KR20090057154A

KR20090057154A - 산란계의 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물

Info

Publication number: KR20090057154A
Application number: KR1020070124043A
Authority: KR
Inventors: 강대경; 임수진; 이학교
Original assignee: 한경대학교 산학협력단; 경기도
Priority date: 2007-12-01
Filing date: 2007-12-01
Publication date: 2009-06-04

Abstract

본 발명은 산란계의 분변으로부터 유산균을 분리하여 그중 설사유발 대장균(Escherichia coli K88) 억제능이 우수하며, 내산성, 내담즙성 및 다양한 효소 분비능을 가진 락토바실러스 (Lactobacillus)속 균주에 관한 것이다.

락토바실러스 살리바리우스 CPM-7, 생균제

Description

산란계의 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물 {Lactobacillus sp. isolated from chicken feces}

본 발명은 산란계의 분변으로부터 분리한 생균제적 특성을 가진 유산균에 관한 것이다.

본 발명과 관련하는 유산균(lactic acid bacteria)은 탄수화물을 분해하고, 이를 이용하여 젖산을 만드는 세균으로서, 산소가 적은 곳에서 잘 증식하는 통성 혐기성균 또는 편성 혐기성균이다. 유산균은 스트렙토코커스(Streptococcus)속, 페디오코커스(Pediococcus)속, 루코노스탁(Leuconostoc)속, 그리고 락토바실러스(Lactobacillus)속 등으로 나뉘며, 이 중에서 락토바실러스 속 미생물은 동형발효 (homofermentation) 또는 이형발효(heterofermentation)을 하는 젖산간균으로서, 유제품이나 채소의 발효과정에서 흔히 볼 수 있는 균이다. 이들은 사람이나 동물의 장내, 특히 소장 부위에 주로 서식하는 것으로 알려져 있다.

유산균은 장내의 pH를 산성으로 유지시킴으로써 대장균이나 살모넬라, 클로스트리디움과 같은 유해균의 번식을 억제하고 설사와 변비를 개선할 뿐 아니라, 비타민 합성, 항암작용, 혈청 콜레스테롤 저하 등의 역할을 한다. 또한, 일부 유산균은 장의 점막과 상피세포에 강하게 결합할 수 있는 특정 단백질을 가지고 있어 유해 세균의 생장을 막는 정장 작용에 많은 도움을 준다. 또한, 유산균은 대식세포(macrophage)의 증식을 촉진함으로써 대식세포의 장내 유해 세균에 대한 인지능력, 살균능력 등을 강화시키고, 면역 관련 물질의 분비를 촉진하여 면역 증강 효과를 나타내는 것으로 알려져 있다(Katsumasa sato, et al., Microbiol. Immunol., 32:689-698, 1988). 사람이나 동물의 장내에서 발견되는 락토바실러스 속 미생물로는 락토바실러스 애시도필러스(L. acidophilus), 락토바실러스 살리바리우스(L. salivarius), 락토바실러스 퍼르멘텀(L. fermentum) 등이 있다.

최근에는 동물이나 사람의 장내로부터 락토바실러스 속 미생물을 분리하고, 이를 이용하여 사료첨가용 생균제, 식품첨가제, 정장제 등으로 개발하고자 하는 연구가 활발히 진행되고 있다. 대한민국 특허 제 2003-495864호에는 내산성 및 내담즙성이 우수한 신규 락토바실러스 애시도필러스 KY01 균주 및 이를 함유하는 제품에 대해 개시되어 있고, 대한민국 특허 제 2001-70689호에는 내산성 및 내담즙성이 우수하고, 병원성 미생물과 부패성 미생물의 생육을 억제시키는 항균 능력이 있는 락토바실러스 애시도필러스 30SC에 대해 개시되어 있다. 또한, 대한민국 특허출원 제 2001-85666호에는 내산성, 내담즙성 및 인체 안전성이 우수하고, 병원성 세균 억제활성, 소취효과 등을 갖는 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) viro-01에 대해 개시되어 있으며, 대한민국 특허출원 제 2001-11797호에는 로타바이러스 및 유해 미생물 억제 활성을 갖는 신 규 내산성 락토바실러스 루테리 프로바이오-16 및 이를 함유하는 생균 활성제에 대해 개시되어 있다. 상기와 같은 락토바실러스 속 미생물에 대한 대부분의 연구는 내산성 및/또는 병원성 또는 부패성 미생물을 갖는 락토바실러스 속 미생물에 대해서 수행되어 오고 있다.

또한, 최근 들어 동물의 성장촉진을 위한 항생물질의 사용 규제가 점차 강화되고 있는 시점에서, 다양한 종류의 기능성 유산균을 분리함으로써 병원성 세균에 의한 가축의 질병 발생을 억제하거나 예방할 수 있는 생균제의 개발에 적용할 수 있다.

본 발명의 목적은 산란계 분변에서 분리한 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7인 것을 특징으로 하는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물을 제공하는데 있다.

산란계 분변에서 분리한 대장균 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 신규 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물.

상기에서 상세히 설명한 바와 같이 본 발명은 산란계의 분변에서 유젖산균을 분리하고 대장균 억제능이 우수한 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7 (L. salivarius CPM-7)을 선별하여 동물용 생균제로 사용함으로써 대장균 등 장내 유해미생물의 증식을 억제시켜 소화관 장애로 인한 가축의 폐사율을 감소시키는 효과가 있다. 또한 본 발명은 항생물질을 대체할 수 있는 생균제로 사용할 수 있는 효과가 있다.

본 발명은 산란계의 분변에서 분리한 락토바실러스 속 미생물에 관한 것이다.

보다 상세히 설명하면 본 발명은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7 (Lactobacillus salivarius CPM-7)인 것을 특징으로 하는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물에 그 특징이 있다.

이하 본 발명의 단계를 설명하면 다음과 같다.

본 발명에서는 산란계의 분변을 채취한 다음, 소디움 아자이드(sodium azide) 0.02%가 첨가된 MRS 고체배지를 이용하여 유산균주들을 분리한다.

분리된 유산균주들 중에서 내담즙성, 내산성 및 병원성 대장균 억제능 등이 우수한 균주를 선발한다.

선발된 유산균주를 동정하고, 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7)으로 명명한다.

상기 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7) 미생물을 한국농용미생물보존센터에 2007년 10월 31일자로 기탁하였다 (수탁번호: KACC 91332P).

또한 본 발명자는 상기와 같은 방법으로 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7)이 내산성, 내담즙성, 당발효 특성, 효소 생성능, 항생물질과 비교한 대장균 억제능 동물의 장상피세포 흡착능 등을 측정함으로써 동물용 생균제로서의 우수성을 입증한다.

이하 본 발명의 구성을 실시예, 시험예, 도면 및 도표를 통하여 상세히 설명하기로 한다. 다만, 본 발명의 권리범위는 실시예, 시험예, 도면 및 도표에 의하여 본 발명의 청구범위가 한정되는 것은 아니다.

실시예.

(1) 시료 채취 및 유산균의 분리

충남 일대의 양계장에서 사육하는 산란계 중에서 건강한 개체들의 분변을 채취하였다. 계분을 0.85% 생리식염수로 희석한 후에 MRS 평판배지에 도말하였으며, 37℃에서 2일간 배양하였다. 무작위 선발법을 이용하여 1차적으로 균주들을 분리한 후에, MRS broth가 첨가된 96-well plate에 접종하고 37℃에서 1일간 배양하였다. 돼지의 설사를 유발하는 E. coli K88이 도말된 LB 평판배지에 홈을 판 후에, 배양액을 100~200μl씩 접종하고 37℃에서 배양하였으며, 대장균 억제환이 큰 유산균을 최종적으로 선발하였다. 배양액을 6,000 rpm에서 15분 원심분리 하였고, 상등액을 버린 후 12% 탈지유 5㎖ 넣어 실험에 사용될 때까지 냉동(-70℃) 보관하였다.

(2) 분리한 유산균의 특성 분석

시험예 1. 유산균의 전자현미경 관찰

최종 선발된 균주를 순수분리하여 MRS 평판배지에 도말한 후 37℃에서 48시간 배양한 후 군락을 떼어내어, 2～4시간, 4℃, 0.05M 소디움 카코딜레이트(sodium cacodylate, pH 7.2)완충용액에서 2% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)와 2% 글루타알데하이드(glutaraldehyde)로 전결착시켰다. 결착시킨 후 0.05M 소디움 카코딜레이트(sodium cacodylate, pH7.2)완충용액으로 10분간 4℃에서 3반복 세척하였다. 세척한 후 0.05M 소디움 카코딜레이트(Sodium Cacodylate, pH7.2)완충용액에서 1% 오슘 테트록사이드(osmium tetroxide)를 첨가하여 4℃에서 2시간 후 결착시켰다. 결착시킨 후 상온에서 증류수로 2회 세척하고 4℃에서 30분간 0.5% 뉴아닐 아세테이트(uranyl acetate)로 앤 블록(En bloc)염색하였다. 상온에서 10분 동안 에탄올 30%, 50%, 70%, 80%, 90%, 100%, 100.100% 각각을 처리하여 탈수시킨 후, 금으로 코팅하고 SEM(JSM-5410LV, JEOL, Japan)으로 관찰하였다.

상기 시험예 1의 결과는 도 1에 나타낸 바와 같이, 락토바실러스속 유산균의 일반적인 형태인 간균의 형태를 나타내었다.

시험예 2. 유산균의 내산성

선발된 균주가 생균제로서 기능을 발휘하기 위해서는 pH 3 이하의 조건인 동물의 위를 통과하여야 한다. 1N HCl로 pH 2, 3, 4로 각각 조정한 MRS 액체배지에 L. salivarius CPM-7 배양액(10⁸ cells/ml)을 2%씩 접종한 후에 37℃에서 배양하면서 배양시간별 생균수의 변화를 관찰하였다.

상기 시험예 2의 결과는 도 2에 나타낸 바와 같이, L. salivarius CPM-7를 pH 2에서 30분간 두었을 때 거의 절반이 생존하였으며 (48%), 30분 이후부터는 생존률이 급격히 감소하였다. 한편, pH 3에서의 생균수는 접종 초기와 거의 비슷한 수준을 유지하였으며, pH 4에서는 control 구 (pH 미조정구)와 유사하게 배양시간에 따라 생균수가 오히려 증가하였다. 음식물의 섭취량이나 종류에 따라 차이가 있겠지만 음식물이 위를 통과하는데 2~3 시간이 소요되며 위산의 pH가 2~3으로 희석된다는 점을 고려할 때, 내산성을 가진 L. salivarius CPM-7이 실제로 위를 통과한 이후의 생존률은 실험치보다 더 높을 가능성을 배제할 수 없다.

시험예 3. 유산균의 내담즙성

Bile salts를 각각 0.1%, 0.2%, 0.3% 첨가한 MRS broth 5ml에 overnight 배양한 유산균 배양액(10⁸ cells/ml)을 2%씩 접종하고 37℃에서 30분에서 6시간동안 배양한 후에 생균수를 측정함으로써 내담즙성 정도를 확인하였다.

상기 시험예 3의 결과는 도 3에 나타낸 바와 같이, bile salt 0.1% 및 0.2% 첨가구에서는 control구 (bile salt 무첨가구)와 유사하게 생균수가 오히려 증가추세를 나타내었고, bile salt 0.3% 첨가구에서는 6시간 이후에도 접종 초기와 비슷한 균수를 유지하였다. Lactobacillus 속은 담즙산에 대한 내성이 약한 편이라고 보고된 바 있으나, 도 3에서 나타난 바와 같이 L. salivarius CPM-7은 담즙산에 대한 내성이 강한 편으로 나타났기 때문에 생균제로서의 가치가 높을 것으로 판단되었다.

시험예 4. 유산균의 당 이용성

최종 선발된 균주를 10시간 배양하고 0.85% 생리식염수로 세척한 다음 다시 멸균된 0.1% 펩톤 용액으로 10배 희석하여 API kit(API50 CHL, BIO?RIEUX, France)을 이용하여 사용법에 따라 접종액(inoculum)을 만들고 API 50 CHL배지에 접종하여 대(strip)을 만든 다음 37℃에서 24시간 배양한 후 색 변화를 관찰하였다. API 50 CHL의 배지의 조성은 이하 표 1과 같다.

표 1

배지의 조성물	함량
폴리펩톤(Polypeptone)	10g
효모 추출물(Yeast extract)	5g
Tween 80	1ml
디포타슘 포스페이트(Dipotassium Phosphate)	2g
소디움아세테이트 3H₂O(Sodium acetate 3H₂O)	5g
디암모늄 시트레이트(Diammonium citrate)	2g
마그세슘 썰페이트(Magnesium sulphate 7H₂0)	0.2g
망간네이즈 썰페이트(Manganase sulphate 4H₂0)	0.05g
브로모크레솔 퍼플(Bromocresol Purple)	0.17g
탈미네랄 수 1000ml

상기 시험예 4의 결과는 표 2에 나타낸 바와 같이, CPM-7 균주는 glucose, galactose, fructose, mannitol, sorbitol과 같은 6탄당 및 그 환원당, maltose, lactose, sucrose와 같은 이당류 등을 선택적으로 이용하는 특성을 나타내었다.

표 2

Characteristics	Result	Characteristics	Result
Shape	rod
Gram stain	+	Arbutin	-
Catalase	-	Esculin	+
Control	-	Salicin	-
Glycerol	-	Celiobiose	-
Erythritol	-	Maltose	+
D-arabinose	-	Lactose	+
L-arabinose	-	Melibiose	+
Ribose D-ribose	-	Sucrose	+
D-xylose	-	Trehalose	+
D-xylose	-	Inulin	-
D-adonitol	-	Melezitose	-
Methyl-BD-xylopyranosicle	+	Raffinose	+
D-galactose	+	Starch	-
D-glucose	+	Glycogen	-
D-fructose	+	Xylitol	-
D-mannose	+	Gentiobiose	-
L-sorbose	_	D-turanose	-
Rhamnose	_	D-lyxose	-
Dulcitol	_	D-tagatose	-
Inositol	_	D-fucose	-
Mannitol	+	l-fucose	-
Sorbitol	+	D-arabitol	+
α-Methyl-D-mannoside	-	L-arabitol	-
α-Methyl-D-glucoside	-	Gluconates	-
N-Acethyl-glucosamine	+	2-keto-Gluconat	-
Amygdalin	-	5-keto-gluconate	-

상기의 전자현미경 관찰, 당 이용성 특성 및 16S rRNA 염기서열을 분석한 결과, 99.9%의 신뢰도로 Lactobacillus salivarius로 동정되었다.

시험예 5. 유산균의 동물 장 상피세포 흡착성

숙주동물 장관세포에의 흡착능은 생균제가 인체나 동물의 장내 정착을 하기 위한 전제조건이다. 선발한 L. salivarius CPM-7이 동물의 장관세포에의 흡착능이 있는지의 여부를 간이실험을 통해 조사하였다. 선발한 균주의 장 상피세포 흡착능을 조사하기 위하여, 돼지의 소장 조직을 채취하였다. 장 상피세포 조직을 1×4 cm 크기의 조각으로 자른 후에, 인산완충용액 (pH 7.2)에 담그고 4℃에서 30분간 방치하였다. 인산완충용액으로 5~7회 세척한 후에, 멸균한 slide glass의 끝부분으로 조직을 긁어서 상피세포가 떨어져 나오도록 하였으며, 떨어져 나온 상피세포를 인산완충용액에 현탁하였다. 동일한 인산완충용액으로 현탁한 L. salivarius CPM-7과 상피세포 현탁액을 혼합하고 37℃에서 30분간 배양하였으며, 그람염색한 후에 상피세포 흡착여부를 광학현미경으로 관찰하였다. 상기 시험예 5의 결과는 도 4에 나타낸 바와 같이, L. salivarius CPM-7이 장 상피세포에 흡착함을 확인할 수 있었다. 생균제의 장관세포 흡착능 여부는 숙주동물 특이적 (host-specific)이라고 알려져 있지만, 본 실험을 통하여 닭의 분변에서 분리한 L. salivarius CPM-7이 돼지의 장관 상피세포에도 흡착함을 확인할 수 있었다.

시험예 6. 유산균의 효소 활성

미생물의 효소 생산여부도 생균제 선발의 주요 지표중의 하나이다. 선발한 균주의 효소 활성을 조사하기 위해서 API ZYM kit (BioMerieux, France)를 사용하였다. L. salivarius CPM-7를 MRS 고체배지에서 배양한 후에 균체를 회수하여 0.85% 생리식염수에 현탁하였다 (Mcfarland 탁도 5~6로 조정). ZYM kit의 각 cupule에 현탁액을 65μl씩 분주하고 37℃에서 4시간 배양한 후에 색깔의 변화를 관찰함으로써, 효소의 활성 정도를 조사하였다.

표 3

Enzyme	Result
1. Cotrol	0
2. Alkaline phosphatase	3
3. Esterase (C₄)	3
4. Esterase Lipase(C₈)	3
5. Lipase(C₁₄)	2
6. Leucine arylamidase	5
7. Valine arylamidase	4
8. Crystine arylamidase	4
9. Trypsin	0
10. α-chymotrypsin	0
11. Acid phospatase	4
12. Naphol-AS-BI-phosphohydrolase	4
13. α-galactosidase	5
14. β-glucuronidase	4
15. β-glucosidase	0
16. α-glucosidase	0
17. β-glucosedase	2
18. N-acetyl-β-glucosidase	2
19. α-mannosidase	0
20. α-fucosidase	0
1) 0, 0 nmol; 1, 5 nmol; 2, 10 nmol; 3, 20 nmol; 4, 30 nmol; 5, ≥ 40 nmol.

상기 시험예 6의 결과는 표 3에 나타낸 바와 같이, L. salivarius CPM-7은 강한 α-galactosidase 활성을 나타내었으며, 이외에도 alkaline phosphatase, esterase, lipase, acrylamidase 활성을 나타내었다. 특히, α-galactosidase는 대두와 같은 곡류에 많이 존재하여 대장내 가스 발생을 유발하는 raffinose나 stachyose와 같은 당류를 분해시키는 효소이므로, 사람이나 동물에 있어서 정장효과를 기대할 수 있었다.

시험예 7. 유산균의 배양시간에 따른 항균력 변화

L. salivarius CPM-7 균주의 배양시간에 따른 항균력을 조사하기 위하여, CPM-7 균주를 MRS 액체배지에 접종하고 37℃에서 배양하였다. 배양 12시간 이후부터 6~12시간 간격으로 배양액을 채취하였으며, 배양 상등액 또는 중화액을 항균력 측정실험에 사용하였다. 상기 시험예 7의 결과는 도 5에 나타낸 바와 같이, 배양 12시간 즉, 대수기부터 대장균 억제환이 뚜렷하게 나타났으며 배양 48시간, 즉 정체기까지 억제능이 지속되었다. L. salivarius CPM-7의 항균력이 유기산 또는 다른 물질에 의한 것인지의 여부를 확인하기 위하여, 초산완충용액(pH 6.0)를 첨가하여 배양액을 중화시킨 후에 대장균 억제능을 조사하였다. 중화 후의 대장균 저해환의 크기가 중화전에 비해 줄어들었지만 중화 후에도 배양시간에 관계없이 저해환이 나타나는 것으로 볼 때, CPM-7 균주가 분비하는 유기산 이외에도 다른 항균물질이 함유되어 있을 것으로 추측되었다.

시험예 8. 항생물질과의 항균력 비교

분리한 균주의 배양액과 항생물질과의 항균력을 비교하기 위하여 E. coli K88을 overlay한 Luria-Bertani 중층배지를 사용하였다. 대장균 중층배지 위에 놓인 페이퍼 디스크 위에 24시간 및 48시간 동안 배양한 선발균주의 배양액을 각각 100㎕식 올려놓았으며, 항생물질과의 항균력을 비교하기 위해 카나마이신 (K, 30μg), 페니실린 (P, 10 units), 테트라사이클린 (T, 30μg), 클로람페니콜 (C, 30μg)이 함유된 페이퍼 디스크를 사용하였다. 페이퍼 디스크를 올려 놓고 30℃에서 하룻밤동안 배양한 후에 각각의 억제환의 크기를 비교하였다. 시험예 8의 결과는 도 6에 나타낸 바와 같이, L. salivarius CPM-7 균주의 24시간 및 48시간 배양액의 대장균 억제능은 클로람페니콜(C, 30μg)보다는 낮았으나, 페니실린(P, 10 units), 카나마이신(K, 30μg) 및 테트라사이클린(T, 30μg)보다는 높았다. 이상의 실험 결과에서 본 바와 같이, L. salivarius CPM-7 균주는 항생제를 대체할 수 있는 생균 제로 사용될 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 실시예(1)～실시예(2)에 의하여 대장균 생장억제력이 우수한 균주를 분리하였으며, 분리된 균주는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7)으로 동정되었다.

본 발명자는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7)을 2007년 10월 31일자로 기탁하여 기탁번호(KACC 91332P)를 부여받았다.

이하 상기 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7(Lactobacillius salivarius CPM-7)를 상기 시험예(1)～(8)의 방법을 기초로 하여 형태 및 당 이용성, 내담즙성, 내산성, 장 상피세포 흡착능성, 효소 활성, 대장균 억제능의 정도를 측정하였다.

본 발명은 상술한 특정의 실시예, 시험예, 도표 또는 도면에 기재된 내용에 기술적 사상이 한정되지 아니하며, 청구범위에서 청구하는 본 발명의 요지를 벗어남이 없이 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 누구든지 다양한 변형의 실시가 가능한 것은 물론이고, 그와 같은 변경은 청구범위 기재의 범위 내에 있게 된다.

도 1은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 형태를 전자현미경으로 관찰한 것이다.

도 2는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 내산성을 나타낸 그래프이다.

도 3은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 내담즙성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 장 상피세포 흡착능을 나타낸 그림이다.

도 5는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 배양시간에 따른 항균력 변화를 나타낸 그림이다.

도 6은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 항생물질과의 항균력을 비교한 그림이다.

표 1은 API 50 CHL 배지의 조성을 나타낸 표이다.

표 2는 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 당 이용성을 나타낸 표이다.

표 3은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7의 효소 활성을 나타낸 표이다.

Claims

산란계 분변에서 분리한 대장균 억제능을 갖는 것을 특징으로 하는 신규 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물.
제1항에 있어서,

상기 미생물은 락토바실러스 살리바리우스 CPM-7 (L. salivarius CPM-7, 기탁번호:KACC 91332P)균주인 것을 특징으로 하는 락토바실러스(Lactobacillus)속 미생물.
제1항의 락토바실러스(Lactobacilli)속 미생물을 함유하는 것을 특징으로 하는 동물용 생균제