CN112143824A - 一种钟器腐霉菌检测引物、lamp检测体系、试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种钟器腐霉菌检测引物、LAMP检测体系、试剂盒及方法。检测引物包含：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环引物环引物LF。比起传统的依据形态特征来鉴定钟器腐霉菌的检测技术，本发明的检测方法具备高准确性、灵敏度且操作方便，在实现了恒温扩增的同时，还为钟器腐霉的检测提供了新的技术平台。可用于生产实践中钟器腐霉的高灵敏度快速检测，可在病害侵染初期鉴定出病原物，并能够对田间土壤中的钟器腐霉菌进行检测。本发明为钟器腐霉菌的防治提供可靠的技术和理论依据。

Description

一种钟器腐霉菌检测引物、LAMP检测体系、试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种钟器腐霉菌检测引物、LAMP检测体系、试剂盒及方法。

背景技术

钟器腐霉(Phytopythiumvexans)属于藻物界(Chromista)、卵菌门(Oomycota)、卵菌纲(Oomycetes)、霜霉目(Pythiales)、腐霉科(Pythiaceae)、疫腐霉属(Phytopythium)。钟器腐霉是一种土传性致病腐霉菌，宿主范围极其广泛，可侵染橡 胶树、马铃薯、甘蔗和猕猴桃等多种经济作物及药用植物等，引发根部疾病，苗期腐烂 等症状，并具世界性分布且已成为许多农作物苗期病害的重要致病菌之一。目前对该病 害还没有有效的检测防治措施，所以建立钟器腐霉的快速分子检测对于其引起的疾病早 期控制具有重要意义。

目前，针对钟器腐霉的检测技术较少。传统的检测方法主要是平板分离法和诱饵法， 并依据形态学特征对其进行鉴定。由于腐霉生长受温度影响形态不稳定且耗时长灵敏度 低，给检测带来了巨大困难。随着分子生物学的发展，特别PCR技术的普及，越来越多 的分子生物学技术被应用到钟器腐霉菌的检测中。普通PCR方法虽然已成功用于检测钟 器腐霉，但其检测过程复杂时间较长，无法满足快速检测的需求。

自2000年环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP) 首次被报道后，已经广泛应用于对病毒、细菌、寄生虫、真菌等病原菌的检测研究。由于该技术特异性强、等温高效、操作简便、耗时短且产物易被检测等特点，因而有着极 为广泛的应用前景。它是针对靶基因的6个区域设计4种特异的引物(两条外引物，两 条内引物)，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)的作用下引起自循环链置 换反应，60-65℃范围80min内，大量合成目标DNA的同时伴随有副产物—白色的焦磷 酸镁沉淀产生。虽然该技术已发展近20年，但在植物病原卵菌的检测报道较少，钟器 腐霉的检测国内外均未见报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种钟器腐霉菌检测引物、LAMP检测体系、试剂盒及方法，该引物、检测体系或检测试剂盒对钟器腐霉菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、 灵敏性高、肉眼观察检测结果。

为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案为:

一种钟器腐霉菌检测引物，所述的引物包含正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF；

引物序列具体如下:

FIP:5'-GTGTAAACTAAAAATAGCTAACTTATCCACCATTATCAAGTGTAG-3'；

BIP:5'-CGCAATTAATTTTATTGTTACTAGCATTCTATGCATACTTAATCCA-3'；

F3:5'-ATCAGGTGCAGGTACTGG-3'；

B3:5'-AGCTGTAATTAAAAGAGACCTATC-3'；

LF:5’-TGAAGGTCCTGAGTGTGCAG-3’。

一种钟器腐霉菌LAMP检测体系，所述的检测体系包含本发明所述的钟器腐霉菌检测引物。

可选的，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、 正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。

可选的，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向 内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF。

可选的，所述的检测体系还包含：1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS0₄,8UBst DNA polymerase,1μL DNA模板，灭菌水补至25μL。

一种钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒，所述的试剂盒包含本发明所述的钟器腐霉菌检测引物。

可选的，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、 正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。

可选的，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向 内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF；

所述的检测体系还包含：1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS0₄,8UBst DNA polymerase,1μL DNA模板，灭菌水补至25μL。

一种钟器腐霉菌检测方法，其特征在于，利用本发明所述的钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒对钟器腐霉菌进行检测；

具体包括：以待检微生物的基因组DNA为模板，以所述的钟器腐霉菌检测引物为引物进行LAMP反应；

如果溶液颜色显示为黄色，检测结果为阳性；如果溶液颜色显示为紫色，检测结果为阴性；

或者，LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则为阳性；无特征性阶梯条带，则为阴性。

可选的，以待检微生物的DNA为模板,DNA的质量浓度为4％的比例进行LAMP反应,反应温度为65℃，反应时间为60min。

有益效果:与现有技术相比，本发明的优点和积极效果表现在:

高准确性：由于传统钟器腐霉菌检测技术只是根据形态特征来确定检测对象，无法 排除人为因素的干扰，很难区分形态相近种，检测准确性只有60-80％。而本发明根据钟器腐霉菌CBS119.80菌株的Cox1基因序列(Genebank:HQ708447)，CBS119.80菌株的Cox1 基因序列来自NCBI数据库，数据库网址为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；利用 Bioedit软件将钟器腐霉菌的Cox1基因序列和其他腐霉菌种的序列进行排列分析，选取 钟器腐霉菌特有的一段序列设计特异性的LAMP引物。LAMP反应通过4条引物(正向内引 物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3)特异性识别靶序列上的6个 独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外，正向环引物LF能够提高反应速率，和 其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下，使本发明能快速的进行钟器腐霉菌的 检测。

操作方便：本发明提供的检测钟器腐霉菌的LAMP方法克服了现有技术中钟器腐霉菌的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐、特异性差的问题及PCR检测技术需 要热循环仪器，无法快速检测钟器腐霉菌的问题。本发明检测方法在65℃等温条件下， 能快速、方便、高效、高特异、高灵敏地检测到钟器腐霉菌，不需要复杂仪器，能较好 满足对钟器腐霉菌的现场检测。

实现了恒温扩增，不像PCR法必须进行热循环，这样就摆脱了对热循环仪器的依赖， 只要有稳定的热源LAMP反应就可以发生，极大的扩展了LAMP使用的范围，LAMP之所以能在恒定的热源下发生反应是因为在LAMP反应液中添加了甜菜碱，使双链DNA处于解 链的动态平衡中，在Bst DNA聚合酶的作用下实现扩增。

本发明为钟器腐霉检测提供了新的技术平台，可用于钟器腐霉菌的高灵敏度快速检 测，同时在病害侵染初期鉴定出病原物，也能够对田间土壤中的病原物进行检测。本发明对减少农药盲目使用，降低生产成本，减少农药的环境污染也具有重要意义。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体 实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是基于琼脂糖凝胶电泳和二甲酚橙颜色变化判定LAMP检测钟器腐霉特异性显色图；图中1(a)LAMP检测钟器腐霉特异性琼脂糖凝胶电泳图；其中M为100bp DNA marker；图中显示第1、2和3泳道具有典型的梯形条带，呈阳性；其余泳道呈阴性；图1(b)中 颜色判定LAMP检测钟器腐霉特异性显色图；图中显示1、2和3管显示黄色，呈阳性， 其余管显紫色。呈阴性；其中1、2和3:Phytopythiumvexans；4: Phytophthorasyringae；5:Phytophthoracinnamomi；6:Phytophthorainfestans；7: Phytopythiumchamaehyphon；8:Phytopythiummontanum；9:Phytopythiumboreale；10: Phytopythiumcitrinum；12:Phytopythiumhelicoides；13:Pythium myriotylum；14: Pythium intermedium；15:Pythium ultimum；16:Phytophthoracambivora；17: Phytopythiumoedochilum；18:Pythium heterothallicum；19:Pythium irregulare；20: Verticilliumalboatrum；21:Phytophthoracactorum；22:Fusarium oxysporum；11:阴 性对照；

图2是基于琼脂糖凝胶电泳和二甲酚橙颜色变化检测LAMP灵敏度；图中2(a)LAMP检测钟器腐霉的特异性的琼脂糖凝胶电泳图；其中M为100bp DNA marker；图中2(b) 颜色判定LAMP检测钟器腐霉灵敏度显色图；图中显示第1、2、3和4管显黄色，呈阳 性；第5管显紫色呈阴性，6号管为阴性对照显紫色；25μL的反应体系中分别含有1ng、 100pg、10pg、1pg、0.1pg的钟器腐霉，其中含有1ng、100pg、10pg、1pg钟器腐霉DNA 反应管显黄色，呈阳性反应；0.1pg的钟器腐霉DNA显紫色，呈阴性反应。显色结果表 明LAMP反应的灵敏度达到1pg。

图3是LAMP检测带菌土壤样品中钟器腐霉显色图；图中3(a)LAMP检测猕猴桃种植 地土壤中钟器腐霉的显色图；图中3(b)LAMP检测秦岭森林土壤中钟器腐霉的显色图； 图中3(c)LAMP检测中药材种植园土壤中钟器腐霉的显色图。图中显示1-6、8-14、16-21 管显示黄色，呈阳性，7、15和22管为阴性对照，显紫色。其中1-6为陕西省猕猴桃种 植基地采集土壤；8为秦岭牛背梁森林土壤、9为秦岭天竺山森林土壤、10为秦岭红河 谷森林土壤、11为秦岭青峰峡森林土壤、12为秦岭石泉森林土壤、13为秦岭太平森林

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案更清楚明白，以下结合具体实施例对本发明作进一 步阐述，但不用来限制本发明的范围。以下实施例均按照常规实验条件，或己发表相关文献中所述的操作技术规程，或按照厂商所建议的实验条件。

引物的获得：

本发明根据荷兰菌种保藏中心菌株CBS119.80的Cox1基因序列 (Genebank:HQ708447)，CBS119.80菌株的Cox1基因序列来自NCBI数据库，数据库网址 为https://www.ncbi.nlm.nih.gov/；利用Bioedit软件将钟器腐霉菌的Cox1基因序列和其 他腐霉菌种的序列进行排列分析，选取钟器腐霉菌特有的一段序列设计特异性的LAMP 引物。LAMP反应通过4条引物(正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反 向外引物B3)特异性识别靶序列上的6个独立区域，其特异性和灵敏度都比较高。此外， 正向环引物LF能够提高反应速率，和其他四条引物一起，在确保反应准确性的情况下， 使本发明能快速的进行钟器腐霉菌的检测。

本发明的钟器腐霉菌的检测引物:由正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环引物LF组成；

各引物序列具体如下:

FIP:5'-GTGTAAACTAAAAATAGCTAACTTATCCACCATTATCAAGTGTAG-3'；

BIP:5'-CGCAATTAATTTTATTGTTACTAGCATTCTATGCATACTTAATCCA-3'；

F3:5'-ATCAGGTGCAGGTACTGG-3'；

B3:5'-AGCTGTAATTAAAAGAGACCTATC-3'；

LF:5’-TGAAGGTCCTGAGTGTGCAG-3’。

本发明的钟器腐霉菌LAMP检测体系，检测体系包含本发明的钟器腐霉菌检测引物。 钟器腐霉菌检测引物具体为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向 外引物B3和反向环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。钟器腐霉菌检测引物具体为：1.6 μm正向内引物FIP,1.6μm反向内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引 物B3,0.8μm环引物LF。检测体系还包含：1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲 酚橙，0.8M甜菜碱，8mMMgS0₄,8UBst DNA polymerase,1μL DNA模板，灭菌水补至25 μL。。

本发明的钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒：包含25μL检测溶液，检测溶液包括:1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF,1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS0₄,8U Bst DNApolymerase,1μL DNA模板，灭菌水补至25μL。

本发明的检测钟器腐霉的LAMP检测方法：包括待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用钟器腐霉菌检测引物或钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒进行LAMP扩增反应； 扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则 证明所检测样品中存在钟器腐霉；无特征性阶梯条带，则所检测样品中无钟器腐霉；或 观察LAMP反应溶液颜色变化，黄色表示检测为阳性，存在钟器腐霉；紫色表示检测结 果为阴性，不存在钟器腐霉。检测钟器腐霉的LAMP检测方法：提取待检测微生物的DNA， 取1μL DNA溶液，加入24μL LAMP试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为： 65℃，60min。

本发明的检测钟器腐霉菌的方法，包括提取待检测微生物的DNA，以提取的DNA为模板，利用所述的LAMP引物组合物进行LAMP：二甲酚橙(xylenol orange)为紫色结 晶，水溶液为红色，碱性溶液中为紫红色，酸性溶液中为柠檬黄色，二甲酚橙可与金属 离子形成红紫色配合物，其颜色随溶液pH变化而改变，反应结束后pH降低使二甲酚橙 的颜色由紫红色变为黄色。反应结束后通过反应的颜色变化，来判断钟器腐霉菌的有无： 黄色表示检测为阳性，存在钟器腐霉；紫红色表示检测结果为阴性，不存在钟器腐霉。

当发生LAMP扩增反应时，通过二甲酚橙的显色反应结果所示，钟器腐霉的反应管均呈黄色，其为阳性结果，而其他腐霉、疫霉、真菌和阴性对照菌反应均呈紫色，为阴 性结果，证明所设计的LAMP特异性引物具有种的特异性。同时反应产物经2％琼脂糖凝 胶电泳，成像观察扩增的反应产物，钟器腐霉的反应管中的反应液出现了典型阶梯形状 条带，而其他腐霉种、疫霉、真菌和阴性对照反应管中没有出现梯形条带。这说明该引 物组可被用于生产实践中发病组织及土壤中钟器腐霉的快速可靠检测鉴定。

实施例1：

钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒:

包含25μL检测溶液，检测溶液包括:1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向内引物 BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF,1.4mM dNTPs, 1×LAMPBuffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS04,8U Bst DNA polymerase,1μ L DNA模板，灭菌水补至25μL。

其中，各引物序列具体如下：

FIP:5'-GTGTAAACTAAAAATAGCTAACTTATCCACCATTATCAAGTGTAG-3'；

BIP:5'-CGCAATTAATTTTATTGTTACTAGCATTCTATGCATACTTAATCCA-3'；

F3:5'-ATCAGGTGCAGGTACTGG-3'；

B3:5'-AGCTGTAATTAAAAGAGACCTATC-3'；

LF:5’-TGAAGGTCCTGAGTGTGCAG-3’。

其中，正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和正向环 引物环引物LF可直接组成用于检测钟器腐霉菌的检测引物。

实施例2：钟器腐霉LAMP反应的特异性试验

为了验证钟器腐霉菌的特异性引物序列，利用实施例1中的检测试剂盒，以3株钟器腐霉菌株和18种其它菌株为供试材料(表1)，LAMP检测结果显示3株钟器腐霉菌株 均能观察到黄色的颜色变化，电泳后能观察到LAMP阶梯状的条带。选择与钟器腐霉不 同种(Phytopythiumchamaehyphon、P.montanum、P.boreale、P.citrinum、P. helicoides、P.oedochilum)和不同属的菌(Pythium myriotylum、Py.intermedium、 Py.ultimum、Py.heterothallicum、Py.irregulare、Phytophthorasyringae、Phy. cinnamomi、Phy.infestans、Phy.cambivora、Phy.cactorum、Verticilliumalboatrum、 Fusariumoxysporum)的DNA作为模板，取1μL DNA溶液，加入24μL的检测溶液进 行LAMP反应，反应程序为65℃60min。

表1用于检测钟器腐霉菌特异性的真菌和卵菌菌株

基于反应体系琼脂糖凝胶电泳和颜色反应作为结果判定标准，结果显示用钟器腐霉 为模板时，颜色呈黄色，扩增出来阶梯状条带(图1a)，而扩增与钟器腐霉不同种、不 同属的菌的DNA模板和阴性对照都成紫色(图1b)。

实施例3：钟器腐霉菌LAMP反应灵敏度试验

为了确定LAMP检测方法的灵敏度，将提取的钟器腐霉菌的DNA用Qbuit 3.0(Thermo Fisher Scientific)测定浓度并调整至1ng/μL，然后用超纯水进行10倍比稀释。分别 取10倍稀释后的各浓度DNA稀释液1μL作为模板，加入24μL的检测溶液中进行LAMP 反应，反应程序为65℃60min。取8μL扩增产物上样；

具体检测结果见图2，其中M为100bp DNA marker；图中2(b)颜色判定LAMP检测 钟器腐霉灵敏度显色图；图中显示第1、2、3和4管显黄色，呈阳性；第5管显紫色呈 阴性，6号管为阴性对照显紫色；25μL的反应体系中分别含有1ng、100pg、10pg、1pg、 0.1pg的钟器腐霉，其中含有1ng、100pg、10pg、1pg钟器腐霉DNA反应管显黄色，呈 阳性反应；0.1pg的钟器腐霉DNA显紫色，呈阴性反应。显色结果表明LAMP反应的灵敏 度达到1pg。

结果显示琼脂糖凝胶电泳和二甲酚橙显色反应表明LAMP反应的灵敏度达到1pg的钟器腐霉菌的DNA(图2)。

实施例4：从带菌土样中检测钟器腐霉

采用改良磁珠法提取带菌土壤基因组DNA，具体操作步骤如下：

①1.5mL的离心管中加入0.3g土壤和0.2g直径为1mm的磁性玻璃珠；

②加入250μL的提取液(100mmol/L pH为9.0的Tris-HCl，40mmol/L的EDTA， 10％SDS，0.8％脱脂乳)，4 000r/min旋涡振荡1min；

③加入150mL氯化苄振荡混匀，60℃金属浴15min；

④在悬浮液中加入3mol/L醋酸钠150μL，轻微振荡混合，于冰上放置15min；

⑤15 000r/min离心10min后将上清液转移到新的1.5mL离心管内；

⑥按照MagExtractor Plant Genome Kit的操作说明纯化DNA，将提取所得的DNA保存于-80℃备用。

依据钟器腐霉的LAMP检测方法，取2μL DNA溶液，加入23μL钟器腐霉菌LAMP 检测试剂盒中的检测溶液进行LAMP，LAMP反应程序为：65℃，60min。当发生LAMP扩 增反应时，通过二甲酚橙的显色反应结果所示，带菌土壤DNA反应管均呈黄色，为阳性 结果；阴性对照组均呈紫色，为阴性结果，证明所设计的LAMP特异性引物可以用于检 测土壤中是否含有钟器腐霉菌。

图3LAMP检测带菌土壤样品中钟器腐霉显色图；图中3(a)LAMP检测猕猴桃种植地土壤中钟器腐霉的显色图；图中3(b)LAMP检测秦岭森林土壤中钟器腐霉的显色图；图 中3(c)LAMP检测中药材种植园土壤中钟器腐霉的显色图。图中显示1-6、8-14、16-21 管显示黄色，呈阳性，7、15和22管为阴性对照，显紫色。其中1-6为陕西省猕猴桃种 植基地采集土壤；8为秦岭牛背梁森林土壤、9为秦岭天竺山森林土壤、10为秦岭红河 谷森林土壤、11为秦岭青峰峡森林土壤、12为秦岭石泉森林土壤、13为秦岭太平森林 土壤、14为秦岭金丝峡森林土壤；17和18为丹参种植基地土壤；19和20为附子种植 园采集土壤；21和22为元胡种植园采集土壤；7、15、22:阴性对照。

依据LAMP检测钟器腐霉的特异性、灵敏度以及可以检测带菌土壤样品的试验，本专利可以用于传统作物、森林土壤和丹参、附子、元胡等中药材生产过程中的病害快速 检测，方法简易，可有效提升农作物、森林土壤及中药材的检测技术水平。

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施 方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾 的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公 开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (10)

1.一种钟器腐霉菌检测引物，其特征在于，所述的引物包含正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF；

引物序列具体如下:

FIP:5'-GTGTAAACTAAAAATAGCTAACTTATCCACCATTATCAAGTGTAG-3'；

BIP:5'-CGCAATTAATTTTATTGTTACTAGCATTCTATGCATACTTAATCCA-3'；

F3:5'-ATCAGGTGCAGGTACTGG-3'；

B3:5'-AGCTGTAATTAAAAGAGACCTATC-3'；

LF:5’-TGAAGGTCCTGAGTGTGCAG-3’。

2.一种钟器腐霉菌LAMP检测体系，其特征在于，所述的检测体系包含权利要求1所述的钟器腐霉菌检测引物。

3.根据权利要求2所述的钟器腐霉菌LAMP检测体系，其特征在于，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。

4.根据权利要求2所述的钟器腐霉菌LAMP检测体系，其特征在于，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF。

5.根据权利要求2-4任一所述的钟器腐霉菌LAMP检测体系，其特征在于，所述的检测体系还包含：1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS0₄,8U BstDNA polymerase，1μL DNA模板，灭菌水补至25μL。

6.一种钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含权利要求1所述的钟器腐霉菌检测引物。

7.根据权利要求6所述的钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：正向内引物FIP、反向内引物BIP、正向外引物F3、反向外引物B3和反向环引物LF的摩尔比为8:8:1:1:4。

8.根据权利要求6所述的钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒，其特征在于，所述的钟器腐霉菌检测引物具体为：1.6μm正向内引物FIP,1.6μm反向内引物BIP,0.2μm正向外引物F3,0.2μm反向外引物B3,0.8μm环引物LF；

所述的检测体系还包含：1.4mM dNTPs,1×LAMP Buffer,1×二甲酚橙，0.8M甜菜碱，8mM MgS0₄,8UBst DNA polymerase,1μL DNA模板，灭菌水补至25μL。

9.一种钟器腐霉菌检测方法，其特征在于，利用权利要求6-8任一所述的钟器腐霉菌LAMP检测试剂盒对钟器腐霉菌进行检测；

具体包括：以待检微生物的基因组DNA为模板，以所述的钟器腐霉菌检测引物为引物进行LAMP反应；

如果溶液颜色显示为黄色，检测结果为阳性；如果溶液颜色显示为紫色，检测结果为阴性；

或者，LAMP反应产物进行琼脂糖凝胶电泳，在紫外光下检测结果，如果存在特征性阶梯状条带，则为阳性；无特征性阶梯条带，则为阴性。

10.根据权利要求9所述的钟器腐霉菌检测方法，其特征在于，以待检微生物的DNA为模板,DNA的质量浓度为4％的比例进行LAMP反应,反应温度为65℃，反应时间为60min。

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