降低的无病生存长度的增加的风险的试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4的应用，其中所述癌症选自乳腺癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、脑癌、卵巢癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、造血系统（淋巴和骨髓）癌、胃肠（例如结肠）癌、泌尿生殖道（例如肾、尿道上皮细胞）癌、子宫癌、头颈癌、鼻咽癌、小细胞癌、非小细胞癌、尤因瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
6.根据权利要求4的应用，其中所述GP88结合成分选自抗-GP88抗体或其抗原结合片段。
7.GP88结合成分在制备鉴定癌症患者中的增加的转移的风险的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7的应用，其中所述癌症选自乳腺癌、肝癌、肾癌、睾丸癌、脑癌、卵巢癌、皮肤癌、肺癌、前列腺癌、甲状腺癌、胰腺癌、子宫颈癌、结肠直肠癌、胃癌、肠癌、膀胱癌、造血系统（淋巴和骨髓）癌、胃肠（例如结肠）癌、泌尿生殖道（例如肾、尿道上皮细胞）癌、子宫癌、头颈癌、鼻咽癌、小细胞癌、非小细胞癌、尤因瘤、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌、黑素瘤、成神经细胞瘤和成视网膜细胞瘤。
9.根据权利要求7的应用，其中所述GP88结合成分选自抗-GP88抗体或其抗原结合片段。
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