CN107232393A - 一种棉粕蛋白饲料的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种棉粕蛋白饲料的制备方法，所述棉粕蛋白饲料的制备方法包括如下步骤：将粉碎后的棉粕与水均匀混合后，蒸煮以形成待发酵物料；将所述待发酵物料冷却，接种黑曲霉和酒用活性干酵母，进行先期固态发酵，再接种枯草芽孢杆菌后发酵，形成固态发酵初物料；取所述固态发酵初物料，加入所述黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，制得棉粕蛋白饲料。本发明通过先在棉粕上接种黑曲霉和酒用活性干酵母进行协同发酵，再接种枯草芽孢杆菌，发酵后形成固态发酵初物料，然后加入黄色短杆菌发酵液，不仅大幅降低了棉粕中游离棉酚的含量，还提高了棉粕中的蛋白含量。

Description

一种棉粕蛋白饲料的制备方法
技术领域
本发明涉及饲料加工技术领域，特别涉及一种棉粕蛋白饲料的制备方法。
背景技术
棉粕是棉籽油品加工的副产物，我国每年棉籽油料加工产出大量的棉籽饼粕，棉粕中粗蛋白含量丰富，同时还含有较高的纤维素和丰富的磷和B族维生素，是一种既经济而又有效的植物蛋白源，开发潜力巨大。但是，由于棉粕中含有一些植物生存、繁殖所必需的抗营养因子，例如游离棉酚、低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸以及环丙烯脂肪酸等，这些抗营养因子的存在会危害动物的健康成长，另外，棉粕中粗蛋白含量高，但蛋白质品质较差，而且蛋氨酸等必需氨基酸含量低且不平衡，使棉粕蛋白的饲用价值的应用范围受到限制。现有技术一般都集中在除去或降解棉粕中的游离棉酚，但对于除去原料中的其他抗营养因子的考虑甚少，有关综合考虑产品的蛋白质含量、氨基酸配比的合理性的报道更是鲜见。
发明内容
本发明的主要目的是提出一种棉粕蛋白饲料的制备方法，旨在提高棉粕中除游离棉酚外的其他抗营养因子的脱除率。
为实现上述目的，本发明提出的一种棉粕蛋白饲料的制备方法，包括如下步骤：
步骤S1、将粉碎后的棉粕与水均匀混合后，蒸煮以形成待发酵物料；
步骤S2、将所述待发酵物料冷却，接种黑曲霉(Aspergillus niger)和酒用活性干酵母(Saccharomyces cerevisiae)，进行先期固态发酵，再接种枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)后发酵，形成固态发酵初物料；
步骤S3、取所述固态发酵初物料，加入黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)发酵液，混合均匀后静置，制得棉粕蛋白饲料。
优选地，步骤S1包括：取粉碎后的棉粕100份(质量份数)与水混合后蒸煮，其中，所述棉粕与水的重量体积比为5:4～1:1，蒸煮温度为120～122℃，蒸煮时间为15～20min。
优选地，在步骤S2中：所述黑曲霉的接种量为0.05～1％，所述酒用活性干酵母的接种量为0.05～0.5％，所述先期固态发酵的发酵温度为25～35℃，发酵时间为15～60h。
优选地，在步骤S2中：所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.2～1％，发酵温度为25～35℃，发酵时间为30～72h。
优选地，步骤S3包括：取棉粕(100份)经固态发酵后的所述固态初物料，加入所述黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，其中，所述黄色短杆菌发酵液的质量份数为2～5份。
优选地，在步骤S3之前，还包括如下步骤：
步骤S31、将黄色短杆菌菌种接种至斜面培养基中，于30～32℃培养24h；
步骤S32、将步骤S31中培养的菌种接种至摇瓶种子培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养12h；
步骤S33、将步骤S32中培养的菌种接种至摇瓶发酵培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养至黄色短杆菌种子浓度不低于109个/mL；
步骤S34、将步骤S33中培养的所述黄色短杆菌种子接入发酵罐，通气量为2～3L/min，搅拌转速为200～600r/min，pH值为6.7～6.8，于30～32℃发酵60～72h，制得所述黄色短杆菌发酵液。
优选地，在步骤S31中，所述斜面培养基包括以下质量百分比含量的成分：牛肉膏或酵母膏1％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、琼脂2％以及水95.5％；所述斜面培养基的pH值为7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min。
优选地，在步骤S32中，所述摇瓶种子培养基包括以下质量百分比含量的成分：葡萄糖2～2.5％、玉米浆2.5～4.0％、硫酸铵0.4～0.6％、碳酸钙1％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％以及水91.75～93.95％；所述摇瓶种子培养基的pH值为7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min。
优选地，在步骤S33中，所述摇瓶发酵培养基包括以下质量百分比含量的成分：糖蜜12～15％、硫酸铵2.2～2.8％、豆粕水解液4％、生物素300～500μg/L、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％以及碳酸钙4％，其余为水；所述摇瓶种子培养基的pH值为7.0～7.2，于0.07MPa压力下灭菌7～10min。
优选地，在步骤S34中，所述发酵罐中以糖蜜为原料，初糖浓度为120～150g/L，且每隔4h监测残糖浓度，当残糖浓度降至25g/L时，流加糖蜜，发酵结束前5h，停止流加糖蜜。
本发明技术方案中，通过先接种黑曲霉和酒用活性干酵母进行协同发酵，再接种枯草芽孢杆菌进行发酵，形成固态发酵初物料，不仅有效地提高了棉粕中的蛋白质含量，还能将棉粕中的α-半乳糖苷、植酸等抗营养因子彻底降解；通过向固态发酵初物料中加入黄色短杆菌发酵液，大幅降低了固态发酵初物料中的游离棉酚含量，而且改善了发酵棉粕中的氨基酸配比，提高了棉粕的营养价值。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明提供的棉粕蛋白饲料的制备方法的一实施例的流程示意图；
图2为图1提供的棉粕蛋白饲料的制备方法中黄色短杆菌发酵液制备方法的流程示意图；
图3为测定本发明制备的棉粕蛋白饲料中游离棉酚含量时吸光度对游离棉酚质量的关系图；
图4为测定本发明制备的棉粕蛋白饲料中植酸含量时吸光度对磷含量的关系图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，若本发明实施例中有涉及方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)，则该方向性指示仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，若本发明实施例中有涉及“第一”、“第二”等的描述，则该“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
针对现有技术中存在的棉粕蛋白含量偏低，除游离棉酚外的其他抗营养因子脱除率低，生产成本偏高的缺陷，本发明提出一种棉粕蛋白饲料的制备方法，如图1所示，包括如下步骤：
步骤S1、将粉碎后的棉粕与水均匀混合后，蒸煮以形成待发酵物料；
可选地，步骤S1包括：取粉碎后的棉粕100份(质量份数)与水混合后蒸煮，其中，所述棉粕与水的重量体积比为5:4～1:1，蒸煮温度为120～122℃，蒸煮时间为15～20min。
步骤S2、将所述待发酵物料冷却，接种黑曲霉和酒用活性干酵母，进行先期固态发酵，再接种枯草芽孢杆菌后发酵，形成固态发酵初物料；
可选地，所述黑曲霉的接种量为0.05～1％，所述酒用活性干酵母的接种量为0.05～0.5％，所述先期固态发酵的发酵温度为25～35℃，发酵时间为15～60h；所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.2～1％，发酵温度为25～35℃，发酵时间为30～72h。
通过所述黑曲霉与所述酒用活性干酵母先期协同发酵，发酵期间所述黑曲霉除分泌纤维素和半纤维素酶外，还分泌各种淀粉酶类，将纤维素降解成可发酵性糖，被菌体利用，提高了蛋白质含量；所述酒用活性干酵母具有利用α-半乳糖苷等低聚糖作为唯一碳源的基因，同时还能分泌降解植酸的酶类，在先期发酵阶段，棉粕蛋白含量得到提高，低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸等抗营养因子完全降解，游离棉酚含量也有所降低。同时，由于棉粕中的纤维素被降解，有利于动物的消化与吸收，进而提高了所述棉粕蛋白饲料的饲用价值。然后，在接种所述枯草芽孢杆菌的后发酵阶段，所述棉粕蛋白含量得到进一步提高，但是由于所述枯草芽孢杆菌在发酵期间需消耗大量氧气以维持其生长与繁殖，进而会剥夺所述黑曲霉以及所述酒用活性干酵母生长繁殖所需要的氧气，抑制它们生长，故所述枯草芽孢杆菌不宜与所述黑曲霉、所述酒用活性干酵母同时接种。
步骤S3、取所述固态发酵初物料，加入黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，制得棉粕蛋白饲料。
可选地，步骤S3包括：取棉粕(100份)经固态发酵后的所述固态初物料，加入所述黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，其中，所述黄色短杆菌发酵液的质量份数为2～5份，将所述固态发酵初物料与所述黄色短杆菌发酵液混合均匀后静置一段时间，让所述黄色短杆菌发酵液与所述固态发酵初物料充分反应，以去除棉粕中的游离棉酚，即可得到棉粕蛋白饲料。
由于形成的固态发酵初物料中的赖氨酸含量严重不足，氨基酸配比也不均衡，而且游离棉酚的含量还需要进一步减少，因此在本发明中，还需要向形成的固态发酵初物料中加入黄色短杆菌发酵液，通过赖氨酸的ε-位上的氨基与游离棉酚的活性醛基快速结合，使游离棉酚的毒性能够快速丧失，以降低其中的游离棉酚的含量。而且由于黄色短杆菌发酵液中除含有赖氨酸外，还含有其他氨基酸，可以调整固态发酵初物料中的氨基酸配比，使氨基酸配比更为均衡合理，其营养价值更接近于豆粕，从而可以提高棉粕在混合饲料中的配比，提高产品的附加值。同时，黄色短杆菌发酵液中残存的糖蜜等营养成分能增强动物的适口感，促进动物采食，进而提高配合饲料中发酵棉粕所占的比例。
最后，为便于延长产品的寿命并且方便运输，将制得的棉粕蛋白饲料进行通风干燥并冷却包装，具体地，于50～85℃通风干燥至含水量低于15％，然后冷却包装，即可得到产品。
在本发明中，步骤S3中的所述黄色短杆菌发酵液的制备方法如图2所示，即在步骤S3之前，还包括如下步骤：
步骤S31、斜面培养：将黄色短杆菌菌种接种至斜面培养基中，于30～32℃培养24h；
可选地，所述斜面培养基包括以下质量百分比含量的成分：牛肉膏或酵母膏1％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、琼脂2％以及水95.5％；调节所述斜面培养基的pH值至7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min，将所述黄色短杆菌菌种接种至所述斜面培养基上，以优化并保藏菌种。
步骤S32、摇瓶培养：将步骤S31中培养的菌种接种至摇瓶种子培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养12h；
可选地，所述摇瓶种子培养基包括以下质量百分比含量的成分：葡萄糖2～2.5％、玉米浆2.5～4.0％、硫酸铵0.4～0.6％、碳酸钙(预先干热灭菌)1％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％以及水91.75～93.95％调节；所述摇瓶种子培养基的pH值至7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min。具体地，将所述摇瓶培养基加入到体积容量为500mL的三角瓶中，种子装液量为100mL，种子培养12h，使菌种进一步扩大。
步骤S33、摇瓶发酵培养：将步骤S32中培养的菌种接种至摇瓶发酵培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养至黄色短杆菌种子浓度不低于109个/mL；
可选地，所述摇瓶发酵培养基包括以下质量百分比含量的成分：糖蜜12～15％、硫酸铵2.2～2.8％、豆粕水解液4％、生物素300～500μg/L、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O0.05％以及碳酸钙(预先干热灭菌)4％，其余为水；所述摇瓶种子培养基的pH值为7.0～7.2，于0.07MPa压力下灭菌7～10min。具体地，将所述摇瓶发酵培养基加入到体积容量为500mL的三角瓶中，发酵液装液量为25mL，培养至所述黄色短杆菌种子的浓度不低于109个/mL。
步骤S34、发酵罐发酵：将步骤S33中培养的所述黄色短杆菌种子接入发酵罐，通气量为2～3L/min，搅拌转速为200～600r/min，pH值为6.7～6.8，于30～32℃发酵60～72h，制得所述黄色短杆菌发酵液。
可选地，所述发酵罐中以糖蜜为原料，初糖浓度为120～150g/L，且每隔4h监测残糖浓度，当残糖浓度降至25g/L时，流加糖蜜，发酵结束前5h，停止流加糖蜜，整个发酵时间控制在60～72h，最终制得所述黄色短杆菌发酵液，其中，所述黄色短杆菌种子接入所述发酵罐的接种量为10％。
实施例1：
准备材料如下：将黄色短杆菌菌种依次通过上述斜面培养、摇瓶培养、摇瓶发酵培养以及发酵罐发酵制备黄色短杆菌发酵液，备用；将干棉粕粉碎，备用。
待发酵物料制备：取干棉粕10kg，按100:100重量体积比加水，混合均匀后于121℃蒸15min，以形成待发酵物料；
固态发酵初物料制备：将待发酵物料(按棉粕干物料重)接种0.4％黑曲霉和0.05％酒用活性干酵母，先期固态发酵27h，再接种1％枯草芽孢杆菌后发酵30h，形成固态发酵初物料，其中，发酵温度为30℃；
棉粕蛋白饲料制备：取固态发酵初物料(按100份干棉粕固态发酵后形成的初物料取样)，加入黄色短杆菌发酵液0.3kg，混合均匀后静置1h，于70℃通风干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白饲料。
实施例2：
实施例2的材料准备同实施例1。
待发酵物料制备：取干棉粕10kg，按100:80重量体积比加水，混合均匀后于121℃蒸煮15min，以形成待发酵物料；
固态发酵初物料制备：将待发酵物料(按棉粕干物料重)接种0.2％黑曲霉和0.2％酒用活性干酵母，先期固态发酵36h，再接种0.5％枯草芽孢杆菌后发酵60h，形成固态发酵初物料，其中，发酵温度为30℃；
棉粕蛋白饲料制备：取固态发酵初物料(按100份干棉粕固态发酵后形成的初物料取样)，加入黄色短杆菌发酵液0.5kg，混合均匀后静置3h，于50℃通风干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白饲料。
实施例3：
实施例3的材料准备同实施例1。
待发酵物料制备：取干棉粕1吨，按100:100重量体积比加水，混合均匀后于121℃蒸煮20min，以形成待发酵物料；
固态发酵初物料制备：将待发酵物料(按棉粕干物料重)接种0.05％黑曲霉和0.1％酒用活性干酵母，先期固态发酵60h，再接种0.8％枯草芽孢杆菌后发酵72h，形成固态发酵初物料，其中，发酵温度为34℃；
棉粕蛋白饲料制备：取固态发酵初物料(按100份干棉粕固态发酵后形成的初物料取样)，加入黄色短杆菌发酵液0.05吨，混合均匀后静置3h，于75℃通风干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白饲料。
实施例4：
实施例4的材料准备同实施例1。
待发酵物料制备：取机械粉碎后的干棉粕10吨，按100:100重量体积比加水，混合均匀后于121℃蒸煮20min，以形成待发酵物料；
固态发酵初物料制备：将待发酵物料(按棉粕干物料重)接种0.4％黑曲霉和0.1％酒用活性干酵母，先期固态发酵20h，再接种0.2％枯草芽孢杆菌后发酵60h，形成固态发酵初物料，其中，发酵温度为25℃；
棉粕蛋白饲料制备：取固态发酵初物料(按100份干棉粕固态发酵后形成的初物料取样)，加入黄色短杆菌发酵液0.3吨，混合均匀后静置3h，于75℃通风干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白饲料。
实施例5：
实施例5的材料准备同实施例1。
待发酵物料制备：取机械粉碎后的干棉粕100吨，按100:100重量体积比加水，混合均匀后于121℃蒸煮20min，以形成待发酵物料；
固态发酵初物料制备：将待发酵物料(按棉粕干物料重)接种1％黑曲霉和0.5％酒用活性干酵母，先期固态发酵15h，再接种0.2％枯草芽孢杆菌后发酵48h，形成固态发酵初物料，其中，发酵温度为25℃；
棉粕蛋白饲料制备：取固态发酵初物料(按100份干棉粕固态发酵后形成的初物料取样)，加入黄色短杆菌发酵液2吨，混合均匀后静置3h，于75℃通风干燥，至物料含水量低于15％，得到所述棉粕蛋白饲料。
对实施例1至实施例5制备的所述棉粕蛋白饲料的各项参数进行测试，包括蛋白含量、游离棉酚含量、低聚糖含量以及植酸含量，其中，蛋白含量、游离棉酚含量、低聚糖含量以及植酸含量的测定方法如下：
1)蛋白含量测定(参照凯氏定氮法)
测试原理：棉粕中的蛋白质为含氮的有机化合物，需将棉粕中的蛋白质转化为铵盐定量。先将棉粕中的蛋白质与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使棉粕中的蛋白质分解，分解得到的氨气和浓硫酸反应生成硫酸铵；然后再进行碱化蒸馏，使氨游离出来；游离出来的氨经硼酸吸收后，再用0.01mol/L的HCl标准溶液滴定，通过HCl溶液的消耗量以及化学计量数算出蛋白-N和铵盐-N总量。
a、测定总氮含量
准确称取棉粕饲料样品0.5g(不妨令之为m1)，置于消化管中，加入0.22g K2SO4和CuSO4的混合试剂(其中，K2SO4和CuSO4的质量比为3:1)、5mL蒸馏水以及15mL浓硫酸在通风橱中进行消化，消化时先用小火消化至有白烟冒出，再加大火力消化至消化液变为蓝绿色，停止消化。再将消化液冷至室温，沿消化管壁缓缓加入35mL蒸馏水摇匀，摇匀后用玻璃棒引流至100mL容量瓶中，并用少量水将消化管中残留的消化液洗出，加水定容至刻度线。
取5mL待测样品倒入凯氏定氮装置蒸馏器的反应室内，在尾气出口接装有20mL浓度为2％的硼酸溶液的烧杯，硼酸溶液中滴加3滴溴甲酚绿-甲基红指示剂，待圆底烧瓶中的水沸腾后将蒸汽出口管接在蒸馏器上，并通入冷凝水，取5mL浓度为40％的NaOH溶液快速倒入反应室内，用玻璃塞塞住溶液入口，并液封。当硼酸溶液由红色变为绿色时再蒸馏8min，将尾气吸收液倒入250mL锥形瓶中，用少量蒸馏水将烧杯中残留的吸收液洗出。
然后将吸收液用0.01mol/L的HCl标准溶液进行滴定，当溶液变为浅红色即停止滴定。根据HCl标准溶液消耗的体积计算出棉粕饲料样品中包括蛋白质-N和铵盐氮总量A。
b、NH4 +氮含量测试
取棉粕饲料样品0.5g(不妨令之为m2)，研碎，加蒸馏水20mL，混匀后于55℃的水浴中提取0.5h，然后取出、冷却并抽滤，将滤液定容至25mL。
取5.0mL滤液，倒入凯氏定氮装置蒸馏器的反应室内，快速加入1％氧化镁悬浊液入反应室内，用玻璃塞塞住溶液入口，并液封。其他操作同凯氏定氮法，计算出0.5g样品中NH4 +-N含量B。
c、计算蛋白质含量：蛋白含量＝[(A/m1)-(B/m2)]×6.25×100％
2)游离棉酚含量测定(参照间苯三酚法)
测试原理：在6.6mol/L的HCl介质中，芳香醛与间苯三酚作用生成紫红色化合物，在550nm处有最大吸收，其颜色深浅与芳香醛含量呈正比，据此定量。
a、配制1mg/mL游离棉酚标准溶液：准确称取0.0285g醋酸棉酚，用70％的丙酮水溶液溶解，定容至25mL，即为母液。
b、0.02mg/mL游离棉酚工作液：准确移取母液1mL，用70％丙酮水溶液稀释，定容至50mL，即为工作液。
c、显色剂：取16.6mL浓盐酸，加入二水间苯三酚1g，用95％乙醇定容至100mL，混匀后，转入棕色瓶，置于4℃冰箱中保存，备用。
d、游离棉酚标准曲线：准确吸取游离棉酚工作液0、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，依次用70％丙酮水溶液定容至1.00mL，加入2mL显色剂，摇匀，置于55℃恒温水浴中，5min后，将反应液转入1cm比色皿，以未加游离棉酚试样为空白样，于550nm处测定吸光度(见表1)，以吸光度对游离棉酚质量作图(见图3)，其线性回归方程为：y＝0.0188x-0.0155，R2＝0.9953。
e、棉粕饲料样品中游离棉酚含量测定：准确称取经机械粉碎后且过100目筛的棉粕饲料样品1g(精确到0.1mg)，置于具塞锥形瓶中，加入50mL 70％丙酮水溶液，盖上瓶塞，置于36℃的恒温振荡器中振荡2h，以中速滤纸过滤；取滤液1mL，加入2mL显色剂，混匀，于55℃恒温水浴中5min，然后比色测定。每组样品重复试验3次，取平均值，根据游离棉酚标准曲线方程计算出棉粕样品中游离棉酚含量。
表1不同含量的游离棉酚标准液的吸光度值
样品编号 1 2 3 4 5 6
游离棉酚工作液/mL 0.00 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00
游离棉酚质量/μg 0.00 4.00 8.00 12.00 16.00 20.00
70％丙酮水溶液/mL 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0.00
吸光度 0.00 0.063 0.123 0.218 0.290 0.355
3)植酸含量测定(沉淀消解法)
准确称取研细的棉粕饲料样品1g(精确到0.1mg)，加入10％Na2SO4 50mL，1.2％HCl50mL，置于慢速搅拌的40℃恒温水浴锅中，10min后抽滤，并将滤液转移至250mL容量瓶中，用蒸馏水定容。
准确移取提取液10mL置于离心管中，加入1.0％FeCl3 4mL，静置2min，再经过15min沸水浴，使植酸完全转化为植酸铁沉淀，冷至室温后，将离心管置于4000rpm离心机离心6min后取出，弃去上清液，将沉淀用15mL 5％Na2SO4和0.6％HCl的混合溶液洗涤，再离心，如此反复三次。最后弃去上清液，沉淀经蒸馏水溶解后转入消化管中进行消化至沉淀完全消失；将消化液冷却至室温，沿消化管壁缓缓加入30mL蒸馏水，混匀后用玻璃棒引流转入100mL容量瓶中，用蒸馏水定容。
取2mL消化液置于具塞试管中，依次加入2mL钼酸铵溶液、1mL Na2SO3、1mL对苯二酚以及14mL蒸馏水，混匀后作为待测试液。空白样品除不加消化液外，其他操作与待测样品相同；静置0.5h后于660nm条件下测定待测样品的吸光度，根据磷含量标准曲线求出样品植酸磷的含量，再转化为棉粕饲料样品中植酸含量，植酸含量的计算公式如下：
式中，OD为测定样品植酸含量的吸光度；ms为棉粕饲料样品的质量。
其中，磷标准曲线的制作包括：a、2.85μg/mL磷标准工作液配制：称取磷酸二氢钾0.0506g，用蒸馏水溶解，并定容至100mL，再从中取出2.50mL，用水稀释并定容至100mL；b、曲线绘制：分别移取磷标准工作溶液0、2、4、6、8、10mL，依次加入0.80mol/L硫酸溶液4mL、50g/L钼酸铵0.4mL，用蒸馏水稀释至50mL，摇匀；显色20min，于660nm条件下测定吸光度，绘制吸光度对磷含量的工作曲线，如图4所示，标准曲线为：y＝0.0028x﹣0.0026，R2＝0.9993。
4)低聚糖(包括棉籽糖和水苏糖)含量测定
称取棉粕(或发酵棉粕)样品用20倍体积的温水(50～60℃)提取50min，然后10000g离心5min，取上清液，用0.22μm膜过滤。采用高效液相色谱(Shimadzu series 10Achromatograph(Kyoto,Japan))定量，使用的色谱柱为：Supelcosil LC-NH2 25cm×4.6mm(Supelco,Bellefonte,PA)，流动相包括80％乙腈和20％水(体积比)，流速为1mL/min。低聚糖(包括棉籽糖和水苏糖)通过示差折光检测器检测，棉籽糖和水苏糖标样均为分析纯。
最终测定实施例1至实施例5制备的所述棉粕蛋白饲料的各参数结果如下：蛋白含量≥50％，游离棉酚含量≤30mg/kg，不含低聚糖(α-半乳糖苷)、植酸等抗营养因子。说明本发明技术方案中，通过先接种黑曲霉和酒用活性干酵母进行协同发酵，再接种枯草芽孢杆菌进行发酵，形成固态发酵初物料，不仅有效地提高了棉粕中的蛋白质含量，还能将棉粕中的α-半乳糖苷、植酸等抗营养因子彻底降解；通过向固态发酵初物料中加入黄色短杆菌发酵液，降低了固态发酵初物料中的游离棉酚含量，而且改善了发酵棉粕中的氨基酸配比，提高棉粕的营养价值。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (10)

1.一种棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤S1、将粉碎后的棉粕与水均匀混合后，蒸煮以形成待发酵物料；
步骤S2、将所述待发酵物料冷却，接种黑曲霉和酒用活性干酵母，进行先期固态发酵，再接种枯草芽孢杆菌后发酵，形成固态发酵初物料；
步骤S3、取所述固态发酵初物料，加入黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，制得棉粕蛋白饲料。
2.如权利要求1所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，步骤S1包括：取粉碎后的棉粕100份(质量份数)与水混合后蒸煮，其中，所述棉粕与水的重量体积比为5:4～1:1，蒸煮温度为120～122℃，蒸煮时间为15～20min。
3.如权利要求1所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中：所述黑曲霉的接种量为0.05～1％，所述酒用活性干酵母的接种量为0.05～0.5％，所述先期固态发酵的发酵温度为25～35℃，发酵时间为15～60h。
4.如权利要求1所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S2中：所述枯草芽孢杆菌的接种量为0.2～1％，发酵温度为25～35℃，发酵时间为30～72h。
5.如权利要求1所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，步骤S3包括：取棉粕(100份)经固态发酵后的所述固态初物料，加入所述黄色短杆菌发酵液，混合均匀后静置，其中，所述黄色短杆菌发酵液的质量份数为2～5份。
6.如权利要求1所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S3之前，还包括如下步骤：
步骤S31、将黄色短杆菌菌种接种至斜面培养基中，于30～32℃培养24h；
步骤S32、将步骤S31中培养的菌种接种至摇瓶种子培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养12h；
步骤S33、将步骤S32中培养的菌种接种至摇瓶发酵培养基中，往复摇床转速120r/min，振幅8cm，于30～32℃培养至黄色短杆菌种子浓度不低于109个/mL；
步骤S34、将步骤S33中培养的所述黄色短杆菌种子接入发酵罐，通气量为2～3L/min，搅拌转速为200～600r/min，pH值为6.7～6.8，于30～32℃发酵60～72h，制得所述黄色短杆菌发酵液。
7.如权利要求6所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S31中，所述斜面培养基包括以下质量百分比含量的成分：牛肉膏或酵母膏1％、蛋白胨1％、NaCl 0.5％、琼脂2％以及水95.5％；所述斜面培养基的pH值为7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min。
8.如权利要求6所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S32中，所述摇瓶种子培养基包括以下质量百分比含量的成分：葡萄糖2～2.5％、玉米浆2.5～4.0％、硫酸铵0.4～0.6％、碳酸钙1％、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％以及水91.75～93.95％；所述摇瓶种子培养基的pH值为7.0～7.2，于0.1MPa压力下灭菌20min。
9.如权利要求6所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S33中，所述摇瓶发酵培养基包括以下质量百分比含量的成分：糖蜜12～15％、硫酸铵2.2～2.8％、豆粕水解液4％、生物素300～500μg/L、K2HPO4 0.1％、MgSO4·7H2O 0.05％以及碳酸钙4％，其余为水；所述摇瓶种子培养基的pH值为7.0～7.2，于0.07MPa压力下灭菌7～10min。
10.如权利要求6所述的棉粕蛋白饲料的制备方法，其特征在于，在步骤S34中，所述发酵罐中以糖蜜为原料，初糖浓度为120～150g/L，且每隔4h监测残糖浓度，当残糖浓度降至25g/L时，流加糖蜜，发酵结束前5h，停止流加糖蜜。
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