CN104757276B - 一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用，属于生物发酵中药技术领域。该微生态制剂乳酸菌种子液、黄芪水提取液、MRS液体培养基、水；其中所述乳酸菌种子液由屎肠球菌与植物乳杆菌按2‑8：8‑2比例混合培养制得；以所述黄芪水提取液对应提取前黄芪的重量计，每0.3克～6克的黄芪对应接种的乳酸菌种子液中活菌的个数为5×10⁹个，提高了黄芪多糖等活性物质和乳酸菌的含量。本发明微生态制剂的制备方法，通过选择合适的发酵温度和发酵时间，提高黄芪和乳酸菌的协同作用效果。本发明微生态制剂作为畜禽饮水添加剂，提高动物生产性能、消化率和机体免疫力。

Description

一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物发酵中药技术领域，具体涉及一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用。

背景技术

随着抗生素、激素等作为畜禽饲养添加剂的滥用，其危害性已逐渐被人们认识，因此，禁止以添加剂形式添加抗生素和激素类物质已经成为现代饲料行业的发展趋势，安全高效的微生态制剂作为添加剂在畜牧业生产中将会有越来越重要的应用。随着微生态学的发展，微生态学理论、方法开始被引入中草药药学的研究，丁轲等利用益生乳杆菌和中药制成的合生元试验结果表明，合生元提高AA肉鸡的免疫功能，提高胸腺指数、法氏囊指数和脾脏指数，提高肠道中的蛋白酶和淀粉酶酶活性；苗晓微等在肉仔鸡日粮中添加乳酸菌与中药合生元制剂，提高日增重、存活率、降低死淘率、提高蛋白质营养成分的利用率。这些研究结果表明利用益生菌和中药开发微生态制剂作为畜禽饲养添加剂具有中药的意义。

乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的统称，是动物肠道内的常在菌，具有调节畜禽硝化到菌群平衡，提高动物免疫性能的作用，目前市场上常用的乳酸菌微生态制剂多以普通培养基培养乳酸菌，然后以液体或粉剂形式存在；黄芪是一种常用中药，主要活性物质为多糖、皂苷和总黄酮，具有提高动物机体免疫力和生产性能的作用，但是目前对于乳酸菌和黄芪作为添加剂的使用通常是将二者简单的组合添加入饲料中或畜禽饮水中，没有发挥乳酸菌的强大生物转化功能，也没有研究发酵后中药活性成分的变化情况。针对现有技术的这种缺陷，朱新术在《发酵黄芪的乳酸菌的驯化及其与黄芪相互作用研究》中公开了从土鸡肠道中筛选出的生产性能好的优良乳杆菌，利用黄芪药液首先驯化该乳杆菌，将驯化后生产性能优异的乳杆菌再接种发酵黄芪，提高黄芪多糖的得率和菌体数量，但是这种需要首先驯化乳杆菌，再利用驯化后功能优异的菌体发酵黄芪的方法，操作复杂，且益生菌菌群单一，并且对于黄芪多糖增率和菌体数量的增率还有待于进一步的提高。

发明内容

为了克服现有技术的缺陷，本发明的目的之一在于提供一种黄芪多糖和乳酸菌增率高的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂。

本发明的目的之二在于提供一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的制备方法。

同时，本发明还在于提供一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的应用。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下原料发酵而成：乳酸菌种子液、黄芪水提取液、MRS液体培养基；其中所述乳酸菌种子液由屎肠球菌与植物乳杆菌按2-8：8-2比例混合培养制得；以所述黄芪水提取液对应提取前黄芪的重量计，每0.3克～6克的黄芪对应接种的乳酸菌种子液中活菌的个数为5×10⁹个。

上述黄芪水提取液为黄芪加水提取制得，其浓度为：每25克黄芪对应加水提取得到225ml～300ml的黄芪水提取液。

所述黄芪提取物由以下方法制备而得：取黄芪加水煎煮三次，合并三次煎煮液，过滤，取上清液，即得。

为了完全提取出黄芪中的水溶性有效成分，优选的，每次煎煮的煎煮时间为30～60min；第一次煎煮加水质量与黄芪的质量比为4～5：1；第二次煎煮加水质量与黄芪的质量比为3～4：1；第三次煎煮加水质量与黄芪的质量比为2～3：1。

所述黄芪水提取液与MRS液体培养基的用量比例为(3～60)：(97～40)；

进一步优选的，所述黄芪水提取液与MRS液体培养基的用量比例为25：75。

所述MRS液体培养基由以下方法制备而得：取酪蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏8g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，吐温-80 1g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，碳酸钙10g，加水1000mL，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌，即得。

所述乳酸菌种由以下方法制备而得：将屎肠球菌和植物乳杆菌按2-8：8-2比例接入所述的MRS液体培养基中，37℃-39℃厌氧培养24-36h，即得。

上述乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括取黄芪提取物、MRS液体培养基，加水混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种乳酸菌种子液，37℃-39℃厌氧培养48-72小时，即得。

上述乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂作为畜禽饮水添加剂的应用，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，在黄芪水提取液、MRS液体培养基组成的发酵基质中接种乳酸菌种发酵而成，其中屎肠球菌和植物乳杆菌按比例混合培养复配成乳酸菌种，丰富益生菌群，同时通过选择合适的乳酸菌种的接种量，使乳酸菌种和黄芪之间产生协同增效作用，相比传统的直接将乳酸菌和黄芪混合的添加剂，提高了黄芪多糖等活性物质和乳酸菌的含量，降低黄芪的毒副作用，生产成本低。

进一步的，优选发酵基质中黄芪水提取液的体积分数为25％，最大限度的发挥屎肠球菌和植物乳杆菌复配乳酸菌种的生物转化功能，提高乳酸菌的增率达到289％，黄芪多糖的增率达到499％。

本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的制备方法，通过选择合适的发酵温度和发酵时间，提高制备的微生态制剂中粗多糖和乳酸菌含量，提高黄芪和乳酸菌的协同作用效果，操作简便，易于控制，适于工业化推广应用。

本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂作为畜禽饲料添加剂，利用屎肠球菌和植物乳杆菌复配的乳酸菌种液体发酵黄芪，使黄芪和乳酸菌种产生协同增效作用，增加黄芪粗多糖含量和乳酸菌活菌量，使该微生态制剂添加于畜禽饮水中，提高动物生产性能、消化率和机体免疫力。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。

下述实施例中植物乳杆菌和屎肠球菌均购自中国普通微生物菌种保藏中心；植物乳杆菌的CGMCC编号为1.557；屎肠球菌的CGMCC编号为1.130。

实施例1

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种子液；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入4倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液250mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液3ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为3：97。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例2

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，38℃培养30小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种子液；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入5倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入4倍量的水，煎煮50min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液300mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液6ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，38℃厌氧振摇培养48小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为6：94。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例3

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入5倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入4倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液300mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液9ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，39℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为9：81。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例4

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入4倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入2倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液225mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液15ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为15：85。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例5

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入5倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入4倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液300mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液20ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为20：80。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例6

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入5倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入4倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液300mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液25ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为25：75。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例7

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入5倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入4倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液300mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液30ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为30：70。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

实施例8

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，由以下方法制备而得，具体操作步骤为：

1)制备MRS培养基：取酪蛋白胨10g、牛肉膏10g、酵母膏8g、葡萄糖5g、乙酸钠5g、柠檬酸氢二铵2g、吐温-80 1g、磷酸氢二钾2g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.05g、碳酸钙10g，加入1000ml水中，各原料完全溶解后，调pH为6.8，高压灭菌制得MRS培养基，备用；

2)制备乳酸菌种：将屎肠球菌和植物乳杆菌等比例接入步骤1)制备的MRS培养基中，37℃培养24小时，制得浓度为1×10⁹个/mL的乳酸菌种；

制备黄芪水提取液：取黄芪25g加入4倍量的水，煎煮60min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮40min，收集煎煮液，再加入3倍量的水，煎煮30min，收集煎煮液，合并三次收集的煎煮液，过滤，即得黄芪水提取液250mL；

3)发酵黄芪：取步骤2)制备的黄芪水提取液60ml和步骤1)制备的MRS培养基，混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种步骤2)制备的乳酸菌种液5ml，37℃厌氧振摇培养72小时，即得；其中黄芪水提取液与MRS培养基的用量比例为60：40。

本实施例乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可作为畜禽饮水添加剂，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在畜禽饮水中的质量百分含量为0.4％～0.6％。

对比例1本对比例中不添加黄芪水提取液，其他同实施例6，制得微生态制剂。

对比例2本对比例中不添加乳酸菌种，其他同实施例6，制得微生态制剂。

对比例3本对比例仅接种植物乳杆菌作为乳酸菌种，接种活菌数量为实施例6中接种的乳酸菌种的总活菌数量，其他同实施例6，制得微生态制剂。

对比例4本对比例仅接种屎肠球菌作为乳酸菌种，接种活菌数量为实施例6中接种的乳酸菌种的总活菌数量，其他同实施例6，制得微生态制剂。

试验例

1、分别于发酵第24h，48h对上述实施例和对比例取样进行乳酸菌含量测定，pH测定和OD_600nm测定，乳酸菌测定方法：称取25mL发酵样品，置于装有225mL生理盐水的无菌三角瓶内，150r/min摇床摇30min，制成1：10的样品匀液，然后吸取1mL样品匀液注入装有9mL生理盐水的无菌试管中，混匀，制成1：100的样品匀液，按照上述操作顺序，依次倍比稀释到适宜浓度。选择3个连续的适宜稀释度，每个稀释度取0.1mL样品稀释液，分别置于2个MRS琼脂平板上，涂布均匀，37℃，厌氧培养48h，对平板上的所有菌落进行计数。然后根据公式：每克样品中菌落数＝平板上菌落数×稀释倍数/平板中菌液添加量来计算发酵样品中细菌总数。pH测定和OD_600nm测定分别利用酸度计和分光光度计进行测定，结果如下表1所示：表1实施例1～8和对比例1～4制备的微生态制剂中乳酸菌含量、pH值、OD_600nm的变化

由表1显示的数据可知：相比对比例1不添加黄芪水提取液，实施例1～8制备的微生态制剂中乳酸菌的数量均有所增加，表明黄芪水提取液对乳酸杆菌和屎肠球菌具有明显的增值效果，并且随着黄芪提取液加入量的增加而增加，至黄芪水提取液的加入体积为发酵基质的25％时(实施例6)，发酵48h，乳酸菌的活菌数最大达到1.71×10⁹，乳酸菌增率达到289％；实施例1～8制备的微生态制剂乳酸菌活菌数均大于对比例3和对比例4，表明屎肠球菌和植物乳杆菌复配的乳酸菌相比单一的屎肠球菌和单一的植物乳杆菌，具有更好的与黄芪互作增值的效果，即屎肠球菌和植物乳杆菌在发酵过程中存在协同提高发酵效果，增加发酵后乳酸菌活菌数的作用；相比对比例3单独添加植物乳杆菌，实施例6乳酸菌増率达到285％，相比对比例4单独添加屎肠球菌，实施例6乳酸菌増率达到282％。

2、分别检测实施例1～8和对比例1～4制备的微生态制剂中黄芪粗多糖的含量，结果如下表2所示；检测方法为：按照硫酸苯酚法测定多糖，取试样，水提1h，过滤，滤渣加8倍水水提，重复两次，合并三次滤液，滤液4000r/min离心15min，弃沉淀，上清液浓缩至料水比为1：2。取浓缩液，加3倍95％乙醇，静置过夜，4000r/min离心20min，回收乙醇，沉淀即为粗多糖。取沉淀置于电热鼓风干燥箱60℃烘干，称重。研成粉末后，取适量，用蒸馏水稀释后供多糖测定，具体检测方法为：

A：葡萄糖标准溶液的配制

取适量葡萄糖，105℃烘干至恒重，精密称取200mg，用蒸馏水溶解定容到100mL容量瓶，配得浓度为2mg/mL的葡萄糖溶液。取上葡萄糖溶液2mL，用蒸馏水定容到50mL容量瓶，得0.08mg/mL葡萄糖标准溶液。

B：葡萄糖标准曲线的制备

分别吸取0mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL、1.2mL葡萄糖标准溶液于标有编号的洁净试管中，每管分别加蒸馏水至2mL，摇匀。分别加5％的苯酚溶液1mL，摇匀。再迅速加入5mL浓硫酸，摇匀。温室下静置10min，然后沸水浴15min，再冰浴冷却至室温。用紫外-可见分光光度计在490nm波长下测吸光度，以葡萄糖浓度作为横坐标(x)，吸光度为纵坐标(y)，绘制葡萄糖标准曲线。

C：取4个带塞的干净试管，蒸馏水作为空白对照，其余3管加试样，分别吸取2mL，按上操作处理，测吸光度。用3个试管的吸光度求平均值，从标准曲线上查出相应的多糖浓度。以下公式计算多糖含量。

公式中：W——多糖的含量；

C——标准曲线中计算的多糖浓度；

V——试样稀释的体积

M——样品的质量；

表2实施例1～8和对比例1～4制备的微生态制剂中黄芪粗多糖的得率

由表2显示的数据可知：相比对比例2不添加乳酸菌，实施例1～8制备的微生态制剂中黄芪粗多糖得率均有所增加，表明乳酸杆菌和屎肠球菌对黄芪多糖具有明显的促进效果，并且随着黄芪提取液加入量的增加而增加，至黄芪水提取液的加入体积为发酵基质的25％时(实施例6)，发酵48h，黄芪粗多糖的得率达到5.09％，粗多糖增率达到499％。相比对比例3和对比例4，实施例1～8的黄芪多糖得率均大于对比例3和对比例4，表明相比单一的屎肠球菌和单一的植物乳杆菌，屎肠球菌和植物乳杆菌复配在发酵过程中具有提高发酵效果，增加黄芪多糖量的协同作用；对比例3单独添加植物乳杆菌，实施例6粗多糖增率达到266％，相比对比例4单独添加屎肠球菌，实施例6粗多糖増率达到278％。

3、本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂作为断奶仔猪饮用水添加剂的效果试验

试验在河南省洛阳市孟津县农鑫养殖场进行，选择体重、日龄(28日龄)相近的三元(杜×长×大)断奶仔猪210头，随机分为7组，每组3个重复，每个重复10头(公母各半)，分别为试验组A、B、C、D、对照组1、2、3，其中试验组以本发明实施例6制备的微生态制剂为饮用水添加剂，具体分组情况见表3。

表3试验分组及微生态制剂添加量

组别	添加量	添加抗生素
			试验组A	0.2％微生态制剂	无
试验组B	0.4％微生态制剂	无
			试验组C	0.6％微生态制剂	无
试验组D	0.8％微生态制剂	无
			对照组1	无	强力霉素
对照组2	添加1％黄芪水提液	无
			对照组3	添加0.05％枯草芽孢杆菌菌液	无

测试指标：试验期30天，分别于试验开始和结束时对试验猪逐一进行空腹称重，以组为单位记录采食量，计算平均日采食量、平均日增重及料肉比。

血样采集：在试验结束后第2天早晨空腹对各试验组仔猪静脉采血，制备血清后保存于-20℃冰箱中，利用试剂盒和酶标仪分别检测各试验组血清中总蛋白、IgG、IgA和IgM的含量。

测试结果：(1)本发明实施例6制备的微生态制剂对1-28d断奶仔猪生长性能的影响见表4。

表4微生态制剂对仔猪生产性能的影响

注：同列数据右标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

从表4可知，试验组比对照组在平均日采食量、平均日增重、料肉比方面均有所提高，差异均显著(P<0.05)，试验组B、C、D比试验A组均高，差异显著(P<0.05)，试验B、C两组之间差异不显著。试验B组在三个指标方面比对照1组分别提高了11.14％，22.55％，8.16％，比对照2组分别提高了8.55％，19.95，6.74％，比对照3组分别提高了8.09％，16.81％，5.76％。综合各项指标，试验B、C组具有较好效果，即按照0.4％-0.6％比例饮水，与抗生素组、单用黄芪组、单用枯草芽孢杆菌组对比，提高仔猪的生长性能。

(2)本发明实施例6制备的微生态制剂对仔猪各项免疫指标的影响见表5。

表5微生态制剂对仔猪各项免疫指标的影响

注：同列数据右标不同小写字母表示差异显著(P<0.05)，相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)。

从表5可知，实验组比对照组在总蛋白、IgG、IgA方面均显著提高，IgM无显著差异，试验组之间除IgA指标差异显著，其他三项指标差异不显著。试验B组总蛋白比对照1、2、3组分别提高18.20％，9.08％，6.00％；IgG比对照1、2、3组分别提高13.58％，9.43％，8.68％；IgA比对照组分别提高2.26％，1.94％，1.62％。综合各项指标，试验B、C两组效果较好，即按照0.4％-0.6％比例饮水，与抗生素组、单用黄芪组、单用枯草芽孢杆菌组对比，提高仔猪的免疫性能。

实施例1～5和实施例7～8制备的微生态制剂作为仔猪饮水添加剂的效果同实施例6制备的微生态制剂。

Claims (7)

1.一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，由以下原料发酵而成：乳酸菌种子液、黄芪水提取液、MRS液体培养基；其中所述乳酸菌种子液由屎肠球菌与植物乳杆菌按2-8：8-2比例混合培养制得；以所述黄芪水提取液对应提取前黄芪的重量计，每0.3克～6克的黄芪对应接种的乳酸菌种子液中活菌的个数为5×10⁹个；所述黄芪水提取液的浓度为：每25克黄芪对应加水提取得到225ml～300ml的黄芪水提取液；所述黄芪水提取液与MRS液体培养基的用量比例为(3～60)：(97～40)。

2.如权利要求1所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述黄芪水提取液由以下方法制备而得：取黄芪加水煎煮三次，合并三次煎煮液，过滤，取上清液，即得。

3.如权利要求1所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，每次煎煮的煎煮时间为30～60min；第一次煎煮加水质量与黄芪的质量比为4～5：1；第二次煎煮加水质量与黄芪的质量比为3～4：1；第三次煎煮加水质量与黄芪的质量比为2～3：1。

4.如权利要求1所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述黄芪水提取液与MRS液体培养基的用量比例为(15～60)：(85～40)。

5.如权利要求1～4任一项所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述乳酸菌种由以下方法制备而得：将屎肠球菌和植物乳杆菌按比例接入MRS液体培养基中，37℃-39℃厌氧培养24-36h，即得。

6.一种如权利要求1～4任一项所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的制备方法，其特征在于，包括取黄芪提取物、MRS液体培养基，加水混合均匀后，调节pH为6.8，高压灭菌后，接种乳酸菌种子液，37℃-39℃厌氧培养48-72小时，即得。

7.一种如权利要求1～4任一项所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在制备畜禽饮水添加剂中的应用。