ES2624261T3 - Procedimientos de diagnostico de cáncer y de determinación de la supervivencia global y la supervivencia sin enfermedad de pacientes con cáncer - Google Patents

Procedimientos de diagnostico de cáncer y de determinación de la supervivencia global y la supervivencia sin enfermedad de pacientes con cáncer Download PDF

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Abstract

Un procedimiento de controla de la eficacia de un curso de tratamiento para un paciente que padece carcinoma de pulmón no microcítico que comprende: determinar un primer nivel de expresión de GP88 en una muestra biológica de dicho paciente antes de dicho tratamiento; y determinar posteriormente un segundo nivel de expresión de GP88 en una muestra biológica de dicho paciente durante dicho tratamiento, en el que la determinación del nivel de expresión de GP88 comprende la puesta en contacto con una composición de unión a GP88, y comparar dicho primer nivel de expresión de GP88 con dicho segundo nivel de expresión de GP88 para indicar la eficacia de dicho tratamiento, en el que un nivel elevado de GP88 en la segunda muestra en comparación con la primera muestra indica un tratamiento ineficaz.

Description

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DESCRIPCION
Procedimientos de diagnostico de cancer y de determinacion de la supervivencia global y la supervivencia sin enfermedad de pacientes con cancer
Antecedentes de la invencion
Campo de la invencion
La solicitud se refiere de manera general a procedimientos de diagnostico y control, y a ensayos para el cancer y kits que pueden usarse en tales procedimientos. Mas en particular, la solicitud se refiere al uso de la expresion de GP88 para predecir la probabilidad de metastasis, la duracion de la supervivencia sin enfermedad y la duracion de la supervivencia global de los pacientes de cancer y el resultado de las terapias contra el cancer.
La invencion es tal como se define en las reivindicaciones.
Tecnica relacionada
El cancer de mama es la forma principal de cancer en las mujeres y la segunda causa principal despues del cancer de pulmon de las muertes por cancer en los Estados Unidos. En el mundo industrializado, aproximadamente una mujer de cada nueve puede esperar desarrollar cancer de mama en su vida. En los Estados Unidos, la incidencia anual de cancer de mama es de aproximadamente 180.000 nuevos casos y aproximadamente 48.000 muertes cada ano (Parkin 1998; Apantaku 2000). Aproximadamente dos millones de mujeres que viven solo en Estados Unidos se han diagnosticado de cancer de mama en algun momento de sus vidas. A pesar de las continuas mejoras en la comprension de la enfermedad, el cancer de mama ha permanecido en gran medida resistente a la intervencion medica. La mayona de las iniciativas clmicas se centran en el diagnostico precoz, seguido de formas las convencionales de intervencion, en particular, la cirugfa, la radiacion, la supresion hormonal, y la quimioterapia. Tales intervenciones tienen un exito limitado, particularmente en pacientes en los que el tumor ha experimentado metastasis. Existe la apremiante necesidad de mejorar el arsenal de herramientas de diagnostico y los procedimientos disponibles para proporcionar informacion mas precisa y mas eficaz que permita un tratamiento satisfactorio de la manera menos invasiva posible. Espedficamente, los marcadores que pueden identificar pacientes con muy bajo riesgo de reaparicion de la enfermedad, metastasis, y muerte tras la cirugfa inicial, reducinan la extension del exceso de tratamiento con regfmenes complementarios caros y potencialmente toxicos. La presente solicitud satisface esa necesidad proporcionando nuevos procedimientos y marcadores para controlar el cancer de mama.
Entre el amplio grupo de pacientes de cancer de mama con tumores localizados y sin metastasis detectable en los ganglios linfaticos proximos, muchos se curaran mediante cirugfa debido a que los tumores no han metastatizado en los tejidos circundantes y en los ganglios linfaticos. Sin embargo, otros tienen una enfermedad metastasica oculta y podnan beneficiarse de la radiacion complementaria o de una terapia antihormonal adyuvante o quimioterapia. Existe una necesidad de marcadores de diagnostico para discriminar entre tumores con bajo riesgo de metastasis metastasica y aquellos con un riesgo mas alto. Los marcadores tumorales que denotan un bajo riesgo de enfermedad metastasica pueden afectar de forma directa a la decision terapeutica sobre usar la radioterapia complementaria, o la terapia hormonal adyuvante o quimioterapia. Ademas, tales marcadores tumorales tambien pueden afectar la recomendacion del cirujano sobre si elegir una cirugfa conservadora de mama o una mastectoirna.
Diagnostico del cancer de mama
El diagnostico definitivo de todos los tipos de enfermedad de mama es a base de una evaluacion histologica de muestras de tejido usando el microscopio optico. Los criterios histologicos usados para definir la mayona de las lesiones de mama son tradicionales pero, sin embargo, son bastante reproducibles para la identificacion de canceres de mama totalmente invasivos. Los logros recientes incluyen la identificacion de un pequeno numero de biomarcadores basados en tejidos que son utiles para predecir el resultado clmico y la respuesta a la terapia (por ejemplo, fraccion de fase S, receptores de estrogeno y progesterona, c- erbB-2) y el descubrimiento de genes (BRCA-I y BRC A-2) asociados con el riesgo familiar de canceres de mama (Dahiya y Deng, 1998; Fitzgibbons, Page y col. 2000).
La base molecular del cancer aun se esta determinando. En el cancer de mama, los receptores para estrogeno y progesterona se relacionan con el estado de diferenciacion de las celulas del epitelio mamario y, en determinados casos, tienen un valor pronostico para el resultado de la enfermedad. Se sabe que el estrogeno es un estimulador principal para el crecimiento de celulas de cancer de mama humano positivas para receptores de estrogeno (RE) in vivo e in vitro. Aunque para el establecimiento y proliferacion de tumores de mama inicialmente se requiere estrogeno, el desarrollo de tumores independientes de estrogeno durante el transcurso del cancer de mama es indicativo de un mal pronostico. Se ha postulado que el efecto mitogenico del estrogeno en el cancer de mama esta mediado, al menos en parte, por factores de crecimiento, incluyendo factores de crecimiento regulados por estrogeno. Asf pues, la identificacion y caracterizacion de genes sensibles a estrogenos, en particular, de genes que codifican factores de crecimiento, contribuye a la comprension de los efectos del estrogeno en celulas de cancer de mama.
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Sin embargo, el diagnostico del cancer de mama aun requiere algun tipo de procedimiento de biopsia. Ademas, los procedimientos de diagnostico y pronostico actuales no pueden distinguir de forma absoluta los canceres de mama que se pueden tratar solo mediante cirugfa de aquellos es probable que reaparezcan o que ya tienen metastasis debido al proceso de metastasis. Como resultado, al menos el 50 por ciento de los pacientes con cancer de mama se tratan con alguna forma de terapia adyuvante. Ademas, los procedimientos disponibles son inadecuados para predecir la respuesta de los canceres de mama a tipos espedficos de terapias adyuvantes.
Las decisiones sobre el tratamiento para los individuos aquejados de cancer de mama se basan con frecuencia en el numero de ganglios linfaticos axilares implicados en la enfermedad, el estado del receptores de estrogeno y del receptor de progesterona (RP), el tamano del tumor primario y la fase de la enfermedad en el momento del diagnostico (Tandon, Clark y col. 1989). Sin embargo, incluso con esta diversidad de factores, actualmente no es posible predecir de manera precisa el transcurso de la enfermedad. Existe claramente una necesidad de identificar nuevos marcadores para separar pacientes con buen pronostico, quienes podnan no necesitar una terapia complementaria mas alla de la extraccion quirurgica del tumor de mama maligno, de aquellos cuyo cancer es mas probable que reaparezca y que podnan beneficiarse de formas de tratamiento adicionales y mas exhaustivas.
Sigue habiendo deficiencias en la tecnica con respecto a la identificacion de marcadores vinculados a la progresion del cancer de mama, al desarrollo de procedimientos de diagnostico para controlar la progresion de la enfermedad y al desarrollo de procedimientos y composiciones terapeuticos para tratar las enfermedades y canceres de mama. La identificacion de marcadores que se expresan o activan de forma diferencial en el cancer de mama sena de una importancia considerable en el desarrollo de un procedimiento rapido y economico para mejorar el diagnostico del cancer de mama, y para predecir el comportamiento del tumor con respecto al pronostico del paciente y la sensibilidad a opciones terapeuticas individuales.
GP88
La glucoprotema de 88 kDa factor de crecimiento derivado de celulas PC de (PCDGF, sigla del ingles PC cell- derived growth factor) es un factor de crecimiento autocrino, aislado en primer lugar de las celulas PC de teratoma de raton altamente tumorigenicas. En la tecnica, el PCDGF tambien se conoce como GP88, precursor de granulina- epitelina (GEP, sigla del ingles granulin-epithelin precursor), precursor de la granulina, progranulina, precursor de la epitelina, proepitelina (PEPI) y acrogranina (denominado en lo sucesivo como GP88), es el miembro mas grande de la familia de la granulina/epitelina de los moduladores de crecimiento de polipeptidos ricos en cistema. Se ha descrito que GP88 estimula la proliferacion y supervivencia de varios tipos celulares de origen mesenquimatoso y epitelial mediante la estimulacion de las rutas de la MAP quinasa, la PI-3 quinasa y la FAK quinasa. De forma interesante, la expresion aumentada de GP88 se encontro en varias lmeas celulares de cancer y/o tejidos tumorales que incluyen el cancer de mama, cancer de ovario, carcinoma de celulas renales, mieloma multiple y glioblastoma.
En celulas de cancer de mama, se ha demostrado que GP88 desempena un papel cntico en la tumorigenesis. La expresion aumentada de GP88 se correlaciona de forma positiva con la adquisicion de un crecimiento independiente de estrogenos, resistencia al tamoxifeno y tumorigenicidad. La inhibicion de la expresion de GP88 mediante la transfeccion de ADNc antisentido en celulas MDA-MB-468 dio como resultado una inhibicion completa del crecimiento tumoral en ratones desnudos. Ademas, se ha demostrado que GP88 previene el efecto apoptotico del tamoxifeno en celulas de cancer de mama positivas para el receptores de estrogeno. Los estudios patologicos en biopsias de carcinoma de mama revelaron que GP88 se expresaba en el 80 % de los carcinomas ductales invasivos en correlacion con marcadores de mal pronostico tales como la clasificacion del tumor, la expresion de p53 y el mdice Ki67, mientras que las lesiones benignas eran principalmente negativas. Ademas, los estudios patologicos en tumores de ovario indicaron que GP88 se expresaba de forma elevada en tumores de ovario epiteliales invasivos, cuando se comparaban con tumores con bajo potencial maligno. Estos estudios demuestran que GP88 desempena un papel en la invasion ademas de estimular la proliferacion de celulas tumorales.
Las granulinas/epitelinas ("grn/epi") son polipeptidos de 6 kDa y pertenecen a una nueva familia de polipeptidos ricos en cistemas dobles. La patente de Estados Unidos n.° 5.416.192 (Shoyab y col.) se dirige a las epitelinas de 6 kDa, en particular, la epitelina 1 y la epitelina 2. De acuerdo con Shoyab, ambas epitelinas estan codificadas por un precursor comun de 63,5 kDa, que se procesa en formas mas pequenas tan pronto como se sintetiza, de manera que los unicos productos naturales que se hallan en las muestras biologicas son las formas de 6 kDa. GP88 es el precursor de la epitelina, y Shoyab y col. explican que GP88 es biologicamente inactivo.
Al contrario de las ensenanzas de Shoyab y col., el laboratorio de los presentes inventores ha demostrado que el precursor no siempre se procesa tan pronto como se sintetiza. Los estudios han demostrado que el precursor (es decir, GP88) se secreta, de hecho, como una glucoprotema de 88 kDa con un resto de carbohidrato de 20 kDa unido en N. El analisis de la secuencia N-terminal de GP88 indica que GP88 comienza en el aminoacido 17 del precursor grn/epi, lo que demuestra que los primeros 17 aminoacidos de la secuencia de la protema, deducida a partir del ADNc precursor, se corresponden con un peptido senal compatible con el direccionamiento para la localizacion en la membrana o para la secrecion. Al contrario de las ensenanzas de Shoyab y col., GP88 es biologicamente activo y tiene una actividad promotora del crecimiento, en particular como un factor de crecimiento autocrino para las celulas productoras.
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Sigue existiendo una necesidad en la tecnica de marcadores vinculados a la progresion de los canceres (por ejemplo, canceres de mama y de pulmon) y de procedimientos de diagnostico para predecir la progresion de la enfermedad a base de tales marcadores. Estas necesidades y otras se satisfacen mediante la presente solicitud.
Sumario de la invencion
La invencion es tal como se expone en las reivindicaciones.
Los inventores han descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad de metastasis aumentada, una supervivencia global disminuida y una supervivencia sin enfermedad disminuida, de pacientes aquejados de cancer (por ejemplo, cancer de mama y de pulmon). Esta asociacion fue particularmente fuerte para los canceres de mama negativos para receptores de estrogeno (RE-), positivos para receptores de estrogeno y negativos para ganglios linfaticos (RE+/GL-), y positivos para receptores de estrogeno y positivos ganglios linfaticos (RE+/GL+). Tal asociacion no se conocfa antes del descubrimiento de los inventores. Los inventores demuestran que la presencia de la expresion elevada de GP88 en cancer de mama humano (en particular, un carcinoma ductal invasivo) se asocia con una alta probabilidad aumentada de metastasis, una supervivencia sin enfermedad y global disminuida, y, por lo tanto, que la expresion de GP88 es un marcador nuevo y novedoso de pronostico de la progresion del cancer de mama. Los niveles elevados de la expresion de GP88 en el(los) tumor(es) primario(s) de las pacientes es un fuerte factor pronostico positivo.
Los inventores demuestran que la presencia de una expresion elevada de GP88 en cancer de pulmon humano (en particular, en el carcinoma de pulmon no microcftico(CPNMNSCLC)), se asocia con una probabilidad aumentada de metastasis, una supervivencia sin enfermedad y global disminuida, y, por lo tanto, la expresion de GP88 es un marcador nuevo y novedoso de pronostico de la progresion del cancer de pulmon. Los niveles elevados de la expresion de GP88 en el(los) tumor(es) primario(s) de las pacientes es un fuerte factor pronostico positivo.
Los niveles de expresion de GP88 se pueden analizar usando cualquier tecnica conocida por los expertos en la materia, por ejemplo, con anticuerpos u otras composiciones que tengan la capacidad de unirse a GP88 (por ejemplo, ligandos, etc.,). Asf pues, el analisis de la expresion de GP88 anade un nuevo nivel de informacion a los marcadores actuales de cancer (por ejemplo, cancer de mama y de pulmon) y es un marcador molecular/bioqmmico de pronostico fiable para el cancer en muestras de pacientes aquejados de cancer. De forma adicional, el control de los niveles de expresion de GP88 es predictivo del resultado de las estrategias terapeuticas eficaces para pacientes con cancer de mama.
En conformidad con la presente divulgacion, se proporcionan procedimientos para el pronostico de la duracion de la supervivencia sin enfermedad o global en un paciente que padece cancer. En un aspecto de la divulgacion, se ha descubierto que los elevados niveles de expresion de GP88 muestran una correlacion inesperada y sorprendentemente elevada con la duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad y/o global.
Asf pues, la presente divulgacion proporciona de forma ventajosa un avance significativo en el tratamiento del cancer debido a que la temprana identificacion de pacientes en riesgo de reaparicion de tumor o de metastasis permitira un tratamiento agresivo temprano, con un potencial de supervivencia significativamente potenciado.
Como alternativa, la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia sin enfermedad y global; predecir la supervivencia sin progresion, predecir la supervivencia sin episodios, predecir el riesgo de una supervivencia sin enfermedad o global disminuida, predecir la probabilidad de recuperacion de un paciente que padece cancer; predecir la probabilidad de reaparicion del cancer y/o de metastasis en un individuo que tiene un tumor canceroso; predecir el riesgo de reaparicion del cancer, procedimientos para explorar a un paciente que padece cancer, para determinar el riesgo de metastasis tumoral; procedimientos para determinar el curso adecuado de un tratamiento para un paciente que padece cancer; procedimientos para controlar la eficacia de un curso de tratamiento para un paciente que padece cancer y kits para su uso en la practica de los procedimientos desvelados.
La invencion proporciona procedimientos para controlar la eficacia de un curso de tratamiento tal como se expone en las reivindicaciones.
Breve descripcion de las figuras
La FIG. 1 muestra las curvas de Kaplan-Meier que se generaron para los pacientes RE- tras una clasificacion de pronostico basada en la tincion con anticuerpo anti-GP88.
La Fig. 2 muestra las curvas de Kaplan-Meier que se generaron para los pacientes RE+/GL- tras una clasificacion de pronostico de la supervivencia sin enfermedad basada en la tincion con anticuerpo anti-GP88.
La FIG. 3 muestra las curvas de Kaplan-Meier que se generaron para los pacientes RE+/GL- tras una clasificacion de pronostico de la supervivencia global basada en la tincion con anticuerpo anti-GP88.
La Fig. 4 muestra las curvas de Kaplan-Meier que se generaron para los pacientes RE+/GL+ tras una
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clasificacion de pronostico de la supervivencia sin enfermedad basada en la tincion con anticuerpo anti-GP88.
La FIG. 5 muestra las curvas de Kaplan-Meier que se generaron para los pacientes RE+/GL+ tras una clasificacion de pronostico de la supervivencia global basada en la tincion con anticuerpo anti-GP88.
La FIG. 6 muestra la deteccion inmunohistoqmmica de diversos niveles de expresion de GP88 en tejido normal y de cancer de mama usando un anticuerpo anti-GP88.
La FIG. 7 es un grafico que muestra la densidad optica (eje y) de muestras que contienen cantidades conocidas de GP88 (eje x). El grafico puede usarse como una referencia para determinar la concentracion de GP88 en una muestra de fluido biologico tal como suero sangumeo.
La FIG. 8 muestra el nivel en circulacion de GP88 para pacientes de cancer de mama (Ptes. de CM) que no tienen evidencia de enfermedad y que tienen enfermedad progresiva.
La FIG. 9 muestra el nivel de GP88 para pacientes de cancer de mama con enfermedad de fase temprana (fase 2) que no tienen evidencia de enfermedad.
La FIG. 10 muestra el nivel de GP88 cuando los pacientes que tienen una enfermedad de fase temprana recaen hasta la fase 4 (enfermedad metastasica).
La FIG. 11 muestra que el mantenimiento de un nivel de GP88 elevado durante varias semanas conduce a una disminucion de la supervivencia de (A) el paciente 1 y (B) el paciente 2.
Las FIG. 12A-C muestran la secuencia de nucleotidos y de aminoacidos deducida de GP88 de raton.
La Figura 13A muestra la secuencia de nucleotidos del ADNc de GP88 humana.
La Figura 13B muestra la secuencia de aminoacidos de GP88 humana.
La Figura 14 muestra las puntuaciones de la tincion de GP88 en tejido incluido en parafina, fijado con formalina (IPFF) de biopsia de cancer de pulmon no microdtico, ajustadas para la supervivencia sin enfermedad (SSE), lo que revela que la expresion de GP88 aumentada se correlaciona con una SSE disminuida. El analisis por Biostat mostro una fuerte relacion entre GP88 y la recidiva (p=0,0091).
La FIG. 15 muestra las puntuaciones de la tincion de GP88 en tejido IPFF de biopsia de CPNM de Fase1 y Fase 2, ajustadas para la supervivencia global (SG). El analisis por Biostat revelo una fuerte relacion entre GP88 y la muerte (p=0,0038). Cada unidad de aumento de GP88 se asocia con un aumento del riesgo de muerte del 65 % al 83 %.
Descripcion detallada de la invencion
En conformidad con la presente divulgacion, se proporcionan procedimientos para el pronostico de un paciente aquejado de cancer, que comprenden determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente.
En un aspecto, el procedimiento puede comprender poner en contacto dicha muestra biologica con una composicion que se une a GP88.
En otro aspecto, el procedimiento puede comprender adicionalmente comparar los niveles de expresion de GP88 en dicha muestra biologica con un patron y proporcionar de este modo un pronostico asociado con dichos niveles de expresion de GP88 determinados.
Por ejemplo, en un aspecto de la divulgacion, se ha descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con pacientes que tienen una duracion disminuida de la supervivencia.
Por ejemplo, en una realizacion de la invencion, se ha descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con pacientes que tienen una duracion disminuida de la supervivencia global.
En otra realizacion, se ha descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con pacientes que tienen una duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad.
En una realizacion de la invencion, se ha descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con pacientes que tienen una duracion disminuida de la supervivencia sin progresion.
En otra realizacion, se ha descubierto que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con pacientes que tienen una duracion disminuida de la supervivencia sin episodios.
Los niveles de expresion de GP88 pueden utilizarse como el unico factor para la valoracion del estado de la enfermedad, o junto con los factores adicionales, que incluyen, en el caso ilustrativo del cancer de mama, el estado
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de los ganglios linfaticos, el estado de los receptores de estrogeno y similares.
Los procedimientos desvelados son utiles en el pronostico de individuos con enfermedades neoplasicas, incluyendo tanto tumores solidos como canceres hematopoyeticos. Las enfermedades neoplasicas ejemplares incluyen carcinomas, tales como adenocarcinomas y melanomas; y sarcomas, tales como diversas leucemias o linfomas. Son de particular interes los canceres de mama, de tftgado, de rinon, de testfculo, cerebral, de ovario, de piel, de pulmon, de prostata, de tiroides, de pancreas, de cuello de utero, colorrectal, de estomago, de intestino, de vejiga, hematopoyetico (linfoide y mieloide), gastrointestinal (por ejemplo, de colon), del tracto genitourinario (por ejemplo, renal, de celulas uroteliales), uterino, de cabeza y cuello y nasofarmgeo; en particular el cancer de mama, de forma mas particular carcinoma ductal invasivo. Aun otros ejemplos adicionales de tumores incluyen tumores benignos que incluyen, pero sin limitacion, hemangiomas, neuromas acusticos, neurofibromas, tracomas y granulomas piogenicos; otras neoplasias tales como la mayona de los canceres rectales, carcinoma de las celulas renales, carcinoma del pulmon no microcftico, cancer del intestino delgado y cancer del esofago. Aun otros ejemplos adicionales de tumores incluyen: fibrosarcoma, mixosarcoma, liposarcoma, condrosarcoma, sarcoma osteogenico, cordoma, angiosarcoma, endoteliosarcoma, linfangiosarcoma, linfangioendoteliosarcoma, sinovioma, mesotelioma, tumor de Ewing, liomiosarcoma, rabdomiosarcoma, carcinomas del sistema gastrointestinal, carcinoma de colon, carcinomas del sistema genitourinario, carcinoma escamoso, carcinoma de celulas basales, adenocarcinoma, carcinoma de las glandulas sudonparas, carcinoma de las glandulas sebaceas, carcinoma papilar, adenocarcinomas papilares, cistadenocarcinoma, carcinoma medular, carcinoma broncogenico, carcinoma de celulas renales, hepatoma, carcinoma del conducto biliar, coriocarcinoma, seminoma, carcinoma embrionario, tumor de Wilms, cancer de cuello de utero, carcinomas del sistema endocrino, tumor testicular, carcinoma de pulmon, carcinoma de pulmon microcftico, carcinoma del pulmon no microcftico, carcinoma de vejiga, carcinoma epitelial, glioma, astrocitoma, meduloblastoma, craniofaringioma, ependimoma, pinealoma, hemangioblastoma, neuroma acustico, oligodendroglioma, meningioma, melanoma, neuroblastoma y retinoblastoma.
"Pronostico", tal como se usa en la presente solicitud, significa la probabilidad de recuperacion de una enfermedad o la prediccion del probable desarrollo o resultado de una enfermedad, incluyendo, pero sin limitacion, predecir la duracion de la supervivencia global, la duracion de la supervivencia sin enfermedad, la supervivencia sin progresion, la supervivencia sin episodios, la probabilidad de reaparicion del cancer en un paciente y la probabilidad de metastasis tumoral.
La frase "supervivencia global" es bien conocida para un experto en la materia y se refiere al destino del paciente tras su diagnostico, a pesar de la posibilidad de que el motivo de muerte de un paciente no se deba directamente a los efectos del cancer. La frase "supervivencia sin enfermedad" es bien conocida para un experto en la materia y significa vivir sin enfermedad controlada. Por ejemplo, si la expresion de GP88 se usa para diagnosticar o controlar el cancer de mama, la supervivencia sin enfermedad significana sin cancer de mama detectable. La frase "probabilidad de recuperacion" es bien conocida para un experto en la materia y se refiere a la probabilidad de desaparicion del tumor o la ausencia de reaparicion del tumor, lo que da como resultado la recuperacion del paciente posterior a un diagnostico de cancer, en el que la probabilidad se determina de acuerdo con el procedimiento de la invencion. La frase "probabilidad de reaparicion" es bien conocida para un experto en la materia y se refiere a la probabilidad de reaparicion del tumor o metastasis en un paciente posterior a un diagnostico de cancer, en el que la probabilidad se determina de acuerdo con el procedimiento de la invencion. La frase "supervivencia sin episodios" es bien conocida para un experto en la materia y significa vivir sin la aparicion de un grupo particular de episodios definidos (por ejemplo, la progresion del cancer) tras una accion en particular (por ejemplo, el tratamiento). La frase "supervivencia sin progresion" es bien conocida para un experto en la materia y se refiere a la duracion de tiempo durante y despues del tratamiento en que un paciente esta viviendo con una enfermedad que no empeora, y puede usarse en un estudio o ensayo cftnico para ayudar a averiguar como de bien esta funcionando un tratamiento. El termino "metastasis" es bien conocido para un experto en la materia y se refiere al crecimiento de un tumor canceroso en un organo o en una parte del cuerpo, que no esta conectada de forma directa al organo del tumor canceroso original. Se entendera que metastasis incluye la micrometastasis, que es la presencia de una cantidad indetectable de celulas cancerosas en un organo o en una parte del cuerpo que no esta directamente conectada al organo del tumor canceroso original. Por lo tanto, la presente divulgacion contempla un procedimiento para determinar el riesgo de crecimiento adicional de uno o mas tumores cancerosos en un organo o en una parte del cuerpo que no esta directamente conectada al organo del tumor canceroso original.
Tal como se usa en el presente documento, la frase "muestra biologica" abarca una diversidad de tipos de muestras obtenidas de un sujeto y utiles en el procedimiento de la invencion. Las muestras biologicas pueden incluir, pero sin limitacion, muestras de tejido solido, muestras de tejido ftquido, fluidos biologicos, aspirados, celulas y fragmentos de celulas. Los ejemplos espedficos de muestras biologicas incluyen, pero sin limitacion, muestras de tejido solido obtenidas mediante extraccion quirurgica, una muestra de ensayo patologica, una muestra archivada o una muestra de ensayo de biopsia, cultivos de tejido o celulas obtenidas de los mismos, y la progenie de las mismas, y cortes o frotis preparados a partir de cualquiera de estas fuentes. Los ejemplos no limitantes son muestras obtenidas a partir de tejido mamario, ganglios linfaticos y tumores de mama. Las muestras biologicas tambien incluyen cualquier material obtenido del cuerpo de un animal vertebrado, que incluyen, pero sin limitacion, sangre, ftquido cefalorraqrndeo, suero, plasma, orina, aspirado del pezon, aspirado con aguja fina, lavados de tejido tales como el lavado ductal, saliva, esputo, fluido ascftico, de tftgado, de rinon, de mama, oseo, de medula osea, de testfculo, de cerebro, de ovario, de piel, de pulmon, de prostata, de tiroides, de pancreas, de cuello de utero, de estomago, de
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intestino, colorrectal, de cerebro, de vejiga, de colon, uterino, semen, linfa, exudado vaginal, Ifquido sinovial, Kquido cefalorraqmdeo, de cabeza y cuello, tumores nasofarmgeos, lfquido amniotico, leche materna, esputo o tensioactivo pulmonar, orina, materia fecal y otras muestras Kquidas de origen biologico, y pueden referirse a las celulas o a fragmentos de celulas suspendidos en las mismas, o al medio lfquido y sus solutos. Toda, o una parte, de la muestra biologica puede tener un nivel de expresion de GP88 caractenstico de uno o mas estados de enfermedad.
Tal como se usa en el presente documento, un "patron" es una referencia que sirve como una base para la comparacion de otros datos. Un patron puede incluir una muestra biologica, fotograffas o fotomicrograffas de muestras biologicas, o intervalos normales (por ejemplo, dentro del intervalo de los individuos sanos) que derivan de un analisis de muestras biologicas. Por ejemplo, los patrones pueden incluir tejido normal y/o canceroso, tejido sin cancer o una muestra patologica archivada que contiene expresion de la protema GP88 en diversos niveles para su uso como control positivo, y tejido tumoral u otros tejidos que no muestran niveles de expresion de GP88 como muestras de control negativo, una fotograffa o fotomicrograffas, o intervalos normales derivados de dichas muestras. Por ejemplo, las fotograffas en la Figura 6 se pueden considerar como patrones. Tales patrones pueden usarse en los procedimientos, incluyendo, pero sin limitacion, para predecir la duracion de la supervivencia sin enfermedad y la global, predecir la supervivencia sin progresion, predecir el riesgo de una supervivencia sin enfermedad o global disminuida, predecir la probabilidad de recuperacion de un paciente que padece cancer, predecir la probabilidad de reaparicion del cancer y/o la metastasis en un individuo que tiene un tumor canceroso, predecir el riesgo de reaparicion del cancer, procedimientos para explorar a un paciente que padece cancer, para determinar el riesgo de metastasis tumoral, procedimientos para determinar el curso adecuado de tratamiento para un paciente que padece cancer y procedimientos para controlar la eficacia de un curso de tratamiento para un paciente que padece cancer.
Una "composicion que se une a GP88" puede incluir cualquier agente, incluyendo, pero sin limitacion, ligandos, anticuerpos anti-GP88 o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, que tengan la capacidad de unirse de forma espedfica a GP88. Tal como se usa en el presente documento, la expresion "agente que se une a (o tiene la capacidad de unirse a) GP88", se refiere a cualquier molecula que se une de forma espedfica a GP88 o a un fragmento de polipeptido de la misma, incluyendo, pero sin limitacion, anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, y detecta de este modo los niveles de expresion de GP88. Preferentemente, tales agentes se marcan para la deteccion usando procedimientos bien conocidos para los expertos en la materia. Los ejemplos de marcadores incluyen, pero sin limitacion, radiomarcadores, cromoforos, fluoroforos, enzimas, restos de union (por ejemplo, biotina) y similares.
Los anticuerpos o fragmentos de union a antfgeno de los mismos, tanto monoclonales como policlonales, pueden utilizarse como composicion que se une a GP88 que se une a la protema GP88 o a un fragmento polipeptfdico de la misma. Tambien se contempla en el presente documento como composicion que se une a GP88 cualquier mutante de protemas que se unen de forma espedfica a GP88, ya sea mediante delecion (como se ejemplifica anteriormente), adicion (por ejemplo, adicion de un dominio GST o de un dominio GFP) o modificacion de la secuencia (por ejemplo, mutagenesis dirigida), y similares.
Los ejemplos de anticuerpos anti-GP88 que pueden usarse para medir la concentracion de GP88 en una muestra de fluido biologico pueden producirse a partir de lmeas celulares de hibridoma, que incluyen, pero sin limitacion, la lmea celular de hibridoma 6B3 (numero de referencia de ATCC PTA-5262), la lmea celular de hibridoma 6B2 (numero de referencia de ATCC PTA-5261), la lmea celular de hibridoma 6CI 2 (numero de referencia de ATCC PTA-5597), la lmea celular de hibridoma 5B4 (numero de referencia de ATCC PTA5260), la lmea celular de hibridoma 5G6 (numero de referencia de ATCC PTA-5595), la lmea celular de hibridoma 4DI (numero de referencia de ATCC PTA- 5593), la lmea celular de hibridoma 3F8 (numero de referencia de ATCC PTA-5591), la lmea celular de hibridoma 3F5 (numero de referencia de ATCC PTA-5259), la lmea celular de hibridoma 3F4 (numero de referencia de ATCC PTA-5590), 3G2 (numero de referencia de ATCC PTA-5592), la lmea celular de hibridoma 2A5 (numero de referencia de AtCc PTA-5589) y 4F10 (numero de referencia de ATCC PTA-8763). Todas las restricciones impuestas por el depositante sobre la disponibilidad al publico del material depositado se eliminaran de forma irrevocable al conceder la patente. En una realizacion de la invencion, se usa como el anticuerpo primario en inmunohistoqmmica y en ELlSA de tipo sandwich el anticuerpo monoclonal 6B3 para GP88, que produce la lmea celular de hibridoma (numero de ATCC PTA-5262).
El termino anticuerpo en el presente documento incluye, pero sin limitacion, anticuerpos policlonales humanos y no humanos, anticuerpos monoclonales (Acm) humanos y no humanos, anticuerpos quimericos, anticuerpos anti- idiotipo (Ac anti-ld) y anticuerpos humanizados.
Tambien se entiende que el termino anticuerpo incluye tanto moleculas intactas como fragmentos de las mismas, tales como, por ejemplo, Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fd, Fd', Fv y scFv, anticuerpos monocatenarios (naturales o recombinantes) que tiene la capacidad de unirse al antfgeno. El anticuerpo o componente de union a antfgeno puede estar en solucion o unido a un soporte (placa, perlas, perlas magneticas, etc.,).
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden ser utiles en tecnicas de inmunofluorescencia que emplean un anticuerpo marcado con fluorescencia (vease a continuacion) con deteccion con microscopfa de fluorescencia, citometna de flujo, o fluorometrica. La reaccion de los anticuerpos y polipeptidos de la presente invencion se puede detectar mediante procedimientos de inmunoensayo bien conocidos en la tecnica. Los anticuerpos de la presente
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invencion se pueden emplear de forma histologica en microscopfa optica, en la formacion de imagenes, en inmunofluorescencia o en microscopfa inmunoelectronica, para la deteccion in situ de la protema GP88 en muestras de tejido o en biopsias. La deteccion in situ se puede lograr mediante la extraccion de una muestra de ensayo histologica de un paciente y aplicando el anticuerpo marcado de forma apropiada de la presente invencion.
La muestra biologica se puede tratar con un soporte de fase solida o un vehmulo tal como nitrocelulosa u otro soporte solido que tenga la capacidad de inmovilizar las celulas o partmulas de celulas o protemas solubles. El soporte puede entonces lavarse, seguido de un tratamiento con el anticuerpo anti-GP88 marcado de manera detectable. Esto va seguido de un lavado del soporte para eliminar el anticuerpo que no se ha unido. La cantidad de marcador unido sobre dicho soporte puede detectarse despues por medios convencionales. Por soporte de fase solida se entiende cualquier soporte que tenga la capacidad de unir antfgeno o anticuerpos tales como, pero sin limitacion, vidrio, polipropileno poliestireno, nylon, celulosa modificada o poliacrilamida. Como alternativa, el antfgeno puede estar en solucion y el anticuerpo esta unido al soporte (placa, perlas, perlas magneticas, etc.,).
La actividad de union de un lote dado de anticuerpo a la protema GP88 se puede determinar de acuerdo con procedimientos bien conocidos. Los expertos en la materia seran capaces de determinar condiciones de ensayo optimas y operativas para cada determinacion empleando la experimentacion rutinaria.
En un aspecto, la divulgacion proporciona procedimientos para el pronostico de una o mas enfermedades caracterizadas por, o asociada(s) con, una expresion diferencial (por ejemplo, anormalmente alta y/o anormalmente baja) de GP88. Las enfermedades en las que el nivel de expresion de GP88 es alto (o elevado) incluyen, pero sin limitacion, cancer de mama, cancer de ovario, cancer de prostata, cancer de endometrio, etc.; y las enfermedades en las que el nivel de expresion de GP88 es bajo incluyen, pero sin limitacion, trastornos neurodegenerativos que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con un patron y predecir de este modo un pronostico asociado con dicho nivel de expresion de GP88.
Un aspecto preferente de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia sin enfermedad de un paciente que padece una o mas enfermedades caracterizadas por, o asociadas con, una expresion diferencial (por ejemplo, anormalmente alta y/o anormalmente baja) de GP88, que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos, o indicativos de una mayor o menor duracion de la supervivencia sin enfermedad, y predecir de este modo la duracion de la supervivencia sin enfermedad asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad.
Un aspecto preferente de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia global de un paciente que padece una o mas enfermedades caracterizadas por, o asociadas con, una expresion diferencial (por ejemplo, anormalmente alta y/o anormalmente baja) de GP88, que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos, o indicativos de una mayor o menor duracion de la supervivencia sin enfermedad, y predecir de este modo la duracion de la supervivencia sin enfermedad asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una duracion disminuida de la supervivencia global.
Un aspecto preferente de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de reaparicion de una o mas enfermedades caracterizadas por, o asociadas con, una expresion diferencial (por ejemplo, anormalmente alta y/o anormalmente baja) de GP88, que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor probabilidad de reaparicion de dicha enfermedad, y predecir de este modo la probabilidad de reaparicion de dicha enfermedad asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad disminuida de reaparicion de dicha enfermedad.
Un aspecto preferente de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia sin progresion de un paciente que padece una o mas enfermedades caracterizadas por, o asociadas con, una expresion diferencial (por ejemplo, anormalmente alta y/o anormalmente baja) de GP88, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dichos niveles con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor duracion de la supervivencia sin enfermedad, y predecir de este modo la duracion de la supervivencia sin progresion asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una supervivencia sin progresion.
Un aspecto preferente de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia sin enfermedad de un paciente que padece cancer, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dichos niveles con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor duracion de la supervivencia sin enfermedad, y predecir de este modo la
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duracion de la supervivencia sin enfermedad asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad.
Otro aspecto de la divulgacion proporciona procedimientos para predecir la duracion de la supervivencia global de un paciente que padece cancer, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicha muestra, comparar dichos niveles con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor duracion de la supervivencia global, y predecir de este modo la duracion de la supervivencia global asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de Gp88 se asocian con una duracion disminuida de la supervivencia global.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de recuperacion de un paciente aquejado de cancer, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicha muestra, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor probabilidad de recuperacion, y predecir de este modo la probabilidad de recuperacion asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad disminuida de recuperacion.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la supervivencia sin progresion de un paciente de cancer, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor supervivencia sin progresion; y predecir de este modo la supervivencia sin progresion asociada con dicho nivel de expresion de la proterna GP88, en la que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una supervivencia sin progresion disminuida de dicho paciente.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona predecir el riesgo de una supervivencia sin enfermedad disminuida de un paciente de cancer, que comprende: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de un mayor o menor riesgo de una supervivencia sin enfermedad disminuida; y predecir de este modo el riesgo de una supervivencia sin enfermedad reducida asociada con dicho nivel de expresion de la proterna GP88.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona predecir el riesgo de una supervivencia global reducida de un paciente de cancer, que comprende: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dichos nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de un mayor o menor riesgo de una supervivencia global disminuida; y predecir de este modo el riesgo de disminucion de una supervivencia global disminuida asociado con dicho nivel de expresion de la proterna GP88.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de recuperacion de un paciente, que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicha muestra, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor probabilidad de recuperacion del cancer, y predecir de este modo la probabilidad de recuperacion asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en los que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad disminuida de recuperacion de dicho paciente.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la probabilidad reaparicion del cancer en un paciente, que comprenden: determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicha muestra, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor probabilidad de reaparicion del cancer, y predecir de este modo la probabilidad de reaparicion del cancer asociada con dicho nivel de expresion de GP88, en los que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad disminuida de reaparicion del cancer.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir la probabilidad de metastasis del cancer en un paciente, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de una mayor o menor probabilidad de metastasis del cancer; y predecir de este modo la probabilidad de metastasis del cancer asociada con dicho nivel de expresion de la proterna GP88, en los que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con una probabilidad aumentada de metastasis del cancer en un paciente.
Otro aspecto de la presente divulgacion proporciona procedimientos para predecir el riesgo de reaparicion del cancer en un paciente, que comprenden: determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparar dicho nivel con patrones indicativos de individuos sanos o indicativos de un mayor o menor riesgo de reaparicion del cancer; y predecir de este modo el riesgo de reaparicion del cancer asociado con dicho nivel de expresion de la proterna Gp88, en los que los niveles elevados de expresion de GP88 se asocian con un riesgo aumentado de reaparicion del cancer en un paciente.
En una realizacion de la invencion, se proporciona un procedimiento para controlar la eficacia de un curso de tratamiento para un paciente que padece un carcinoma de pulmon no microdtico. Este procedimiento comprende: a) determinar un primer nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica de dicho paciente antes de dicho tratamiento y b) determinar posteriormente un segundo nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica de
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dicho paciente durante dicho tratamiento. La comparacion de dicho primer nivel de expresion de GP88 con dicho segundo nivel de expresion de GP88 indicara entonces la eficacia de dicho tratamiento, en el que un nivel elevado de GP88 en la segunda muestra, en comparacion con la primera muestra, indica un tratamiento no eficaz.
Otro aspecto de la divulgacion proporciona un procedimiento para explorar a un paciente aquejado de cancer, para determinar el riesgo de reaparicion del tumor o la metastasis tumoral. El procedimiento comprende determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente, comparando dicho nivel con un patron. Un paciente en el que se ha descubierto que tiene niveles elevados de GP88, con respecto a un patron, se clasifica como que es mas probable de padezca una reaparicion del tumor o metastasis tumoral.
Un aspecto adicional preferente de la divulgacion proporciona un procedimiento para determinar el curso adecuado de un tratamiento para un paciente que padece cancer. Este procedimiento comprende determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de un paciente. Despues, se identifica un primer grupo de pacientes como que tienen bajos niveles de expresion de una GP88, cuyo grupo de pacientes puede necesitar un tratamiento adecuado para pacientes que tienen una mayor posibilidad de supervivencia o un tiempo aumentado para la reaparicion del tumor o la metastasis. El procedimiento ademas comprende identificar un segundo grupo de pacientes como que tienen niveles elevados de expresion de una GP88, cuyo grupo de pacientes puede necesitar un tratamiento adecuado para pacientes que tienen una menor posibilidad de supervivencia y como que es mas probable que padezcan una reaparicion del tumor o metastasis.
En otro aspecto mas de la divulgacion, se proporcionan procedimientos para la determinacion de niveles de expresion de GP88 en una etapa temprana del desarrollo del tumor. Los expertos en la materia conocen las diversas etapas del desarrollo tumoral, tal como se ejemplifica en Markman 1997, Basic Cancer Medicine, por ejemplo.
La divulgacion tambien se dirige a un procedimiento para determinar la eficacia de la cirugfa conservadora de la mama (mastectoirna parcial) para el tratamiento de un cancer de mama sin afectacion ganglionar que comprende: a) obtener una muestra biologica de un individuo que necesite una cirugfa conservadora de mama, b) medir los niveles de expresion de GP88 en dicha muestra biologica y c) comparar dichos niveles con los de un patron, para predecir la sensibilidad de dicho cancer de mama a la cirugfa conservadora de mama.
Otro aspecto de la divulgacion proporciona procedimientos para el pronostico de un paciente con cancer, que comprenden: a) obtener una muestra biologica de un individuo que necesite un pronostico; b) determinar el nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de dicho paciente; c) puntuar dicha muestra para los niveles de expresion de GP88 y d) comparar dicha puntuacion con la obtenida de una muestra control (o patron).
La divulgacion tambien se dirige a un procedimiento para determinar el efecto de un tratamiento antiestrogenico que comprende: a) obtener una muestra biologica de un individuo que necesite tratamiento antiestrogenico, b) medir los niveles de expresion de GP88 en dicha muestra biologica y c) comparar dichos niveles con un patron para predecir la sensibilidad al tratamiento antiestrogenico. Este procedimiento puede comprender ademas una etapa de determinacion del curso adecuado del tratamiento para tal paciente, de acuerdo con los procedimientos enumerados anteriormente.
Tal como se usa en el presente documento, "terapia antiestrogenica" se refiere a la administracion de una composicion de antiestrogenos con el fin de prevenir o tratar el crecimiento tumoral. Los ejemplos de antiestrogenos incluyen antagonistas de loa receptores de estrogenos o MSRE (sigla de: moduladores selectivos de receptores de estrogeno) (tamoxifeno y raloxifeno). Otras composiciones de antiestrogenos incluyen, inhibidores de la aromatasa (por ejemplo, Arimidex® (anastrozol), Femera®) y reguladores negativos del receptores de estrogeno (por ejemplo, Faslodex®). Los efectos antiestrogenicos del tamoxifeno pueden referirse a su capacidad para competir con estrogenos por los sitios de union en tejidos diana. Otros antiestrogenos, tales como los inhibidores de la aromatasa, inhiben o reducen la cantidad de estrogeno disponible.
La divulgacion tambien se dirige a un procedimiento para explorar compuestos que comprende:
a) obtener compuestos a explorar por su capacidad de afectar de forma positiva o de forma negativamente la expresion de GP88; b) poner en contacto una muestra biologica relevante con dicho compuesto y c) determinar el efecto de dicho compuesto en los niveles de expresion de GP88 en dicha muestra biologica. Preferentemente, el efecto de dicho compuesto se puede determinar mediante la union de un anticuerpo a GP88 para dicha muestra, con respecto a un patron.
Determinacion de los niveles de expresion de GP88
La determinacion de la expresion de GP88 se puede realizar mediante uno o mas procedimientos conocidos por un experto en la materia. Por ejemplo, los niveles de expresion de GP88 se pueden determinar mediante la deteccion de (a) un polipeptido GP88, (b) ARNm que codifica una protema GP88, (c) una porcion de ADN que constituye un gen de GP88, o (d) cualquier combinacion de los mismos.
Por ejemplo, los niveles de expresion de GP88 se pueden detectar midiendo los niveles de la protema GP88 usando las composiciones que se unen a GP88. La deteccion de los niveles de protema GP88 se puede llevar a cabo
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usando cualquiera de los procedimientos conocidos por un experto en la materia, que incluyen, pero sin limitacion, procedimientos de quimioluminiscencia, deteccion mediante tincion histoqmmica o bioqmmica (es decir, ensayos inmunohistoqmmicos), analisis por transferencia de Western, citometna de flujo, inmunoprecipitacion (o el equivalente de los mismos para los agentes que no son anticuerpos), medicion de la absorbancia de la resonancia de plasmon, y similares. En una realizacion de la invencion, el procedimiento para detectar los niveles de la protema GP88 es un inmunoensayo (tal como un ELISA), que incluye el uso de al menos un anticuerpo. En otra realizacion mas de la invencion, se puede llevar a cabo mediante inmunohistoqmmica usando un anticuerpo anti-GP88, la tincion de GP88 en una muestra de tejido, por ejemplo, cortes de tejido incluidos en parafina, fijados con formalina, y determinando la expresion de GP88.
Por ejemplo, se realizo una realizacion de la invencion usando el kit de IHQ Oncostain 88™, que usa un anticuerpo monoclonal de raton primario, un anticuerpo anti-IgG de raton secundario, un bloqueante de la peroxidasa para inactivar la actividad de la peroxidasa endogena y un sustrato cromogenico. La medicion del polipeptido que codifica un gen de GP88 puede incluir mediciones de fragmentos del polipeptido, en las que los fragmentos surgen a partir de variantes transcripcionales o traduccionales del gen o, de forma alternativa, los polipeptidos de distintos tamanos surgen como resultado de modificaciones postraduccionales que incluyen la proteolisis de una porcion mayor de un polipeptido de GP88.
La deteccion de los niveles de los ARNm que codifican GP88 tambien puede servir como un indicador de la expresion de GP88. Se conocen bien en la tecnica los procedimientos usados para detectar los niveles de ARNm e incluyen la deteccion de la hibridacion o amplificacion con el ARNm que codifica GP88. Esta deteccion se puede llevar a cabo mediante el analisis del ARNm, tanto in vitro como in situ (por ejemplo, en una muestra de tejido), usando uno de los procedimientos conocidos para un experto en la materia, tal y como se ejemplifica en Current Protocols in Molecular Biology (John Wiley & Sons, 1999); en la patente de Estados Unidos n.° 5.882.864; y similares. Un ARNm de GP88 detectado sera cualquier transcrito de ARN de un gen GP88, o un fragmento del mismo.
Clasificacion de pacientes
Los pacientes se pueden clasificar comparando los niveles de expresion de GP88 en la muestra biologica obtenida de un paciente con un patron. Por ejemplo, tras medir el nivel de expresion de GP88 en la muestra, el nivel medido se compara con un patron. El patron es un nivel de expresion de GP88 usado para evaluar el nivel de expresion de GP88 en la muestra biologica de un paciente. Por ejemplo, en una realizacion, cuando los niveles de expresion de GP88 en la muestra del paciente son mayores que los del patron, se considerara que la muestra del paciente tiene niveles elevados de expresion de GP88. Por el contrario, en otra realizacion, cuando los niveles de expresion de GP88 en la muestra del paciente son menores que los del patron, se considerara que la muestra tiene niveles bajos de expresion de GP88.
En otra realizacion, a los pacientes se les puede asignar una "puntuacion" asociada con la expresion de GP88 en una muestra biologica dada. Se puede "puntuar" una muestra durante el diagnostico o control de un cancer de mama. La puntuacion se puede determinar mediante los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica. En una realizacion, a los niveles elevados de expresion de GP88 en una muestra biologica se les da una mayor puntuacion en comparacion con los bajos niveles de expresion de GP88, a los que se les da una puntuacion comparativamente menor. La puntuacion tambien se puede determinar mediante un examen visual de las muestras mediante inmunohistoqmmica. En otra realizacion, una puntuacion mas cuantitativa implica determinar dos o mas parametros, por ejemplo (i) la intensidad de la tincion y (ii) la proporcion de celulas tenidas ("positivas") que se han muestreado. A base de estos multiples parametros se pueden asignar puntuaciones que reflejen niveles crecientes de tincion positiva.
Asf pues, en una realizacion, se puede comparar una puntuacion asociada con los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica obtenida de un paciente con la puntuacion asociada con los niveles de expresion de GP88 en el patron o con celulas que no tengan niveles de expresion de GP88 bajos o elevados usadas como control. Tal comparacion puede proporcionar una base para un mejor pronostico del paciente. Por ejemplo, en una realizacion, los procedimientos de la invencion pueden puntuar los niveles de expresion de GP88 usando una escala de 0 a 3+, en la que 0 es negativo (expresion de GP88 que no se puede detectar), 1+ y 2+ se asocian con una tincion debil y debil a moderada, respectivamente, y 3+ se asocia con una tincion de alta intensidad, en mas del 10% de las celulas tumorales; y en la que una baja puntuacion indica un mejor pronostico de los pacientes.
El pronostico de los pacientes que expresan diversos niveles de GP88 se puede llevar a cabo usando analisis de unica variable o analisis de multiples variables. Estos procedimientos determinan la probabilidad de una correlacion entre una o mas variables y un dado resultado. En una realizacion, los procedimientos determinaran la probabilidad de una correlacion entre los niveles de expresion de GP88 (o los niveles de expresion de GP88 acoplados con otra variable) y la supervivencia sin enfermedad o global de los pacientes de cancer. Para llevar a cabo estos analisis se puede usar uno cualquiera de la pluralidad de procedimientos conocidos para los expertos en la materia. Un ejemplo de analisis de variable unica es el procedimiento de Kaplan-Meir o la prueba de rangos logantmicos. Un ejemplo de analisis de multiples variables es el modelo de regresion de riesgo proporcional de Cox. Los procedimientos de la invencion pueden comprender ademas el analisis de los niveles de expresion de GP88 junto con marcadores
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adicionales de cancer de mama. La relacion proporcional de Cox proporciona una relacion de riesgo o un riesgo para la supervivencia sin enfermedad y global para un paciente con un nivel de expresion de GP88 variable.
El analisis de la supervivencia usando los procedimientos de Kaplan y Meier es la tecnica estadfstica recomendada para su uso en ensayos de cancer. Se aplica analizando la distribucion de los tiempos de supervivencia de los pacientes tras su inclusion en un estudio. El analisis expresa esto en terminos de la proporcion de pacientes aun vivos hasta un tiempo dado despues de su inclusion. En terminos graficos, una representacion de la proporcion de pacientes que sobreviven frente al del tiempo tiene un descenso caractenstico (a menudo exponencial), indicando la inclinacion de la curva la eficacia del tratamiento que se esta investigando. Cuanto menos pronunciada sea la curva de supervivencia, mas eficaz sera el tratamiento. El analisis de Kaplan-Meier se puede usar para analizar la significancia estadfstica de las diferencias entre las curvas de supervivencia asociadas a dos tratamientos diferentes.
En una realizacion, despues de que se han determinado los niveles de expresion de GP88 en la muestra obtenida de un paciente y se han comparado con el patron, se clasifica entonces al paciente en un grupo que tiene una determinada probabilidad de supervivencia sin enfermedad o global. Despues, se evalua la probabilidad de supervivencia sin enfermedad o global para el paciente a base de la probabilidad de supervivencia sin enfermedad o global para los pacientes en ese grupo. Por ejemplo, se puede determinar que la muestra biologica obtenida de un paciente tiene niveles elevados de expresion de GP88 con respecto al patron. Despues, este paciente podna clasificarse en un grupo de pacientes que tienen niveles elevados de expresion de GP88. Ya que, en conformidad con la presente invencion, se ha descubierto que hay una duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad o global para el grupo de pacientes que expresan niveles elevados de GP88, se considera que el paciente espedfico aquejado de cancer tiene una duracion disminuida de la supervivencia sin enfermedad o global.
Kits
La presente divulgacion proporciona un kit para determinar los niveles de expresion de GP88 en la muestra biologica. Tal kit comprendera un reactivo para detectar el ARNm que codifica GP88, el polipeptido GP88 o cualquier combinacion o fragmento de los mismos. El reactivo comprendera una o mas moleculas que tengan la capacidad de unirse espedficamente a una secuencia de acido nucleico (ADN o ARN) que codifica GP88 o al polipeptido GP88.
El kit puede comprender uno o mas reactivos de acido nucleico para la deteccion del ARNm que codifica GP 88 (ya sea sentido como antisentido). El uno o mas reactivos de acido nucleico se pueden usar para la hibridacion y/o amplificacion del ARNm que codifica GP88. El kit puede comprender uno o mas parejas de cebadores para amplificar el ARNm que codifica GP88. El kit puede comprender adicionalmente muestras del ARNm total obtenido de tejido en diversos estados fisiologicos, tales como, por ejemplo, normal y de tumor con metastasis progresiva, para usarlos como controles. El kit tambien puede comprender tampones, bases nucleotfdicas y otras composiciones a utilizar en reacciones de hibridacion y/o amplificacion. Cada solucion o composicion puede estar contenida en un vial o frasco, y todos los viales se mantienen en estrecho confinamiento en una caja para la venta comercial. Otra realizacion de la presente invencion abarca un kit para su uso en la deteccion del ARNm que codifica GP88 en una muestra biologica, que comprende sondas de oligonucleotido eficaces para unirse con alta afinidad in vitro o in situ al ARNm que codifica GP88, y envases para cada una de estas sondas.
En una realizacion adicional, la divulgacion abarca un kit para su uso en la determinacion del nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica que comprende uno o mas agentes, tales como, por ejemplo, uno o mas anticuerpos, espedficos para uno o mas polipeptidos GP88, o fragmentos. En una realizacion particular, el kit comprendera uno o mas agentes y uno o mas marcadores de acido nucleico, en el que los agentes y los marcadores de acido nucleico se modifican en una manera apropiada para llevar a cabo ensayos de inmunorreaccion en cadena de la polimerasa.
Un aspecto preferente de la divulgacion se dirige a un kit para determinar los niveles de expresion de GP88 en una muestra biologica de mairnfero, en el que dichos niveles de expresion de GP88 son un indicador del pronostico del cancer de mama, comprendiendo dicho kit: a) un anticuerpo que se une espedficamente a GP88 o a un fragmento de union a antfgeno del mismo, b) un reactivo util para detectar el grado de interaccion entre dicho anticuerpo y GP88; c) un reactivo o solucion util para la recuperacion del antfgeno y d) muestras de control positivo y/o negativo. Dicho anticuerpo se puede enlazar de forma directa a un reactivo indicador, en el que dicho reactivo indicador se selecciona del grupo que consiste en reactivos fluorescentes, colorimetricos, de inmunoperoxidasa e isotopicos. Como alternativa, el kit puede incluir adicionalmente un segundo anticuerpo indicador enlazado a un reactivo indicador, en el que dicho reactivo indicador se selecciona del grupo que consiste en reactivos fluorescentes, calorimetricos, de inmunoperoxidasa e isotopicos.
En una realizacion, el kit contiene al menos un anticuerpo primario (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal anti-GP88 6B3), al menos un anticuerpo secundario marcado (por ejemplo, anticuerpo policlonal anti-GP88 humano marcado con una enzima de deteccion tal como HRP) y a al menos un sustrato (por ejemplo, TMB). Como alternativa, los kits pueden contener anticuerpos secundarios radiomarcados en lugar del anticuerpo secundario marcado con una enzima. Los kits tambien pueden contener artfculos desechables para llevar a cabo ensayos de deteccion (por ejemplo, placas de microtitulacion, pipetas).
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Debe entenderse que la aplicacion de las ensenanzas de la presente invencion a un problema o entorno espedfico, estara dentro de la capacidad de un experto en la materia, a la luz de las ensenanzas contenidas en el presente documento. La presente invencion se ilustra de forma mas completa mediante los siguientes ejemplos no limitativos.
Ejemplo 1
Expresion de GP88 en carcinoma ductal invasivo
La metodologfa actual se basa en la tincion de GP88 en lesiones de mama humana incluidas en parafina y fijadas con formalina, investigadas con variables patologicas clmicas. Se observo tincion citoplasmatica de GP88 en carcinoma de mama, mientras que casi siempre fue negativa en epitelio benigno de mama. Se prepararon cortes de tejido de 4-6 micrometros de 203 biopsias incluidas en parafina, fijadas con formalina. La tincion de GP88 se llevo a cabo mediante inmunohistoqmmica usando un anticuerpo anti-Gp88 humano, y la expresion de GP88 se examino en tejidos normales, lesiones benignas, carcinomas ductales y lobulillares (Tabla 1; CDIS: carcinoma ductal in situ, CIIS: carcinoma infiltrante in situ, CLIS: carcinoma lobulillar in situ, CLI: carcinoma lobulillar infiltrante). Adicionalmente, se realizaron estudios de correlacion de la expresion de GP88 en los IDC con la clasificacion histologica, el mdice de proliferacion (Ki67), p53, RE y expresion de Her-2.
Tabla 1. Puntuacion de la inmunotincion de GP88
Diagnostico
N 0 1 + 2+ 3+
Benigno
26 25 (96 %) 1 (4 %) 0 0
CDIS
27 9 (33 %) 8 (30 %) 7 (26 %) 3 (11 %)
IDC
124 25 (20 %) 48 (39 %) 33 (27 %) 18 (15 %)
CLIS
12 11 (92%) 1 (8 %) 0 0
CLI
17 8 (47%) 6 (35%) 3 (18%) 0
Se ha observado que GP88 se expresa tanto en los tumores RE+ como RE-, y se expreso de forma predominante en los IDC con una correlacion con la clasificacion histologica y con un mdice de proliferacion Ki67.
Ejemplo 2
Analisis de los niveles de expresion de GP88 en tejidos de cancer de mama de RE-. Pacientes RE+/GL- y pacientes RE+/GL+
Diseno del estudio
El estudio clmico se llevo a cabo con 389 casos de cancer de mama (vease por favor la Tabla 2 para las caractensticas de los sujetos consideradas en el estudio clmico), espedficamente, muestras de tejido de carcinoma ductal invasivo almacenadas como bloques incluidos en parafina, fijados con formalina y obtenidos a partir de tres bancos de tejidos. Los criterios de inclusion son como sigue: ano y edad en el momento del diagnostico, caractensticas del tumor: receptores de estrogeno (RE), receptor de progesterona (RP), clasificacion del tumor, tamano del tumor, estado ganglionar, estado en el ultimo seguimiento, supervivencia global (SG), estado de recidiva, tiempo hasta la primera recidiva, tratamiento (RE+, tamoxifeno LNO). Los casos que se ajustan a los criterios de inclusion se extrajeron para preparar portaobjetos para el estudio.
Procedimientos de estudio
Para cada caso, el laboratorio de histologfa del sitio de procesamiento del banco corto en ese momento cortes de tejido de 4 - 6 micrometros en portaobjetos de microscopio cargados de forma positiva. El patologo responsable de extraer los bloques examino la adecuacion del corte de los portaobjetos. La expresion de GP88 se determino mediante la tincion de los portaobjetos con el kit Oncostain 88™ y se puntuo mediante patologos certificados.
Materiales y procedimientos
El procedimiento actual se realizo usando el kit de IHQ Oncostain 88™, que usa un anticuerpo primario monoclonal de raton, un anticuerpo secundario anti-IgG de raton, un bloqueante de la peroxidasa para inactivar la actividad de la peroxidasa endogena y un sustrato cromogenico. El anticuerpo primario de raton se une a GP88 humana expresada en el citoplasma de las celulas de carcinoma de mama. Esta etapa se siguio de la adicion de un anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa que se une al anticuerpo primario. El complejo espedfico anticuerpo primario- anticuerpo secundario se visualizo despues con un sustrato cromogenico diluido de forma optima, se contratino y se cubrio con un cubre objetos. Los resultados se interpretaron usando un microscopio optico.
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Resultados
Se analizo el patron de tincion de las muestras de tejido y se categorizo (es decir, se puntuo) como se muestra en la Tabla 3. Se observaron los niveles de expresion de GP88 para la tincion citoplasmatica en mas del 10% de las celulas tumorales. A la ausencia de tincion o tincion palida observada en menos del 10 % de las celulas tumorales se le dio una puntuacion de "0". A la tincion citoplasmatica debil observada en mas del 10 % de las celulas tumorales se les dio una puntuacion de "1+", a una tincion citoplasmatica de debil a moderada observada en mas del 10 % de las celulas tumorales se le dio una puntuacion de "2+" y a una tincion citoplasmatica fuerte observada en mas del 10 % de las celulas tumorales se le dio una puntuacion de "3+". La Figura 6 muestra la reactividad del anti-GP88 con las biopsias de cancer de mama incluidas en parafina, fijadas con formalina y el patron de tincion, mediante un procedimiento de tincion inmunohistoqmmica indirecto.
Los patrones de tincion obtenidos anteriormente se sometieron a interpretaciones adicionales para ayudar en la evaluacion del pronostico de tumores de mama (vease la Tabla 4, mas adelante). Se categorizo una puntuacion de menos de 3+ (es decir, 0, 1+ y 2+) como grupo de bajo riesgo de GP88 y se considero que tiene un riesgo disminuido o menor de reaparicion o muerte, y una puntuacion de 3+ se categorizo como grupo de riesgo alto de GP88 y se considero que tiene un riesgo aumentado o mayor de reaparicion o muerte.
Plan y analisis estadistico
El analisis estadistico de los resultados lo llevo a cabo un bioestadfstico. El plan de analisis estadistico se baso en la evaluacion del rendimiento de la prueba por su capacidad para predecir la supervivencia sin enfermedad y/o la supervivencia global. Se diseno para su uso la prueba de rangos logantmicos para identificar parejas de grupos de diagnostico y los modelos de riesgos proporcionales de Cox para la cuantificacion del riesgo en poblaciones RE+ separadas por el estado de los ganglios linfaticos (vease la Tabla 5 a continuacion; SG= supervivencia global, SSE = Supervivencia sin enfermedad, nGL = Negativos para ganglios linfaticos y pGL = positivos para ganglios linfaticos). Ademas, las funciones de supervivencia para la supervivencia global y sin enfermedad se determinaron mediante las curvas de Kaplan-Meier para el grupo Gp88 3+ y GP88 < 3+ (GP88 0, 1 y T).
Entre los pacientes RE- GP88 mostro una asociacion estadfsticamente significativa con la mortalidad global (Figura 1). Los datos mostraron que los pacientes que teman canceres RE- que expresan un nivel elevado de GP88 (GP88 3+) tienen una menor probabilidad de supervivencia global que los canceres RE- con una menor expresion de GP88 (GP88 0, 1 + o 2 +).
La expresion elevada de GP88 (3+) es un indicador elevado estadfsticamente significativo del riesgo de reaparicion del tumor en la poblacion RE+ / GL-, y se asocia de manera significativa con la mortalidad global. Un nivel elevado de expresion de GP88 (grupo de alto riesgo de GP88 con una puntuacion de 3+ en la tincion citoplasmatica) se asocio con una supervivencia sin enfermedad disminuida (Figura 2) y una supervivencia global disminuida (Figura 3).
La expresion elevada de GP88 (3+) tambien fue un indicador elevado estadfsticamente significativo del riesgo de recidiva y de la mortalidad global en la poblacion RE+ / GL+. Un nivel elevado de expresion de GP88 (grupo de alto riesgo de GP88 con una puntuacion de 3+ en la tincion citoplasmatica) se asocio con una supervivencia sin enfermedad disminuida (Figura 4) y una supervivencia global disminuida (Figura 5).
Tabla 4: Interpretacion del patron de tincion
Puntuaci on
GP88 Categoria de GP88 Interpretacion
0
< 3+ Grupo de bajo riesgo de GP88 Riesgo disminuido (menor) de reaparicion o muerte
1 +
2+
3+
3+
Grupo de alto riesgo de GP88 Riesgo aumentado (mayor) de recidiva o muerte
Ejemplo 3
Analisis de los niveles de expresion de GP88 en fluidos biologicos obtenidos de pacientes de cancer de mama
Las concentraciones de GP88 en muestras de suero humano se midieron por triplicado mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Las muestras de GP88 patron se prepararon a partir de GP88 recombinante en una solucion de glicerol al 30% y PBS-leche al 1 % a concentraciones de 0, 0,1, 0,25, 0,5, 1, 3, 10 y 20 ng/ml. Se recubrieron pocillos de 100 microlitros en una placa de microtitulacion con 10 microgramos por
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mililitro de anticuerpo monoclonal 6B3 anti-GP88 humana (0,78 mg/ml de anticuerpo 6B3 en solucion salina tamponada con fosfato (PBS)) y se incubaron toda una noche a 4<0>C. Los pocillos se lavaron con PBS seguido de la adicion a cada pocillo de policlonal anti-PCDGF humano (fraccion de IgG) a una concentracion de 3 microgramos/ml a 37<0>C durante 1,5 horas. Los pocillos se lavaron con PBS antes de la adicion a cada pocillo del anticuerpo de deteccion (cabra anti IgG de conejo - peroxidasa de rabano picante (HRP)). Se anadio TMB (sustrato) y se permitio la incubacion con las muestras durante 1 hora. La densidad optica de las muestras se determino usando un lector espectrometro de ELISA configurado a una longitud de onda de 620 nanometros. La representacion de la densidad optica de las muestras de GP88 patron (eje y) frente a la cantidad de GP88 en cada muestra (eje x) genero una curva patron (Figura 7). La concentracion de GP88 de las muestras desconocidas se determino mediante la medicion de la densidad optica y usando la curva patron (Figura 6), para determinar la concentracion de GP88.
El nivel de GP88 en circulacion se midio para los pacientes aquejados de cancer de mama que no teman evidencias de enfermedad y que teman una enfermedad progresiva. Se observo (Figura 8) que el nivel de GP88 en el suero de los pacientes de cancer de mama (Ptes. de CM) sin evidencias de enfermedad (de partida) esta dentro del intervalo de los individuos sanos. Sin embargo, los Ptes. de CM con una enfermedad progresiva tienen niveles de GP88 en circulacion significativamente mas altos.
Los estudios ademas mostraron que los niveles en circulacion de expresion de GP88 en pacientes de cancer de mama que no tienen evidencia de enfermedad permanecen bajos y dentro del intervalo de los individuos sanos. Los niveles de expresion de GP88 se midieron (Figura 9) en pacientes sin evidencia de enfermedad durante un amplio penodo de tiempo (es decir, 4 anos: de octubre de 2004 a abril de 2008, tal como se muestra en la Figura 9). Los resultados demostraron que los pacientes en una etapa temprana de la enfermedad (Fase 2) que no teman evidencia de enfermedad mantuvieron estables los niveles de GP88 que estan dentro del intervalo de los individuos sanos.
Se observaron niveles de GP88 en circulacion para pacientes en la fase temprana (fase 2), que expresaron niveles elevados de GP88 que recayeron a la etapa 4 con el tiempo (aproximadamente, un ano y medio: de enero de 2006 a mayo de 2007, en el presente caso). Los datos mostraron (Figura 10) que en las ultimas etapas los pacientes expresaron de forma anomala niveles elevados de GP88.
Los niveles elevados de GP88 se asocian con perdida de la supervivencia
Se midio el nivel de GP88 en el suero de dos pacientes que murieron de cancer de mama usando el protocolo convencional de ELISA y se observo que el mantenimiento de unos niveles elevados de GP88 durante varias semanas conduda a una disminucion de la supervivencia. Los dos pacientes finalizaron el estudio cuando se determino que no teman evidencia de enfermedad (NEE), en los que el nivel de GP88 era bajo y estaba dentro del intervalo de los individuos sanos (aproximadamente 20 unidades - 20 ng/ml). Sin embargo, con el tiempo, los niveles de GP88 alcanzaron de 160 a 200 unidades (160-200 ng/ml), momento en el cual el paciente 1 murio en una semana (Figura HA) y el paciente 2 murio en 3 semanas (Figura HB).
Se observaron resultados similares cuando el nivel de expresion de GP88 se midio en plasma de pacientes de cancer de mama, es decir, se observaron niveles elevados de GP88 cuando se compararon con los individuos sanos.
Aunque la invencion se ha descrito en referencia a realizaciones desveladas, deber entenderse que pueden realizarse diversas modificaciones sin alejarse del espmtu de la invencion. En consecuencia, la invencion esta limitada solo por las siguientes reivindicaciones.
Ejemplo 4
Estudios para validar GP88 como un factor de pronostico en cancer de pulmon
Tal como se describe anteriormente en los materiales y procedimientos del Ejemplo 2, el examen de la expresion de GP88 en micromatrices de tejido usando el kit de IHQ Oncostain 88™ demostro la expresion de GP88 en tejido de cancer de pulmon tanto de carcinoma escamoso como de adenocarcinoma y la ausencia de expresion de GP88 en tejidos humanos normales que incluyen tejido de pulmon normal humano (Tabla 5, a continuacion).
Tabla 5: Analisis de tincion de GP88 en tejidos normal y de carcinoma de pulmon
Fuente de tejido para el analisis
Numero total de casos Puntuacion (% del total)
0
1 + 2+ 3+
Carcinoma escamoso
28 8 (29 %) 9 (32 %) 5 (18 %) 6 (21 %)
5
10
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(continuacion)
Fuente de tejido para el analisis
Numero total de casos Puntuacion (% del total)
0
1 + 2+ 3+
Adenocarcinoma
27 7 (26 %) 5 (19 %) 7 (26 %) 8 (30 %)
Pulmon normal
5 5 (100 %) 0 0 0
Analisis de los niveles de expresion de GP88 en tejidos de cancer de pulmon
Para determinar si los niveles crecientes de GP 88 en tejido de cancer de pulmon en la Fase I/II se correlacionan en pacientes de cancer de pulmon con una supervivencia sin enfermedad (SSE) reducida, se calculo la expresion de GP88 en 85 casos de CpNM en fase I/II que se puede extirpar, provistos de datos clmicos y de resultados. El tejido se tino usando el kit de IHQ Oncostain 88™ y un patologo certificado por la junta puntuo la tincion de GP88 de los portaobjetos tenidos resultantes para.
Tras el analisis de las puntuaciones de GP88 y de los datos de supervivencia usando las representaciones de Kaplan-Meier, se observo una disminucion estadfsticamente significativa en la SSE a medida que aumentaban los niveles de GP88. Esto se ensayo formalmente mediante un ajuste a un modelo de riesgo proporcional de Cox usando PROC PHREG de SAS, tratando el nivel de GP88 como un predictor de recidiva a intervalos de escala. Esto dio una asociacion altamente significativa entre GP88 y la recidiva (P = 0,0091). El coeficiente de GP88 fue de 0,676, indicando que cada unidad de aumento en GP88 se corresponde aproximadamente con la duplicacion del riesgo de recidiva (Figura 14).
La correlacion de la expresion de GP88 con la supervivencia global en los mismos 85 casos demostro un aumento del 74 % del riesgo de morir para cada aumento en la puntuacion de GP88 (Figura 15). Estos datos demuestran que, de manera similar al cancer de mama, la expresion de GP88 se puede usar como un predictor de riesgo de recidiva en cancer de pulmon, por ejemplo, en una fase temprana de CPNM.
Ejemplo 6
Analisis de los niveles de expresion de GP88 en fluidos biologicos obtenidos de pacientes de cancer de pulmon
Se midieron las concentraciones de GP88 en muestras de suero humano obtenidas de pacientes de cancer de pulmon y de pacientes sanos sin cancer de pulmon mediante ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA). Los datos se muestran en la Tabla 6 a continuacion.
Tabla 7. Comparacion de los niveles sericos de GP88 en pacientes de cancer de pulmon y en
pacientes sanos sin cancer de pulmon.
Tipo de paciente
Numero de casos Niveles sericos de GP88 (ng/ml)
Media Intervalo
Sano
18 28,7 ± 4,25 16,6 -38,2
Cancer de pulmon
18 43,0 ± 10,6 28,5 -73*
-2 pacientes progresaron despues de la medicion inicial, alcanzando 120 ng/ml
Los datos mostrados en la Tabla 7 indican que la GP88 serica se puede usar en el cancer de pulmon como un indicador predictivo. Adicionalmente, el analisis de datos usando una representacion de caja y bigote comparativo mostro una clara diferencia entre las muestras obtenidas de pacientes con cancer de pulmon y de pacientes sanos sin cancer de pulmon. La prueba de la suma de rangos de Wilcoxon confirma esta impresion visual, dando un valor de P aproximado de 0,0004.

Claims (10)

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    REIVINDICACIONES
    1. Un procedimiento de controla de la eficacia de un curso de tratamiento para un paciente que padece carcinoma de pulmon no microcftico que comprende:
    determinar un primer nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica de dicho paciente antes de dicho tratamiento; y determinar posteriormente un segundo nivel de expresion de GP88 en una muestra biologica de dicho paciente durante dicho tratamiento,
    en el que la determinacion del nivel de expresion de GP88 comprende la puesta en contacto con una composicion de union a GP88, y comparar dicho primer nivel de expresion de GP88 con dicho segundo nivel de expresion de GP88 para indicar la eficacia de dicho tratamiento, en el que un nivel elevado de GP88 en la segunda muestra en comparacion con la primera muestra indica un tratamiento ineficaz.
  2. 2. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la muestra es una muestra de tejido solido.
  3. 3. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha composicion de union a GP88 se
    selecciona de un anticuerpo anti-GP88 o un fragmento de union a antfgeno del mismo.
  4. 4. El procedimiento de la reivindicacion 3, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es policlonal o monoclonal.
  5. 5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 4, en el que dicho fragmento de union a antfgeno se selecciona del grupo que consiste en Fab, F(ab)2, Fab', F(ab')2, Fd, Fd', Fv y scFv.
  6. 6. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, en el que dicho anticuerpo o fragmento del mismo es un anticuerpo humanizado o quimerizado.
  7. 7. El procedimiento de la reivindicacion 2, en el que la muestra de tejido solido es tejido pulmonar.
  8. 8. El procedimiento de la reivindicacion 1, en el que la muestra es un fluido biologico.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 8, en el que el fluido es suero, sangre, plasma, esputo pulmonar o tensioactivo pulmonar.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 9, en el que el fluido es suero.
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