CN114457186A

CN114457186A - 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用

Info

Publication number: CN114457186A
Application number: CN202210232204.2A
Authority: CN
Inventors: 戴婷婷; 周紫薇; 杨静; 钱茱希; 吴翠萍
Original assignee: Nanjing Customs Animal And Plant And Food Testing Center; Nanjing Forestry University
Current assignee: Nanjing Customs Animal And Plant And Food Testing Center; Nanjing Forestry University
Priority date: 2022-03-09
Filing date: 2022-03-09
Publication date: 2022-05-10
Anticipated expiration: 2042-03-09
Also published as: CN114457186B

Abstract

本发明公开了一种引起杜鹃根腐病的病原菌Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppini_05588，该检测靶标Ppini_05588的DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO:1所示，蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。同时，还公开了特异性检测靶标Ppini_05588的引物对，其正向引物序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物序列如SEQ ID NO：4所示。本发明所发掘的检测靶标和其设计的引物对用于普通PCR，其特异性强，灵敏度高，为杜鹃根腐病的病原菌P.pini的检测提供了新的技术方法。

Description

杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用

技术领域

本发明属于杜鹃根腐病病原菌检测技术领域，具体涉及杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini的特异性检测靶标Ppini_05588及应用。

背景技术

Phytophthora pini是一种重要的卵菌植物病原体，P.pini能够引起杜鹃根部的腐烂以及枝干溃疡。目前已发现P.pini能在杜鹃、挪威云杉、杨树、欧洲山毛榉树、橄榄树等植物上致病。目前对该病还没有有效的防治措施，防止病原菌的传播扩散是控制该病的最有效措施。因此为了更有效地检测该病菌，建立快速检测方法，为病害的风险及研究决策提供依据，从而有利于降低该病害的发生对生态环境的保护起到一定的作用。

传统的卵菌分类鉴定主要是基于形态学特征、致病性测定、生理生化特征等。传统的分离疫腐霉的方法采是用诱捕法从土壤、灌溉水和植物材料中分离。传统方法在疫霉菌的检测中发挥了重要作用，但是费时费力而且要求操作者具备专业的疫霉菌分离、形态学鉴定知识和丰富的经验；同时传统分类鉴定方法耗时长、灵敏度低、易受人为及环境等诸多因素的干扰，不能在病害潜伏期和发病初期做出诊断，很难对病害发生进行及时的监测和有效控制。所以为了快速并准确的检测到病原菌，发掘特异性好的靶基因是目前所有检测技术的核心。不同的靶标序列检测的特异性和灵敏度存在一定的差距，因选择的目标靶序列不同、片段大小不同，结果都会有很大差别。靶标基因的选择要确保其在种内的不同菌株间的高度保守，而在种间变异性较高。

综上所述，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对提升对杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

发明内容

针对现有技术中的技术问题，本发明提供一种杜鹃根腐病病原菌P.pi ni的检测靶标Ppini_05588及基于新检测靶标其PCR检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述杜鹃根腐病病原菌P.pini的PCR检测试剂盒。

第一方面，本发明提供了一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标Ppini_05588，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

第二方面，本发明提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物Ppi05588 PCR-F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Ppi05588 PCR-R1序列如SEQ ID NO：4所示。

第三方面，本发明提供了第二方面所述的引物对在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。

第四方面，本发明还提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的试剂盒，至少包括1次用量的含有本发明第二方面所述的引物对的检测溶液，其中所述引物组合浓度为20μM。

进一步地，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg²⁺，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。

第五方面，本发明还提供了第四方面所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。

第六方面，本发明还提供了一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的方法，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL本发明第四方面中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；58℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。

相比于现有技术，本发明的优点为：

1)本发明首次公开了高信赖度特异性分子检测靶标Ppini_05588，并基于该新靶标建立灵敏、准确PCR检测技术体系，对提升对杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速分子检测研究及其检测时所致病害早期诊断具有重要作用。

2)采用本发明提供的检测引物对针对杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株和其他镰刀菌、真菌以及松材线虫、病原卵菌等进行检测，结果显示仅有杜鹃根腐病病原菌P.pini的检测结果为阳性，能够扩增出特异性条带，条带大小为247bp；同时，经过特异性实验证明，PCR法检测杜鹃根腐病病原菌P.pini基因组DNA的灵敏度为100pgμL^-1。

3)本发明为杜鹃根腐病病原菌P.pini的检测提供了新的检测靶标的发掘方法和技术平台，在病害侵染初期鉴定出病原物，本发明可以用于带菌植株组织中杜鹃根腐病病原菌P.pini的快速检测，能够对感病样品进行快速检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1是基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的特异性引物Ppi05588PCR-F1/Ppi05588PCR-R1在疫霉菌种间普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Ppi05588 PCR-F1和下游引物Ppi05588PCR-R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株中特异地扩增出一条247bp的条带，而其余疫霉未产生目的条带；其中，从左边到右边，依次为：1，Marker；2，杜鹃根腐病病原菌Phytophthorapini；3，辣椒疫霉Phytophthora capsici；4，烟草疫霉Phytophthora nicotianae；5，大豆疫霉Phytophthorasojae；6，柑桔褐腐疫霉Phytophthora citrophthora；7，荔枝疫霉Phytophthora litchii；8，大雄疫霉Phytophthora megasperma；9，寄生疫霉Phytophthora parasitica；10，冬生疫霉Phytophthora hibernalis；11，丁香疫霉Phytophthora syringae；12，N阴性对照；13，Marker。

图2是基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的特异性引物在其他卵菌和真菌中的普通PCR特异性验证电泳图；特异性引物上游引物Ppi05588 PCR-F1和下游引物Ppi05588 PCR-R1只能从供试的杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株中特异地扩增出一条247bp的条带，而其余卵菌或真菌未产生目的条带；

图3是实施例3基于杜鹃根腐病病原菌P.pini新检测靶标Ppini_05588设计的检测引物组合的灵敏度验证电泳图，结果显示该引物的检测灵敏度仅能达到100pg·μL^-1。

图4是实施例4的实验接种及检测结果图。其中图4A中1为人工接种琼脂块杜鹃样品，图4A中2-4为人工接种杜鹃根腐病病原菌P.pini的杜鹃；图4B为人工接种杜鹃根腐病病原菌P.pini的发病杜鹃的PCR检测结果图。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(1000bp)、杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini、人工接种杜鹃根腐病病原菌P.pini的杜鹃(RhododendronsimsiiPlanch)提取的DNA、重复人工接种杜鹃根腐病病原菌P.pini的杜鹃(Rhododendron simsiiPlanch)提取的DNA、重复人工接种杜鹃根腐病病原菌P.pini的杜鹃(Rhododendron simsiiPlanch)提取的DNA、人工接种琼脂块的杜鹃(Rhododendronsimsii Planch)提取的DNA、NC(阴性对照)、Marker(1000bp)。

具体实施方式

下面将结合附图对本发明技术方案的实施例进行详细的描述。以下实施例仅用于更加清楚地说明本发明的技术方案，因此只是作为示例，而不能以此来限制本发明的保护范围。需要注意的是，除非另有说明，本申请使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域技术人员所理解的通常意义。

实施例1

本研究通过Blast序列搜索，序列提取、比对与分析，挖掘大规模的基因组数据库，从而发掘疫霉菌的检测靶标。通过全基因组比对，共计获得P.pini特异性检测靶标1000个以上；随机从P.pini 1000多个特异性基因中挑选出部分基因作为候选基因，设计了并筛选特异性引物，表1列出其中6个靶标基因(表1)。采用PCR技术对设计的特异性引物进行验证。特异性评价选择与P.pini不同种(辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)；大豆疫霉(Phytophthora sojae)；柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)；荔枝疫霉(Phytophthora litchii)；大雄疫霉(Phytophthora megasperma)；寄生疫霉(Phytophthoraparasitica)；冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；丁香疫霉(Phytophthora syringae)等)和不同属的菌(Phytopythium litorale；Phytopythium helicoides)；松脂溃疡菌(Fusariumcircinatum)；藤仓镰刀菌(Fusariumfujikuroi)；葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)；松材线虫(Bursaphelenchusxylophillus)；Diaporthepescicole；Lasiodiplodiaparva；苹果炭疽(Colletotrichum aenigma)等)的DNA作为模板，进行PCR特异性和灵敏度验证，最终获得1个杜鹃根腐病病原菌P.pini的检测新靶标基因Ppini_05588。

表1杜鹃根腐病病原菌6个特异性基因序列表

新靶标基因Ppini_05588其DNA序列如SEQ ID NO：1所示，CDS序列如SEQ ID NO：1，其蛋白序列如SEQ ID NO：2所示，并基于该新靶标建立灵敏、准确的PCR检测技术体系。

该检测技术体系所使用的PCR检测引物组合物：由上游引物Ppi05588PCR-F1和下游引物Ppi05588 PCR-R1，各引物序列具体如下：

Ppi05588PCR-F1：CGACGATATGGCAAGATATC

Ppi05588PCR-R1：GTTCGCAAAC CTCTCTCGTA

提取待检微生物的DNA，取1μL DNA溶液，加入23μL试剂盒中的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；58℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。其中，所述1mL所述的检测溶液包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg²⁺，100μL 1％B SA，50单位Taq酶(TaKaRa)、特异引物Ppi05588 PCR-F1和Ppi05588PCR-R120μM引物，加入超纯水制备成1mL检测溶液。

反应结束后取7μL扩增产物于1.5％琼脂糖凝胶中电泳30min(100V)，在凝胶成像系统上检测并拍照。每个实验至少重复3次。

实施例2

为了验证杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性引物序列，本实施例以3株杜鹃根腐病病原菌P.pini菌株和病原卵菌以及其它真菌为供试材料(表2)，采用CTAB法提取发病组织中杜鹃根腐病病原菌P.pini的DNA。具体方法如下：取少量菌丝粉，加900μL 2％CTAB提取液和90μL 10％SDS，漩涡混匀，于60℃水浴1h，中间每10min上下颠倒几次。12000rpm离心10min，取上清加等体积酚/氯仿/异戊醇(25：24：1)，颠倒混匀，12000rpm离心10min；将上清转移至新管，加等体积氯仿，轻轻颠倒混匀，12000rpm离心5min。上清转移至新管中，加2倍体积的无水乙醇和1/10体积的3M NaAc(pH 5.2)，-20℃沉淀(>1h)。12000rpm离心10min，倾去上清，沉淀用70％乙醇洗涤两次，室温晾干。加适量灭菌超纯水或TE(pH 8.0)溶解沉淀(含20μg/mL RNase)，37℃处理1h后，-20℃保存备用。

表2用于杜鹃根腐病病原菌P.pini PCR检测的卵菌和真菌菌株

PCR检测结果如图1、图2所示，杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini菌株均可特异地扩增出一条247bp的条带，其余病原卵菌以及真菌琼脂糖凝胶电泳没有出现扩增条带。选择与杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini不同种(辣椒疫霉(Phytophthora capsici)；烟草疫霉(Phytophthora nicotianae)；大豆疫霉(Phytophthora sojae)；柑桔褐腐疫霉(Phytophthora citrophthora)；荔枝疫霉(Phytophthora litchii)；大雄疫霉(Phytophthora megasperma)；寄生疫霉(Phytophthora parasitica)；冬生疫霉(Phytophthora hibernalis)；丁香疫霉(Phytophthora syringae)等)和不同属的菌(Phytopythium litorale；Phytopythium helicoides；松脂溃疡菌(Fusariumcircinatum)；藤仓镰刀菌(Fusarium fujikuroi)；葡萄座腔菌(Botryosphaeriadothidea)；松材线虫(Bursaphelenchus xylophillus)；Diaporthe pescicole；Lasiodiplodia parva；苹果炭疽(Colletotrichum aenigma)等)的DNA作为模板，取1μLDNA溶液，加入23μL试剂盒检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；58℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。

证明所设计的特异性引物上游引物和下游引物PCR特异性引物具有种的特异性,Ppini_05588是一个特异性较强的新检测靶标。这说明该引物组可被用于生产实践中发病组织中杜鹃根腐病病原菌的快速可靠的检测鉴定。当用于发病组织中存在杜鹃根腐病病原菌时，采用NaOH快速裂解法提取杜鹃根腐病病原菌的DNA，具体过程如下：取一段发病的植株组织，每毫克组织加入10μL 0.5M NaOH，在研钵中充分研磨后转移至1.5mL的EP管中，12000rpm离心5min，取5μL上清液加入495μL 0.1mM Tris(pH 8.0)，混匀后取1μL直接用于PCR反应。每个反应至少重复三次，同时为确定植株中无PCR抑制物存在。

实施例3

用杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini的菌株的不同浓度的基因组DNA作为扩增模板，进行PCR扩增反应，使用Nanodro 2000微量分光光度计测出实施例1提取DNA的浓度为100ng·μL^-1。将其依次稀释为10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1、10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1、1fg·μL^-1、100ag·μL^-1，根据实施例1-2采用的引物、反应体系和反应条件，对不同浓度的DNA进行PCR检测。结果如图3所示，25μL的反应体系中分别含有100ng·μL^-1、10ng·μL^-1、1ng·μL^-1、100pg·μL^-1P.pini DNA的出现247bp特异性阳性条带，呈阳性反应，25μL的反应体系中分别含有10pg·μL^-1、1pg·μL^-1、100fg·μL^-1、10fg·μL^-1、1fg·μL^-1、100ag·μL^-1P.pini DNA的未出现特异性条带呈阴性反应；结果表明PCR检测的灵敏度达到100pg·μL^-1(图3)；

实施例4活体组织中杜鹃根腐病病原菌Phytophthora pini的普通PCR检测

采用NaOH碱裂解法提取接种丁香疫霉菌的发病柑橘组织的DNA，将其作为模板用于PCR扩增。取1uL DNA溶液，按实施例2的方法，进行PCR反应。结果如图4所示，其中图4A(1)为人工接种琼脂块的杜鹃叶片，图4A(2-3)为人工接种P.pini的感病杜鹃叶片，图4B为人工接种P.pini的发病杜鹃叶片的PCR检测结果。PCR检测结果图中从左边到右边分别为Marker(1000bp)、P.pini、人工接种P.pini的杜鹃叶片提取的DNA、重复人工接种P.pini的杜鹃叶片提取的DNA、重复人工接种P.pini的杜鹃叶片提取的DNA及人工接种琼脂块的杜鹃叶片提取的DNA、NC(阴性对照)、Marker(1000bp)。结果显示，P.pini菌株及人工接种P.pini的杜鹃叶片提取的DNA均可特异地扩增出一条247bp的条带，而人工接种琼脂块的杜鹃叶片提取的DNA及阴性对照没有出现扩增条带。

除非另外具体说明，否则在这些实施例中阐述的数值并不限制本发明的范围。在这里示出和描述的所有示例中，除非另有规定，任何具体值应被解释为仅仅是示例性的，而不是作为限制，因此，示例性实施例的其他示例可以具有不同的值。

序列表

<110> 南京林业大学、南京海关动植物与食品检测中心

<120> 杜鹃根腐病病原菌的特异性检测靶标Ppini_05588及应用

<130> 202203

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 1

atggttgctc tctttcaccc attccgccgg ccagaagact tcgatgacga tattcgaaac 60

ggcggccagg ttggttacga gcgatggtgg cgcgatcacg cacctaccgg agctcgtgag 120

tttctgaaat tttctaaaga ttataacatt tcccgagaga tcgcccgcca acggatagac 180

gacgatatgg caagatatcg gggttacatc gagtgctcat cggatgaaga ggcagatggt 240

tctagcatcc tagaaggatc gtcgggtgag gaggaggata tggcatggga cgataactcg 300

tctcaagcag atacggcttt ggtgaagtcc atgacagaac atactcttaa attccagtgg 360

ggtcgtgaag cggttcaatt gtcggctgcg tcaagcgatg taccgttacg agagaggttt 420

gcgaacgttt ctgttccggt agatgacaga gataaagata tcgcagctac tgagagacta 480

cttgccgagc gtgaaactaa gcccgtggcg aatgggacca tgaatctgcc agaagcggaa 540

acaaaagtca tattgctgcg gggcgctatc gcaaactgtg atatttggat ggatccaact 600

ctgattccaa atacctcgag gcccgaattg gggcagcaat catcgctaca agaaatatct 660

caacatttca gtctgaatga aaagcagcac aaagcgtttg tgcgctttgg aaagccattt 720

gtgcgatccc atgcaagcct tggcggggtc ctgggaatct gccgatgccc ttaa 774

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> Phytophthora pini

<400> 2

Met Val Ala Leu Phe His Pro Phe Arg Arg Pro Glu Asp Phe Asp Asp

1 5 10 15

Asp Ile Arg Asn Gly Gly Gln Val Gly Tyr Glu Arg Trp Trp Arg Asp

20 25 30

His Ala Pro Thr Gly Ala Arg Glu Phe Leu Lys Phe Ser Lys Asp Tyr

35 40 45

Asn Ile Ser Arg Glu Ile Ala Arg Gln Arg Ile Asp Asp Asp Met Ala

50 55 60

Arg Tyr Arg Gly Tyr Ile Glu Cys Ser Ser Asp Glu Glu Ala Asp Gly

65 70 75 80

Ser Ser Ile Leu Glu Gly Ser Ser Gly Glu Glu Glu Asp Met Ala Trp

85 90 95

Asp Asp Asn Ser Ser Gln Ala Asp Thr Ala Leu Val Lys Ser Met Thr

100 105 110

Glu His Thr Leu Lys Phe Gln Trp Gly Arg Glu Ala Val Gln Leu Ser

115 120 125

Ala Ala Ser Ser Asp Val Pro Leu Arg Glu Arg Phe Ala Asn Val Ser

130 135 140

Val Pro Val Asp Asp Arg Asp Lys Asp Ile Ala Ala Thr Glu Arg Leu

145 150 155 160

Leu Ala Glu Arg Glu Thr Lys Pro Val Ala Asn Gly Thr Met Asn Leu

165 170 175

Pro Glu Ala Glu Thr Lys Val Ile Leu Leu Arg Gly Ala Ile Ala Asn

180 185 190

Cys Asp Ile Trp Met Asp Pro Thr Leu Ile Pro Asn Thr Ser Arg Pro

195 200 205

Glu Leu Gly Gln Gln Ser Ser Leu Gln Glu Ile Ser Gln His Phe Ser

210 215 220

Leu Asn Glu Lys Gln His Lys Ala Phe Val Arg Phe Gly Lys Pro Phe

225 230 235 240

Val Arg Ser His Ala Ser Leu Gly Gly Val Leu Gly Ile Cys Arg Cys

245 250 255

Pro

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 3

cgacgatatg gcaagatatc 20

<210> 4

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 4

gttcgcaaac ctctctcgta 20

<210> 5

<211> 669

<212> DNA

<213> Phytophthora pini

<400> 5

atgaacgagg agtatggtga ccgctttaaa acgcgctcgg attcagtaga cagcgatgag 60

ctgacgcaag tgctgacaga gctgggcgtc gccatggaca aggaagacac cagttcgagt 120

tcgagctacg aggatgacaa ggtcgctgct tccggtggca cgtcttcgca gcgtattgcc 180

aagcccacta gttccccgag ggaggctcca cacctgaccg aaagtacccc caaggaagag 240

cggaaactga ccgaaactac cccgaaggtg gaccaaaagc agccgaacgt tcaaccgaag 300

aaggacctaa cggttgccca cgtgctatct ccagctcctg ccaccgtttc tgtggatgac 360

tccgcactgg cagaggtgat gacgcagttg gatgaggaag atgagttggc ttcgcatggc 420

gacacggaca tgagctacgt agacgaatcc gtgtccgaca atttggagac cgatgacatg 480

gagtccgagg gcatgaatgc tgggcgttcg tctgcaaaga agagtattac tcgtcgtctc 540

atcgagagca ccagtgaaga caccgaagaa gaacctgatt tgcaccgaac caagacaaaa 600

cagaaaccaa ttcgacacaa gaaactcacc aaagacccca ggaatcttgt ggaagctgtc 660

ccggagtag 669

<210> 6

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 6

tcggattcag tagacagcga 20

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 7

gtcagtttcc gctcttcctt 20

<210> 8

<211> 609

<212> DNA

<213> Phytophthora pini

<400> 8

atgcctatgc cgatcgaggt gcttggtgag cgggcggctc agttctttgt agcgtattcg 60

cgcgagcctc gcccatataa gaaggacgaa atgctgatgc ccgtcctgca cgcaatagcg 120

aaaaatggct gtgggaagtt tactctggac gatgcgaaac gcgagctgca ccgcgtggtg 180

tcttgcggtc ggtgcgaaac ctcggggcac cagtaccgtg gcgccaaaga gaagtaccac 240

acttgggatt ccaagtcttg tcaaattctc gtaacctggc tagctcgcaa ttacatacac 300

taccagcacc acaggggcaa actcagaacg ctggagagag aagtcgttcc agtactggcg 360

agagctggac gccgcttcaa tcagtacaag gtgcaggcgc agattagata cctgcaaagg 420

atgtacgaca agcacatggc gaccggagga agcctgccag tgtgcttcga gcggttcgaa 480

ggagcctacg aagtgttccg gagccacgat ttacaccacc aaaagaagcg tcgcggtgcg 540

gaaggctgtt tattccacgc caatcttgac gcagaagcgc ttgctgctgc tgatctgatt 600

ggaatttag 609

<210> 9

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 9

gagcctcgcc catataagaa 20

<210> 10

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 10

tgcgagctag ccaggttacg 20

<210> 11

<211> 687

<212> DNA

<213> Phytophthora pini

<400> 11

atgcgtgcag acgaagtggc agacgaagtg gcagacgaag tggcagacga agtggcagac 60

gaagtggcaa gaacccagga agagatgccg attgtttctc ctgtgcggaa gaaggcacgg 120

atgcagcaag acaagacctg cgcatcaagt tcgcgcctgt tgacaagcga gcaattgagt 180

ttgctggttc agctgaatga ttcatactcg agctatgggc gggctggacg taagtgggca 240

acgatccaaa cccaaatgcg cacgtcctac gctgaactgg atgtgaaacg gagcagtttg 300

agggacatct gcacccgagt gaagaagcag cgcgaaattc gagagctgac gaggtgcagg 360

gagcagcacg agcagtgcag cacgacgatc gatcgtctgg aagaagtagt tcgtcgagag 420

aaggaagata aagaggttct tactgtcgtg tcagaggagt ggagagtgaa gtcggagaag 480

ctcatggagg aggtgcagtt actcaaaaaa gagaaggctg aagcggaaaa gagagccaag 540

aagcagtcga agcaggtcgc caagtccatg gaggatctgg agacgcaggt gaagaactgg 600

aaacacaaga ctgaaatcgc gaacgcgttg ttgaagacgg agaaggggac gagcgagttc 660

ctccgtgaaa ccctgaacaa ggagtaa 687

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 12

gaagtggcaa gaacccagga 20

<210> 13

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 13

catccagttc agcgtaggac 20

<210> 14

<211> 765

<212> DNA

<213> Phytophthora pini

<400> 14

atgggctaca gattacttgg agaaacggct agactctact tgcgcaatga tgaaatcgcg 60

gagactgcta tttcgatcga caaaaatatg attcagaggg caacatttac tcgagtcgac 120

gctattcaag aagaagttat cgctgccgca tgggttattg attcgatgtt agagctgcga 180

tcgctggagc ggcgcaatgc tggcgcgacg ctgattcaca tcatacaagg acaacttgca 240

ggctgcctat acaggttcaa ctaccgtcgt gaggcggccg acacagcgga caatggatta 300

attttggaat tggcgaatgc tcaaaatctt cgtcatgaat tttacgtgga catgctgact 360

ggaatcctcg gcgcatcgtg tcgtcaaact cggacgattg gtccagcagt gaacacgaga 420

acacggacac gaagtgttga tgcctgtata gaagaaaacc tagactttga ccggatcgag 480

gcagcgagct ttttgcggga gctggctgtt gttcaagaaa ttgctgattc gaaggctgtt 540

gctgatgctg cggtagagct ggtggggttg cgacaaacac accgtgcttc gagcgacgag 600

atcgacaatg cagtaaccgc tcttgcagat cgtcaagaag cgtaccgtac tgcctgtggc 660

gccacagacc gagccgacat ggtcttgatc gccgaaatta ggaacaatcg cagacatcga 720

caggattcat gggcggatcg agttgcccaa cagcaccaga gttga 765

<210> 15

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 15

gagtcgacgc tattcaagaa 20

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 16

ctgtgtcggc cgcctcacga 20

<210> 17

<211> 618

<212> DNA

<213> Phytophthora pini

<400> 17

atgcatctat acgccacacg atctgtccga gaaacagctg aacattccga cgtggtggac 60

aagaacgctc attcagggga cggcagcact gacatagata cggacacgaa gggacccgat 120

gtcactatgg aggaacccag tgtcgatata gaaggacccg ctgtcactat ggagagggct 180

accatcactg tcgaggaagc agctattgcg aaggactccc tagagctcaa caaggacagc 240

gacactgaag cgcgagtcgc ggaggacgct ccagccactg aggacaagcc tgtgttgcta 300

ccaaaggcct cgccagaagt tatcgacgtg gatgaacttc atcctgaaga gccggactgt 360

cacggcttca cgctgcgcca tcgcgtcaac acaaatgtcc cgtttattga gcattcgaag 420

acattaaaag cctcggacgc agctacaaag gcccgactag ccggcgttgt ggatcctacg 480

cccgttgcaa ttttctctct tcgaagaaga cttattgagt ttggaagccg gaaatatggt 540

gtccaacgca gtggcagatt tgtgcatcac gaagctggac aacagtattt tctcggcagc 600

attggctctt ttttctga 618

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 18

aacgctcatt caggggacgg 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(artificial sequence)

<400> 19

ggcttgtcct cagtggctgg 20

Claims

1.一种引起杜鹃根腐病病原菌P.pini的特异性检测靶标Ppini_05588，其特征在于，所述检测标靶的DNA序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的引物对，其特征在于，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物Ppi05588 PCR-F1序列如SEQ ID NO：3所示，反向引物Ppi05588 PCR-R1序列如SEQ ID NO：4所示。

3.权利要求2所述的引物对在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。

4.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的试剂盒，其特征在于，至少包括1次用量的含有权利要求3所述的引物对的检测溶液，其中所述引物组合浓度为20μM。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述检测溶液还包括：4种dNTP各2000μM，100μL 10×PCR反应缓冲液，80mM Mg²⁺，100μL 1％BSA，50单位Taq酶。

6.权利要求4-5任一所述的试剂盒在检测杜鹃根腐病病原菌P.pini中的应用。

7.一种检测杜鹃根腐病病原菌P.pini的方法，其特征在于，包括以下步骤：取1μL检测对象的DNA溶液，加入23μL权利要求5中所述的检测溶液和1μL灭菌去离子水，总体积为25μL；PCR扩增程序为94℃变性3分钟，94℃变性30秒钟；58℃退火30秒；72℃延伸45秒钟；33个循环，最后72℃延伸10分钟。