CN102230923A - 烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法 - Google Patents

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本发明属于一种采用超高效液相色谱仪测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量的方法。本方法在超声频率30KHz～40KHz、超声声强0.4～50W/cm2下，以乙腈和水混合液为萃取溶液，在20℃～50℃下，经15min～60min萃取烟草及烟草制品中水溶性糖；以Amide色谱柱为分析柱，以乙腈和水混合液作为流动相，采用配备了蒸发光散射检测器的超高效液相色谱仪测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量。本发明具有操作简便、分析速度快、灵敏度高、准确性和稳定性好的特点，特别适用于大批量烟草及其烟草制品中多种水溶性糖的分析。

Description

烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法
技术领域
本发明属于一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，该方法利用超声萃取烟草及烟草制品中水溶性糖，采用超高效液相色谱仪测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量。
背景技术
糖类物质是烟草中一类重要化合物，烟草中糖类化合物种类较多，在烟草植物体中含量可达到干重的25％～50％，对烟叶品质影响比较大的是水溶性糖、淀粉、纤维素和果胶质等。烟草中水溶性糖(尤其是还原糖)与烟叶外观质量、内在质量、物理特性有密切的关系，水溶性糖含量高的烟叶比较柔软、色泽好；水溶性糖类在烟草制品燃吸过程中进行酸性反应，使吃味醇和，也是形成香气物质的重要前体；水溶性糖具有一定程度保润作用，是体现烟草优良品质的指标之一。因此，测定烟草中水溶性糖含量及其变化规律，对烟草生产、卷烟配方以及吸烟与健康研究具有实际意义。
目前，烟草中水溶性糖测定方法主要有比色法、红外分光光度法、连续流动分析法、毛细管电泳法、离子色谱法、气相色谱法和高效液相色谱法。最近，烟草行业相继发布了两项烟草及烟草制品中水溶性糖的测定标准-《YC/T159-2002烟草及烟草制品水溶性糖的测定连续流动法》、《YC/T 251-2008烟草及烟草制品葡萄糖、果糖、蔗糖的测定离子色谱法》。
随着色谱技术不断发展，气相色谱法和高效液相色谱法已经成为测定糖类化合物的主要方法，由于气相色谱需要糖类化合物衍生化后才能分析，高效液相色谱的示差折光检测和蒸发光散射检测不需衍生化，样品经前处理即可直接进样，高效液相色谱法更适合于糖类化合物的分析检测。
高效液相色谱法中的示差折光检测器对环境的温度比较敏感，灵敏度较低且不能用于梯度洗脱，中国专利文献CN200910194169.4公开了一种烟草中的水溶性糖的测定方法，该方法建立了高效液相色谱结合示差折光检测器测定烟草中水溶性糖的方法，该方法的线性良好，回收率在99.2％～101.7％之间，精密度在0.14％～0.86％之间，果糖、葡萄糖和蔗糖的检出限在0.39μg/mL～0.71μg/mL之间。该方法不使用有毒试剂，经实验对比，和现有离子色谱法检测标准的检测结果一致，可用于各种烟草样品中水溶性糖的快速、批量检测。
蒸发光散射检测器(ELSD)是一种基于不挥发的样品颗粒对光的散射程度与其质量成正比而进行检测的质量检测器，对没有紫外吸收、荧光或电活性的物质以及产生末端紫外吸收的物质均能产生响应，故ELSD稳定性好、灵敏度高，可以用梯度洗脱，适宜于烟草中水溶性糖的分析测定。孙雨安、杨俊、王岚等先后利用该高效液相色谱-蒸发光散射检测法测定了烟草中的水溶性糖，取得了较好的分析效果(分析科学学报，2004，20(5)：531-533；分析化学，2005，33(11)：1596-1598；烟草科技，2006，(8)：25-28)。
超高效液相色谱是分离科学中的一个全新类别，UPLC借助于HPLC的理论及原理，涵盖了小颗粒填料、非常低系统体积及快速检测手段等全新技术，增加了分析的通量、灵敏度及色谱峰容量。与传统的HPLC相比，UPLC的速度、灵敏度及分离度分别是HPLC的9倍、3倍及1.7倍。
由于超高效液相色谱-蒸发光散射检测器分析测定是一项近年出现的全新技术，如何利用其分析测定特定领域——烟草及烟草制品中多种水溶性糖，目前人们还未进行广泛研究，所以迄今为止，现有技术中还没有相关的分析方法的技术报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用超高效液相色谱仪来测定烟草及烟草制品中水溶性糖的方法，该方法具有操作简便、分析速度快、灵敏度高、准确性和稳定性好，特别适用于大批量样品分析的烟草及其烟草制品中多种水溶性糖的分析。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的在超声频率30KHz～40KHz、超声声强0.4～50W/cm2下，以乙腈和水混合液为萃取溶液，在20℃～50℃下，经15min～60min萃取烟草及烟草制品中水溶性糖；以Amide色谱柱为分析柱，以乙腈和水混合液作为流动相，采用配备了蒸发光散射检测器的超高效液相色谱仪测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量。
本发明的技术方案还包括：①在超声萃取烟草及烟草制品中水溶性糖过程中，乙腈和水的萃取溶液体积比为乙腈/水＝1/5～5/1，萃取后用经过活化的WatersOasis HLB固相萃取小柱净化萃取液，然后过0.22μm有机滤膜；②在测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，分析色谱条件为色谱柱用ACQUITY UPLC BEHAmide柱，流动相中加入了质量分数0.2％的三乙胺，流动相流速0.1～0.2mL/min，柱温10℃～60℃；蒸发光散射检测器条件为漂移管温度25℃～75℃，载气为氮气，气体压力20～60psi，喷雾器模式为冷却，数据率10bps，采用与标样对比保留时间定性，外标法定量。
本发明的具体技术参数为：①超声萃取烟草及烟草制品中水溶性糖过程中，乙腈和水的萃取溶液质量比为70∶30，超声频率40KHz、超声声强0.5W/cm2，萃取温度35℃，时间30min；②测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，色谱柱为Waters公司生产的ACQUITY UPLC BEH Amide柱，规格为2.1mm×50mm，1.7μm，流动相采用梯度洗脱，流速0.15ml/min，柱温45℃；漂移管温度55℃，载气气体压力40psi。
在所述的测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，流动相采用梯度洗脱，洗脱程序为，
Figure BDA0000053519020000031
其中的百分比为质量百分比，A为水；B为0.2％的三乙胺与乙腈混合溶液。
本发明所述的烟草及烟草制品为烟叶、烟梗、烟丝、梗丝、烟草薄片，所测定的水溶性为果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、木糖、甘露糖；超高效液相色谱仪采用Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，并配备有真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、蒸发光散射检测器和色谱工作站。
本发明的有益效果是：利用BEH Amide分析柱来改善水溶性糖的分离效果，利用超高效液相色谱仪-蒸发光散射检测器提高分析速度，提供了一种操作简便、分析速度快、灵敏度高、准确性和稳定性好的测定烟草及其烟草制品中多种水溶性糖的方法，特别适用于大批量样品的分析测定。
附图说明
图1为本发明的测定水溶性糖含量标准样品和样品色谱图。
图中：1-鼠李糖，2-木糖，3-果糖，4-甘露糖，5-葡萄糖，6-蔗糖，7-麦芽糖。
具体实施方式
本发明通过以下具体实施例作进一步描述，但并不限制本发明。
前处理方法
称取1.0g(精确至0.0001g)烟丝于100mL锥形瓶中，加入50mL的乙腈/水(70∶30)，在35℃下，以超声频率40KHz、超声声强0.5W/cm2，超声30min。过滤后取5mL过预先活化好的固相萃取小柱(小柱活化方式：用3mL甲醇冲洗，再用6mL水冲洗)，待液体全部流过小柱后用2mL水冲洗，萃取液和洗脱液收集到10mL容量瓶中，最后定容，过0.22μm有机滤膜用于UPLC分析。
UPLC分析条件
色谱柱：ACQUITY UPLC BEH Amide柱(2.1mm×50mm，1.7μm，Waters公司)；流动相：A：水；B：0.2％三乙胺/乙腈溶液；流速：0.15mL/min；柱温：45℃；进样体积：5μL；梯度洗脱程序见表1；ELSD条件：漂移管温度：55℃；载气：氮气；气体压力：40psi；喷雾器模式：冷却；数据率：10bps。采用与标样对比保留时间定性，外标法定量。标样色谱图如图1(A)所示，样品色谱图如图1(B)所示。
表1UPLC梯度洗脱程序
Figure BDA0000053519020000041
工作曲线和检出限、定量限
分别配制一系列浓度约为5、10、20、50、100、250、500、1000μg/mL的7种糖的混合标准溶液，按实施例2的分析条件进行测定，以峰面积Lg值为纵坐标，浓度(μg/mL)Lg值为横坐标绘制工作曲线，线性回归方程、相关系数、检出限及定量限见表2。
表2回归方程、检出限与定量限
Figure BDA0000053519020000042
精密度和回收率
采用标准加入法，计算7种糖的相对标准偏差、回收率，结果见表3。由此可见，所测定的糖的相对标准偏差在0.78％～5.66％之间，表明本方法具有较好的重复性，7种糖的回收率均在85.18％～105.27％之间，说明该方法测定烟丝中糖的含量比较准确，适用于烟丝样品中这7种糖的定量分析。
表3精密度和回收率实验(n＝6)
Figure BDA0000053519020000043
烟草样品分析
采用此方法测定了15个烟草及烟草制品中水溶性糖含量，结果见表4。结果表明，同一种烟草及烟草制品果糖、葡萄糖含量最高，蔗糖、麦芽糖次之，而木糖、甘露糖、鼠李糖的含量极少。不同类型烟草及烟草制品中其水溶性糖含量不同，烤烟中水溶性糖含量较高(尤其是果糖和葡萄糖)，香料烟次之，白肋烟中含量最低。
表4样品中水溶性糖的含量(mg/g)
  样品编号   鼠李糖   木糖   果糖   甘露糖   麦芽糖   蔗糖   葡萄糖
  1   ND   ND   ND   ND   1.421   0.312   0.937
  2   ND   0.563   0.83   ND   ND   0.468   0.679
  3   ND   ND   1.093   ND   ND   0.466   1.168
  4   1.165   4.458   56.75   2.734   29.763   8.732   6.993
  5   0.787   6.176   54.788   3.103   34.438   2.925   8.012
  6   2.637   37.466   2.249   19.476   1.652   6.398   71.051
  7   0.515   35.872   ND   20.963   2.533   4.194   71.179
  8   1.013   4.274   44.173   2.131   28.246   3.211   8.257
  9   0.748   5.652   38.243   1.963   24.785   3.32   7.474
  10   ND   0.253   57.245   1.969   47.34   2.953   4.062
  11   0.397   5.918   83.157   2.265   67.33   4.585   9.974
  12   ND   0.821   72.056   2.727   56.044   5.643   9.383
  13   0.414   5.907   81.381   2.541   70.827   6.719   10.142
  14   0.352   3.496   71.071   3.074   52.184   6.192   9.339
  15   0.584   3.118   82.369   2.557   86.484   30.352   9.338
注：ND-表示未检出。

Claims (5)

1.一种烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：在超声频率30KHz～40KHz、超声声强0.4～50W/cm2下，以乙腈和水混合液为萃取溶液，在20℃～50℃下，经15min～60min萃取烟草及烟草制品中水溶性糖；以Amide色谱柱为分析柱，以乙腈和水混合液作为流动相，采用配备了蒸发光散射检测器的超高效液相色谱仪测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量。
2.根据权利要求1所述的烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：①在超声萃取烟草及烟草制品中水溶性糖过程中，乙腈和水的萃取溶液体积比为乙腈/水＝1/5～5/1，萃取后用经过活化的Waters Oasis HLB固相萃取小柱净化萃取液，然后过0.22μm有机滤膜；②在测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，分析色谱条件为色谱柱用ACQUITY UPLC BEH Amide柱，流动相中加入了质量分数0.2％的三乙胺，流动相流速0.1～0.2mL/min，柱温10℃～60℃；蒸发光散射检测器条件为漂移管温度25℃～75℃，载气为氮气，气体压力20～60psi，喷雾器模式为冷却，数据率10bps，采用与标样对比保留时间定性，外标法定量。
3.根据权利要求2所述的烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于具体参数为：①超声萃取烟草及烟草制品中水溶性糖过程中，乙腈和水的萃取溶液质量比为70∶30，超声频率40KHz、超声声强0.5W/cm2，萃取温度35℃，时间30min；②测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，色谱柱为Waters公司生产的ACQUITYUPLC BEH Amide柱，规格为2.1mm×50mm，1.7μm，流动相采用梯度洗脱，流速0.15ml/min，柱温45℃；漂移管温度55℃，载气气体压力40psi。
4.根据权利要求3所述的烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：在测定烟草及烟草制品中水溶性糖含量过程中，流动相采用梯度洗脱，洗脱程序为，
Figure FDA0000053519010000011
其中的百分比为质量百分比，A为水；B为0.2％的三乙胺与乙腈混合溶液。
5.根据权利要求4所述的烟草及烟草制品中水溶性糖的测定方法，其特征在于：所述的烟草及烟草制品为烟叶、烟梗、烟丝、梗丝、烟草薄片，所测定的水溶性为果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、鼠李糖、木糖、甘露糖；超高效液相色谱仪采用Waters ACQUITY超高效液相色谱仪，并配备有真空脱气机、二元梯度泵、自动进样器、恒温柱箱、蒸发光散射检测器和色谱工作站。
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