CN116083449B - 一种旋柄腐霉的特异性检测靶标Phe_g13067及其应用 - Google Patents

一种旋柄腐霉的特异性检测靶标Phe_g13067及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种旋柄腐霉(Phytopythiumhelicoides)的检测新靶标Phe_g13067及其检测引物，该检测靶标Phe_g13067的DNA序列如SEQ IDNO：1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，还公开了特异性检测靶标Phe_g13067的PCR检测技术的特异性引物组合，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。同时，本发明所发掘的检测靶标和其设计的引物组合用于普通PCR，其特异性强，灵敏度高，证明Phe_g13067适合旋柄腐霉(Phytopythiumhelicoides)的检测靶标。本发明发掘的新靶标和基于该靶标建立的检测方法对于港口的进境植物上携带的Pp.helicoides实现即检即防，保护我国生态安全具有重要作用。

Description

一种旋柄腐霉的特异性检测靶标Phe_g13067及其应用
技术领域
本发明属于基因检测技术领域，具体涉及一种旋柄腐霉(Pp.helicoide s)的特异性检测靶标Phe_g13067及其应用。
背景技术
旋柄腐霉(Pp.helicoides)是腐霉属，寄主植物广泛，可侵染亚洲莲花、柑橘、猕猴桃、微型玫瑰、菊花、卡兰奇等植物。其在V8培养基上25℃培养4d菌落直径为25-46mm，7d菌落直径65-70mm。气生菌丝羊绒状，大多数菌株不产生色素而呈奶白色。孢子囊多倒卵形，较少近球形，具一孔突，顶生，偶有间生，近球形孢子囊直径为17-36μm。
旋柄腐霉是引起几种作物根腐病的重要病原体，特别是在循环营养液的潮起潮落灌溉系统中的小型玫瑰和长寿花。1930年由美国Drechsler首次从大丽花根中分离出旋柄腐霉(Pp.helicoides)。1996年，日本首次在发生根腐病的迷你玫瑰中发现旋柄腐霉(Pp.helicoides)，此后，猕猴桃等相继被发现也可以被旋柄腐霉侵染。日本已经报道了由旋柄腐霉(Pp.helicoide s)侵染引起的微型玫瑰、菊花、卡兰乔和草莓冠腐病和茎腐病。在美国，该病原也可以引起开心果根腐病。谢晓勇等首次报道旋柄腐霉(Pp.helicoi des)引起了玉米茎腐病。2019年，M.V.Marin等首次报道旋柄腐霉(Pp.helicoides)在美洲草莓上引起的冠腐病。2022年，周紫薇等首次报道旋柄腐霉(Pp.helicoides)引起石楠的冠枯病和根腐病。
为了阻止旋柄腐霉(Pp.helicoides)病原菌的传播，需要对其进行快速、准确地检测。发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因此选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。虽然现有技术中也有针对Pp.helicoides的快速分子检测，但是其检测靶标灵敏度并不高。
综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对Pp.helicoides的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
发明内容
针对现有技术中Pp.helicoides生物学检测方法所需周期长、检测方法特异性差、灵敏度低、特异性检测靶标较少的问题，本发明提供一种新的Pp.helicoides的检测靶标Phe_g13067及基于新检测靶标的PCR检测引物组合物。
第一方面，本发明提供了一种Pp.helicoides的特异性检测靶标Phe_g13067，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
ATGGCTCGAGCCAGCAGCGCCCCAGCGACTCGTAAGAAGGCGACGG
CCGGCCAGGCGAAGAAGGCTGCGGTGGCGTCGTCCACCAAACAAAA
GGCGGGGCCTAAATCCAACCCAACTCCAAAAGCCGACGCGACTTCTA
AAGTGAAGGCAATCTCGAAGGCAAAGGCAACCTCGAAGGGAAAGAA
AACCCAGACGGTAAAGGCAACTGCGAAGGGAAAAGCAGCTCCCAAG
TCAAAGGCAGTATCCGTGGGGAAGGCGAAGGGGTCGATTGGTCACG
TCGTCGTCAGCTCCCATGAAACGCCATACGAACGCCTGACATCTTCG
GAGAAAGAGTACGCCACCCAGGAGCTCGCGAATGCCGCAGTTCTGG
AGATGTGGAATGAGTACAAGTCCGAATACCAGTTGGAGGGATGCAG
ACTTTACAAGAACAAAGCAGGTTACTGCAAATTCTTCATGCGCGGTC
AAGAAGGCACAGAGACCACGCTCGAAGCCCGTCCAAAGATGACTGA
TCTGAGCTGGGAGCTAGCAGAGGTCGGTGCTTCCGAAGATCCAGATGCCTGGAACTAG(SEQ ID NO：1)
第二方面，本发明还提供了一种Pp.helicoides的特异性检测靶标Phe_g13067，其编码的蛋白质序列如SEQ ID NO:2所示。
MARASSAPATRKKATAGQAKKAAVASSTKQKAGPKSNPTPKADATSK
VKAISKAKATSKGKKTQTVKATAKGKAAPKSKAVSVGKAKGSIGHVV
VSSHETPYERLTSSEKEYATQELANAAVLEMWNEYKSEYQLEGCRLYKN
KAGYCKFFMRGQEGTETTLEARPKMTDLSWELAEVGASEDPDAWN(SEQ ID NO：2)
第三方面，本发明还提供了一种检测Pp.helicoides的引物组合，其正向引物Pheg13067-F2序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Pheg13067-R2序列如SEQ ID NO：4所示。
Pheg13067-F2：AGCGCCCCAGCGACTCGTAA(SEQ ID NO：3)
Pheg13067-R2：CTTCCCCACGGATACTGCCT(SEQ ID NO：4)
第四方面，本发明还提供了一种检测旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)的试剂盒，所述试剂盒包括至少一次用量的含有所述的引物组合的检测溶液。
进一步地，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
第五方面，本发明还提供了所述的旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)的特异性检测靶标Phe_g13067、所述的引物组合以及所述的试剂盒在检测旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)中的应用。
第六方面，本发明还提供了一种检测旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)的方法，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求5中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸45秒；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
相比于现有技术，本发明的优点为：
1)本发明首次公开了高信赖度特异性分子检测靶标Phe_g13067，并基于该新靶标建立灵敏、准确PCR检测技术体系，对提升对Pp.helicoides的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。
2)采用本发明提供的检测引物组合针对Pp.helicoides能够扩增出特异性条带，条带大小为240bp；同时，经过特异性实验证明，PCR法检测Pp.helicoides基因组DNA的灵敏度为100pg.μL-1。
3)本发明为Pp.helicoides的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，在病害侵染初期鉴定出病原物，本发明可以用于带菌植株组织中Pp.helicoides的快速检测，能够对入境样品中含有的检疫性病原物进行快速检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1是基于Pp.helicoides新检测靶标Phe_g13067设计的特异性引物Pheg13067-F2/Pheg13067-R2在疫霉属种间普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Pheg13067-F2和下游引物Pheg13067-R2只能从供试的Pp.helicoides菌株中特异地扩增出一条240bp的条带，而其余疫霉属未产生目的条带；其中，从左边到右边，依次为：1，Marker；2，旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)；3，Pythiumplurisporium腐霉；4，瓜果腐霉(Pythium aphanidermatum)；5，刺腐霉(Pythium spinosum)；6，湖滨疫腐霉(Phytopythiumlittorals)；7，宽雄腐霉(Pythium dissotocum)；8，异丝腐霉(Pythium diclinum)；9，N阴性对照。
图2是Pp.helicoides新检测靶标Phe_g13067设计的特异性引物在其他真菌和卵菌中的普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Pheg13067-F2和下游引物Pheg13067-R2只能从供试的Pp.helicoides菌株中特异地扩增出一条240bp的条带，而其余真菌或卵菌未产生目的条带。
图3是基于旋柄腐霉(Pp.helicoides)新检测靶标Phe_g13067设计的检测引物组合的灵敏度验证电泳图，结果显示该引物的检测灵敏度能达到100pg·μL-1。
图4基于旋柄腐霉(Pp.helicoides)新检测靶标Phe_g9226设计的检测引物组合的特异性验证电泳图。结果表明能从供试的Pp.helicoides菌株中特异地扩增出一条240bp的条带，而其余真菌或卵菌未产生目的条带。
图5基于旋柄腐霉(Pp.helicoides)新检测靶标Phe_g9226设计的检测引物组合的灵敏度验证电泳图。结果显示该引物的检测灵敏度灵敏度仅10ng/uL。
图6为基于Pp.helicoides新检测靶标Phe_g13067在人工接种植物的发病图及检测结果图。图6A为人工接种旋柄腐霉Pp.helicoides的发病杜鹃叶片图，CK是人工接种空白琼脂快的杜鹃叶片，1是人工接种杜鹃旋柄腐霉发病第一天的杜鹃叶片，2是发病第二天的杜鹃叶片，3是发病第三天的杜鹃叶片，4是发病第四天的杜鹃叶片，5是发病第四天的杜鹃叶片。图6B为人工接种杜鹃叶片病原菌旋柄腐霉(Pp.helicoides)的发病杜鹃的PCR检测结果。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(2000bp)、旋柄疫腐霉(P.helicoides)病原菌、NC(健康植物作为阴性对照)、发病第一天、发病第二天、发病第三天、发病第四天、发病第五天。结果显示，旋柄腐霉(Pp.helicoides)菌株及人工接种旋柄腐霉(Pp.helicoides)的杜鹃提取的DN A均可特异地扩增出一条240bp的条带，而人工接种琼脂块的杜鹃提取的DNA及阴性对照没有出现扩增条带。
具体实施方式
下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。
实施例1
本研究通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得旋柄腐霉(Pp.helicoides)特异性检测靶标1000个以上；随机从旋柄腐霉(Pp.helicoides)1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物，表1列出其中4个靶标基因(表1)。采用PCR技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与旋柄腐霉(Pp.helic oides)不同种Pythiumplurisporium腐霉；瓜果腐霉(Pythium aphanidermatu m)；刺腐霉(Pythiumspinosum)；Phytopythium littorals腐霉；宽雄腐霉(Pythium dissotocum)；异丝腐霉(Pythium diclinum)和不同属的菌(松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)；平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；印度腥黑粉菌(Tilletia indica)；莴苣盘梗霉菌(Bremia lactucae)；茄病镰刀菌(Fusarium solani)；链格孢菌(Alternaria alternata)；贵腐霉菌(Botrytis cinerea)等的DNA作为模板，进行PCR特异性和灵敏度验证，最终获得1个旋柄腐霉(Pp.helicoi des)的检测新靶标基因。
表1旋柄腐霉(Pp.helicoides)的4个特异性基因序列表
新靶标基因Phe_g13067其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：1，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，并基于该新靶标建立灵敏、准确的PCR检测技术体系。
该检测技术体系所使用的PCR检测引物组合物：由上游引物Pheg13067-F2和下游引物Pheg13067-R2，各引物序列具体如下：
Pheg13067-F2：AGCGCCCCAGCGACTCGTAA(SEQ ID NO：3)
Pheg13067-R2：CTTCCCCACGGATACTGCCT(SEQ ID NO：4)
提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸45秒；33个循环，最后72℃延伸10分钟。其中，所述1mL所述的检测溶液包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶(TaKaRa)、特异引物Pheg13067-F2和Pheg13067-R220μM引物，加入超纯水制备成1mL检测溶液。
反应结束后取10μL扩增产物于1.0％琼脂糖凝胶中电泳30min(150V)，在凝胶成像系统上检测并拍照。每个实验至少重复3次。
实施例2
为了验证旋柄腐霉(Pp.helicoides)的特异性引物序列，本实施例以3株旋柄腐霉(Pp.helicoides)菌株和病原真菌以及其它卵菌为供试材料(表2)，采用CTAB法提取发病组织中旋柄腐霉(Pp.helicoides)的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。
表2用于旋柄腐霉(Pp.helicoides)PCR检测的真菌和卵菌
PCR检测结果如图1、图2所示，旋柄腐霉(Pp.helicoides)菌株均可特异地扩增出一条240bp的条带，其余病原真菌以及卵菌琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与旋柄腐霉(Phytopythium helicoides)不同种Pyt hiumplurisporium腐霉；瓜果腐霉(Pythiumaphanidermatum)；刺腐霉(Pyt hium spinosum)；湖滨疫腐霉(Phytopythium littorals)；宽雄腐霉(Pythi um dissotocum)；异丝腐霉(Pythium diclinum)和不同属的菌(松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)；平头炭疽菌(Colletotrichum truncatum)；立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)；印度腥黑粉菌(Tilletia indica)；莴苣盘梗霉菌(Bremialactucae)；腐皮镰孢菌(Fusarium solani)；链格孢菌(Alternaria alternata)；灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)等的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒，62℃退火30秒；72℃延伸45秒；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
证明所设计的特异性引物上游引物和下游引物PCR特异性引物具有种的特异性，Phe_g13067是一个特异性较强的新检测靶标。
实施例3
用旋柄腐霉(Pp.helicoides)的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng.μL-1。将其依次稀释为10ng.μL-1、1ng.μL-1、100pg.μL-1、10pg.μL-1、1pg.μL-1、100fg.μL-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行PCR检测。结果如图3所示，25μL的反应体系中分别含有100ng.μL-1、10ng.μL-1、1ng.μL-1、100pg.μL-1Pp.helicoidesDNA的出现240bp特异性阳性条带，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有10pg.μL-1、1pg.μL-1、100fg.μL-1Pp.helicoides DNA的未出现特异性条带呈阴性反应；结果表明PCR检测的灵敏度达到100pg.μL-1(图3)。
对比例
针对旋柄腐霉(Pp.helicoides)的特异性检测靶标的选择和PCR引物组的设计，本发明初步选择了4个靶标(Phe_g13067、Phe_g9226、Phe_g4051、Phe_g12623)并基于4个靶标设计了符合条件的引物，最终筛选出1个特异性检测新靶标Phe_g13067，且基于该靶标设计了1组最为特异并灵敏度极高的引物，即实施例1中所使用的引物组合物(上游引物Pheg13067-F2和下游引物Pheg13067-R2)。采用其余3个检测靶标设计的引物，通过PCR检测结果显示其特异性不高，以靶标Phe_g9226为例，其实际的引物序列为：Phe_g9226-F1:(SEQID NO.6)ATCTCGGCCACTGCAGCCTC；Phe_g9226-F1:(SEQ ID NO.7)CTTACTGGCCTTGGCCTTGG；实施例2中所采用的菌株为供试材料旋柄腐霉(Pp.helicoides)和其它腐霉以及多种病原真菌，PCR检测结果显示剩余所选引物的特异性高，结果如图4所示；但灵敏度差，仅10ng.μL-1，结果如图5所示。
而本发明最终筛选出高信赖度特异性分子检测靶标Phe_g13067及基于该靶标设计的特异性引物(Pheg13067-F2、Pheg13067-R2)，经过灵敏度检测，25μL的反应体系中分别不同浓度：100ng.μL-1、10ng.μL-1、1ng.μL-1、100pg.μL-1、10pg.μL-1、1pg.μL-1、100fg.μL-1的旋柄腐霉(Pp.helicoides)DNA；用这些不同浓度的旋柄腐霉(Pp.helicoides)的标准菌株的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增，反应重复实验3次。3次重复实验的结果一致，扩增结果如图3所示。在基因组DNA浓度为10pg.μL-1时，PCR检测能够检测出特异性条带，证明发生特异性扩增，检测结果判为阳性。而在基因组DNA浓度为10pg.μL-1时，PCR产物经检测没有发现特异性条带，证明没有发生特异性扩增，检测结果判为阴性，即PCR法检测旋柄腐霉(Pp.helicoides)基因组DNA的灵敏度为100pg.μL-1。
实施例4
当用于发病组织中存在旋柄腐霉(Pp.helicoides)时，采用NaOH快速裂解法提取旋柄腐霉菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5MNaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。
采用NaOH碱裂解法提取接种旋柄腐霉(Pp.helicoides)菌的发病杜鹃组织的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。取1uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行PCR反应。图6A为人工接种旋柄腐霉的感病杜鹃，其中CK是人工接种空白琼脂快的杜鹃叶片，1是人工接种杜鹃旋柄腐霉第一天致病的杜鹃叶片，2是人工接种杜鹃旋柄腐霉第二天致病的杜鹃叶片，3是人工接种杜鹃旋柄腐霉第三天致病的杜鹃叶片，4是人工接种杜鹃旋柄腐霉第四天致病的杜鹃叶片，5是人工接种杜鹃旋柄腐霉第五天致病的杜鹃叶片。图6B为人工接种杜鹃叶片病原菌旋柄腐霉(Pp.helicoides)的发病杜鹃的PC R检测结果。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(2000bp)、旋柄疫腐霉(Pp.helicoides)、NC(阴性对照)、人工接种旋柄腐霉(Pp.helicoid es)的杜鹃第一天、人工接种旋柄腐霉(Pp.helicoides)的杜鹃第二天，人工接种杜鹃第三天，人工接种杜鹃第四天，人工接种杜鹃第五天。结果显示，旋柄腐霉(Pp.helicoides)菌株及人工接种旋柄腐霉(Pp.helicoides)的杜鹃提取的DNA均可特异地扩增出一条240bp的条带，而人工接种琼脂块的杜鹃提取的DNA及阴性对照没有出现扩增条带。
除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

Claims (6)

1.一种旋柄腐霉(Pp.helicoides)的特异性检测靶标Phe_g13067，其特征在于，所述检测靶标的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种检测权利要求1所述的旋柄腐霉(Pp.helicoides)的特异性检测靶标Phe_g13067的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括正向引物Pheg13067-F2和反向引物Pheg13067-R2，所述正向引物Pheg13067-F2序列如SEQ IDNO：3所示，反向引物Pheg13067-R2序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种检测权利要求1所述的旋柄腐霉(Pp.helicoides)的特异性检测靶标Phe_g13067的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括至少一次用量的含有权利要求2中所述的引物组合的检测溶液。
4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg2+，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。
5.权利要求2所述的引物组合或权利要求4所述的试剂盒在检测旋柄腐霉(Pp.helicoides)中的应用。
6.一种检测旋柄腐霉(Pp.helicoides)的方法，其特征在于，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求4中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒；62℃退火30秒；72℃延伸45秒；33个循环，最后72℃延伸10分钟。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234432A (zh) * 2018-10-12 2019-01-18 南京农业大学 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒
CN112143824A (zh) * 2020-09-04 2020-12-29 陕西师范大学 一种钟器腐霉菌检测引物、lamp检测体系、试剂盒及方法
CN114457186A (zh) * 2022-03-09 2022-05-10 南京林业大学 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP6167310B2 (ja) * 2015-08-03 2017-07-26 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 試験試料が植物病原性卵菌を含有するかどうかを判定する方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109234432A (zh) * 2018-10-12 2019-01-18 南京农业大学 一种基于重组酶聚合酶扩增方法检测大豆猝倒病的引物、探针和试剂盒
CN112143824A (zh) * 2020-09-04 2020-12-29 陕西师范大学 一种钟器腐霉菌检测引物、lamp检测体系、试剂盒及方法
CN114457186A (zh) * 2022-03-09 2022-05-10 南京林业大学 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用

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