BR112020015899A2 - Composições, e método para preparar composição fermentada com odor melhorado usando levedura - Google Patents

Abstract

a presente invenção se refere a um método para preparar uma composição fermentada e, mais especificamente, a um método para preparar uma composição fermentada com odor melhorado, que compreende preparar farinha de grão; realizar fermentação primária da farinha de grão usando levedura; realizar fermentação secundária do produto fermentado primário usando uma cepa do gênero bacillus; e obter o produto fermentado secundário. a composição fermentada da presente descrição apresenta um alto teor de um peptídeo com um baixo peso molecular e, assim, possibilita o aumento de digestibilidade e taxa de absorção de proteínas durante a ingestão, melhorando também ao mesmo tempo o odor peculiar de um produto fermentado para melhorar sua palatabilidade.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para “COMPOSIÇÕES, E MÉTODO

PARA PREPARAR COMPOSIÇÃO FERMENTADA COM ODOR MELHORADO USANDO LEVEDURA” CAMPO DA TÉCNICA

[001] A presente descrição se refere a um método para preparar uma composição fermentada, e mais especificamente, a um método para preparar uma composição fermentada com odor melhorado, que inclui preparar farinha de grão, realizar fermentação primária da farinha de grão usando levedura; realizar fermentação secundária do produto fermentado primário usando uma cepa do gênero Bacillus, e obter o produto fermentado secundário; levedura para melhorar o odor de um produto fermentado de Bacillus que produz α-galactosidase, protease e fitase; uma composição para fermentar grão, contendo a levedura; uma composição fermentada preparada pelo método anterior; e uma composição de ração contendo a levedura ou composição fermentada.

ANTECEDENTES DA TÉCNICA

[002] Grão é amplamente usado como ração para a pecuária, em decorrência de alta eficiência na alimentação, em virtude de seu alto teor de energia e boa digestibilidade em virtude de seu baixo teor de fibra bruta. Entretanto, a alimentação de grãos apresenta um baixo teor de proteínas e aminoácidos e, assim, um suplemento auxiliar é essencialmente exigido para nutrição equilibrada. Como tais fontes proteicas, fontes de proteína animal (por exemplo, farinha de peixe, leite em pó desnatado, farinha de carne, sangue, etc.) e fontes de proteína vegetal (por exemplo, soja, sementes, linho, etc.) são usadas. Glúten de milho, que é uma fonte de proteína vegetal, é um subproduto da preparação de amido de milho, que é similar em teor à farinha de peixe, com um alto teor de proteína (cerca de 3 vezes daquelas fontes de proteína vegetal comum) e curso baixo, e é assim amplamente usado como uma fonte de proteína para ração. Adicionalmente, farelo de soja, que é um subproduto que permanece após a produção de óleo de soja a partir de sojas, é usado como uma fonte principal de proteínas em ração, em virtude de seu alto teor de proteína.

[003] Entretanto, oligossacarídeos indigestos, proteínas não solúveis modificadas durante o processo de fabricação, etc. contidas no farelo de soja ou glúten de milho diminuem a digestibilidade, e são assim problemáticos para uso como ração. Portanto, existe uma necessidade de desenvolvimento de um método de processamento inédito capaz de melhorar a digestibilidade das partes de proteína, de maneira tal que o farelo de soja ou glúten de milho possam ser usados como alimentação proteica de alta qualidade.

[004] Adicionalmente, em relação a isso, vários agentes microbianos complexos que podem ser usados para uma composição alimentícia foram recentemente desenvolvidos, mas estes agentes microbianos complexos apresentam um problema no qual as ações fisiológicas e as interações entre micro-organismos não foram considerados.

[005] Nestas circunstâncias, os presentes inventores realizaram esforços para solucionar os problemas anteriores. Em função disso, descobriram que é possível aumentar o teor de sacarídeo solúvel em água de uma matéria-prima, por meio do tratamento enzimático farinha de grão, e concentrar as proteínas contidas na mesma por meio de fermentação de levedura e fermentação de Bacillus e, assim, é possível melhorar a funcionalidade de uma composição aumentando a proporção do teor de proteína e a contagem de célula viável na farinha de grão, finalizando por meio disso a presente descrição.

DESCRIÇÃO PROBLEMA TÉCNICO

[006] Um aspecto da presente descrição é prover um método para preparar uma composição fermentada com odor melhorado, que inclui preparar farinha de grão; realizar fermentação primária da farinha de grão usando levedura; realizar fermentação secundária do produto fermentado primário usando uma cepa do gênero Bacillus; e obter o produto fermentado secundário.

[007] Um outro aspecto da presente descrição é prover levedura para melhorar odor de um produto fermentado de Bacillus que produz α-galactosidase, protease e fitase.

[008] Ainda um outro aspecto da presente descrição é prover uma composição para fermentação de grão contendo a levedura.

[009] Ainda um outro aspecto da presente descrição é prover uma composição fermentada preparada pelo método anterior.

[010] Ainda um outro aspecto da presente descrição é prover uma composição alimentar contendo a levedura ou composição fermentada.

SOLUÇÃO TÉCNICA

[011] A presente descrição é descrita em detalhes da seguinte maneira. Entretanto, descrições respectivas e modalidades descritas na presente descrição também podem ser aplicadas às outras descrições e modalidades. Isto é, todas as combinações de vários elementos descritos na presente descrição estão no escopo da presente descrição. Adicionalmente, o escopo da presente descrição não é limitado pela descrição específica a seguir.

[012] Para atingir os objetivos anteriores, um aspecto da presente descrição provê um método para preparar uma composição fermentada com odor melhorado, que inclui preparar farinha de grão; realizar fermentação primária da farinha de grão usando levedura; realizar fermentação secundária do produto fermentado primário usando uma cepa do gênero Bacillus; e obter o produto fermentado secundário.

[013] Na preparação da farinha de grão pelo método de preparação anterior, a farinha de grão pode conter, sem limitação, quaisquer matérias-primas comumente usadas em um processo de preparação de alimentação. Especificamente a farinha de grão pode conter soja, farelo de soja, milho ou glúten de milho, etc., mais especificamente, farelo de soja ou glúten de milho, e ainda mais especificamente, tanto farelo de soja quanto glúten de milho, mas a farinha de grão não é limitada a esta.

[014] A farinha de grão pode ser uma que é submetida ao ajuste de teor de umidade e tratamento térmico.

[015] Sabe-se que micro-organismos exigem pelo menos um certo nível de umidade para o seu crescimento, e que é difícil para os mesmos crescer em uma concentração de umidade de 5 % a 12 %, que é a concentração de umidade contida nas próprias matérias-primas. Adicionalmente, sabe-se que a maior das enzimas (por exemplo, glucoamilase, proteases, etc.) se submete a uma reação de decomposição baseada em hidrólise e, assim, pelo menos um certo nível de teor de umidade é necessário para possibilitar uma reação enzimática suave.

[016] Especificamente, o teor de umidade ajustado na farinha de grão pode estar em uma faixa de 30 % a 60 %, mais especificamente 35 % a 55 %, e mais especificamente 40 % a 50 %, mas o teor de umidade ajustado não é limitado a estes. A composição com o teor de umidade ajustado na faixa anterior pode ser vantajosa, à medida que pode prevenir a redução da taxa de fermentação, em virtude de um baixo teor de umidade, e melhora o problema de alto custo que é incorrido na transferência das matérias-primas e no processo de secagem após a fermentação e, adicionalmente, a composição pode ser vantajosa a partir do aspecto de eficiência térmica.

[017] Em particular, o teor de umidade pode afetar o grau de aumento no teor de proteína durante a fermentação da composição. Especificamente, à medida que o baixo teor de umidade se torna mais baixo, este se torna mais desvantajoso para o crescimento de um micro-organismo, e o grau de aumento no teor de proteína de uma composição por fermentação pode ser reduzido. Adicionalmente, quando o teor de umidade é excessivamente elevado, o custo de secagem para remover a umidade contida no final da fermentação aumenta e, em função disso, os custos de fabricação podem aumentar e a competitividade do produto pode ser reduzida.

[018] Entretanto, o processo de tratamento térmico pode esterilizar micro- organismos prejudiciais contidos nas próprias matérias-primas, e reduzir estes materiais que inibem a digestibilidade, tais como fatores anti-nutricionais (por exemplo, inibidores de tripsina presentes no farelo de soja ou glúten de milho). Adicionalmente, uma vez que glúten de milho apresenta baixa higroscopicidade, este pode ajudar a garantir que umidade suficiente esteja contida no glúten de milho por meio de um processo de tratamento térmico após a hidrólise.

[019] O tratamento térmico pode ser realizado usando vários métodos conhecidos na técnica, por exemplo, usando vapor ou vapor superaquecido.

[020] Especificamente, o tratamento térmico pode ser realizado em 90 °C até 110 °C por 20 a 40 minutos, mais especificamente em 95 °C até 105 °C por 25 a 35 minutos, e mais especificamente em 100 °C por 30 minutos, mas o tratamento térmico não é limitado aos mesmos.

[021] Quando a temperatura do tratamento térmico é baixa ou o tempo de tratamento é curto, existe um problema no qual o efeito de esterilização de vários germes é diminuído, e o processo de fermentação subsequente não pode prosseguir facilmente, ao passo que quando a temperatura do tratamento térmico é alta ou o tempo de tratamento é longo, existe um problema no qual a digestibilidade pode ser reduzida em virtude da desnaturação das proteínas na composição e, assim, a qualidade do produto final pode ser deteriorada.

[022] No método de preparação da presente descrição, a fermentação primária é fermentar a farinha de grão usando levedura.

[023] Da maneira aqui usada, o termo “levedura” é um termo genérico para organismos unicelulares, os quais são um grupo de fungos ou cogumelos, mas que não apresentam hifas nem uma função de fotossíntese ou motilidade. A própria levedura é usada como uma fonte barata de gordura/proteína, e também pode ser usada para fermentação de alimento ou ração. Especificamente, a levedura usada para a fermentação de levedura da composição fermentada pode ser Saccharomyces cerevisiae, mas a levedura não é limitada à mesma.

[024] Uma vez que a levedura secreta uma enzima capaz de decompor oligossacarídeos, esta pode decompor oligossacarídeos em matérias-primas vegetais para ração e, além disso, as paredes celulares de levedura podem funcionar como um componente usado para animais e, assim, o método para preparar uma composição fermentada usando a levedura pode melhorar os componentes e a funcionalidade das matérias-primas vegetais.

[025] A levedura da presente descrição pode ser uma que produz α- galactosidase, protease e fitase, e mais especificamente Saccharomyces cerevisiae, depositada com o número de acesso KCCM12123P ou número de acesso KCCM12124P. Em geral, nem toda levedura pode produzir α-galactosidase, protease e fitase, mas a levedura da presente descrição pode produzir estas enzimas e, assim, apresenta um efeito excelente de melhorar os odores do produto fermentado e composição fermentada por fermentação de Bacillus, comparada às outras espécies de levedura.

[026] A quantidade de levedura a ser inoculada na composição fermentada pode ser um fator importante que afeta a fermentação. A quantidade de inoculação de levedura pode ser tal que o número de levedura imediatamente após a inoculação está em uma faixa de 105 CFU/g a 109 CFU/g, e mais especificamente, 106 CFU/g a 108 CFU/g, mas a quantidade de inoculação de levedura não é limitada à mesma.

[027] Quando a quantidade inoculada é muito pequena, a quantidade do líquido de fermentação das bactérias para semear a ser consumido é pequena, mas exige um tempo mais longo para a fermentação da composição. Em função disso, o tempo de fermentação exigido para produzir um produto se torna mais longo, aumentando assim a probabilidade de contaminação com vários germes. Entretanto, quando a quantidade inoculada é muito grande, o tempo de fermentação pode ser significativamente menor, mas existe uma desvantagem na qual bactérias para semear devem ser providas para inoculação. Em particular, uma vez que o desempenho da fermentação depende amplamente das características de crescimento das cepas de fermentação a serem usadas, e do tipo do aparelho de fermentação, os versados na técnica serão capazes de selecionar apropriadamente a quantidade de inoculação, considerando as características destas cepas no estágio de produção.

[028] A realização da fermentação primária de farinha de grão da presente descrição pode incluir adicionalmente tratar a farinha de grão com uma enzima. Mais especificamente, a etapa pode incluir adicionar α-amilase ou glucoamilase.

[029] O método de preparação da presente descrição pode aumentar o teor de sacarídeo solúvel em água de uma matéria-prima por meio de tratamento enzimático de farinha de grão, e pode concentrar proteínas contidas na mesma por meio de fermentação de levedura e fermentação de Bacillus e, assim, é possível melhorar a funcionalidade de uma composição aumentando a razão de teor de proteína na farinha de grão.

[030] O tratamento enzimático de farinha de grão corresponde à decomposição de carboidratos estruturais.

[031] Da maneira aqui usada, o termo “carboidrato estrutural” se refere a um carboidrato com pouca utilização (por exemplo, celulose, hemicelulose, pectina, etc.) que constitui as paredes celulares de células vegetais. Carboidratos estruturais podem inibir a utilização de matérias-primas para rações para animais (por exemplo, farelo de soja, glúten de milho, etc.) por micro-organismos fermentadores, e também podem diminuir a taxa de absorção e taxa de digestão da pecuária. Dessa maneira, o tratamento enzimático pode ser realizado de maneira a melhorar a taxa de utilização de substrato por micro-organismos fermentadores, e a taxa de absorção e taxa de digestão da pecuária.

[032] Especificamente, exemplos de enzimas que podem decompor os carboidratos estruturais incluem α-amilase, glucoamilase, celulase, pectinase, etc. e, mais especificamente, α-amilase ou glucoamilase, mas as enzimas não são limitadas às mesmas.

[033] O tratamento enzimático pode ser realizado simultaneamente, ou sequencialmente, em conexão com a inoculação de levedura na farinha de grão a ser fermentada, de acordo com o tipo da enzima.

[034] Especificamente, se o tratamento enzimático for realizado simultaneamente ou sequencialmente, poderá variar, dependendo do tipo das enzimas.

[035] Uma vez que as condições de atividade variam de enzima para enzima, a etapa de tratamento enzimático e a etapa de fermentação de levedura podem ser realizadas, considerando as condições de atividade enzimática e condições de fermentação de levedura. Por exemplo, quando α-amilase termofílica é usada, a atividade enzimática exige uma condição de temperatura elevada. Portanto, um processo de tratamento térmico e uma etapa de tratamento enzimático podem ser realizados simultaneamente, adicionando uma enzima antes do tratamento térmico, após o tratamento de umidade da farinha de grão. Isto é, a etapa de fermentação de levedura pode ser realizada após o processo de tratamento térmico e a etapa de tratamento enzimático.

[036] Entretanto, quando glucoamilase ou α-amilase mesofílica é usada, a atividade enzimática não exige uma condição de temperatura elevada. Portanto, uma etapa de tratamento enzimático pode ser realizada após completar o tratamento de umidade e tratamento térmico. Neste caso, a reação enzimática e a fermentação de levedura podem ser realizadas separadamente ou simultaneamente. Por exemplo, a reação enzimática pode ser realizada a 50 °C até 70 °C, por 30 minutos a 1 hora e 30 minutos, adicionando glucoamilase ou α-amilase mesofílica à farinha de grão, e a seguir a fermentação de levedura pode ser realizada por inoculação com levedura. Alternativamente, para a otimização do processo, a etapa de reação enzimática e a etapa de fermentação de levedura podem ser realizadas simultaneamente, adicionando uma enzima e levedura simultaneamente.

[037] A realização da fermentação primária da farinha de grão pode incluir, adicionalmente, adicionar glucoamilase à farinha de grão em uma quantidade de 0,1 % em peso a 1,0 % em peso, 0,3 % em peso a 0,7 % em peso, ou 0,5 % em peso; inocular uma cultura de levedura em uma quantidade de 1 % em peso a 30 % em peso, 1 % em peso a 20 % em peso, 5 % em peso a 15 % em peso, 8 % em peso a 12 % em peso, ou 10 % em peso; ou realizar fermentação anaeróbica para a farinha de grão, em que uma cultura de levedura é inoculada, a 10 °C até 50 °C, 20 °C até 40 °C, 25 °C até 35 °C, ou 30 °C por 1 a 10 horas, 2 a 10 horas, 4 a 8 horas, 5 a 7 horas, ou 6 horas.

[038] No método de preparação da presente descrição, a etapa de fermentação secundária corresponde a uma etapa na qual o produto fermentado primário se submete à fermentação adicional usando uma cepa do gênero Bacillus, e a fermentação secundária é realizada em ordem sequencial seguindo a fermentação primária.

[039] Bacillus, que é um gênero que pertence à família Bacillus, e as bactérias do gênero Bacillus são bactérias Gram-positivas, bactérias em forma de bastonete. Especificamente, a cepa do gênero Bacillus pode ser pelo menos uma cepa selecionada do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus toyoi, Bacillus coagulans, Bacillus polyfermenticus, e Bacillus amyloliquefaciens, mais especificamente, Bacillus amyloliquefaciens, e ainda mais especificamente, a cepa do gênero Bacillus pode ser a Bacillus amyloliquefaciens depositada com o número de acesso KCCM11471P, mas a cepa do gênero Bacillus não é limitada à mesma.

[040] A quantidade da cepa do gênero Bacillus a ser inoculada na composição fermentada é a mesma descrita anteriormente, com relação ao caso da quantidade de inoculação de levedura.

[041] Bacillus exibe um sabor acre pela produção de amônia durante a fermentação, e este sabor acre pode afetar a preferência da composição fermentada. Entretanto, o método de preparação da presente descrição pode melhorar a preferência de um produto fermentado de Bacillus, melhorando o odor peculiar do produto fermentado de Bacillus por meio da fermentação sequencial usando levedura e Bacillus.

[042] Adicionalmente, realizando sequencialmente a fermentação de levedura e a fermentação pela cepa do gênero Bacillus, a contagem de célula viável em uma composição fermentada pode ser significativamente aumentada, e um aumento como este na contagem de célula viável pode melhorar os efeitos de probióticos da composição fermentada.

[043] No método para preparar uma composição fermentada da presente descrição, uma composição fermentada pode ser produzida, na qual as características e vantagens de cada levedura e Bacillus são combinadas. Em geral, sabe-se que

Bacillus não pode produzir α-galactosidase e, assim, não pode decompor completamente polissacarídeos com uma ligação glicosídica. Entretanto, algumas cepas de levedura podem produzir α-galactosidase e, assim, o componente de sacarídeo de farelo de soja ou glúten de milho, que é difícil de decompor com apenas uma cepa do gênero Bacillus, pode ser decomposto por levedura e, assim, o componente de sacarídeo do farelo de soja ou glúten de milho pode ser usado eficientemente como um substrato para o crescimento e metabolismo das cepas de fermentação.

[044] Especificamente, a funcionalidade de uma composição fermentada pode ser melhorada decompondo os oligossacarídeos presentes na farinha de grão, usando uma enzima decompositora de oligossacarídeo expressa em levedura e aumentando a contagem de célula viável da própria levedura, aumentando assim os teores de componentes funcionais na levedura. Adicionalmente, a taxa de digestão e taxa de absorção de uma composição alimentar podem ser melhoradas decompondo as proteínas na farinha de grão, usando uma protease expressa em Bacillus.

[045] No método para preparar uma composição fermentada da presente descrição, a fermentação pode ser uma fermentação sólida ou fermentação em estado líquido e, especificamente, a fermentação pode ser uma fermentação sólida.

[046] Da maneira aqui usada, o termo “fermentação sólida” se refere a um método para realizar a produção fermentada por um micro-organismo, usando uma matéria-prima no estado sólido contendo uma certa quantidade de água.

[047] A fermentação secundária da presente descrição, após 2 a 10 horas, 4 a 8 horas, 5 a 7 horas, ou 6 horas após a inoculação de levedura, pode incluir adicionalmente inocular uma cultura de uma cepa do gênero Bacillus em uma quantidade de 1 % em peso a 30 % em peso, 1 % em peso a 20 % em peso, 5 % em peso a 15 % em peso, 8 % em peso a 12 % em peso, ou 10 % em peso; e realizar uma fermentação aeróbica a 35 °C até 40 °C, ou 37 °C, em uma umidade de 80 % a 100 %, 90 % a 100 %, 93 % a 97 % ou 95 %.

[048] Um produto fermentado secundário, que passou pela etapa de fermentação secundária, pode ser um no qual o teor de um peptídeo de baixo peso molecular está em uma faixa de 30 % a 100 %, mais especificamente 40 % a 100 %, 50 % a 100 %, 60 % a 100 %, 40 % a 90 %, 50 % a 90 %, 40 % a 80 %, 50 % a 80 %, 40 % a 70 %, ou 50 % a 70 %.

[049] O “peptídeo de baixo peso molecular” se refere a um peptídeo com um peso molecular de 30 kDa ou menos, e mais especificamente, 0,1 kDa a 30 kDa, 1 kDa a 30 kDa, 0,1 kDa a 20 kDa, 1 kDa a 20 kDa, 0,1 kDa a 10 kDa, 1 kDa a 10 kDa, ou 10 kDa ou menos.

[050] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê levedura para melhorar o odor de um produto fermentado de Bacillus que produz α-galactosidase, protease e fitase.

[051] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê uma composição para fermentação de grão contendo a levedura anterior, e uma composição alimentar contendo a levedura anterior.

[052] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê uma composição fermentada preparada pelo método anterior.

[053] Ainda um outro aspecto da presente descrição provê uma composição alimentar contendo a composição fermentada anterior.

[054] A α-galactosidase, protease, fitase, produto fermentado de Bacillus, e levedura são da maneira descrita anteriormente.

[055] A levedura pode ser uma que produz α-galactosidase, protease e fitase e, mais especificamente, Saccharomyces cerevisiae depositada com o número de acesso KCCM12123P ou número de acesso KCCM12124P.

[056] Da maneira aqui usada, o termo “composição alimentar” se refere a um material que fornece os nutrientes orgânicos ou inorgânicos que são necessários para manter a vida de um sujeito e para formar o sujeito. A composição alimentar pode conter nutrientes (por exemplo, energia, proteínas, lipídeos, vitaminas, minerais, etc.) que são necessários para um sujeito consumir a ração, e podem ser usados como uma ração vegetal (por exemplo, grãos, farinhas de raiz, subprodutos de processamento alimentar, algas, fibras, gorduras e óleos, amido, cabaças, subprodutos de grãos, etc.) ou uma ração animal (por exemplo, proteínas, materiais inorgânicos, gorduras e óleos, minerais, proteínas de célula única, zooplanctons, farinha de peixe, etc.), mas o uso da composição alimentar não é particularmente limitado a estes. Na presente descrição, a composição alimentar é um conceito que inclui todos os materiais que são adicionados à alimentação (isto é, aditivo alimentar), matérias-primas para a ração, ou a própria ração fornecida ao sujeito.

[057] O sujeito, que se refere àquele para criar, pode ser incluído, sem limitação, contanto que sejam organismos que possam ingerir a ração da presente descrição. Como tal, a composição alimentar da presente descrição pode ser aplicada a uma pluralidade de dieta (isto é, ração) para animais, incluindo mamíferos, aves domésticas, peixe e crustáceos. Pode ser usada em mamíferos comercialmente importantes (por exemplo, porcos, gado, cabras, etc.), animais de zoológico (por exemplo, elefantes, camelos, etc.), ou animais domésticos (por exemplo, cachorros, gatos, etc.). Aves domésticas comercialmente importantes podem incluir galinhas, patos, gansos, etc., e peixes criados comercialmente e crustáceos (por exemplo, truta e camarão) também podem ser incluídos.

[058] O teor do farelo de soja ou glúten de milho em uma composição alimentar, de acordo com a presente descrição, pode ser ajustado adequadamente de acordo com o tipo e idade de animais a serem aplicados, forma de aplicação, efeitos desejados, etc., por exemplo, em uma faixa de 1 % em peso a 99 % em peso, especificamente 10 % em peso a 90 % em peso, e mais especificamente 20 % em peso a 80 % em peso, mas o teor do farelo de soja ou glúten de milho não é limitado aos mesmos.

[059] Para administração, a composição alimentar da presente descrição pode incluir adicionalmente uma mistura de pelo menos um de um ácido orgânico (por exemplo, ácido cítrico, ácido fumárico, ácido adípico, ácido láctico, etc.); fosfato (por exemplo, fosfato de potássio, fosfato de sódio, polifosfato, etc.); um antioxidante natural (por exemplo, polifenol, catequina, tocoferol, vitamina C, extrato de chá verde,

quitosana, ácido tânico, etc.); além do concentrado de proteína de soja hidrolisada. Se necessário, outros aditivos típicos (por exemplo, um agente anti-influenza, um tampão, um agente bacteriostático, etc.) pode ser adicionada. Além disso, um diluente, um agente dispersante, um agente tensoativo, um aglutinante, ou um lubrificante pode ser adicionado me maneira adicional para formular a composição em uma preparação injetável (por exemplo, uma solução aquosa, uma suspensão, uma emulsão, etc.), uma cápsula, grânulo, ou um comprimido.

[060] Adicionalmente, a composição alimentar da presente descrição pode ser usada junto com vários componentes auxiliares (por exemplo, aminoácidos, sais inorgânicos, vitaminas, antioxidantes, agentes antifúngicos, agentes antibacterianos, etc.), e um suplemento nutriente, um acelerador do crescimento, um acelerador de digestão/absorção, e um agente profilático, além dos principais ingredientes, incluindo uma ração proteica vegetal (por exemplo, trigo, cevada, milho, etc. pulverizado ou fragmentado), uma ração proteica animal (por exemplo, farinha de sangue, farinha de carne, farinha de peixe, etc.), gordura animal e óleo vegetal.

[061] Quando a composição alimentar da presente descrição for usada como um aditivo alimentar, a composição alimentar pode ser adicionada como tal ou usada junto com outros componentes, e pode ser apropriadamente usada de acordo com o método convencional. A composição alimentar pode ser preparada na forma de administração de uma formulação de liberação imediata ou formulação de liberação contínua, em combinação com um carreador farmaceuticamente aceitável não tóxico. O carreador comestível pode ser amido de milho, lactose, sacarose, ou propileno glicol. O carreador sólido pode estar na forma de administração de comprimidos, pós, trociscos, etc., e o carreador líquido pode estar na forma de administração de xaropes, suspensões líquidas, emulsões, soluções, etc. Além disso, o agente de administração pode incluir um conservante, um lubrificante, um acelerador de solução, ou um estabilizador, e também pode incluir outros agentes para melhorar doenças inflamatórias, e um material usado para proteção contra vírus.

[062] A composição alimentar, de acordo com a presente descrição, pode ser misturada em uma quantidade de aproximadamente 10 g a 500 g, especificamente 10 g a 100 g por 1 kg, com base no peso seco da ração para pecuária, e após ser completamente misturada, a composição alimentar pode ser provida como mosto ou submetida a um processo adicional de pelotização, extensificação ou extrusão, mas não é limitada à mesma.

[063] De acordo com o método da presente descrição documentado anteriormente, é possível aumentar o teor de sacarídeo solúvel em água de uma matéria-prima, por meio de tratamento enzimático de farinha de grão, e concentrar as proteínas contidas na mesma por meio de fermentação de levedura e fermentação de Bacillus e, assim, é possível melhorar a funcionalidade, digestibilidade e taxa de absorção de uma composição aumentando a razão de teor de proteína e da contagem de célula viável na farinha de grão.

[064] Adicionalmente, da maneira descrita anteriormente, um produto fermentado de Bacillus produz um odor peculiar durante o processo de fermentação em virtude da amônia, etc., e isto pode causar um problema em usar o produto fermentado correspondente como ração, etc. A levedura da presente descrição é usada em uma fermentação complexa associada com a fermentação de Bacillus, e é assim capaz de reduzir significativamente o odor do produto fermentado pela fermentação de Bacillus. Adicionalmente, a levedura da presente descrição contém a levedura, e é assim capaz de prover uma composição para fermentação de grão e composição alimentar com odor melhorado.

EFEITOS VANTAJOSOS DA INVENÇÃO

[065] O método para preparar uma composição fermentada da presente descrição pode aumentar o teor de sacarídeo solúvel em água de uma matéria prima, por meio de tratamento enzimático de farinha de grão, e concentrar proteínas contidas na mesma por meio de fermentação de levedura e, assim, é possível melhorar a funcionalidade de uma composição aumentando a razão de teor de proteína e a contagem de célula viável na farinha de grão. Em particular, uma vez que a levedura secreta uma enzima capaz de decompor oligossacarídeos, esta pode decompor oligossacarídeos em matérias-primas vegetais para ração e, além disso, as paredes celulares de levedura podem funcionar como um componente usado para animais e, assim, o método para preparar uma composição fermentada usando a levedura pode melhorar os componentes e funcionalidade das matérias-primas vegetais. Adicionalmente, o método para preparar uma composição fermentada da presente descrição pode incluir adicionalmente a fermentação de Bacillus após a fermentação de levedura. Uma vez que Bacillus produz uma protease, as proteínas na composição fermentada podem ser peptidizadas e, em função disso, a digestibilidade da proteína e taxa de absorção da ração pode ser melhorada. Adicionalmente, o método para preparar uma composição fermentada da presente descrição pode melhorar o odor peculiar causado por fermentação de Bacillus, por meio da fermentação sequencial de fermentação de levedura e fermentação de Bacillus, melhorando por meio disso a preferência da composição.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

[066] A figura 1 mostra uma imagem que ilustra os resultados de medição de componentes de sacarídeo em um grupo de matérias-primas de grão, um grupo de grãos mistos apenas com fermentação de Bacillus, um grupo de grãos mistos apenas com fermentação de levedura, e um grupo de grãos mistos com fermentação combinada por levedura e Bacillus, em que (1) representa materiais padrões: estaquiose, rafinose, sacarose e glicose (a partir do fundo); (2) representa matérias- primas de farelo de soja; (3) representa matérias-primas de glúten de milho; (4) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de levedura; (5) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de levedura (CJN1697); (6) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) com fermentação combinada por levedura (CJN1697) e Bacillus; (7) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) com fermentação combinada por levedura (CJN2343) e Bacillus; e (8) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) com fermentação combinada por levedura (Angest®) e Bacillus.

[067] A figura 2 mostra uma imagem que ilustra os resultados da análise de componentes proteicos para cada um dos seguintes grupos: o grupo de matérias- primas de grão (farelo de soja, glúten de milho, e matérias-primas de grão misto); o grupo das matérias-primas de grão apenas com fermentação de Bacillus; o grupo das matérias-primas de grão apenas com fermentação de levedura; e o grupo das matérias-primas de grão com fermentação combinada por levedura e Bacillus.

[068] A figura 3 mostra um gráfico que ilustra os resultados da análise filogenética da cepa CJN1697.

[069] A figura 4 mostra um gráfico que ilustra os resultados da análise filogenética da cepa CJN2343.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO

[070] Daqui por diante, a presente revelação será descrita em detalhes por meio de modalidades exemplares. Entretanto, estas modalidades exemplares são apenas para propósitos ilustrativos, e não são pretendidas para limitar o escopo da presente descrição. EXEMPLO 1: TRIAGEM DE CEPAS DE LEVEDURA

[071] Entre as cepas de levedura, aquelas cepas com capacidades excelentes de que produz α-galactosidase, protease e fitase foram selecionadas. Para confirmar a capacidade de que produz α-galactosidase, o meio de ágar X-gal (NaCl (0,5 %), peptona (1 %), rafinose (1 %), ágar (1,5 %), e X-gal (0,5 %)) foi preparado. Adicionalmente, para confirmar a capacidade de produzir protease, o meio de ágar YM (leite em pó desnatado (2 %), extrato de levedura (0,3 %), extrato de malte (0,3 %), peptona (1 %) e ágar (1,5 %)) foi preparado, e para avaliar a atividade de fitase o meio foi preparado adicionando fitina ao meio anterior.

[072] Cada cepa de levedura foi cultivada no meio YPD (glicose (2 %), extrato de levedura (0,8 %), e peptona de soja (0,2 %)) a 30 °C por 12 horas, e por meio disso a cepa Saccharomyces cerevisiae foi preparada. A cultura de levedura preparada (5 µL) foi adicionada em gota a gota em cada meio de ágar, cultivada a 30 °C por cerca de 24 horas, e a capacidade de produzir α-galactosidase, protease e fitase foi avaliada pelas zonas claras geradas, onde cada gota da cultura de levedura foi colocada.

[073] A presença de α-galactosidase foi confirmada através do meio de ágar X- gal, e a capacidade de produzir protease e fitase foi examinada medindo e comparando o tamanho de cada colônia, e a zona clara gerada em torno da colônia (tamanho da zona clara/tamanho da colônia) (Tabela 1). No caso das cepas onde nenhuma geração de zona clara foi observada, em virtude da ausência da atividade de protease, estas cepas foram indicadas como “0”. Em função disso, entre cerca de 100 cepas de Saccharomyces cerevisiae, 14 cepas mostraram ter a atividade α- galactosidase, e entre as 14 cepas, duas cepas (isto é, CJN1697 e CJN2343) foram finalmente selecionadas excluindo aquelas cepas onde a atividade de protease necessária para fermentação de grão não está mais presente. [Tabela 1] Número da Presença de Razão (Zona Número Presença de Razão (Zona cepa α- clara/Tamanho da da cepa α- clara/Tamanho da Galactosidase colônia) Galactosidase colônia)) Protease Fitase Protease Fitase CJN1023 X 1,11 1,58 CJN2225 X 1,03 1,32 CJN1025 X 1,51 1,11 CJN2229 X 1,03 1,20 CJN1102 X 1,07 1,24 CJN2343 O 1,13 1,25 CJN1103 X 1,19 1,29 CJN2347 X 1,11 1,33 CJN1105 X 1,22 1,48 CJN2350 X 1,08 1,34 CJN1108 X 1,11 1,25 CJN2387 X 1,07 1,41 CJN1110 X 1,11 1,33 CJN2389 X 1,09 1,42 CJN1145 X 1,03 1,32 CJN2390 X 1,08 1,39 CJN1146 X 1,02 1,43 CJN2391 X 1,05 1,37 CJN1147 X 1,00 1,58 CJN2393 X 1,11 1,32 CJN1148 X 1,00 1,32 CJN2394 X 1,10 1,41 CJN1292 X 1,21 1,42 CJN2395 X 1,10 1,39 CJN1293 X 1,00 1,52 CJN2560 O 0,00 1,09

CJN1294 X 1,13 1,31 CJN2562 O 0,00 1,06 CJN1295 X 1,14 1,59 CJN2563 O 0,00 1,03 CJN1297 X 1,10 1,38 CJN2564 O 0,00 1,13 CJN1298 X 1,19 1,71 CJN2565 O 0,00 1,18 CJN1334 X 1,23 1,14 CJN2597 O 0,00 1,17 CJN1336 X 1,00 1,24 CJN2600 O 0,00 1,23 CJN1437 X 1,00 1,33 CJN2601 O 0,00 1,16 CJN1439 X 1,00 1,11 CJN2602 O 0,00 1,10 CJN1440 X 1,12 1,65 CJN2603 X 0,00 1,19 CJN1441 X 1,02 1,43 CJN2604 O 0,00 1,10 CJN1442 X 1,10 1,66 CJN2605 O 0,00 1,13 CJN1443 X 1,09 1,30 CJN2606 O 0,00 1,13 CJN1697 O 1,02 1,50 CJN2642 X 0,00 1,03 CJN1837 X 1,00 1,29 CJN2643 X 0,00 1,19 CJN1838 X 1,06 1,41 CJN2644 X 0,00 1,11 CJN1839 X 1,04 1,41 CJN2645 X 0,00 1,15 CJN1840 X 1,03 1,37 CJN2646 X 0,00 0,00 CJN1841 X 1,02 1,41 CJN2647 X 0,00 1,26 CJN1842 X 1,09 1,39 CJN2648 X 0,00 1,17 CJN1843 X 1,09 1,26 CJN2649 X 0,00 1,13 CJN1844 X 1,06 1,37 CJN2650 X 0,00 1,00 CJN1845 X 1,06 1,24 CJN2651 X 0,00 1,12 CJN1846 X 1,04 1,37 CJN2672 X 0,00 1,09 CJN1907 X 1,55 1,12 CJN2673 X 0,00 1,06 CJN1973 X 1,05 1,23 CJN2674 X 0,00 1,09 CJN1974 X 0,00 1,29 CJN2675 X 0,00 1,12 CJN1975 X 0,00 1,19 CJN2676 X 0,00 1,10 CJN1976 X 0,00 1,23 CJN2677 X 0,00 1,09

CJN2022 X 0,00 1,33 CJN2678 X 0,00 1,14 CJN2023 X 0,00 1,20 CJN2679 X 0,00 1,10 CJN2024 X 0,00 1,32 CJN2680 X 0,00 1,11 CJN2025 X 0,00 1,35 CJN2681 X 0,00 1,18 CJN2026 X 0,00 1,29 CJN2682 X 0,00 1,11 CJN2027 X 0,00 1,36 CJN2683 X 0,00 1,09 CJN2028 X 0,00 1,29 CJN2684 X 0,00 1,10 CJN2029 X 1,05 1,24 CJN2685 X 0,00 1,06 CJN2030 X 0,00 1,14 CJN2686 X 0,00 1,17 CJN2031 X 1,03 1,57 CJN2687 X 0,00 1,12 CJN2067 X 1,10 1,45 CJN2688 X 0,00 1,20 CJN2145 X 1,09 1,42 CJN2689 X 0,00 1,16 CJN2147 X 1,03 1,22 CJN2690 X 0,00 1,03 CJN2150 X 1,03 1,38 EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE COMPOSIÇÃO FERMENTADA 2-1. MÉTODO DE TRATAMENTO DE UMIDADE E TRATAMENTO

TÉRMICO DE FARINHA DE GRÃO

[074] Farinha de farelo de soja e farinha de glúten de milho foram, cada qual, preparadas. Água foi adicionada ao farelo de soja para ajustar o teor de umidade do farelo de soja em cerca de 45 %, com base no peso do farelo de soja e a mistura foi submetida ao tratamento térmico a 100 °C por 30 minutos. Em relação à farinha de glúten de milho, ácido fosfórico foi adicionado em uma quantidade de 1,5 % em peso, com base no peso do glúten de milho, e a seguir água foi adicionada para ajustar o teor de umidade do glúten de milho em cerca de 43 %, e a mistura foi submetida ao tratamento térmico a 100 °C por 30 minutos. Hidróxido de sódio (NaOH) em uma quantidade de 2,4 % em peso, com base no peso do glúten de milho, foi adicionado ao glúten de milho, que foi submetido ao tratamento térmico, e a seguir a água foi adicionada para ajustar o teor de umidade do glúten de milho em cerca de 45 %. 2-2. MÉTODO DE TRATAMENTO ENZIMÁTICO E PREPARAÇÃO DE

GRUPO COM FERMENTAÇÃO DE LEVEDURA

[075] A farinha de farelo de soja e farinha de glúten de milho, preparadas pelo método do exemplo 2-1, foram misturadas na mesma razão de peso para prepara farinha de grão mista. A seguir, glucoamilase (0,5 % em peso) foi adicionada à farinha de grão mista e inoculada com cada cultura de três tipos de Saccharomyces cerevisiae (CJN1697, CJN2343, e levedura de pão comercial (obtida de Angel Yeast Co., Ltd.)), em uma quantidade de 10 % em peso e misturada, e a seguir foi fermentada naturalmente de maneira anaeróbica a 30 °C por 6 horas, e por meio disso os grupos com fermentação de levedura foram preparados. 2-3. MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE GRUPO COM LEVEDURA E

BACILLUS FERMENTAÇÃO

[076] O grupo de fermentação de levedura, preparado pelo método do exemplo 2-2, foi submetido adicionalmente à fermentação de Bacillus. Mais especificamente, da maneira descrita no exemplo 2-2, cada grupo de fermentação, em que a fermentação foi realizada usando os três tipos de Saccharomyces cerevisiae (CJN1697, CJN2343, e levedura de pão comercial) e 6 horas após a inoculação de levedura, foi inoculado com a cultura de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM11471P) em uma quantidade de 10 % em peso, e seguir a fermentação aeróbica foi realizada em um termo-higrostato (temperatura: 37 °C, umidade: 95 %) por 24 horas. 2-4. MEDIÇÃO DE COMPONENTES EM CADA GRUPO EXPERIMENTAL

[077] Para cada grupo experimental preparado pelos métodos dos exemplos 2-2 e 2-3, o teor de umidade, contagem de célula viável de Bacillus, contagem de célula viável de levedura, e teor de proteína foram avaliados de acordo com tempo. O teor de proteína foi avaliado por um aparelho Kjeldahl após secagem, e o produto fermentado foi pulverizado. Os resultados avaliados são mostrados na tabela 2 a seguir. [Tabela 2] Amostra Tempo Teor de Bacillus Levedura Teor de Nível (hora) umidade (CFU/g) (CFU/g) proteína aumentado

(%) (Peso de teor de seco, proteína %) (%) CP Grupo com 0 1,9  107 61,90 1,15 fermentação de 6 50,57 7,5  107 63,03 2,29 levedura 22 35,85 6,1  108 67,00 6,26 (CJN1697) 26 33,66 7,3  108 67,31 6,56 30 32,78 1,4  6,9  108 66,26 5,51 104 Grupo 1 com 0 1,9  107 61,27 0,52 fermentação de 6 50,66 1,1  8,4  107 63,63 2,89 levedura e 107 Bacillus (CJN1697 22 44,21 5,9  3,8  108 69,70 8,95 + Bacillus 109 amyloliquefaciens) 26 39,50 9,0  5,4  108 69,90 9,15 109 30 35,61 8,6  3,9  108 70,94 10,20 109 Grupo 2 com 0 2,1  107 62,32 1,57 fermentação de 6 50,72 1,5  8,3  107 64,51 3,76 levedura e 107 Bacillus (CJN2343 22 46,00 3,1  4,2  108 68,89 8,14 + Bacillus 109 amyloliquefaciens) 26 38,46 6,2  4,5  108 70,23 9,48 109 30 34,06 9,0  4,7  108 70,49 9,74 109 Grupo 3 com 0 2,3  107 61,40 0,66 fermentação de 6 50,53 1,1  6,9  107 64,14 3,39 levedura e 107 Bacillus (Levedura 22 48,79 1,9  3,7  108 68,51 7,77 de pão comercial 109 + Bacillus 26 42,22 7,3  3,2  108 69,72 8,97 amyloliquefaciens) 109 30 38,46 1,5  2,3  108 70,86 10,12 1010

[078] Em função disso, em todos os grupos experimentais nos quais a fermentação de levedura foi realizada, a quantidade de levedura vida aumentou de 107 CFU/g a 108 CFU/g. Adicionalmente, em todos os grupos experimentais nos quais a fermentação de Bacillus foi realizada, a quantidade de Bacillus vivos aumentou de 109 CFU/g a 1010 CFU/g. Adicionalmente, confirmou-se que a quantidade de proteínas na composição aumentou através da fermentação de levedura, e foi confirmado que a adição da fermentação de Bacillus após a fermentação de levedura foi mais eficiente em aumentar a quantidade de proteína.

[079] Dessa maneira, isto é, quando a fermentação de Bacillus é realizada nas matérias-primas de grão após a fermentação de levedura, o teor de proteína das matérias-primas de grão pode ser adicionalmente aumentado por Bacillus sem inibir o crescimento de levedura. EXEMPLO 3: CONFIRMAÇÃO DE GRAU DE DECOMPOSIÇÃO DE

OLIGOSSACARÍDEO POR FERMENTAÇÃO

[080] Dois tipos de grupos de matérias-primas de grão (um grupo de matérias- primas de farelo de soja e um grupo de matérias-primas de glúten de milho), um grupo de grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de Bacillus, um grupo de grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de levedura, e um grupo de grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) com fermentação combinada por levedura e Bacillus foram preparados, e componentes de sacarídeos foram analisados para cada grupo.

[081] O grupo de matérias-primas de farelo de soja (figura 1 (2)) e o grupo de matérias-primas de glúten de milho (figura 1 (3)), que não foram pré-tratados, foram preparados. O componente de sacarídeo de cada grupo foi analisado quantitativamente por meio de cromatografia em camada fina (TLC). 25 mL de água destilada foram adicionados em 1 g de cada amostra, e a mistura foi aquecida em água em ebulição por 15 a 20 minutos e extraída por agitação a 37 °C por 2 horas. O extrato foi centrifugado e o sobrenadante foi recuperado e usado como uma amostra TLC. 2 µL do sobrenadante foram espalhados em uma placa de TLC em sílica gel, secos em um nível constante, e desenvolvidos por 3 horas na solução em desenvolvimento. Após o desenvolvimento finalizar, os pontos de oligossacarídeo e monossacarídeo foram confirmados por meio do desenvolvimento da cor e processos de secagem.

[082] O grupo de grãos mistos apenas com fermentação de Bacillus (figura 1 (4)) foi preparado misturando a farinha de farelo de soja e a farinha de glúten de milho, preparadas pelo método do exemplo 2-1, na mesma razão de peso, inoculando com a cultura de Bacillus amyloliquefaciens em uma quantidade de 10 % em peso à mistura, seguido pelo desenvolvimento da fermentação aeróbica em um termo- higrostato (temperatura: 37 °C, umidade: 95 %) por 24 horas.

[083] O grupo de grãos mistos apenas com fermentação de levedura (figura 1 (5)) foi preparada pelo método do exemplo 2-2. Em relação ao grupo de grãos mistos com fermentação combinada por levedura e Bacillus, 3 grupos (figura 1 (6) (CJN1697 + Bacillus), figura 1 (7) CJN2343 + Bacillus, e figura 1 (8) levedura de pão + Bacillus) foram preparados usando três tipos de levedura.

[084] O componente de sacarídeo de cada grupo de fermentação foi determinado da mesma maneira para a avaliação do componente de sacarídeo no grupo de matérias-primas de farelo de soja, e no grupo de matérias-primas de glúten de milho. Para cada grupo de fermentação, 25 mL de água destilada foram adicionados a 1 g de cada amostra, e a mistura foi aquecida em água fervente por 15 a 20 minutos e extraída por agitação a 37 °C por 2 horas. O extrato foi centrifugado e o sobrenadante foi recuperado e usado como uma amostra de TLC.

[085] Na figura 1, a canaleta (1) representa o componente de marcadores de sacarídeo de estaquiose, rafinose, sacarose e glicose, na ordem do fundo para o topo; canaleta (2) representa o grupo de matérias-primas de farelo de soja; canaleta (3) representa o grupo de matérias-primas de glúten de milho; canaleta (4) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de levedura; canaleta (5) representa grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) apenas com fermentação de levedura (CJN1697); cada uma das canaletas (6) a (8) representa o grupo de grãos mistos (farelo de soja + glúten de milho) com fermentação combinada por levedura e Bacillus ((6) CJN1697 + Bacillus, (7) CJN2343 + Bacillus, e (8) levedura de pão + Bacillus).

[086] Em referência à figura 1, no grupo de fermentação única usando Bacillus (figura 1 (4)), confirmou-se que o componente de sacarídeo contido no farelo de soja não foi completamente decomposto em decorrência do micro-organismo não poder utilizar suficientemente o componente de sacarídeo durante o processo de fermentação e, assim, os oligossacarídeos foram incluídos no produto fermentado. Entretanto, no grupo onde a fermentação foi realizada usando levedura (figura 1 (5)), confirmou-se que os oligossacarídeos foram decompostos por levedura, e o micro- organismo utilizou de maneira suficiente o componente de sacarídeo decomposto, resultando assim em um teor baixo de oligossacarídeos.

[087] Adicionalmente, nos grupos de fermentação onde as cepas de levedura CJN1697 e CJN2343 foram usadas (canaletas (6) e (7)), nenhum ponto de oligossacarídeo específico foi observado no produto fermentado em virtude da atividade enzimática de α-galactosidase, ao passo que no grupo de fermentação onde levedura de pão comercial (Angest®) foi usada (canaleta (8)), a atividade de α- galactosidase da levedura de pão foi baixa e, assim, um ponto específico de oligossacarídeo foi observado.

[088] Dessa maneira, a composição fermentada preparada usando a levedura é caracterizada de maneira tal que oligossacarídeos sejam decompostos na composição e, assim a composição fermentada não exige nenhuma enzima digestiva individual para sua decomposição quando ingerida por um animal através da alimentação, tornando assim mais fácil a digestão das rações. Em particular, confirmou-se que é mais eficiente usar uma cepa de levedura de CJN1697 ou CJN2343. EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DO GRAU DE DECOMPOSIÇÃO DE

PROTEÍNA POR FERMENTAÇÃO

[089] Da mesma maneira do exemplo 3, grupos de matérias-primas de grão (farelo de soja, glúten de milho, e matérias-primas de grão mistas), um grupo de matérias-primas de grão apenas com fermentação de Bacillus, um grupo de matérias- primas de grão apenas com fermentação de levedura, e um grupo de matérias-primas de grão com fermentação combinada por levedura e Bacillus foram preparados, respectivamente, e a análise dos componentes de proteína em cada grupo foi experimentada.

[090] Como o grupo de matérias-primas de grão, um total de três tipos de grupos (isto é, um grupo de matérias-primas de farelo de soja (grupo 2), um grupo de matérias-primas de glúten de milho (grupo 3), e um grupo de grãos mistos, em que farelo de soja e glúten de milho foram misturados na mesma razão de peso (grupo 4) foram preparados. O padrão de peso molecular de proteína de cada matéria-prima foi confirmado por SDS-PAGE. 100 mg de cada amostra foram misturados com 5 mL de uma solução de ureia 8M, e a mistura foi sonicada para extração e centrifugada, e o sobrenadante foi recuperado. Em cada sobrenadante, o teor de proteína foi quantificado usando ácido bicinconímico, e confirmado por SDS-PAGE carregando uma certa quantidade de cada amostra de proteína.

[091] Os grupos de matérias-primas de grão apenas com fermentação de Bacillus (grupos 5 a 8) foram preparados inoculando uma mistura de farinha, em que a farinha de farelo de soja e farinha de glúten de milho preparadas pelo método do exemplo 2-1 foram misturadas na mesma razão de peso, com a cultura de Bacillus amyloliquefaciens em uma quantidade de 10 % em peso, seguido pela realização de fermentação aeróbica em um termo-higrostato (temperatura: 37 °C, umidade: 95 %) por 24 horas. O tempo de fermentação (0 hora, 16 horas, 20 horas, e 24 horas) para cada grupo é mostrado na tabela 3 a seguir.

[092] Os grupos de matérias-primas de grão apenas com fermentação de levedura (grupos 9 a 12) foram preparados pelo método do exemplo 2-1, e os grupos de matérias-primas de grão com fermentação combinada por levedura e Bacillus (grupos 13 a 24) foram preparados pelo método do exemplo 2-3, usando três tipos de levedura. As cepas usadas na fermentação de cada grupo e o tempo de fermentação de cada grupo são mostrados na tabela 3 a seguir. Nos grupos com fermentação combinada, onde a fermentação de Bacillus prosseguiu após fermentação de levedura, fermentação de Bacillus prosseguiu 6 horas após fermentação de levedura.

[093] O nível de decomposição de proteína de cada grupo de fermentação foi confirmado por SDS-PAGE. As amostras foram pré-tratadas da mesma maneira como na confirmação do nível de distribuição de peso molecular de proteínas em grupos de matérias-primas de grão. O padrão de peso molecular de proteína de cada matéria- prima foi confirmado por SDS-PAGE. 100 mg de cada amostra foram misturados com uma solução de ureia 8M, e a mistura foi sonicada por extração e centrifugada, e o sobrenadante foi recuperado. O teor de proteína foi quantificado usando ácido bicinconínico, e confirmado por SDS-PAGE carregando uma certa quantidade de cada amostra de proteína. Os resultados são mostrados em figura 2. [Tabela 3] Grupo Matéria- Fermentação Fermentação de Tempo Total experimental prima do de levedura Bacillus de grão Fermentação (Tempo de fermentação de levedura + Tempo de fermentação de Bacillus) Grupo 1 - - - - Grupo 2 Farelo de - - soja Grupo 3 Glúten de - - milho Grupo 4 Grão misto - - Grupo 5 Grão misto - B. 0 amyloliquefaciens Grupo 6 Grão misto - B. 16 amyloliquefaciens Grupo 7 Grão misto - B. 20 amyloliquefaciens Grupo 8 Grão misto - B. 24 amyloliquefaciens Grupo 9 Grão misto CJN1697 - 6 Grupo 10 Grão misto CJN1697 - 22 Grupo 11 Grão misto CJN1697 - 26 Grupo 12 Grão misto CJN1697 - 30 Grupo 13 Grão misto CJN1697 B. 6 (6 + 0) amyloliquefaciens Grupo 14 Grão misto CJN1697 B. 22 (6 + 16) amyloliquefaciens Grupo 15 Grão misto CJN1697 B. 26 (6 + 20) amyloliquefaciens Grupo 16 Grão misto CJN1697 B. 30 (6 + 24) amyloliquefaciens Grupo 17 Grão misto CJN2343 B. 6 (6 + 0) amyloliquefaciens

Grupo 18 Grão misto CJN2343 B. 22 (6 + 16) amyloliquefaciens Grupo 19 Grão misto CJN2343 B. 26 (6 + 20) amyloliquefaciens Grupo 20 Grão misto CJN2343 B. 30 (6 + 24) amyloliquefaciens Grupo 21 Grão misto Levedura de B. 6 (6 + 0) pão amyloliquefaciens Grupo 22 Grão misto Levedura de B. 22 (6 + 16) pão amyloliquefaciens Grupo 23 Grão misto Levedura de B. 26 (6 + 20) pão amyloliquefaciens Grupo 24 Grão misto Levedura de B. 30 (6 + 24) pão amyloliquefaciens

[094] Na tabela 3 anterior, o tempo dos grupos de fermentação sequencial por levedura e Bacillus significa o tempo total de fermentação, que é igual à soma do tempo de fermentação de Bacillus e o tempo de fermentação de levedura (isto é, 6 horas).

[095] A figura 2 mostra uma imagem que ilustra os resultados de SDS-PAGE das proteínas sobrenadantes nos grupos 1 a 24.

[096] Com relação à tabela 3 e à figura 2, Bacillus pode produzir protease e, assim, pode decompor proteínas em peptídeo de baixo peso molecular, durante o processo de fermentação, usando a protease. Portanto, nos grupos de fermentação combinada por levedura e Bacillus, confirmou-se que as proteínas de farelo de soja e glúten de milho foram decompostas. Entretanto, uma vez que a levedura não pode produzir protease de maneira alguma, as proteínas não podem ser decompostas no grupo apenas com fermentação de levedura e, assim, os padrões de proteína de matérias-primas foram indicados como estavam. Isto é, uma vez que a composição que passou por fermentação de Bacillus após a fermentação de levedura contém peptídeo de baixo peso molecular, a composição pode melhorar a taxa de absorção de proteína da ração.

[097] Para avaliar mais especificamente o conteúdo de peptídeo de baixo peso molecular no produto fermentado, a distribuição de acordo com o peso molecular de peptídeo de baixo peso molecular foi avaliada usando o método de cromatografia de permeação em gel (GPC).

[098] GPC é um método para confirmar o tempo de retenção (RT) analisando proteínas padrão com diferentes pesos moleculares, e para avaliar a distribuição proteica de analitos, de acordo com peso molecular, usando peso molecular e uma curva padrão de RT. Para confirmar o nível de decomposição proteica doas matérias- primas em virtude da fermentação, a distribuição de proteína no produto fermentado foi analisada pelo método GPC.

[099] Os analitos de GPC foram pré-tratados da mesma maneira que no método SDS-PAGE. 100 mg de cada amostra foram suspensos em 5 mL de um solvente de ureia 8 M, e a mistura foi sonicada por extração e centrifugada, e o sobrenadante recuperado foi filtrado com um filtro de seringa e usado como um analito para análise de GPC. Como o analito, cada um dos produtos fermentados do grupo 4 (matérias- primas mistas: farelo de soja + glúten de milho), grupo 8 (apenas fermentação de Bacillus), grupo 12 (apenas fermentação de levedura) e grupos 16, 20 e 24 (fermentação combinada por Bacillus + levedura) foi usado. Os resultados da análise de GPC são mostrados na tabela 4 a seguir. [Tabela 4] Peso Matéria- Bacillus Levedura CJN1697 + CJN2343 + AngelY + B molecular prima Controle Controle B B (kDa) mista (Grupo 4) 24 Hr 30 Hr 30 Hr 30 Hr 30 Hr (Grupo 8) (Grupo 12) (Grupo 16) (Grupo 20) (Grupo 24) > 75 60,11 16,38 58,36 10,51 10,36 9,50 30 a 75 22,89 11,70 24,17 5,74 6,12 5,34

10 a 30 7,37 21,91 7,14 16,51 17,09 16,33 5 a 10 2,78 16,20 2,72 17,93 17,90 17,75 <5 6,86 33,81 7,61 49,31 48,53 51,07 Total 100 100 100 100 100 100

[0100] Com relação à tabela 4, a matéria-prima continha mais de 82 % de peptídeos de polímero de 30 kDa ou mais. No caso apenas de fermentação de Bacillus, o teor de peptídeo de baixo peso molecular de 30 kDa ou menos foi cerca de 71 %, ao passo que no caso da fermentação combinada por Bacillus e levedura, o teor de peptídeo de baixo peso molecular de 30 kDa ou menos foi cerca de 83 %, mostrando assim um aumento significativo no teor de peptídeo de baixo peso molecular. Adicionalmente, quando o produto fermentado foi obtido por Bacillus e levedura, o teor de peptídeo de baixo peso molecular de 10 kDa ou menos no produto fermentado foi em uma faixa de cerca de 66 % a cerca de 69 %, mostrando assim um aumento de cerca de 40 % comparado ao teor de peptídeo de baixo peso molecular de 10 kDa ou menos no produto fermentado apenas por fermentação de Bacillus. Isto é, no caso de fermentação de Bacillus e levedura, a eficiência de decomposição proteica foi maior e o teor de peptídeo de baixo peso molecular foi aumentado no produto fermentado. Portanto, pode ser observado que a taxa de digestão e de absorção podem ser significativamente maiores quando o produto fermentado por Bacillus e levedura é usado como uma matéria prima para alimento ou ração. EXEMPLO 5: COMPARAÇÃO ENTRE FERMENTAÇÃO SIMULTÂNEA

OU FERMENTAÇÃO SEQUENCIAL DE LEVEDURA E BACILLUS

[0101] As contagens de célula viável e a quantidade de aumento proteico foram avaliadas e comparadas entre um caso onde a fermentação de levedura e a fermentação de Bacillus são realizadas simultaneamente, e um caso onde a fermentação de levedura e a fermentação de Bacillus são realizadas sequencialmente.

[0102] O grupo com fermentação de levedura foi preparado pelo método do exemplo 2-2, e o grupo com fermentação sequencial por levedura e Bacillus foi preparado pelo método do exemplo 2-3. O grupo com fermentação simultânea por levedura e Bacillus foi preparado misturando a farinha de farelo de soja e a farinha de glúten de milho, preparadas pelo método do exemplo 2-1, na mesma razão de peso, adicionando glucoamilase (0,5 %) às mesmas, e inoculando simultaneamente com levedura e Bacillus, seguido pela realização de fermentação aeróbica.

O grupo com fermentação sequencial por levedura e Bacillus foi preparado realizando fermentação de Bacillus 6 horas após fermentação de levedura.

O teor de umidade, a contagem de célula viável de Bacillus, a contagem de célula viável de levedura, e a quantidade de proteínas foram avaliados de acordo com tempo em cada grupo, e os resultados são mostrados na tabela 5 a seguir. [Tabela 5] Amostra Tempo Teor de Bacillus Levedura Teor de Nível (hr) umidade (CFU/g) (CFU/g) proteína aumentado (%) (Peso de teor de seco, proteína %) (%) CP Bacillus Controle 0 49,6 5,5  61,9 2,3 107 16 44,6 9,6  69,2 9,5 109 20 42,4 1,3  69,3 9,6 1010 24 38,5 9,6  69,6 9,9 109 Grupo com 0 49,1 1,5  107 61,0 1,3 Fermentação de 16 48,5 3,7  108 67,1 7,5 levedura 20 48,8 4,4  108 68,9 9,2 (CJN1697) 24 48,4 4,1  108 67,9 8,2

Grupo com 0 49,4 4,8  1,7  107 60,9 1,2 Fermentação 107 Simultânea por 16 41,5 1,2  3,1  107 68,0 8,4 Levedura e 1010 Bacillus (CJN1697 20 39,4 1,3  1,9  107 69,9 10,2 + Bacillus 1010 amyloliquefaciens) 24 35,8 1,1  1,6  107 69,1 9,4 1010 Grupo com 0 2,8  107 60,1 0,4 Fermentação 6 (6 + 49,7 6,4  3,8  107 62,4 2,7 Sequencial por 0) 107 Levedura e 22 (6 + 45,1 6,5  1,9  108 70,8 11,1 Bacillus (CJN1697 16) 109 + Bacillus 26 (6 + 43,3 6,9  2,2  108 715 11,9 amyloliquefaciens) 20) 109 30 (6 + 40,9 1,1  1,3  108 70,7 11,0 24) 1010

[0103] Na tabela 5 anterior, o tempo dos grupos de fermentação sequencial por levedura e Bacillus significa o tempo de fermentação total, que é igual à soma do tempo de fermentação de Bacillus e o tempo de fermentação de levedura (isto é, 6 horas).

[0104] Com relação à tabela 5, quando a fermentação de Bacillus foi realizada após a fermentação de levedura, tanto a contagem de célula viável de Bacillus quanto a contagem de célula viável de levedura aumentaram na proporção de seu tempo de fermentação tempo. Entretanto, foi confirmado que, quando levedura e Bacillus foram simultaneamente inoculados e fermentados juntos, a contagem de célula viável de Bacillus aumentou em proporção de seu tempo de fermentação, mas a contagem de célula viável de levedura permaneceu em um nível de 10 7 CFU/g. Isto é, quando levedura e Bacillus foram simultaneamente inoculados e fermentados juntos, levedura não afetou o crescimento de Bacillus, ao passo que Bacillus inibiu o crescimento de levedura.

[0105] Dessa maneira, presumiu-se que a protease de Bacillus reduz a população de levedura, que prolifera por brotamento, e foi confirmado que a ordem de inoculação microbiana apresenta um efeito significativo para o crescimento de ambos os micro- organismos (isto é, levedura e Bacillus) em fermentação sólida. Em particular, confirmou-se que tanto Bacillus quanto levedura podem utilizar mais facilmente o componente de sacarídeo solúvel em água, em decorrência de os oligossacarídeos no farelo de soja serem decompostos durante a fermentação de levedura, realizando primeiro a fermentação de levedura por 6 horas. EXEMPLO 6: PROBLEMAS DE MELHORIA DO ODOR

[0106] Um produto fermentado de Bacillus produz um odor peculiar durante o processo de fermentação em virtude da amônia, etc., e isto pode ser um fator limitante no uso de ração. Portanto, neste exemplo, foi confirmado se a fermentação complexa por levedura e Bacillus reduz ou não o odor do produto fermentado de Bacillus. Um teste de odor foi realizado com relação a uma matéria-prima mista de farelo de soja e glúten de milho, um produto fermentado apenas por Bacillus amyloliquefaciens (KCCM11471P), e um produto de fermentação complexa por levedura (levedura de pão; CJN1697 ou CJN2343) e Bacillus amyloliquefaciens (KCCM11471P) (50 sujeitos). O escore foi determinado em uma escala de pontos de 0 a 5, de maneira tal que um escore mais alto representa uma maior intensidade de odor peculiar de Bacillus (Tabela 6).

[0107] Em função disso, confirmou-se que o produto fermentado apenas por fermentação de Bacillus (uso de Bacillus amyloliquefaciens (KCCM11471P)) mostrou o escore mais alto. Adicionalmente, foi confirmado que, quando a fermentação sequencial de Bacillus foi realizada usando levedura CJN1697 ou CJN2343, o odor foi significativamente reduzido, comparado quando a levedura comercialmente disponível foi usada. [Tabela 6]

Matéria Apenas Fermentação Fermentação Fermentação -prima Fermenta Sequencial de sequencial de sequencial de ção de Levedura e Levedura e Levedura e Bacillus Bacillus (Levedura Bacillus Bacillus de pão) (CJN1697) (CJN2343) Meio 1,6 4,75 3,8 2,5 2,45 STDEV 0,82 0,55 0,89 1,00 0,76 EXEMPLO 7: ANÁLISE DE SEQUÊNCIA DE NUCLEOTÍDEO DE GENE RNAR 18S E FILOGENIA DE CEPAS DE SACCHAROMYCES CEREVISIAE DA

PRESENTE DESCRIÇÃO

[0108] Para analisar as cepas isoladas no exemplo 1, o sequenciamento de DNA ribossomal 18S foi realizado da seguinte maneira. Os cromossomos das cepas CJN1697 e CJN2343 foram isolados usando o kit de purificação de DNA genômico Wizard (Promega, Estados Unidos), e a seguir submetidos à amplificação por PCR usando oligonucleotídeos iniciadores NS1 (5′-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3′) e NS8 (5′-TCCGCAGGTTCACCTACGGA-3′), que são oligonucleotídeos iniciadores universais usados no sequenciamento de RNAr 18S. Os produtos de PCR amplificados foram purificados usando o gel Wizard SV e sistema de limpeza de PCR (Promega, EUA). Em função disso, os produtos de PCR amplificados purificados foram comparados com as sequências de DNA ribossomal do GENEBANK usando o programa BLASTN, e a homologia de sequência foi comparada e analisada usando os programas Clustal X e Mega 2.

[0109] Em função da análise filogenética, ambas as cepas da presente descrição (isto é, CJN1697 e CJN2343) mostraram uma homologia de 99 % à mesma de Saccharomyces cerevisiae, uma cepa de referência (figuras 3 e 4). As cepas da presente descrição (isto é, CJN1697 e CJN2343) foram, cada qual, denominadas Saccharomyces cerevisiae CJN1697 e Saccharomyces cerevisiae CJN2343, e depositadas no Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) em 11 de outubro de 2017, de acordo com o Tratado de Budapeste, com os números de acesso

KCCM12123P e KCCM12124P, respectivamente.

[0110] A partir do precedente, os versados na técnica, aos quais a presente descrição pertence, serão capazes de entender que a presente descrição pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente descrição. Em relação a isso, as modalidades exemplares aqui descritas são apenas para propósitos ilustrativos, e não devem ser interpretadas como limitantes do escopo da presente descrição. Ao contrário, a presente descrição é pretendida para cobrir não apenas as modalidades exemplares, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes, e outras modalidades que podem ser incluídas no espírito e escopo da presente descrição, da maneira definida pelas reivindicações em anexo.

[0111] [Número de Admissão] Nome da agência depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) Número do depósito: KCCM12123P Data do depósito: 11 de outubro de 2017 Nome da agência depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) Número do depósito: KCCM12124P Data do depósito: 11 de outubro de 2017 Nome da agência depositária: Korean Culture Center of Microorganisms (KCCM) Número do depósito: KCCM11471P Data do depósito: 11 de outubro de 2017

Claims (16)

REIVINDICAÇÕES

1. Método para preparar uma composição fermentada com odor melhorado, caracterizado por compreender: preparar farinha de grão; realizar fermentação primária da farinha de grão usando levedura; realizar fermentação secundária do produto fermentado primário usando uma cepa do gênero Bacillus; e obter o produto fermentado secundário.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a levedura produzir α-galactosidase, protease e fitase.

3. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, caracterizado por a levedura ser Saccharomyces cerevisiae depositada com o número de acesso KCCM12123P ou número de acesso KCCM12124P.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por, no produto fermentado secundário, um peptídeo com um peso molecular de 30 kDa ou menos estar contido em uma quantidade de 40 % a 100 %.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a farinha de grão compreender farelo de soja ou glúten de milho.

6. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a realização da fermentação primária da farinha de grão compreender adicionar α- amilase ou glucoamilase.

7. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a farinha de grão passar por ajuste de teor de umidade e a seguir tratamento térmico.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado por o teor de umidade ajustado estar em uma faixa de 30 % a 60 %.

9. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cepa do gênero Bacillus ser pelo menos uma cepa selecionada do grupo que consiste em Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus toyoi, Bacillus coagulans, Bacillus polyfermenticus, e Bacillus amyloliquefaciens.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a cepa do gênero Bacillus ser Bacillus amyloliquefaciens depositada com o número de acesso KCCM114371P.

11. Levedura para melhorar o odor de um produto fermentado de Bacillus, caracterizada por produzir α-galactosidase, protease e fitase.

12. Levedura, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada por a levedura ser Saccharomyces cerevisiae depositada com o número de acesso KCCM12123P ou número de acesso KCCM12124P.

13. Composição para fermentação de grão, caracterizada por compreender a levedura de acordo com a reivindicação 12.

14. Composição alimentar, caracterizada por compreender a levedura de acordo com a reivindicação 12.

15. Composição fermentada, caracterizada por ser preparada por um método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10.

16. Composição alimentar, caracterizada por compreender a composição fermentada de acordo com a reivindicação 15.