CN117821631A - 基于双重lamp-lfd检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于双重LAMP‑LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，属于分子生物检测领域，试剂盒至少包括双重LAMP引物组合(SEQ ID No.1～SEQ ID No.8)；可根据需要添加LAMP反应预混液、Bst II DNA聚合酶、阳性对照(猪链球菌和副猪格拉瑟菌DNA)、阴性对照(ddH2O)、扩增产物稀释液(ddH2O)或横向流动试纸条中的一种或多种。本发明主要针对猪链球菌特异性gdh基因和副猪格拉瑟菌特异性infB基因，成功开发双重LAMP‑LFD试剂盒及其检测方法，从而实现猪链球菌病和副猪格拉瑟病病原核酸快速鉴别诊断，为猪链球菌病和副猪格拉瑟病防控提供有效技术支撑。
Description
技术领域
本发明属于分子生物检测领域，具体涉及一种基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法。
背景技术
猪链球菌(Streptococcus suis,SS)和副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)是感染猪群中常见重要致病菌，其临床症状和病理变化相似，均可引起败血症、多发性浆膜炎、脑膜炎、关节炎和肺炎等。根据荚膜多糖的不同，将猪链球菌分为35个血清型(1～34型和1/2型)，其中1、2、1/2、7、9、14型为猪群中的主要致病血清型，尤以血清2型流行最广，危害最为严重。临床上副猪格拉瑟菌有15个血清型，各地流行菌株血清型不一。近年来，从临床典型病例中可分离出1、2、4、5、6、7、9、12、14型等血清型，但以4、5、12型最为常见，各血清型之间缺乏免疫交叉保护能力。猪链球菌和副猪格拉瑟菌易混合感染，且症状相似临床难以区分，因此，开发灵敏特异的诊断技术，对于疫病防控意义重大。
当前针对猪链球菌和副猪格拉瑟菌诊断方法主要包括流行病学、病原分离与鉴定、分子生物学和血清学检测方法。其中病原分离与鉴定操作繁杂，周期长，临床应用少；常规PCR、荧光定量PCR等分子生物学检测方法虽然具有特异性强、灵敏度高等优点，但是所需仪器较为昂贵、需要专业操作人员，也不利于临床现场使用。凝集试验、ELISA等血清学检测也存在对实验材料要求高、且无法实现同时检测此两种病原等缺点。
环介导等温扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification,LAMP)具有操作设备简便、敏感高效等突出优点。而横向流动试纸条(Lateral flow dipstick,LFD)具有结果观察直观、应用便捷等显著优势。目前，针对猪链球菌和副猪格拉瑟菌的双重LAMP-LFD检测方法尚未报道。因此，建立同时检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌双重LAMP-LFD检测方法，对猪链球病和格拉瑟病的诊断、流行病学调查及疫病防控具有重要意义。
发明内容
本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的双重LAMP-LFD试剂盒及其检测方法，从而实现快速诊断猪链球菌和副猪格拉瑟菌病原，达到及时防控。
本发明的技术方案为：基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的引物组合，包括两组LAMP引物，用于扩增猪链球菌的LAMP引物为：SS-F3的核苷酸序列如SEQIDNo.1所示；SS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；SS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；SS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；用于扩增副猪格拉瑟菌的LAMP引物为：GPS-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；GPS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；GPS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；GPS-BIP的核苷酸序列如SEQ IDNo.8所示。
进一步地，所述引物SS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物SS-BIP的5’端标记有6-FA M；所述引物GPS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物GPS-BIP的5’端标记有Digoxigenin。
基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的试剂盒，所述试剂盒含有上述所述的引物组合。
进一步地，所述试剂盒还包括LAMP反应预混液、Bst IIDNA聚合酶、扩增产物稀释液、横向流动试纸条、阴性对照或阳性对照中的一种或多种。
非疾病诊断目的基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，包括如下步骤：
(1)提取待检测样本的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以上述所述的引物组合进行LAMP扩增；
(3)将扩增产物加入横向流动试纸条，根据横向流动试纸条信息判断待检测样本是否含有猪链球菌或/和副猪格拉瑟菌。
进一步地，所述LAMP扩增的反应体系为：模板DNA 2μL，权利要求1或2所述的引物组合共1.6μL，2×LAMP反应预混液5μL，Bst IIDNA聚合酶2μL、ddH2O 14.4μL；所述LAMP扩增的反应程序为：62℃40min。
进一步地，所述引物组合的组成为：SS-F30.1μL、SS-B30.1μL、SS-FIP 0.2μL、SS-BIP 0.2μL、GPS-F30.1μL、GPS-B30.1μL、GPS-FIP 0.4μL、GPS-BIP 0.4μL。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明主要针对猪链球菌特异性gdh基因和副猪格拉瑟菌特异性infB基因，成功开发双重LAMP-LFD试剂盒及其检测方法，从而实现猪链球菌病和副猪格拉瑟病病原核酸快速鉴别诊断，为猪链球菌病和副猪格拉瑟病防控提供有效技术支撑。
附图说明
图1为双重LAMP-LFD结果判定示例，其中A：阳性；B：阴性；C：无效。
图2SS(A、C、E)和GPS(B、D、F)LAMP反应条件优化结果；M：DL 2000DN A Marker；A和B:1-8:60,60.3,61,62,63.2,64.2,64.7,65℃；9:ddH2O；C和D:1-6:20,25,30,35,40,45min；7:ddH2O；E和F:1-6:1:1,1:2,1:4,1:6,1:8,1:10。
图3重组质粒pMD-SS和pMD-GPS PCR扩增结果；M：DL 2000DNA Marker；1：pMD-SS；2：pMD-GPS。
图4重组质粒标准品pMD-SS和pMD-GPS为模板的双重LAMP-LFD敏感性检测；1-7：pMD-SS和pMD-GPS浓度从106-100copies/μL。
图5双重LAMP-LFD检测模拟组织样品；1：不含猪链球菌和副猪格拉瑟菌的猪肺组织；2-6：猪链球菌18～1.85×105CFU和副猪格拉瑟菌22～2.2×105CFU。
图6双重LAMP-LFD试剂盒特异性检测；1-6：猪链球菌1、2、7、9、14、16型；7-8：副猪嗜血杆菌5、4型；9：粪肠球菌；10：无乳链球菌；11：多杀性巴氏杆菌；12：胸膜肺炎放线杆菌；13：猪鼻支原体；14：化脓性链球菌；15：肺炎链球菌；16：副猪嗜血杆菌12型；17：阳性对照；18：阴性对照。
图7双重LAMP-LFD试剂盒在不同仪器中的检测。
具体实施方式
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。
猪链球菌1型CVCC2937株、猪链球菌2型CVCC9740株、猪链球菌7型CVCC563株、猪链球菌9型CVCC989株、猪链球菌14型CVCC212株、猪链球菌16型CVCC223株、猪鼻支原体CVCC679株、副猪格拉瑟菌4型CVCC156株、副猪格拉瑟菌5型CVCC167株、副猪格拉瑟菌12型CVCC134株、粪肠球菌CVCC1927株、无乳链球菌CVCC586株、多杀性巴氏杆菌CVCC390株、胸膜肺炎放线杆菌CVCC259株、化脓性链球菌CVCC593株、肺炎链球菌CVCC1929株均由中国兽医药品监察所保存与供应。
实施例1LAMP引物组的设计
靶基因选择是影响LAMP检测的重要因素之一。gdh基因编码猪链球菌重要毒力因子谷氨酸脱氢酶(GDH)，且该基因在不同血清型之间的核酸序列高度保守，相似性约96％～100％。infB基因在物种系统发育研究中是有用的遗传标记基因，在区分物种中也适用于副猪格拉瑟菌，且已有证实infB基因是检测副猪格拉瑟菌的良好靶标，可将副猪格拉瑟菌与其他所有密切相关的物种区分开来。根据猪链球菌gdh基因和副猪格拉瑟菌infB基因，各设计2对引物组，并对内引物分别进行标记，引物序列如表1所示
表12对LAMP引物组
实施例2LAMP反应温度、反应时间及引物浓度比的优化
运用单一控制变量法分别对反应温度、反应时间和引物浓度比进行优化。反应温度分别设置为60～65℃；反应时间分别设置为20～45min；内外引物浓度比(F3:FIP和B3:BIP)分别设置为1:1、1:2、1:4、1:6、1:8、1:10。反应结束后通过琼脂糖凝胶电泳进行比较。
结果显示，当反应温度为62℃时，LAMP扩增产物均出现清晰、典型梯形条带(图2中A、B)；当反应时间为40min及其以上时，LAMP扩增产物趋于稳定，条带清晰(图2中C、D)。当引物浓度为1:4时，单重LAMP扩增条带效果最好，条带更清晰(图2中E、F)。在此基础上，经优化双重LAMP反应体系中，猪链球菌引物浓度比(F3:FIP、B3:BIP)为1:2、副猪格拉菌引物浓度比(F3:FIP、B3:BIP)为1:4。
最终确定的反应体系和反应程序如下：
配成25μL双重LAMP反应体系为：含模板(样品DNA/阳性对照/阴性对照)2μL，引物组共1.6μL(SS-F30.1μL、SS-B30.1μL、SS-FIP 0.2μL、SS-BIP 0.2μL、GPS-F30.1μL、GPS-B30.1μL、GPS-FIP 0.4μL、GPS-BIP 0.4μL)，2×LAMP反应预混液5μL，Bst IIDNA聚合酶2μL、ddH2O 14.4μL。
反应程序为：62℃40min。
反应结束后，取5-10μL LAMP扩增产物用稀释液稀释20倍，混匀，取80μL稀释的反应产物滴于横向流动试纸条的加样孔，于15min内记录判读区检测结果。结果判定(见图1)：
若质控区(C)、检测1区(T1)和检测2区(T2)均出现阳性条带，则待检样品中含猪链球菌和副猪格拉瑟菌核酸；若质控区(C)、检测1区(T1)均出现阳性条带，检测2区(T2)未出现条带，则待检样品中仅含猪链球菌核酸；若质控区(C)、检测2区(T2)均出现阳性条带，检测1区(T1)未出现条带，则待检样品中仅含副猪格拉瑟菌核酸；若质控区(C)出现阳性条带，检测1区(T1)和检测2区(T2)未出现条带，则待检样品中不含猪链球菌和副猪格拉瑟菌核酸；若质控区(C)未出现阳性条带，检测1区(T1)和检测2区(T2)是否出现阳性条带，检测均视为无效。
横向流动试纸条主要由样品垫、共轭垫、硝化纤维素(NC膜)和吸收垫组装在一个普通的塑料粘合背衬板上。NC膜检测1区(T1)上固定的抗核酸标记物抗体1与内外引物分别标记6-FAM和Biotin的核酸扩增产物反应(呈红色)；NC膜检测2区(T2)上固定的抗核酸标记物抗体2与内外引物分别标记Digoxigenin和Biotin的核酸扩增产物反应(呈红色)；质控区(C)是判断样品是否足够，层析是否正常的标准，无论带标记物的核酸扩增产物是否存在样本中，质控区(C)均呈现蓝色条带。(其厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司，货号：B110201)
实施例3重组质粒标准品的构建
以猪链球菌和副猪格拉瑟菌基因组DNA为模板，利用设计的2对特异性引物(表2)分别进行单一PCR扩增，PCR扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测后，用DNA凝胶回收试剂盒回收PCR产物，连接至pMD18-T载体构建重组质粒pMD-SS和pMD-GPS，经菌液PCR鉴定、测序加以验证。利用紫外分光光度计检测2种阳性质粒浓度，分别计算其拷贝数。
表2构建重组质粒标准品的引物
结果显示，扩增的2条目的片段与预期一致(图3)。利用核酸蛋白测定仪Nano-Drop检测2种重组质粒浓度并换算至1×1010copies/μL。
实施例4双重LAMP-LFD试剂盒的构建
试剂盒至少包括双重LAMP引物组合(SEQ ID No.1～SEQ ID No.8)；可根据需要添加LAMP反应预混液、Bst IIDNA聚合酶、阳性对照(猪链球菌和副猪格拉瑟菌DNA)、阴性对照(ddH2O)、扩增产物稀释液(ddH2O)或横向流动试纸条中的一种或多种。
实施例5双重LAMP-LFD试剂盒灵敏度的确定
将2种阳性质粒等体积混合后进行10倍倍比稀释，以质粒浓度梯度为1×107copies/μl-1×100copies/μl为模板进行双重LAMP-LFD，确定其灵敏度。
由图4可知，双重LAMP-LFD检测的最低拷贝数均是10copies/μl。
实施例6双重LAMP-LFD试剂盒模拟组织样品中的敏感性确定
将猪链球菌接种在10mL含5％新生牛血清胰酪大豆胨液体培养基(TSB)，副猪格拉瑟菌接种在10mL含5％新生牛血清和0.1％NAD的TSB培养基中，37℃180r/min培养12h后将两种菌液进行连续10倍倍比稀释至10-7，用移液枪吸取不同稀释度的菌液(10-5、10-6、10-7)各100μL，分别滴加在含5％新生牛血清胰酪大豆胨琼脂培养基(TSA)和含5％新生牛血清和0.1％NAD的TSA培养基上，用涂菌棒将菌液涂布均匀，37℃培养12h后进行菌落计数，重复三次。取研磨后的0.25g猪肺组织，加入100μL稀释后的菌液，使用商业试剂盒进行核酸提取，然后用双重LAMP-LFD试剂盒进行检测。
结果显示，菌液计数结果如表3，经计算每毫升培养基中猪链球菌为1.85×108CFU、副猪格拉瑟菌为6×108CFU；双重LAMP-LFD检测结果如图5，最低检测菌数分别为18CFU、22CFU。
表3猪链球菌和副猪格拉菌菌液计数结果
实施例7双重LAMP-LFD试剂盒特异性检测
分别以猪链球菌1型、2型、7型、9型、14型、16型，猪鼻支原体、副猪格拉菌4型、5型、12型，粪肠球菌、无乳链球菌、多杀性巴氏杆菌、胸膜肺炎放线杆菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌的核酸为模板进行双重LAMP-LFD检测。以重组质粒pMD-SS和pMD-GPS的混合物为阳性对照，ddH2O为阴性对照，验证建立的双重LAMP-LFD方法的特异性。
结果显示，猪链球菌和副猪格拉瑟菌均能检测出，而其它猪病原体均无交叉反应(图5)，表明该方法具有良好的特异性。
实施例8重复性及适用性试验
制备3批诊断试剂分别进行批间与批内试验，验证其重复性；将同一批诊断试剂，分别在PCR仪、金属浴和水浴锅中进行恒温反应，比较在这三种仪器中的反应效果。
结果显示，批间与批内试验均一致，表明该方法重复性好。此外，同一批诊断试剂，在PCR仪、金属浴和水浴锅中的反应效果均一致(图7)。
实施例9临床应用
对采集的22份猪临床样本(胸腔积液、肺脏组织和鼻拭子)进行LAMP-LFD方法检测，同时采用国标法(GB/T 19915.5-2005《猪链球菌2型多重PCR检测方法》、GB/T34750-2017《副猪嗜血杆菌检测方法》)对上述样品进行检测，验证该方法的可行性。
结果显示，SS阳性率为36.36％(8/22)，GPS阳性率为45.45％(10/22)，混合感染率为13.34％(3/22)。此外，该方法与参考的国标法检测结果一致，表明其准确性较好。
表4临床样品检测结果
*SS：GB/T 19915.5-2005《猪链球菌2型多重PCR检测方法》；GPS：GB/T34750-2017《副猪嗜血杆菌检测方法》。
Claims (7)
1.基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的引物组合，其特征在于，包括两组LAMP引物，用于扩增猪链球菌的LAMP引物为：SS-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；SS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.2所示；SS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示；SS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.4所示；用于扩增副猪格拉瑟菌的LAMP引物为：GPS-F3的核苷酸序列如SEQ ID No.5所示；GPS-B3的核苷酸序列如SEQ ID No.6所示；GPS-FIP的核苷酸序列如SEQ ID No.7所示；GPS-BIP的核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。
2.根据权利要求1所述的引物组合，其特征在于，所述引物SS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物SS-BIP的5’端标记有6-FAM；所述引物GPS-FIP的5’端标记有Biotin，所述引物GPS-BIP的5’端标记有Digoxigenin。
3.基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒含有权利要求1或2所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括LAMP反应预混液、BstIIDNA聚合酶、扩增产物稀释液、横向流动试纸条、阴性对照或阳性对照中的一种或多种。
5.非疾病诊断目的基于双重LAMP-LFD检测猪链球菌和副猪格拉瑟菌的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)提取待检测样本的基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的DNA为模板，以权利要求1或2所述的引物组合进行LAMP扩增；
(3)将扩增产物加入横向流动试纸条，根据横向流动试纸条信息判断待检测样本是否含有猪链球菌或/和副猪格拉瑟菌。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述LAMP扩增的反应体系为：模板DNA 2μL，权利要求1或2所述的引物组合共1.6μL，2×LAMP反应预混液5μL，Bst IIDNA聚合酶2μL、ddH2O 14.4μL；所述LAMP扩增的反应程序为：62℃40min。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述引物组合的组成为：SS-F30.1μL、SS-B30.1μL、SS-FIP 0.2μL、SS-BIP 0.2μL、GPS-F30.1μL、GPS-B30.1μL、GPS-FI P 0.4μL、GPS-BIP 0.4μL。
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