KR101162088B1 - 실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 - Google Patents
실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 Download PDFInfo
- Publication number
- KR101162088B1 KR101162088B1 KR1020080095870A KR20080095870A KR101162088B1 KR 101162088 B1 KR101162088 B1 KR 101162088B1 KR 1020080095870 A KR1020080095870 A KR 1020080095870A KR 20080095870 A KR20080095870 A KR 20080095870A KR 101162088 B1 KR101162088 B1 KR 101162088B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- pro
- hbv
- pres1
- seq
- gly
- Prior art date
Links
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/706—Specific hybridization probes for hepatitis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/08—Hepato-biliairy disorders other than hepatitis
- G01N2800/085—Liver diseases, e.g. portal hypertension, fibrosis, cirrhosis, bilirubin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Virology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
본 발명은 실시간 PCR을 이용하여 B형 간염에서 유래된 간질환 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변형된 preS1 항원 유전자를 검출할 수 있는 간질환 진단용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프로브를 포함한다. 본 발명의 간질환 진단키트를 사용할 경우, B형 간염, 간경변, 간암 등의 각종 간질환에 특이적인 변이된 HBV preS1 항원 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 preS1 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
HBV, preS1 항원, 트립토판, 프롤린
Description
본 발명은 실시간 PCR을 이용하여 Ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 실시간 PCR을 이용하여 B형 간염에서 유래된 간질환 환자에 특이적인 HBV로부터 유래된 변형된 preS1 항원 유전자를 검출할 수 있는 간질환 진단용 키트에 관한 것이다.
B형 간염 바이러스(hepatitis B virus, HBV)는 전세계적으로 약 3억명 이상 감염되어 있으며, 이의 감염은 무증상 감염, 만성 간염, 간경변, 간세포암으로 이행하는 다양한 임상경과를 보인다. 한편, 이러한 임상경과에는 HBV 염기서열 변이 이외에도, HBV 유전자형(genotype) 등이 영향을 미치는 바, 국내 환자에서 분리되는 HBV 대부분이 유전형 C라고 보고되고 있다(참조: Kim BJ and Song BC., Korean J. Gastroenterol., 42(6):496-501, 2003). 대부분의 HBV가 유전형 B와 유전형 B 에 비해 상대적으로 병원성이 높은 것으로 알려진 유전형 C를 동등한 수준으로 포함하는 것과는 달리, 국내환자에서 발견되는 HBV는 유전형 C를 상대적으로 높은 수준으로 포함하며, 이처럼 높은 수준의 유전형 C를 갖는 HBV는 지역특이적인 변이주를 발생시킬 가능성이 높기 때문에, 이에 대한 관심이 모아지고 있다.
한편, HBV 변이주 중에서 preS1 부위의 유전자 변이 특히 결실(deletion) 유전자 변이 및 preS1의 시작부위의 유전자 변이가 간질환의 악화, 특히 간세포암과 관련이 있다고 보고되었다(참조 Hsieh YH et al., Carcinogenesis 25: 2023-2032, 2004; Raimondo G et al., J Hepatol 40: 515-519, 2004). 지금까지 알려진 바에 의하면, HBV의 preS 부위는 preS1 부위와 preS1 부위로 구성되며, 이들은 S 항원과 함께 1개의 ORF로 구성되고, 각각 S 항원과 같은 C 말단을 공유하는 Large S 항원과 Middle S 항원을 코딩한다. 이 중, preS1 부위는 HBV의 간세포에 결합하는 부위가 포함되어 있고, S 항원에 전사 수준을 조절하는 S 프로모터가 존재하기 때문에, 이 부위의 유전자 변이는 S 항원의 발현에 큰 영향을 미치고, preS1 부위는 HBV에 대한 T 및 B 세포 수준에서의 숙주 면역반응의 표적이 되는 부위를 갖고 있으며, 이 부위의 유전자 변이가 급발성 간염 및 간암과 연관되어 있다고 알려져 있다.
현재, preS1 지역의 유전자 변이가 간질환의 악화와 연관이 있다고 알려져 있지만, preS1 부위의 염기서열 변이가 간질환의 악화에 영향을 미치는 기전은 아직까지 확실하지는 않다. 지금까지의 연구결과에 비추어 볼 때, 유전자 변이가 Large S 항원, Middle S 항원, 및 Small S 항원 세 단백의 발현 비율에 영향을 미 쳐서 결국 세포 외부로 이 단백들이 분비되지 않고 세포 내 소포체에 축적되기 때문에, 세포독성이 유발되는 것으로 예상되고 있다(참조: Chisari FV and Ferrari C., Annu Rev Immunol. 13:29-60, 1995).
이에 따라, B형 간염으로부터 유래된 다양한 임상적 증상에 있어서, HBV의 변이된 preS1 항원 단백질 또는 그를 암호화하는 유전자가 중요한 역할을 수행할 것이라는 가정 하에, HBV의 변이된 preS 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 용이하게 검출할 수 있는 방법을 개발하여, B형 간염의 악화를 예방 또는 조기 진단하려는 노력이 계속되고 있으나, 아직까지는 별다른 성과가 없는 실정이다.
이에, 본 발명자들은 B형 간염으로부터 유래된 다양한 임상적 증상에 영향을 미치는 HBV의 변이된 preS1 항원 유전자를 발굴하고, 전기 유전자를 효과적으로 검출할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력한 결과, 특정부위가 변이된 HBV의 preS1 항원 유전자가 간질환의 악화와 연관되어 있다는 사실을 발견하고, 상기 변이된 HBV의 preS1 항원을 암호화하는 유전자 부위를 검출할 수 있는 진단용 키트를 이용할 경우, 변이된 preS1 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 주된 목적은 HBV의 변이된 preS1 항원 단백질을 암호화하는 유전자를 검출함으로써, 이에 의하여 발병되는 간질환을 용이하게 진단할 수 있는 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 키트에 의하여 검출된 HBV의 변이된 preS1 항원 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 단백질을 암호화하는 유전자를 제공하는 것이다.
본 발명의 간질환 진단키트를 사용할 경우, B형 간염, 간경변, 간암 등의 각종 간질환에 특이적인 변이된 HBV preS1 항원 유전자를 용이하게 검출할 수 있으므로, 변이된 preS1 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
본 발명자들은 HBV에 감염된 간질환 환자의 혈액으로부터 DNA를 수득하고, 이에 포함된 HBV preS 항원의 염기서열을 분석하였다. 그 결과, 일부 환자로부터 수득한 preS1 항원 단백질의 4번째 아미노산인 트립토판을 암호화하는 유전자가 tgg가 아닌, 프롤린을 암호화하는 ccg로 변이된 형태(W4P)로 존재하며, 보균자 및 간질환이 정도가 양호한 간염환자에 비해 간질환의 악화가 심화된 간경변 및 간세 포암의 환자에게서 상기 유전자 변이의 변이율이 증가함을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명자들은 preS1 항원에서 W4P 변이를 나타내는 HBV는 간염의 증상을 악화시킬 수 있는 병원성이 높은 균주이고, 이를 조기에 진단할 경우, B형 간염으로부터 유래된 간질환의 발병을 예방할 수 있을 것으로 판단하고, 이에 사용하기 위한 키트를 개발하게 되었다.
구체적으로, 피검자로부터 수득한 시료로부터 DNA를 수득하고, 이를 주형으로하고, 하기의 프라이머 DelF2 및 HB2R를 이용한 PCR 증폭방법을 수행하여 PCR 절편을 수득하였다:
DelF2: 5'-GGG TCA CCA TAT TCT TGG G-3'(서열번호 1)
HB2R: 5'-CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3'(서열번호 2)
상기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 하기의 프라이머 preS1-F2 및 preS-R4와 프로브 앵커(anchor) 및 센서(sensor)를 이용한 실시간 PCR 증폭방법을 수행한 결과, W4P 변이를 포함하는 유전자는 증폭되었으나, W4P 변이를 포함하지 않는 유전자는 증폭되지 않음을 확인하였다:;
프라이머
preS1-F2: 5'-CTT GGG AAC AAG AGC TAC AGC-3'(서열번호 3)
preS1-R4: 5'-TTG AGA GAA GTC CAC CAC GA-3'(서열번호 4)
프로브
anchor: 5'-ACA GAA AGA TTC GTC CCC ATG CCT TGT CGA GG-Fluorscein-3'(서열번호 5)
sensor: 5'-LC Red 640-TGG AAG ACG GAC CTC CCA TG-Phospate-3'(서열번호 6)
결국, 본 발명의 B형 간염 및 B형 간염 유래 간질환 진단용 키트는 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프로브를 포함한다: 이때, B형 간염 유래 간질환은 특별이 이에 제한되지 않으나, 간암 또는 간경변이다.
아울러, 상기 키트를 이용하여, 다양한 HBV 감염에 의하여 간암 또는 간경변 이 발병한 환자의 시료를 대상으로 유전적으로 변이된 preS1 항원의 유전자를 검출한 결과, 서열번호 7 내지 11의 preS1 항원 유전자가 모두 preS1의 시작부위에서 4번째 아미노산을 암호화하는 유전자가 ccg임을 확인하였다.
아울러, 상기 서열번호 7 내지 11의 preS1 항원 유전자는 각각 서열번호 12 내지 17의 preS1 항원을 암호화하고, 상기 각 항원 단백질은 모두 4번째 아미노산이 프롤린임을 알 수 있었다.
따라서, 본 발명의 진단키트를 이용하거나 또는 상기 서열번호 7 내지 11의 유전자를 이용하면, 환자로부터 간질환에 특이적인 변이된 HBV preS1 항원 유전자를 용이하게 검출할 수 있을 것으로 예상되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: preS1 항원의 유전자 변이주의 검색
실시예 1-1: HBV 환자의 DNA 수득
간암, 간경변, 만성 간염 및 보균자의 임상 증상을 보이는 몇 명의 HBV 간염 환자로부터 수득한 혈액의 혈청 100㎕에 DNAzol(Molecular Research Center, Inc., USA) 500㎕를 첨가하여 1분간 혼합하고, 페놀/클로로포름/이소아밀알코올(50:49:1, v/v/v) 혼합용매 500㎕를 첨가한 다음, 실온에서 10분간 12,000rpm으로 원심분리하여 상층액 400㎕를 수득하였다. 전기 상층액에 이소프로판올 260㎕를 가하고 4℃에서 10분간 15,000rpm으로 원심분리하여 침전물을 수득하고, 전기 침전물을 70% 에탄올로 세척한 후, 다시 Tris 완충용액(pH 7.8) 30㎕에 용해시켜서 각 환자의 DNA를 수득하였다.
실시예 1-2: HBV preS1 항원의 염기서열 분석
전기 수득한 HBV 환자의 DNA에 존재하는 HBV DNA의 preS1 항원 유전자 변이양상을 분석하기 위하여, HBV의 EcoR I 절단부위를 기준으로 1로 하여, HBV의 preS1 지역을 포함하는 2814 내지 3037번까지의 223-bp의 염기서열을 결정하고, preS1 항원의 유전형 변이양상을 분석하였다.
먼저, 전기 실시예 1-1에서 수득한 DNA를 주형으로 하고, 정방향 프라이머 DelF2 (5'-GGG TCA CCA TAT TCT TGG G-3': 서열번호 1) 및 역방향 프라이머로 HB2R (5'-CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3': 서열번호 2)을 사용하여 PCR을 수행하여(first denaturation: 95℃ 10분; 30 cycle: 95℃ 45 초, 58℃ 60초, 72℃ 90 초; final extension: 72℃ 5분), pre-S1 유전자의 2814 에서 S 유전자의 989번째까지의 총 1491bp 염기서열을 갖는 PCR 절편을 수득하였다.
그런 다음, 전기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 정방향 프라이머 preS1-F2 (5'-CTT GGG AAC AAG AGC TAC AGC-3') 및 역방향 프라이머 preS-R4 (5'-TTG AGA GAA GTC CAC CAC GA-3')을 사용하는 것을 제외하고는, 상술한 바와 동일한 방법을 수행하여, 2814 내지 3037번째의 총 223-bp 염기서열을 갖는 PCR 절편을 수득하였다.
이어, 후기 수득한 각 223-bp의 PCR 절편(2814-3037)을 자동염기서열 분석장치(Applied Biosystems Model 377 DNA Automatic Sequencer, Perkin-Elmer Applied Biosystems, UK)에 적용하여, 각 환자로부터 수득한 PCR 절편 중 모든 preS1 지역을 포함하는 총 223-bp (2814-3037 bp) 염기서열을 결정하고, 이를 염기서열 분석프로그램(DNASTAR Megalign, Window Version 3.12e, Madison, USA)을 이용하여 GenBank에 등록된 HBV의 표준 염기서열과 비교분석하여, preS1 항원의 유전형 변이양상을 분석하였다(참조: 도 1).
도 1은 간염환자 특이적인 preS1 항원의 변이된 염기서열과 HBV의 야생형 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림이다. 도 1에서 보듯이, 각 환자로부터 수득한 일부 시료에서 preS1 항원 유전자의 변이가 발견되었다. 즉, 정상적인 HBV의 preS1 항원 단백질의 4 번 아미노산은 트립토판이고, 이를 암호화하는 유전자는 tgg이며, 일부 시료에서 수득한 PCR 절편에서는 preS1 항원 단백질의 네 번째 아미노산을 암호화하는 유전자가 tgg가 아닌, 프롤린인 ccg의 형태("W4P")로 존재함을 확인할 수 있었다.
특히, 간암환자 (Seldi26-4-HCC, JH29-HCC, JH33-HCC) 및 간경변 환자 (JejuII-65-LC, SNUII-16-LC, SNUII-42-LC)에서 W4P 변이를 갖는 preS1 항원 유전자가 존재하였고 보균자(A-hepa14) 중에선 80명 중 1명 만이 발견되었다. 만성간염 환자에서는 유전자 변이가 없는 야생형의 preS1 유전자를 가지고 있음을 확인하였다.
실시예 2: 실시간 PCR 증폭방법을 이용한 키트에 의한 변이된 preS1 항원의 검출
직접염기서열 분석없이 실시간 PCR 증폭방법을 이용한 방법만으로 변이된 preS1 항원을 검출할 수 있는 방법으로서, 다음과 같이 실시간 PCR 분석키트(Real-time PCR analysis kit)를 제작하였다.
실시예 2-1: 실시간 PCR 분석키트의 제작
프라이머 DelF2(5'-GGG TCA CCA TAT TCT TGG G-3', 서열번호 1), 프라이머 HB2R(5'-CAT ACT TTC CAA TCA ATA GG-3', 서열번호 2), 프라이머 preS1-F2(5'-GGG TCA CCA TAT TCT TGG GAA C-3', 서열번호 3), 프라이머 preS1-R4(5'-CGA ATG CTC CCR CTC CTA C-3', 서열번호 4)와 프로브 anchor(5'-ACA GAA AGA TTC GTC CCC ATG CCT TGT CGA GG-3', 서열번호 5) 및 프로브 sensor(5'-TGG AAG ACG GAC CTC CCA TG-3', 서열번호 6)을 각각 화학적으로 합성하고, 이를 포함하는 실시간 PCR 분석키트를 제작하였다.
이때, 상기 프로브 anchor는 3‘ 말단을 형광염료(fluorescein, TIM MOLBIOL Inc., Berlin, Germany)로 표지하고, 프로브 sensor는 5‘ 말단을 형광염료(LC Red640, TIM MOLBIOL Inc., Berlin, Germany)로 표지하며, 3’ 말단에 인산기(phosphate)를 부가하고, 상기 프로브 중에서 프로브 sensor가 표적 염기서열을 검출할 수 있도록 설계하였다.
실시예 2-2: 실시간 PCR 분석키트를 이용한 W4P 변이주의 검출
먼저, 상기 실시예 2-1에서 제작한 실시간 PCR 분석키트에 포함된 2종의 프라이머(DelF2 및 HB2R)를 이용하여, 중합효소 연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 즉, PCR은 실시예 1-1에서 수득한 각 환자(만성 간염환자, 간경변환자 및 간암환자)의 DNA를 주형으로 하고, 프라이머 DelF2(서열번호 1)과 HB2R(서열번호 2)를 이용하여 수행하여, PCR 절편을 수득하였다.
이어, 상기 수득한 PCR 절편을 주형으로 하고, 상기 실시예 2-1에서 제작한 실시간 PCR 분석키트에 포함된 2종의 프라이머(preS1-F2 및 preS1-R4) 및 프로브(anchor 및 sensor)를 이용하여 실시간 PCR 증폭방법을 다음과 같이 수행하였다: 마스터믹스(Taq buffer(LC Faststart DNA Master HP kit(Roche Diagnostics)): 1.25ul, MgCl2: 1ul(2 mM), preS1-F2: 0.469ul(0.75uM), preS1-R4: 0.219ul(0.35uM), Anchor: 0.75ul(0.18uM), Sensor: 0.75ul(0.18uM), 증류수: 7.063ul 및 검체 DNA: 1ul)를 실시간 PCR 기기(LightCycler 2.0 system)의 캐필러리에 12.5ul씩 분주하고, 상기 주형 DNA를 1ul를 가한 다음, 700 x g에서 15초동안 원심분리하였다. 그런 다음, 상기 캐필러리를 실시간 PCR 기기의 캐로셀(carousel)에 삽입하고, 실시간 PCR 기기용 프로그램(LightCycler software 4.05)을 이용하여, 증폭 사이클(95℃에서 10분간 1회 denaturation 및, 95℃에서 10초, 58℃에서 10초 및 72℃에서 20초의 45사이클)로 실시간 PCR을 수행하면서 각 사이클마다 형광값을 측정하였다.
그런 다음, 융해곡선(melting curve) 분석을 수행하기 위하여, 45℃에서 90℃까지 초당 0.1℃(0.1℃/s) 씩 올리면서 형광량을 측정하였다. 사이클 중에 생성된 증폭산물에 결합한 프로브에 의해 발생된 증폭신호를 검출하여 성공적인 증폭산물 생성을 모니터링하였다. 그런 다음, 증폭사이클이 종료되면, 곧바로 이어진 융해곡선 분석을 시행하여, 검체 DNA의 표적부위에 결합한 프로브의 Tm 값을 상기 프로그램을 이용하여 측정하였다.
그 결과, preS1 유전자에서 W4P 변이를 나타내는 Seldi26-4 변이주의 시료만이 실시간 PCR 증폭이 되었고, 다른 부분에 변이를 나타내는 변이주의 시료는 증폭 되지 않았다.
실시예 2-3: 실시간 PCR 분석키트를 이용한 HBV 간염 환자로부터 변이된 preS1 항원의 검출
332 명의 HBV에 감염된 간질환 환자(간암 환자 146명, 간경변 72명, 만성간염 34명, 보균자 80명)로부터 채혈한 혈액으로부터 DNA를 실시예 1-1과 같은 방법으로 수득하였다. 그리고, 그 DNA 를 주형으로 실시예 2-2 와 같은 방법으로, 실시간 PCR 증폭방법을 시행하여 결과를 분석하였다.
상술한 preS1 항원 단백질의 변이를 나타내는 시료를 HBV 환자의 유형에 따라 분류하였다(참조: 표 1). 이때, 변이율은 전체 환자수에 대한 변이 유전자를 갖는 환자수의 비율로 산출하였다.
| 변이유전자(환자수) | 정상유전자(환자수) | |
| 감암환자 간경변환자 만성간염환자 보균자 |
10.3%(15) 11.1%(8) 0%(0) 1.3%(1) |
89.7%(131) 88.9%(64) 100%(34) 98.7%(79) |
상기 표 2에서 보듯이, 상기 preS1 W4P 항원 단백질의 변이는 보균자에서는 발견되지 않았으나, 간질환 환자에게 332명 중 24명(7.2%)이 발견되었고, 간암환자에서는 146 명 중 15명(10.3%), 간경화 환자에서는 72명 중 8명(11.1%)이 발견되었다. 간암환자와 간경화 환자에서 218명 중 23명(10.6%)에 반해 만성간염 환자와 보균자에선 114명 중 한 명(0.9%)의 결과로 보아, 간질환의 정도가 악화될수록 변이항원 단백질의 변이율이 증가함을 알 수 있었으므로, preS1 항원 단백질의 변이가 간질환의 악화와 관련성이 있음을 알 수 있었다.
한편, 유전형 C를 갖는 다양한 HBV(Seldi26-4-HCC, JH29-HCC 및 JH33-HCC)의 감염에 의한 간암 환자 및 다양한 HBV(JejuII-65-LC 및 SNUII-16-LC)의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자를 대상으로 하여 상술한 바와 동일한 방법으로 염기서열을 분석한 결과, Seldi26-4-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자(서열번호 7), JH29-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자(서열번호 8), JH33-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자(서열번호 9), JejuII-65-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자(서열번호 10) 및 SNUII-16-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원 유전자(서열번호 11)는 모두 preS1의 시작부위에서 4번째 아미노산을 암호화하는 유전자가 ccg임을 확인하였다.
또한, 상기 간암 환자 및 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원을 대상으로 하여 상술한 바와 동일한 방법으로 아미노산 서열을 분석한 결과, Seldi26-4-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원(서열번호 12), JH29-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원(서열번호 13), JH33-HCC의 감염에 의한 간암 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원(서열번호 14), JejuII-65-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원(서열번호 15) 및 SNUII-16-LC의 감염에 의한 간경변 환자에서 유래된 HBV의 preS1 항원(서열번호 16)은 모두 preS1의 시작부위에서 4번째 아미노산이 프롤린임을 확인하였다.
따라서, preS1 항원의 변이(W4P)가 간암 및 간경변의 발병과 관련성이 있음을 다시 한번 확인할 수 있었다.
상기 결과에서 보듯이, 실시간 PCR 증폭방법을 이용한 키트를 이용할 경우에는, 야생형 preS1 항원 유전자 및 변이된 preS1 항원 유전자를 구별할 수 있으므로, 변이된 preS1 항원 유전자를 포함하는 HBV에 의하여 발병되는 간질환을 조기에 효과적으로 진단할 수 있을 것이다.
도 1은 간염환자 특이적인 preS1 항원의 변이된 염기서열과 HBV의 야생형 염기서열을 비교한 결과를 나타내는 그림이다.
<110> SEOUL NATIONAL UNIVERSITY INDUSTRY FOUNDATION
<120> A Diagnostic Kit for Hepatitis B-Associated Hepatic Disorder
Using Real-Time PCR
<160> 16
<170> KopatentIn 1.71
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 1
gggtcaccat attcttggg 19
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 2
catactttcc aatcaatagg 20
<210> 3
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 3
cttgggaaca agagctacag c 21
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> primer
<400> 4
ttgagagaag tccaccacga 20
<210> 5
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 5
acagaaagat tcgtccccat gccttgtcga gg 32
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> probe
<400> 6
tggaagacgg acctcccatg 20
<210> 7
<211> 357
<212> DNA
<213> Seldi26-4-HCC
<400> 7
atgggaggtc cgtcttccaa acctcgacac ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cattggccag aggccaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagcg gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggcc 357
<210> 8
<211> 357
<212> DNA
<213> JH29-HCC
<400> 8
atgggaggtc cgtcttccaa acctcgacac ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cattggccag aggccaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggagtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagcg gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggcc 357
<210> 9
<211> 357
<212> DNA
<213> JH33-HCC
<400> 9
atgggaggtc cgtcttccaa acctcgacac ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcgt tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cattggccag aggccaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccacca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagcg gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggcc 357
<210> 10
<211> 357
<212> DNA
<213> JejuII-65-LC
<400> 10
atgggaggtc cgtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcat tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccatca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggcc 357
<210> 11
<211> 357
<212> DNA
<213> SNUII-16-LC
<400> 11
atgggaggtc cgtcttccaa acctcgacaa ggcatgggga cgaatctttc tgttcccaat 60
cctctgggat tctttcccga tcaccagttg gaccctgcat tcggagccaa ctcaaacaat 120
ccagattggg acttcaaccc caacaaggat cactggccag aggcaaatca ggtaggagcg 180
ggagcattcg ggccagggtt caccccatca cacggcggtc ttttggggtg gagccctcag 240
gctcagggca tattgacaac agtgccagca gcgcctcctc ctgcctccac caatcggcag 300
tcaggaagac agcctactcc catctctcca cctctaagag acagtcatcc tcaggcc 357
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> Seldi26-4-HCC
<400> 12
Met Gly Gly Pro Ser Ser Lys Pro Arg His Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 13
<211> 119
<212> PRT
<213> JH29-HCC
<400> 13
Met Gly Gly Pro Ser Ser Lys Pro Arg His Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Glu Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 14
<211> 119
<212> PRT
<213> JH33-HCC
<400> 14
Met Gly Gly Pro Ser Ser Lys Pro Arg His Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Pro His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 15
<211> 119
<212> PRT
<213> JejuII-65-LC
<400> 15
Met Gly Gly Pro Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Ser His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
<210> 16
<211> 119
<212> PRT
<213> SNUII-16-LC
<400> 16
Met Gly Gly Pro Ser Ser Lys Pro Arg Gln Gly Met Gly Thr Asn Leu
1 5 10 15
Ser Val Pro Asn Pro Leu Gly Phe Phe Pro Asp His Gln Leu Asp Pro
20 25 30
Ala Phe Gly Ala Asn Ser Asn Asn Pro Asp Trp Asp Phe Asn Pro Asn
35 40 45
Lys Asp His Trp Pro Glu Ala Asn Gln Val Gly Ala Gly Ala Phe Gly
50 55 60
Pro Gly Phe Thr Pro Ser His Gly Gly Leu Leu Gly Trp Ser Pro Gln
65 70 75 80
Ala Gln Gly Ile Leu Thr Thr Val Pro Ala Ala Pro Pro Pro Ala Ser
85 90 95
Thr Asn Arg Gln Ser Gly Arg Gln Pro Thr Pro Ile Ser Pro Pro Leu
100 105 110
Arg Asp Ser His Pro Gln Ala
115
Claims (4)
- preS1 항원 단백질의 4번째 아미노산인 트립토판이 프롤린으로 치환된(W4P) 변이 단백질을 암호화하는 유전자를 검출하도록, 서열번호 1 내지 4의 염기서열을 갖는 프라이머 및 서열번호 5 및 6의 염기서열을 갖는 프로브를 포함하는, 간암 또는 간경변 진단용 키트.
- 삭제
- preS1 항원 단백질의 4번째 아미노산인 트립토판이 프롤린으로 치환된(W4P) 변이 단백질을 암호화하는, 서열번호 7 내지 11로부터 선택되는 1개의 염기서열을 가지는, HBV의 preS1 항원을 암호화하는 유전자.
- preS1 항원 단백질의 4번째 아미노산인 트립토판이 프롤린으로 치환된(W4P), 서열번호 12 내지 16으로부터 선택되는 1개의 아미노산 서열을 가지는, HBV의 preS1 항원 단백질.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080095870A KR101162088B1 (ko) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020080095870A KR101162088B1 (ko) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20100036582A KR20100036582A (ko) | 2010-04-08 |
| KR101162088B1 true KR101162088B1 (ko) | 2012-07-04 |
Family
ID=42214065
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020080095870A KR101162088B1 (ko) | 2008-09-30 | 2008-09-30 | 실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR101162088B1 (ko) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018145627A1 (en) * | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Tcm Biotech International Corp. | Probe combination for detection of cancer |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103184295B (zh) * | 2011-12-27 | 2015-08-05 | 上海星耀医学科技发展有限公司 | 一种乙型肝炎病毒核酸定量检测方法与试剂盒 |
| KR101446388B1 (ko) * | 2012-04-03 | 2014-10-01 | 서울대학교산학협력단 | Ｂ형 간염 바이러스의 ｐｒｅＳ1 Ｗ4Ｐ 변이 단백질을 발현하는 형질전환 동물 및 이의 용도 |
-
2008
- 2008-09-30 KR KR1020080095870A patent/KR101162088B1/ko active IP Right Grant
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Hepatology, Vol.33, No.1, pp.277-286(2001.01.)* |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018145627A1 (en) * | 2017-02-07 | 2018-08-16 | Tcm Biotech International Corp. | Probe combination for detection of cancer |
| US11319602B2 (en) | 2017-02-07 | 2022-05-03 | Tcm Biotech Internationl Corp. | Probe combination for detection of cancer |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR20100036582A (ko) | 2010-04-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101209312B1 (ko) | 실시간 중합효소 연쇄반응을 통한 ｈｂｖ 검출 방법 | |
| CN104450963B (zh) | 一种hbv dna数字pcr定量检测试剂盒及其应用 | |
| CN108570498A (zh) | 用于检测人类cyp2c9和vkorc1基因多态性的引物探针组合物、试剂盒及应用 | |
| EP0633320A1 (en) | Oligonucleotides of HCV, primers ND probes therefrom, method of determining HCV genotypes and method of detecting HVC in samples | |
| AU772692B2 (en) | Diagnostic assay | |
| KR101162088B1 (ko) | 실시간 ｐｃｒ을 이용하여 ｂ형 간염유래 간질환을 진단하기 위한 키트 | |
| KR20180047774A (ko) | 실시간 중합효소연쇄반응을 이용하여 rnf213 유전자의 돌연변이를 원인으로 하는 질병을 진단하기 위한 조성물 및 이의 이용 | |
| CN113355332B (zh) | Heg1基因突变体及其应用 | |
| KR102555330B1 (ko) | SARS-CoV-2 진단용 조성물, 키트 및 이를 이용한 SARS-CoV-2의 진단방법 | |
| Wang et al. | VKORC1 haplotypes influence the performance characteristics of PIVKAII for screening of hepatocellular carcinoma | |
| El-Kafrawy et al. | P53 mutations in hepatocellular carcinoma patients in Egypt | |
| KR101418836B1 (ko) | 간질환 진단용 마커 및 이의 용도 | |
| KR100758727B1 (ko) | Ｈｂｖ 환자의 간질환 악화 가능성 진단용 조성물 및 이를포함하는 진단용 키트 | |
| JP5713337B2 (ja) | Ｃ型肝炎ウイルス株の評価方法およびその利用 | |
| KR101402608B1 (ko) | 만성 ｂ형 간염 치료제의 약제내성 예측용 조성물 및 그 예측 방법 | |
| JP2008283945A (ja) | 肝癌検出用マーカー | |
| CN107312833B (zh) | 用于检测人类brca1基因突变的lsp引物及试剂盒 | |
| JPWO2005085436A1 (ja) | Ｂ型肝炎ウィルスによる発癌の検出法 | |
| KR100764850B1 (ko) | Ｈｂｖ ｓ항원을 이용한 ｂ형 간염 진단용 키트 | |
| KR20120022387A (ko) | 변이된 ＨＢＶ 코어 항원을 이용한 ＨＢｅ 항원 음성 만성 Ｂ형 간염 진단용 키트 | |
| KR101948816B1 (ko) | B형 간염 바이러스(hbv) 및 라미부딘 내성 hbv의 동시 검출용 조성물 | |
| KR101050477B1 (ko) | Ｈｂｖ 위음성 감염 관련 ｈｂｖ ｓ 항원 단백질 | |
| KR20090033307A (ko) | Ｂ형 간염 유래 간질환 진단용 키트 | |
| CN114182013A (zh) | 用于诊断肝细胞癌易感性的试剂盒及其应用 | |
| KR102091373B1 (ko) | C형간염 감염인 혈장에서 추출된 핵산으로부터 hcv 분자유전학적 특성 분석을 위한 유전자 증폭 및 염기서열 분석용 프라이머 세트 및 검사법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| AMND | Amendment | ||
| E601 | Decision to refuse application | ||
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| J201 | Request for trial against refusal decision | ||
| AMND | Amendment | ||
| B601 | Maintenance of original decision after re-examination before a trial | ||
| GRNT | Written decision to grant | ||
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20150601 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20160204 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20170524 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180521 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190828 Year of fee payment: 8 |