CN116064926A - 一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物及应用 - Google Patents

一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物及应用 Download PDF

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CN116064926A CN202210800395.8A CN202210800395A CN116064926A CN 116064926 A CN116064926 A CN 116064926A CN 202210800395 A CN202210800395 A CN 202210800395A CN 116064926 A CN116064926 A CN 116064926A
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Abstract

本申请涉及一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物及应用。所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和28组分别用于对28种人乳头瘤病毒核酸分型进行检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均标记有所述的通用标签引物，所述通用标签引物的碱基序列如SEQ ID NO:59所示。利用所述引物探针组合物或试剂盒能够实现28种HPV亚型的单管、同时检测，且检测准确性高、灵敏度和特异性好，同时全部检测过程能利用全自动设备自动实现。

Description

一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物及 应用
技术领域
本申请涉及分子生物学技术领域，尤其是涉及一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物及应用。
背景技术
人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus，HPV)属于乳头瘤病毒科，是一种小分子的、无被膜包被的环状双链DNA病毒，基因组长约8000碱基对(bp)，分为3个功能区，即早期转录区(E区)、晚期转录区(L区)和非转录区(长控制区，LCR)。HPV通过直接或间接接触污染物品或性传播感染人类。该病毒不但具有宿主特异性，而且具有组织特异性，只能感染人的皮肤和粘膜上皮细胞，引起人类皮肤的多种乳头状瘤或疣及生殖道上皮增生性损伤。
对于感染生殖道和肛门的HPV，根据各基因型别致病力大小或致癌危险性大小可分为低危型和高危型两大类。而持续性的高危型HPV感染则是导致宫颈上皮内瘤变及宫颈癌的主要原因。低危型HPV一般与尖锐湿疣或低度鳞状上皮内病变相关。
目前已报道发现的HPV亚型已超过百数之多，如果将这些亚型全部实现分型检测，不仅存在资源浪费和过度医疗的问题，且对于稀有亚型来说，检测该亚型所对应的临床意义并不大。考虑到各人群感染各亚型的比例的差异性以及早筛、早诊、早治的需求，对临床意义相关性较为明显的亚型实现快速、准确的分型检测，对于宫颈癌、尖锐湿疣等的早期诊断、早期治疗具有重要意义。
目前HPV的检测方法主要分为传统诊断和分子生物学诊断两大类，其中，细胞学、阴道镜、病理学均属于传统诊断方式的范畴。传统诊断由于其灵敏度和特异性的限制，限制了其在早筛早诊领域的应用。2021年7月6日，WHO发布了宫颈癌预防中宫颈癌癌前病变的筛查和治疗指南，推荐以HPV-DNA检测作为宫颈癌筛查的首选筛查方法，这也宣布了HPV的筛查正式进入了分子生物学技术时代。
市场上的HPV分子生物学检测技术主要包括不依赖扩增的杂交捕获-化学发光技术(凯杰、德同)，以及以结合多种信号检测方式的PCR检测技术，诸如荧光PCR、反向斑点杂交、液体芯片等(罗氏、亚能、透景等)。杂交捕获技术的灵敏度较低，只能达到105拷贝/mL的水平。PCR检测技术目前是HPV分子检测的主流技术，灵敏度可以达到103拷贝/mL的水平，但存在操作人工介入多、检测时间整体较长、中途开盖可能引入或导致污染等问题，只适合用于专业的PCR实验室以及专业人员进行操作，限制了其在基层单位的推广和应用。近期较为热门的恒温扩增荧光法也被引入到了HPV的检测，例如，北京海普威生物技术有限公司利用LAMP法检测HPV的产品在2021年取得了NMPA注册证；中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所在2021年8月份申请了RAA技术检测HPV16/18，HPV6/11的引物探针试剂盒专利，但恒温扩增技术由于不能像PCR技术那样利用升降温循环来降低错配导致的假阳性，所以直接使用恒温扩增荧光技术的检测方法为了回避假阳性，同样会导致灵敏度不够的问题。
目前HPV分子生物学的检测技术，从检测区域的选择上进行区分，主要为2种情况，一种为使用L1区域的通用引物，通过通用引物的设计来囊括多种亚型的扩增效果，利用特异性的探针来实现亚型的区分和识别。使用L1区域是目前HPV分型最主要的方法，但L1区域在病毒整合过程中存在缺失的可能，比如HPV18亚型已在多篇文献中有报道存在缺失，因此使用该设计会存在漏检的可能。另一种情况是使用E6/E7区域的引物，该区域不会随着病毒的整合而缺失，使用该区域检测可以从设计层面避免漏检。但由于该区域的引物保守度不高，所以实现多亚型的覆盖时需要多条引物，导致扩增体系庞大，扩增效率较低，因此该方法的亚型覆盖度一般都不高。
由于现有产品不能兼顾设计层面不漏检、可多分型、快速、操作及要求简单(可基层化)、灵敏度及特异性高，而随着早筛需求的逐渐普及，迫切需要一种操作简单(全自动、无人工介入)、快速且可分型、灵敏度及准确度、特异性高的综合性能优势明显的产品来满足市场的需要。
发明内容
为了解决现有技术的不足，本申请提供一种新的用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物和包括所述引物探针组合物的试剂盒，利用所述引物探针组合物或试剂盒能够实现28种HPV亚型的单管、同时检测，且检测准确性高、灵敏度和特异性好，同时全部检测过程能利用全自动设备自动实现。
为此，本申请第一方面提供了一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物，所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和28组分别用于对28种人乳头瘤病毒亚型进行核酸分型检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均连接有所述通用标签引物的碱基序列，所述通用标签引物的碱基序列如SEQ ID NO:59所示；优选地，所述通用标签引物的5’端修饰有生物素(biotin)。
对于多重体系来说，控制不同引物间的竞争干扰，以及抑制引物二聚体的形成是需要克服的重点内容。前人的研究已经证实，通过引入通用引物的方式，可以较大程度上控制不同引物间的竞争干扰。对于通用引物的设计，现有的文献和专利中多采用通用引物对的方式，通过在正、反向特异性引物的5’端分别加入一段通用序列，而且一般设计的通用引物的Tm值会高于特异性引物，然后利用两段式扩增实现降低多重引物间的竞争干扰。该方法仍然考验通用引物对的扩增效率，而且通用引物对之间仍然存在由于引物二聚体导致的扩增效率不理想的情况。
现有的文献报道了一种采用单条标签降低引物二聚体的方法，相关的现有专利中也是使用了单条通用引物(GCAAGCCCTCACGTAGCGAA)，实现了15种病原体的同时检测，但对该通用引物分析发现，该引物仍然存在形成二聚体的风险，如下所示。
Figure BDA0003733760790000021
因此，针对上述情况，本申请重新设计了一段通用标签引物(Tag)，其碱基序列为ATACGACTCACTCTTGCGA(SEQ ID NO:59)，该序列不与人源基因组、HPV、淋球菌、衣原体的基因组序列结合，且该序列与之前报道的相比，更不容易形成二聚体，如下所示，进而更有利于多重体系的扩增。
Figure BDA0003733760790000022
将该序列连接到设计完成的正反向特异性引物的5’端，形成标记的特异性引物。其中，标记有Tag的特异性引物用PAGE纯化，Tag的5’端标记biotin，HPLC纯化。与使用单条的L1引物的检测效果相比，使用该通用标签引物后的本申请的检测效果更好。
在一些实施方式中，所述28组分别用于对28种人乳头瘤病毒亚型进行核酸分型检测的引物探针组中的28条上游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:1～28所示，28条下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:30～57所示，28条探针的碱基序列分别如SEQ ID NO:60～87所示。
值得注意的是，本申请所请求保护的上述上、下游引物和探针的碱基序列不限于上述范围。引物和探针前后挪动几个碱基位置和或错配几个碱基也在本申请的保护范围内。
本申请中，术语“引物”表示这样的寡核苷酸：其能够通过模板依赖性DNA聚合酶“引发”DNA合成，即例如寡核苷酸的3’-末端提供游离3’-OH基团，可以通过模板依赖性DNA聚合酶将更多的“核苷酸”连接至所述3’-OH基团，建立3’至5’磷酸二酯键，由此使用脱氧核苷三磷酸，并且由此释放焦磷酸。
本申请中，术语“上游引物”，是沿着负链进行不间断延长的寡核苷酸；术语“下游引物”，是沿着正链进行不间断延长的寡核苷酸。应理解，当正链和反链的指定发生互换时，对应的上游引物和下游引物的命名也可随之互换。也即，本申请中的上游引物和下游引物是相对而言的。
本申请中，28组所述的引物探针组中的上、下游引物和探针均基于HPV基因组的E6/E7区域设计获得，因此利用上述引物和探针对HPV亚型进行检测时不会因为病毒整合引发的基因组缺失导致漏检，准确性高。同时所述所述引物探针组中的上、下游引物和探针均为各亚型的特异性引物和探针，通过引物和探针的双重设计保障靶点识别的特异性。进一步地，本申请所述引物探针组中的上、下游引物均采用通用标签引物进行了修饰，利用同一标签的作用降低多重体系中引物间的竞争抑制以及引物二聚体的影响，提高扩增效率和检测灵敏度。
在一些实施方式中，所述28条探针的5’端上均修饰有氨基(NH2)。
在一些实施方式中，所述引物探针组合物中还包括一组针对内参基因的引物探针组，其包括一条针对内参基因的上游引物、一条针对内参基因的下游引物和一条针内参基因的探针。
本申请中，通过设置内参基因可以监测采样情况以及监测全流程的检测过程，以确保检测过程的准确性。本申请中，所选用的内参基因为管家基因β-globin。
在一些实施方式中，所述针对内参基因的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO:29所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:58所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:88所示。
在一些实施方式中，所述针对内参基因的探针的5’端修饰有氨基。
需要注意的是，本申请中只是通用标签引物上修饰有生物素，而针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29对上、下游引物均无需修饰生物素。
本申请中，所述的28种人乳头瘤病毒亚型分别为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV58、HPV59、HPV61、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV82和HPV83。
依据WHO国际癌症研究机构(IARC)及其他国际组织的研究成果，《人乳头瘤病毒(HPV)核酸检测及基因分型、试剂技术审查指导原则》中纳入了18种HPV中高危型别，包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59和68，共13种高危型别，以及26、53、66、73和82，共5种中危型别。结合其他研究成果以及临床相关性情况，本申请将HPV6、11、40、42、43、44、54、61、81和83，共10种低危型别也纳入了分型检测的范围。
本申请第二方面提供了一种用于人乳头瘤病毒核酸分型的全自动检测试剂盒，其包括如本申请第一方面所述的引物探针组合物。
在一些实施方式中，所述试剂盒包括核酸提取试剂、扩增试剂和杂交显色试剂。
本申请中，所述扩增试剂中含有所述引物探针组合物中的所有引物(通用标签引物和29对上、下游引物)，用于对待测样本中的核酸进行多重PCR扩增。所述杂交显色试剂中含有所述引物探针组合物中的所有探针，所述探针用于捕获多重PCR扩增产物中的靶标序列，进而将扩增产物中的靶标序列固定于杂交膜的特定位点上，并用于后续显色。
在一些实施方式中，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品。
本申请利用上述阳性质控品和阴性质控品能够对检测结果进行有效质控，避免检测过程中假阳性和假阴性的出现，进一步确保检测结果的准确性。
在一些实施方式中，所述核酸提取试剂包括裂解液、磁珠、结合液、漂洗液和洗脱液。
本申请中，所述核酸提取试剂用于获取样本中的目标核酸。其中，所述裂解液用于破坏样本中细胞的结构，进而充分释放出细胞内的核酸；所述磁珠用于吸附裂解释放的核酸；所述结合液用于促进所释放的核酸与磁珠的结合；所述漂洗液用于纯化核酸，去除核酸中的杂质(蛋白质等)；所述洗脱液用于将所述磁珠与核酸分离，进而将纯化后的核酸释放，进而溶解在液相(如水)中。
在一些实施方式中，所述裂解液中包括胍盐、表面活性剂和第一缓冲盐；所述磁珠为硅羟基磁珠；所述结合液为异丙醇；所述漂洗液包括第二缓冲盐和有机醇；所述洗脱液为水(例如纯化水)。
在一些具体实施方式中，所述胍盐为盐酸胍，所述盐酸胍在所述裂解液中的浓度为2～8M；所述表面活性剂为吐温20，所述吐温20在所述裂解液中的浓度为1～20wt％；所述第一缓冲盐为MOPS(3-吗啉丙磺酸)，所述MOPS在所述裂解液中的浓度为20～100mM。
在一些优选的具体实施方式中，所述裂解液中含有6M的盐酸胍、10wt％的Tween20和100mM的MOPS。
在一些具体实施方式中，所述第二缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述漂洗液中的浓度为5～20mM；所述有机醇为乙醇，所述乙醇的体积浓度为40～70％。
在一些优选的具体实施方式中，所述漂洗液为含有10mM MOPS的70v/v％乙醇溶液。
在一些实施方式中，所述扩增试剂包括Taq酶、UNG酶、dNTPs、特异性引物和通用标签引物；其中，所述特异性引物为所述引物探针组合物中针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条上游引物和针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条下游引物。
本申请中，所述扩增试剂用于对裂解获得的目标核酸进行多重PCR扩增，进而对目标核酸中相应的标靶序列进行放大。
在一些实施方式中，所述扩增试剂中Taq酶的含量为0.5～1.5U，UNG酶的含量为0.03～1U，dNTPS的含量为0.2～0.3mM，特异性引物中每条引物的含量为0.005～5μM，通用标签引物的含量为0.1～5μM。
本申请中，所述Taq酶为一种具有热稳定性的DNA聚合酶；UNG酶为尿嘧啶-N-糖基化酶，其作用是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。本申请通过采用Taq酶和UNG酶，能够保证PCR结果的准确性，预防非特异性PCR扩增和污染。
本申请实现降低多重扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用主要是通过降低特异性引物的用量和提高通用标签引物的用量来实现的。因此，在设计多重体系时，所述扩增试剂中特异性引物中每条引物的含量为0.005～5μM，通用标签引物的含量为0.1～5μM。
在一些具体实施方式中，所述扩增试剂中Taq酶的含量为1.5U，UNG酶的含量为0.1U，dNTPS的含量为0.3mM，特异性引物中每条引物的含量为0.01μM，通用标签引物的含量为1μM。
在一些实施方式中，所述杂交显色试剂包括杂交膜、杂交漂洗液、酶结合液和显色液，其中所述杂交膜上固定有所述引物探针组合物中针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条探针。
本申请，所述杂交显色试剂用于对多重PCR扩增产物进行杂交显色。其中，杂交膜上固定有特异性探针，所述探针能够与扩增产物中相应的靶标序列特异性结合进而将所述靶标序列固定于所述杂交膜的特定位点上；所述杂交漂洗液用于提供杂交环境以及去除扩增产物中的非特异性物质的干扰；所述酶结合液中含有的酶能够通过生物素-链霉亲和素的结合固定于靶标序列上；所述显色液能够与酶结合液中的酶反应，进而对靶标序列进行显色。
在一些实施方式中，所述杂交膜上每条探针的含量为0.2～50μM，优选为20μM。
本申请中，所述探针可以通过纳升点膜技术点到杂交膜上。
在一些实施方式中，所述杂交膜为尼龙膜；所述杂交漂洗液中包括十二烷基硫酸钠和第三缓冲盐；所述酶结合液中包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中包括过氧化脲、第四缓冲盐和四甲基联苯胺。
在一些具体实施方式中，所述杂交漂洗液中所述十二烷基硫酸钠的浓度为5～15wt％；所述第三缓冲盐为磷酸盐，所述磷酸盐在所述杂交漂洗液中的浓度10～100mM；所述酶结合液中所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶(HRP)的浓度为(0.1～1)μg/mL；所述显色液中氧化脲的浓度为0.01～0.1wt％；所述第四缓冲盐为柠檬酸盐，所述柠檬酸盐在所述显色液中的浓度5～50mM；所述显色液中四甲基联苯胺(TMB)的浓度为0.01～0.05wt％。
在一些优选的具体实施方式中，所述杂交漂洗液中含有10wt％的SDS，10mM的磷酸盐；所述酶结合液中含有0.4μg/mL的链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中含有0.03wt％的过氧化脲、5mM的柠檬酸盐和0.015wt％的TMB。
在一些实施方式中，所述杂交膜上还固定有显色质控探针(SP探针)；优选地，所述杂交膜上显色质控探针的含量为0.2～50μM。在一些具体实施方式中，所述杂交膜的三个定位点上固定有显色质控探针。
本申请所述SP探针用于对杂交显色结果进行质控，以确保检测结果的准确性。另外，所述SP探针除了作为显色质控外，还用作软件自动识别和判读的定位点，通过3个定位点的设计，实现从人工肉眼判读到软件自动识别的转变。实验结束后，自动判读软件搜索位置固定的三个定位点(SP点)进行定位，并以此确定其他斑点出现的位置；再通过SP点大小设定一个模拟圆圈的范围，统计模拟圆圈内像素点的灰度平均值作为斑点亮度信息，统计斑点附近四个位置区域灰度均值作为背景亮度，点亮度与背景亮度的灰度差异即为该点的对比度读值。斑点显色越深，则斑点位置与周围区域的灰度差异就越大，继而对比度读值就越高，因此可以通过对比度读值情况反映斑点的检出结果。
在一些实施方式中，所述阳性质控品为检测结果为HPV16亚型阳性的Siha细胞；所述阴性质控品为检测结果为HPV各亚型均为阴性的HEK293细胞。
本申请中，利用上述试剂盒对人乳头瘤病毒核酸分型进行检测的原理属于核酸提取-扩增-反向斑点杂交法，具体为：利用核酸提取试剂，从样本中获得目标核酸；利用扩增试剂实现靶序列的放大；通过杂交将扩增后产物结合到杂交膜的探针上。由于引物中有biotin修饰，结合到杂交膜上的产物上也带有biotin修饰。通过生物素亲和素的相互作用，扩增产物可以结合修饰有链霉亲和素的HRP。然后利用HRP催化过氧化氢以及TMB的显色反应，实现目视化检测结果的呈现。如果样本中含有靶标，则该靶标经过提取扩增后富集放大的产物会结合到含有特异性探针的杂交膜上，继而会通过HRP-TMB的显色作用，在该探针位置呈现有蓝色斑点。
本申请所述试剂盒将各HPV亚型特异性探针以及内标探针通过纳升点膜技术固定在杂交膜上，因此利用本申请所述试剂盒能够一次检测实现对28种HPV亚型的检测，根据杂交膜上的各探针位置的显色情况判断样本中是否含有靶序列。同时所述试剂盒结合图2-3所示的设备、如图4-5所示的芯片配套使用，能够实现全检测过程的自动化，将目前市场上的手动分步操作转化为自动化进行，减少过程中的人工介入导致的误差以及手工操作开盖等引入的污染风险。
本申请第三方面提供了一种利用如本申请第二方面所述的试剂盒进行人乳头瘤病毒核酸分型的检测方法。
在一些实施方式中，所述方法包括如下步骤：
S1，采用所述核酸提取试剂获取待测样本中的目标核酸；
S2，将所述目标核酸与所述扩增试剂混合后进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S3，采用所述杂交显色试剂对所述扩增产物进行杂交显色，并对显色结果进行判读。
本申请中，步骤S1中待测样本中目标核酸的获取是通过磁珠法实现的，样本经过裂解液裂解后，释放的核酸被磁珠捕获，经过洗涤和洗脱后，得到纯化的目标核酸。
在一些实施方式中，步骤S2中，所述多重PCR扩增在单管中完成。
在一些具体实施方式中，所述多重PCR扩增的条件为：
37℃10min；
95℃2min；
95℃15s，55℃20s，72℃20s，45个循环；
72℃3min。
在一些具体实施方式中，步骤S3的具体操作为：将所述扩增产物与杂交膜在30℃～50℃下杂交10～15min，加入杂交漂洗液对杂交膜清洗后加入酶结合液，30～37℃反应10～15min，然后加入显色液(过氧化脲+TMB)，反应5～10min进行显色，并对显色结果进行判读。
在一些实施方式中，所述方法通过全自动化设备自动完成。
本申请所述方法能够通过全自动化设备自动完成，实现了全过程的无人工介入，进而避免了人工介入引入的操作误差或者污染，重复性好，稳定性高，适用于基层机构的筛查与检测。
具体地，本申请所述的检测方法与其他方法的特点比对分析如表1所示。
表1
Figure BDA0003733760790000051
通过表1可知，与现行产品相比，本申请所述方法在分型能力、检测时长、自动化程度上综合优势明显，且通过E6/E7区域的设计避免了由于设计层面的漏检。
本申请包括以下至少一种有益技术效果：
(1)灵敏度：本申请的引物探针组合物是采用漏检风险更低的E6/E7区域进行设计得到，在设计层面降低了漏检的可行性；且经过优化，本申请的引物探针组合物在灵敏度层面仍然保持了较高的水平。
(2)准确性：本申请在检测混合样本时，比对试剂检测阳性的样本，本申请均全部检出。本申请中除了检出了比对试剂中未包含的亚型外，还发现了1例HPV18阳性样本。该结果用一代测序进行了结果的确认，证实检测结果正确，表明该方法的准确性更高。同时，本申请的引物探针组合物或试剂盒能够同时实现28种HPV亚型的检测，由于增加了亚型覆盖度，本产品可以帮助更多的使用者获益。
(3)特异性：采用本申请的试剂盒检测本试剂盒中未包含的亚型，如HPV67、69、70、71、72，结果均为阴性；检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、白色念珠菌，结果也均为阴性，进一步确认了本申请对于试剂盒内包含的亚型具备高度的特异性。
(4)操作便捷性：在检测实施过程中，本申请涉及的操作只是将样本加入到检测芯片对应的样本池，其他操作全部由设备完成，从而降低了人工介入导致的污染，进一步提高了准确性。与涉及到大量操作的非自动化产品相比，本产品具备更好的用户友好度。
附图说明
图1为实施例2中各亚型以及内参基因的检测探针和质控探针在杂交膜上的点阵分布图；其中图中各标识的意义如下：
SP：显色质控探针；GB-内参基因质控探针；16、18等其他数字：HPV对应各亚型的特异性探针；
各标识判读时的使用规则为：(1)试剂盒内的阳性质控须在16、GB、SP位置处均出现阳性斑点，否则说明实验失败；(2)试剂盒内的阴性质控须在GB、SP位置出现阳性斑点，其他位置均不能出现阳性斑点，否则说明实验失败或发生污染。
图2为实施例3中所采用的自动化设备的外观图。
图3为实施例3中所采用的自动化设备的内部结构图。
图4为实施例3中所述设备内安装的芯片的正面图。
图5为实施例3中所述设备内安装的芯片的反面图。
具体实施方式
为使本申请更加容易理解，下面将结合实施例来进一步详细说明本申请，这些实施例仅起说明性作用，并不局限于本申请的应用范围。本申请中所使用的原料或组分若无特殊说明均可以通过商业途径或常规方法制得。除非另外指出，本申请的核酸序列按照5’到3’的方向从左到右写出。
实施例1：引物探针组合物的设计
从NCBI数据库中分别下载HPV6、11、16、18、26、31、33、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、56、58、59、61、66、68、73、81、82、83的基因组序列，进行序列比对，在E6/E7区域选择即保持亚型间特异性，又保持亚型内保守性的位置设计引物和探针。将设计的引物和探针分析彼此间的相互作用后，选择彼此间3’端无5个碱基及以上匹配的引物，以及彼此间无连续8个碱基及以上匹配的探针。
并进一步下载HPV67、69、70、71、72的序列，将上述设计的引物和探针与该序列进行比对分析，确认与上述型别无非特异交叉作用。
同时为了控制多重体系中不同引物间的竞争干扰，以及抑制引物二聚体的形成，本申请中设计了一段新的通用标签引物(Tag)，其碱基序列为ATACGACTCACTCTTGCGA(SEQID NO:59)，该序列不与人源基因组、HPV、淋球菌、衣原体的基因组序列结合，且该序列与之前报道的通用标签引物相比，更不容易形成二聚体，继而更有利于多重体系的扩增。将该序列连接到设计完成的正反向特异性引物的5’端，形成标记的特异性引物。其中，标记有Tag的特异性引物用PAGE纯化，Tag的5’端标记biotin，HPLC纯化。
本申请中选择管家基因β-globin作为检测的内参基因(内标)，用于监测采样情况以及监测全流程的检测过程。
经过理论分析和实验验证后，本申请中最终选择的引物和探针的碱基序列如表2所示。
表2：本申请所述引物探针组合物中的引物和探针的碱基序列
Figure BDA0003733760790000061
Figure BDA0003733760790000071
Figure BDA0003733760790000081
实施例2：多重检测体系的设计
1.核酸提取的条件
本申请中，核酸提取是通过磁珠法实现的，样品经过裂解液裂解后，释放的核酸被磁珠捕获，经过洗涤和洗脱后，得到纯化的核酸。
本实施例中，优选的核酸提取条件为：加入0.2mL样本，用0.2mL含10％Tween20、6M盐酸胍、100mM MOPS的裂解液在56℃裂解10min；然后加入0.2mL异丙醇、0.2mg硅羟基磁珠，结合10min；吸附磁珠，然后用含有10mM MOPS的70v/v％乙醇清洗磁珠；然后加入纯化水，56℃加热5min洗脱核酸。
2.扩增体系
本申请中，利用1条Tag的标记实现降低多重扩增体系的竞争干扰和引物二聚体的作用主要是通过降低特异性引物和提高Tag的用量来实现的。因此，本实施例在设计多重体系的扩增体系时，每条特异性引物的用量为0.01μM，Tag的用量为1μM，taq酶的用量为1.5U，dNTPS的用量为0.3mM，UNG酶的用量为0.1U。
使用实施例1中所设计的引物，根据本实施例中的扩增体系各组分的用量配制扩增体系，使用提取的核酸进行单管PCR扩增。
其中，扩增条件为：37℃10min；95℃2min；(95℃15s，55℃20s，72℃20s)，45个循环；72℃3min。
3.杂交体系
本申请中，将所检测的亚型的探针通过纳升点膜技术点到杂交膜上，各亚型以及内参基因的检测探针、质控探针在杂交膜上的点阵分布图如图1所示。通过单管扩增的多重产物，与涵盖所检测亚型的杂交膜进行杂交，实现多亚型的单管、同时检测。
本实施例中，优选的杂交体系为：杂交膜上的每条靶点探针的浓度为20μM；杂交漂洗液中SDS的浓度10wt％，缓冲盐为磷酸盐，浓度10mM；酶结合液中HPR浓度为0.4μg/mL；显色液中过氧化脲浓度为0.03wt％；缓冲盐为柠檬酸盐，浓度5mM；TMB浓度为0.015％，缓冲盐为柠檬酸盐，浓度5mM。
扩增完成后，扩增产物与杂交膜在37℃杂交15min，然后加入酶结合液，37℃反应10min，然后加入显色液(过氧化脲+TMB)，反应5min。根据加入模板的不同，可以在杂交膜上看到不同位置的显色斑点。
实施例3：HPV各亚型的检测
将各亚型人工合成质粒与Hek293细胞配制成各个亚型的模拟样品，根据实施例2的条件对上述模拟样品进行核酸提取、扩增和杂交，检测结果如表3所示。
上述检测过程采用的自动化设备自动进行。所采用的自动化设备为北京博晖创新生物技术集团股份有限公司生产的核酸芯片检测仪，其外观和内部结构图分别如图2和3所示；设备内安装的芯片的正面和反面图如图4和5所示。本实施例中所配套使用的芯片已获得专利授权(CN201110235199.2，CN201110235234.0，CN201210121023.9，CN201220175387.0)。
表3：HPV各亚型的检测结果
Figure BDA0003733760790000091
从表3可知，本申请对各亚型均可稳定检出。
实施例4：性能评价
本实施例中所采用的自动化设备同实施例3。
1.准确性检测
采用实施例2中确定的体系结合自动化设备，对10个混合样本进行全流程的自动化检测和性能验证，并将检测结果与已上市产品(表1中厂家C)进行性能比对，结果如表4所示。本实施例中所采用的自动化设备为北京博晖创新生物技术集团股份有限公司生产的核酸芯片检测仪，其外观和内部结构图分别如图2和3所示；设备内安装的芯片的正面和反面图如图4和5所示。本实施例中所配套使用的芯片已获得专利授权(CN201110235199.2，CN201110235234.0，CN201210121023.9，CN201220175387.0)。
表4：本申请的试剂盒与同类产品性能比对结果
Figure BDA0003733760790000101
从表4可知，比对试剂检测阳性的样本，采用本申请所述试剂盒的检测方法均全部检出。另外，本申请中除了检出了比对试剂中未包含的亚型外，还发现了1例HPV18阳性样本。该结果用一代测序进行了结果的确认，证实本实施例中的结果正确，表明采用本申请所述试剂盒的检测方法的准确性更高。
2.特异性检测
采用实施例2中确定的体系结合自动化设备，对本申请的试剂盒未包含的亚型(HPV67、69、70、71、72)、淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体和白色念珠菌，添加Hek293细胞后，进行全流程的自动化检测，结果如表5所示。
表5：特异性检测结果
Figure BDA0003733760790000111
从表5可知，采用本申请的方法检测本试剂盒中未包含的亚型，HPV67、69、70、71、72，结果均为阴性；检测淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、白色念珠菌，结果也均为阴性。且由于添加了Hek293细胞，内参均正常检出，证实检测过程正常，因此，该阴性结果可以表明，采用本申请所述试剂盒的检测方法对试剂盒内包含的亚型具备高度的特异性。
应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本申请，并不构成对本申请的任何限制。通过参照典型实施例对本申请进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本申请权利要求的范围内对本申请作出修改，以及在不背离本申请的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本申请涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本申请限于其中公开的特定例，相反，本申请可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。

Claims (15)

1.一种用于人乳头瘤病毒核酸分型检测的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物包括一条通用标签引物和28组分别用于对28种人乳头瘤病毒亚型进行核酸分型检测的引物探针组；其中每组所述的引物探针组中均包括一条上游引物、一条下游引物和一条探针，且所述上游引物和下游引物的5’端均连接有所述通用标签引物的碱基序列，所述通用标签引物的碱基序列如SEQ ID NO:59所示；优选地，所述通用标签引物的5’端修饰有生物素。
2. 根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，所述28组分别用于对28种人乳头瘤病毒亚型进行核酸分型检测的引物探针组中的28条上游引物的碱基序列分别如SEQID NO:1~28所示，28条下游引物的碱基序列分别如SEQ ID NO:30~57所示，28条探针的碱基序列分别如SEQ ID NO:60~87所示；优选地，所述28条探针的5’端均修饰有氨基。
3. 根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述引物探针组合物中还包括一组针对内参基因的引物探针组，其包括一条针对内参基因的上游引物、一条针对内参基因的下游引物和一条针内参基因的探针；优选地，所述针对内参基因的上游引物的碱基序列如SEQ ID NO: 29所示，下游引物的碱基序列如SEQ ID NO:58所示，探针的碱基序列如SEQ ID NO:88所示；进一步优选地，所述针对内参基因的探针的5’端修饰有氨基。
4.根据权利要求1或2所述的引物探针组合物，其特征在于，所述的28种人乳头瘤病毒亚型分别为HPV6、HPV11、HPV16、HPV18、HPV26、HPV31、HPV33、HPV35、HPV39、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV45、HPV51、HPV52、HPV53、HPV54、HPV56、HPV58、HPV59、HPV61、HPV66、HPV68、HPV73、HPV81、HPV82和HPV83。
5.一种用于人乳头瘤病毒核酸分型的全自动检测试剂盒，其包括如权利要求1-4中任意一项所述的引物探针组合物。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸提取试剂、扩增试剂和杂交显色试剂；优选地，所述试剂盒中还包括阳性质控品和阴性质控品。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述核酸提取试剂包括裂解液、磁珠、结合液、漂洗液和洗脱液；
优选地，所述裂解液中包括胍盐、表面活性剂和第一缓冲盐；所述磁珠为硅羟基磁珠；所述结合液为异丙醇；所述漂洗液中包括第二缓冲盐和有机醇；所述洗脱液为水；
进一步优选地，所述胍盐为盐酸胍，所述盐酸胍在所述裂解液中的浓度为2~8M；所述表面活性剂为吐温20，所述吐温20在所述裂解液中的浓度为1~20wt%；所述第一缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述裂解液中的浓度为20~100mM；
更进一步优选地，所述第二缓冲盐为MOPS，所述MOPS在所述漂洗液中的浓度为5~20mM；所述有机醇为乙醇，所述乙醇的体积浓度为40~70%。
8.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述扩增试剂包括Taq酶、UNG酶、dNTPs、特异性引物和通用标签引物；其中，所述特异性引物为所述引物探针组合物中针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条上游引物和针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条下游引物；
优选地，所述扩增试剂中Taq酶的含量为0.5~1.5U，UNG酶的含量为0.03~1U，dNTPS的含量为0.2~0.3mM，特异性引物中每条引物的含量为0.005~5μM，通用标签引物的含量为0.1~5μM。
9.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交显色试剂包括杂交膜、杂交漂洗液、酶结合液和显色液，其中所述杂交膜上固定有所述引物探针组合物中针对内参基因和28种人乳头瘤病毒亚型的29条探针；优选地，所述杂交膜上每条探针的含量为0.2~50μM；
优选地，所述杂交膜为尼龙膜；所述杂交漂洗液中包括十二烷基硫酸钠和第三缓冲盐；所述酶结合液中包括链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶；所述显色液中包括过氧化脲、第四缓冲盐和四甲基联苯胺；
进一步优选地，所述杂交漂洗液中所述十二烷基硫酸钠的浓度为5~15wt%；所述第三缓冲盐为磷酸盐，所述磷酸盐在所述杂交漂洗液中的浓度10~100mM；所述酶结合液中所述链霉亲和素标记的辣根过氧化物酶的浓度为（0.1~1）μg /mL；所述显色液中氧化脲的浓度为0.01~0.1wt%；所述第四缓冲盐为柠檬酸盐，所述柠檬酸盐在所述显色液中的浓度5~50mM；所述显色液中四甲基联苯胺的浓度为0.01~0.05wt%。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于，所述杂交膜上还固定有显色质控探针；优选地，所述杂交膜上显色质控探针的含量为0.2~50μM。
11.根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于，所述阳性质控品为检测结果为HPV16亚型阳性的Siha细胞；所述阴性质控品为检测结果为HPV各亚型均为阴性的HEK293细胞。
12.一种利用如权利要求6-11中任意一项所述的试剂盒进行人乳头瘤病毒核酸分型的检测方法。
13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
S1，采用所述核酸提取试剂获取待测样本中的目标核酸；
S2，将所述目标核酸与所述扩增试剂混合后进行多重PCR扩增，获得扩增产物；
S3，采用所述杂交显色试剂对所述扩增产物进行杂交显色，并对显色结果进行判读。
14.根据权利要求13所述的方法，步骤S2中，所述多重PCR扩增在单管中完成。
15.根据权利要求12-14中任意一项所述的方法，其特征在于，所述方法通过全自动化设备自动完成。
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