KR101214573B1 - 바이셀라 코리엔시스를 이용하여 얻어진 발효대두박 및 그 제조 방법 - Google Patents

바이셀라 코리엔시스를 이용하여 얻어진 발효대두박 및 그 제조 방법 Download PDF

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Abstract

대두박을 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시켜 얻어진 발효대두박, 상기 발효대두박을 포함하는 사료 조성물, 및 상기 발효대두박을 제조하는 방법이 제공된다.

Description

바이셀라 코리엔시스를 이용하여 얻어진 발효대두박 및 그 제조 방법{Fermented soybean meal by Weissella koreensis and method of preparing the same}
본 발명은 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 를 이용하여 대두박으로부터 발효대두박을 생산하는 가공 기술 및 상기 발효대두박의 용도에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 단백질분해 효소(protease) 생성능이 우수한 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 열처리한 대두박 배지에 접종 및 발효하여 대두박의 단백질을 농축하고 트립신억제인자(trypsin inhibitor)와 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose) 등의 올리고당을 제거하여 얻어진 발효 대두박, 상기 발효 대두박을 포함하는 사료 조성물, 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
축산사료 원료 중 단백질을 공급하는 원료원 중 가장 경제적이고 고품질의 식물성 단백질로 대두박을 많이 이용하고 있다.
대두박은 콩기름을 짜고 남은 찌꺼기를 의미하는 것으로, 콩깻묵이라고도 하고, 주로 사료 및/또는 비료로 사용된다. 그러나, 대두박을 어린 가축, 예컨대 어린 돼지에 사용하면 대두박에 포함된 항영양인자들에 의해 소화가 잘 안되어 소화를 저해하기 때문에[Li 등, Transient hypersensitivity to soybean meal in early-weaned pig. J. Anim. Sci. 68:1790, 1990), 어린 가축의 사료에는 사용량을 제한하고 있다.
위와 같은 대두박의 항영양인자로 단백질 소화를 방해하는 트립신억제인자, 혈구 응집소인 헤마글루티닌(hemagglutinin), 가축의 설사와 복통을 유발하는 라피노스, 스타키오스 등의 올리고당 등이 있다(Ratner 등, Soybean: anaphpylacogenic properties. Ann. Allergy. 13:289, 1955). 이들 중 일부는 열처리에 의해서 파괴 되지만 이 과정에서 대두단백질이 변성될 수 있고 라이신(lysine)등의 필수 아미노산이 소실될 수 있다.
따라서 대두의 단백질을 보다 효율적으로 이용하기 위하여 항영양인자를 제거하여 효율성을 증대시키는 가공법들이 개발되고 있다.
대두박은 건물을 기준으로 하였을 때 단백질이 55～56중량%, 가용성탄수화물이 13～14중량%, 불용성탄수화물 21～22중량%이며 이밖에 1중량%정도의 조지방과 4～6중량% 정도의 회분으로 구성되어 있다(한인규, 식물성 단백질사료, 사료가공학, 선진문화사, 67-107, 1998).
기존 대두박 가공제품 중 농축대두단백질(soy protein concentrates, SPC)은 가용성 비단백질 구성성분을 약 78℃의 65%(v/v) 에탄올로 추출하여 제거한 다음 특수 열처리를 하여 제조하고, 분리정제 대두단백질(isolated soy proteins, ISP)은 알칼리 조건에서 단백질성분을 용해하여 수확한 후 산성 조건에서 단백질을 침전하는 방법으로 대두박의 비단백질 성분을 제거하고 분무건조(spray drying) 공법으로 건조하여 제조하였다(Protein technology institute, Composition of ISP and SPC, 1991). 상기의 방법으로 제조된 농축 대두단백질과 분리정제 대두단백질을 사료로 사용하면 가축의 성장을 촉진하는 것으로 보고되었다(Hancock 등, Effect of ethanol extractionand duration of heat treatment of soybean flakes on the utilization of soy protein by growing rats and pigs. J. Anim. Sci. 78:3233, 1990).
그러나 이런 화학적인 대두단백질 가공 방법은 생산 단가가 높고 제조과정 중 열처리, 화학적 처리, 열건조 등으로 인하여 단백질 변성, 수용성 아미노산의 소실 등이 일어나 실제 단백질의 용해도는 낮아지게 된다는 문제점을 갖는다. 따라서, 종래의 방법은 단백질의 극심한 변성이 일어나지 않을 정도에서 열처리를 하기 때문에 항영양인자인 트립신억제인자도 상당량 존재하는 문제점이 있다.
이와 같은 화학적인 대두단백질 가공 방법의 문제점을 해결하는 수단으로 세균인 바실러스(Bacillus)균이나 곰팡이인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 이용한 생물학적 가공방법으로 발효하는 발효대두박 제품이 나오게 되었다. 하지만 기존의 세균인 바실러스(Bacillus)균이나 곰팡이인 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae)를 이용한 발효법은 일반적으로 고상발효법으로 알려져 있다. 고상발효법은 호기적인 상태와 발효과정에서 생산되는 발효열을 제거하기 위해서 지속적으로 공기를 불어 넣어주어야 한다는 단점이 있다. 또한 대두박을 30cm 이내의 두께로 배양하여야 하므로 과다한 공간과 설비를 필요로 하여 생산성이 떨어지는 단점이 있다.
이에 본 발명자들은 단백질분해능이 매우 우수한 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 균주를 사용하여 대두박을 발효시킴으로써, 혐기조건에서도 발효가 가능하며 항영향인자의 함량이 현저하게 감소한 발효대두박을 제조할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
따라서, 본 발명의 목적은 단백질분해능이 매우 우수한 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP) 균주를 이용하여 제조된 발효 대두박을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 상기 발효대두박을 포함하는 사료 조성물을 제공하는 것이다.
또 다른 목적은 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP) 균주를 이용한 발효대두박 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명자들은 혐기적인 조건에서도 단백질분해효소 활성이 매우 높은 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 균주를 열처리한 대두박에 접종하여 대두박 내의 탄수화물을 미생물 성장에 필요한 에너지원으로 소진시킴으로써, 대두박 내의 단백질을 상대적으로 농축하여 약 55중량% 이상, 바람직하게는 57 중량% 이상의 조단백질을 포함하고, 트립신억제인자와 라피노스, 스타키오스등의 올리고당과 같은 항영양인자를 감소시킨 발효 대두박을 제조할 수 있음을 확인하여 그 제조방법을 확립하고, 상기 제조방법에 의해 제조된 발효대두박은 대두박의 단백질이 작은 크기의 펩티드로 가수분해되었음을 증명함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 단백질분해능이 매우 우수한 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP) 균주를 이용하여 혐기적발효에 의한 효소 활성 및 조단백질 함량을 극대화하는 원료배지의 대두박 수분 함량과 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP) 균주 발효에 의한 항영양인자가 낮고 조단백질 함량이 높으며 아미노산 구성이 기존의 고상발효법에 의한 발효대두박보다 높은 대두박 열처리 조건을 확립하였으며, 상기 조건에서 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP) 균주를 이용하여 제조된 발효대두박 대두단백질의 구성아미노산과 가수분해 정도를 다른 균주를 이용한 발효물과 비교함으로써 본 발명의 효과를 입증하였다.
본 발명은 대두박의 수분 함량에 따른 단백질분해능이 우수한 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 발효에 의한 효소 생성 및 조단백 함량의 변화를 조사하고; 대두박의 열처리 조건에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 발효 후 트립신억제인자(trypsin inhibitor)와 라피노스(raffinose), 스타키오스(stachyose)같은 항영양인자 변화를 조사하고, 상기 조사된 발효 최적의 조건에서 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용하여 발효대두박을 제조하고, 본 발명에 의해 제조된 발효대두박의 구성아미노산 및 유리아미노산 및 가수분해 정도를 대두박과 종래의 고상발효대두박과 비교하여 본 발명 발효대두박의 가수분해화 정도를 확인하여 완성되었다.
이에 본 발명의 일례는 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박을 제공한다. 상기 발효대두박은 대두박을 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시켜 얻어진 것으로, 조단백질 함량 및 단백질 분해효소 역가가 현저하게 증가하고, 트립신억제인자와 라피노스, 스타키오스 등의 올리고당과 같은 항영양인자 함량이 현저하게 감소된 것을 특징으로 한다.
일 구체예에 있어서, 발효대두박의 단백질분해효소 역가 및 조단백질 함량을 보다 증진시키기 위하여, 상기 대두박의 초기 수분 함량은 70 중량% 이상(예컨대 70 내지 85 중량%), 바람직하게는 78 중량% 이상 (예컨대, 78 내지 85 중량%), 더욱 바람직하게는 78 내지 82 중량%인 것이 좋다. 이 때, 대두박의 초기 수분 함량은 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시키기 전의 발효 대상 재료로서의 대두박 내의 수분 함량을 의미한다.
또 다른 구체예에 있어서, 발효대두박의 조단백질 함량을 보다 증진시키기 위하여, 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시킬 재료로서의 대두박은 초기 조단백질 함량이 45 내지 50 중량%인 것을 사용하는 것이 좋다.
또 다른 구체예에 있어서, 상기 발효대두박은 열처리된 대두박을 이용하여 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시켜 얻어진 것일 수 있다. 발효 대상 대두박을 열처리함으로써 트립신억제인자, 스타키오스, 라피노스 등과 같은 항영양인자의 함량을 현저하게 감소시킬 수 있다. 항영양인자의 함량 감소 측면에서, 상기 발효 대상 대두박의 열처리 온도는 60 내지 130 ℃, 바람직하게는 80 내지 130℃ 범위로 할 수 있으며, 열처리 시간은 5 내지 100분, 바람직하게는 10분 내지 80분 범위에서 적절히 조절할 수 있다. 상기 열처리 시간은 열처리 온도에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 예컨대, 열처리 온도가 높아질수록 짧게, 열처리 온도가 낮아질수록 길게 조절할 수 있다. 일 구체예에서, 발효 전 대두박을 80 내지 100℃에서 50 내지 70분 동안, 바람직하게는 55 내지 65분 동안 열처리하거나, 110 내지 130℃, 바람직하게는 118 내지 123℃에서 10 내지 20분, 바람직하게는 13 내지 17분 동안 열처리하는 것이 좋으며, 특히 약 121℃에서 약 15분간 열처리하여 발효하는 것이 가장 좋다.
본 발명의 발효대두박의 제조시에 대두박에 접종되는 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 양은 특별한 제한은 없으나, 발효효율과 발효산물의 성분을 고려할 때, 대두박 1g당 1x102 내지 1x108 cells, 바람직하게는 1x103 내지 1x107 cells 일 수 있다.
상술한 바와 같은 본 발명의 발효대두박은 조단백질 함량이 55 중량% 이상 (예컨대, 55 내지 70 중량%), 바람직하게는 57 중량% 이상(예컨대, 57 내지 70 중량%), 더욱 바람직하게는 60중량% 이상 (예컨대, 60 내지 70 중량%)이고, 카세인을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(Tyrosin)에 의하여 측정된 단백질 분해효소 역가가 6 U/g 이상 (예컨대, 6 내지 9 U/g), 바람직하게는 7.5 U/g 이상 (예컨대, 7.5 내지 9 U/g)인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 발효대두박은 항영양인자인 트립신억제인자의 함량이 1.3 TImg/g 이하, 바람직하게는 0.8 TImg/g 이하, 더욱 바람직하게는 0.4 TImg/g 이하이고, 스타키오스 함량이 0.08 중량%이하, 바람직하게는 0.04 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.02 중량% 이하이고, 라피노스 함량은 0.04 중량% 이하, 바람직하게는 0.02 중량% 이하, 더욱 바람직하게는 0.01 중량% 이하인 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 발효대두박은 메티오닌, 라이신, 트레오닌, 페닐알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 시스테인, 티로신, 세린, 아스파르트산, 알라닌, 글루탐산 및 프롤린의 17가지 구조 아미노산 총함량이 57 중량% 이상 (예컨대, 57 내지 65중량%), 바람직하게는 59 중량% 이상 (예컨대, 59 내지 64 중량%)이고, 이중 어린이 필수 아미노산인 아르기닌과 히스티딘 함량이 5.7 중량% 이상 (예컨대, 5.7 내지 6.5 중량%), 바람직하게는 5.8 중량% 이상(예컨대, 5.8 내지 6.5 중량%)이고, 메티오닌, 라이신, 트레오닌, 페닐알라닌, 발린, 루신 및 이소루신의 필수 아미노산의 총 함량이 19 중량% 이상 (예컨대, 19 내지 25 중량%)인 것일 수 있다 (표 4 참조).
또한, 본 발명의 발효대두박은 유리아미노산의 함량에 있어서도 현저하게 높은 것으로 확인되었는데 (표 5 참조), 유리 메티오닌, 유리 라이신, 유리트레오닌, 유리 페닐알라닌, 유리 발린, 유리 루신, 유리 이소루신, 유리 아르기닌, 및 유리 히스티딘의 총 함량이 1500 내지 3000 mg/kg, 바람직하게는 2000 내지 2500 mg/kg일 수 있으며, 예컨대, 유리 메티오닌 함량이 95 내지 120 mg/kg, 바람직하게는 100 내지 115 mg/kg, 유리 라이신 함량이 110 내지 135 mg/kg, 바람직하게는 115 내지 130 mg/kg, 유리 트레오닌 함량이 85 내지 115 mg/kg, 바람직하게는 95 내지 110 mg/kg, 유리 페닐알라닌 함량이 385 내지 425 mg/kg, 바람직하게는 395 내지 415 mg/kg, 유리 발린 함량이 330 내지 370 mg/kg, 바람직하게는 340 내지 360 mg/kg, 유리 루신 함량이 770 내지 810 mg/kg, 바람직하게는 780 내지 800 mg/kg, 유리 이소루신 함량이 300 내지 340 mg/kg, 바람직하게는 315 내지 330 mg/kg, 유리 아르기닌 함량이 65 내지 95 mg/kg, 바람직하게는 70 내지 90 mg/kg 유리 히스티딘 함량이 48 내지 60 mg/kg인, 바람직하게는 50 내지 55 mg/kg일 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시킨 발효대두박은 단백질분해효소 역가, 조단백질 함량, 및 구조아미노산 및 유리아미노산의 함량이 높은 반면, 항영양인자의 함량은 현저하게 낮은 것을 특징으로 한다.
따라서, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시킨 발효대두박은 어린 가축도 소화시키기 용이하여 사료 재료로서 유용하다.
이에, 본 발명의 또 다른 예는 상기 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박을 포함하는 사료 조성물을 제공한다.
본 발명의 사료 조성물 내의 상기 발효대두박의 함량은 적용 가축 종류, 연령, 적용 형태, 목적하는 효과 등에 따라서 적절하게 조절 가능하며, 예컨대, 1 내지 99 중량%, 10 내지 90 중량%, 또는 20 내지 80 중량%일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 사료 조성물을 적용 가능한 가축 종류는 특별한 제한이 없으며, 예컨대, 소, 양, 사슴 등의 반추동물, 돼지, 닭, 오리, 거위 등의 조류, 어류, 등으로 이루어진 선택된 1종 이상일 수 있다.
또 다른 예는 상기 발효대두박의 제조 방법을 제공한다. 상기 발효대두박 제조 방법은
1) 대두박을 준비하는 단계;
2) 상기 대두박에 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 접종하는 단계; 및
3) 상기 접종된 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 배양하여 대두박을 발효시키는 단계
를 포함한다.
앞서 설명한 바와 같이, 상기 단계 1)에서 준비된 대두박은 초기 수분 함량이 70 중량% 이상(예컨대 70 내지 85 중량%), 바람직하게는 78 중량% 이상 (예컨대, 78 내지 85 중량%), 더욱 바람직하게는 78 내지 82 중량%인 것이 좋다. 또한 상기 대두박은 초기 조단백질 함량이 45 내지 50 중량%인 것일 수 있다.
상기와 같은 범위로의 대두박의 초기 수분 조절은 통상적인 수분 조절 방법에 의하여 수행 가능하고, 예컨대, 대두박을 물에 침지시켜 대두박 내 수분 함량을 상기 범위로 조절할 수 있다. 이와 같이 침지에 의하여 대두박 내 수분을 조절하는 경우 공기와 접촉 방지 및 온도 유지에 유리하며, 효소 활성을 높일 수 있는 이점이 있다.
상기 단계 2)에서 대두박에 접종되는 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 양은 대두박 1g당 1x102 내지 1x108 cells, 바람직하게는 1x103 내지 1x107 cells 일 수 있다.
상기 단계 3)의 발효 공정은 호기적 조건 하에서는 물론, 산소 공급 없이 혐기적 조건 하에서 수행 가능한 것을 특징으로 한다. 이와 같이 혐기적 조건하에서 발효 공정을 수행함으로써, 공기 공급을 위한 설비 필요 없고 공기 공급 과정을 생략할 수 있어서 경제적으로 유리할 뿐 아니라 공정의 단순화에도 유리하다. 상기 발효 공정은 대두박에 접종되는 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 25 내지 35℃, 바람직하게는 28 내지 32℃에서 36 내지 60시간, 바람직하게는 42 내지 54 시간 동안 배양함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 발효대두박 제조 방법은 상기 단계 1)과 단계 2) 사이에, 단계 1)에서 준비된 대두박을 열처리 하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 열처리 단계는 60 내지 130 ℃, 바람직하게는 80 내지 130℃의 온도 범위에서 5 내지 100분, 바람직하게는 10분 내지 80분 동안 수행될 수 있다. 상기 열처리 시간은 열처리 온도에 따라서 적절하게 조절될 수 있으며, 예컨대, 열처리 온도가 높아질수록 짧게, 열처리 온도가 낮아질수록 길게 조절할 수 있다. 일 구체예에서, 상기 단계 2) 수행 전에, 단계 1)에서 준비된 대두박을 80 내지 100℃에서 50 내지 70분 동안, 예컨대 55 내지 65분 동안 열처리하거나, 110 내지 130℃, 예컨대, 118 내지 123℃에서 10 내지 20분, 바람직하게는 13 내지 17분 동안 열처리하는 것이 좋으며, 특히 약 121℃에서 약 15분간 열처리한 후, 단계 2)의 접종 및 단계 3)의 발효 공정을 수행하는 것이 가장 좋다. 열처리시 기압 조건은 크게 상관은 없으며, 예컨대 대기압 범위 내지 1.5 기압 정도 하에서 수행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 발효대두박을 제조함에 있어서, 최적의 수분함량을 알기 위해 대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 단백질분해효소 생성 및 조단백질 함량의 변화를 조사하였다(실시예 1 참조). 단백질분해효소(protease) 활성은 카세인(20mM Tris-HCl 버퍼 내 0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(tyrosine)을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4: 101, 1978]으로 측정하고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmol의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 조단백질 함량은 킬달장치(Kjeldahl system)로 측정하였다.
그 결과, 상기한 바와 같이, 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 단백질분해효소 역가와 발효대두박의 조단백질 함량 모두 대두박의 초기수분함량이 증가함에 따라 함께 증가하였으며, 대두박의 초기 수분함량이 70 중량% 이상인 경우(예컨대 70 내지 85 중량%), 바람직하게는 78 중량% 이상 (예컨대, 78 내지 85 중량%), 더욱 바람직하게는 78 내지 82 중량%일 때 높은 값을 나타내었다. 따라서, 발효대두박을 제조하기 위한 대두박의 최적 수분함량은 70% 이상, 바람직하게는 78 중량% 이상, 더욱 바람직하게는 78 내지 82 중량%임을 알 수 있다.
대두박의 항영양인자인 트립신억제인자는 단백질이기 때문에 이를 제거하는 가장 손쉬운 방법은 열처리를 하는 것이다. 따라서, 발효대두박을 제조함에 있어서 최적의 대두박 열처리 조건를 확립하기 위하여 대두박의 열처리 온도에 따른 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)에 의한 발효대두박 내의 항영양인자인 트립신억제인자, 라피노스, 및 스타키오스 함량을 조사하였다(실시예 2 참조). 트립신억제인자 역가는 AACC-71-10(American association of cereal chemists, 1995)의 방법에 따라 측정하고, 라피노스 및 스타키오스 함량은 액상 크로마토그래피(liquid chromatography, LC)로 정량하였다.
측정 결과, 상기한 바와 같이, 열처리 온도가 올라갈수록 트립신억제인자 역가와 스타키오스와 라피노스 함량은 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 발효에 의하여 현저히 감소하는 것을 확인하였다. 열처리 시간은 온도에 따라 적절히 조절 가능하며, 열처리 온도를 높게 하면 열처리 시간을 짧게 하고, 열처리 온도를 낮게 하면 열처리 시간을 길게 하여 조절할 수 있다.
발효대두박 제조를 위한 균주 발효에 의한 생물학적 가공에서 항영양인자들 함량을 고려할 때, 열처리 온도는 60 내지 130 ℃, 바람직하게는 80 내지 130℃ 범위로 할 수 있으며, 열처리 시간은 5 내지 100분, 바람직하게는 10분 내지 80분 범위에서 적절히 조절할 수 있다. 일 구체예에서, 대두박을 80 내지 100℃에서 50 내지 70분 동안, 예컨대 55 내지 65분 동안 열처리하거나, 110 내지 130℃, 예컨대, 118 내지 123℃에서 10 내지 20분, 바람직하게는 13 내지 17분 동안 열처리하는 것이 효율적이며, 특히 약 121℃에서 약 15분간 열처리하여 발효하는 것이 가장 효율적인 것으로 확인되었다.
일 구체예에 따른 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 본 발명 발효대두박 제조과정은 다음과 같다:
액상발효기에 조단백질 함량이 45~49%를 포함하는 대두박을 수분함량 80~90%로 맞추고, 30분간 침지한 후, 121℃, 1.5기압에서 15분 열처리 한 후 품온이 35℃가 될 때까지 냉각한 후, 바이셀라 코리엔시스(KCTC 10400BP) 스타터를 대두박 원료 1kg 당 1g 넣어서 잘 혼합한 후, 30℃로 유지하면서 48시간 산소공급없이 정치배양 한다. 배양이 완료된 발효대두박은 50℃에서 열풍 건조한 후 분쇄하여 본 발명 발효대두박을 제조하였다.
본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 기존의 바실러스균이나 아스퍼질러스균을 이용한 발효대두박 가공 방법에서 가장 문제가 많은 호기적과정과 냉각에 필요한 과다한 공기의 공급 등이 없어서 생산설비가 단순해지고 설비공간이 매우 적게 필요해서 생산비가 매우 저렴할 뿐만 아니라 본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 조단백질 함량이이 높고 트립신억제인자 함량이 현저히 낮았다.
대두박은 식물성사료원료 중 높은 단백질원료이지만 항영양인자와 함유된 단백질의 소화 흡수성에서 특히 어린 가축의 성장에 부족한 단점도 있다. 이런 단점을 개선하는 방법 중의 하나가 미생물을 이용한 발효를 통해 가수분해된 펩티드 형태로 만들거나 소화가 쉽게 일어나도록 저 분자량의 단백질로 분해를 하는 것이다. 본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)에서 분비하는 단백질분해효소에 의해 대두단백질이 분해되어있고 있다. 따라서, 본 발명 발효대두박의 구조아미노산 및 유리아미노산의 함량과 가수분해화 정도를 알기 위하여 대두박, 본 발명 발효대두박, 종래의 고상발효대두박 가공제품을 비교하였다(실시예 3 및 실시예 4 참조).
그 결과, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박이 조사된 17개의 구조아미노산 모두에서 대두박이나 타사 고상발효제품에 비해 아미노산 함량이 높은 것으로 나타났다. 특히 식물성원료에서 가장 부족한 아미노산인 라이신이나 메티오닌이 높았으며 어린이 필수아미노산인 아르기닌과 히스티딘이 다른 제품들보다 높게 나타났다. 유리아미노산 함량에 대한 비교를 통해 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박과 일반대두박과 타사 고상발효제품과의 비교 결과(표 5 참조), 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박의 단백질 조성이 다른 경쟁제품보다 양적으로도 질적으로도 다른 패턴을 보이는 것으로 나타났다.
이상과 같이, 본 발명은 대두단백질을 단백질분해효소 기능이 우수한 김치유산균 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 균주로 산소 공급없이 혐기적으로 발효하여 대두박에 포함된 탄수화물을 미생물의 성장에 필요한 에너지원으로 이용하여 대두박속의 상대적 단백질 함량을 농축하고 항영양인자로 알려진 트립신저해인자(Trypsin inhibitor)를 제거하는 생물학적 대두단백질 가공방법으로 상기발효 대두펩티드는 단백질의 함량이 기존의 바실러스나 아스퍼질러스 균주를 이용한 발효대두단백보다 높고 또한 구조아미노산의 함량도 높으며, 단백질의 용해도가 높아 유리아미노산이 많이 나와 가축이 소화 흡수하기 용이하여 어린 가축의 성장을 촉진하는 뛰어난 효과가 있다.
이상에서 설명한 바와 같이 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박은 높은 단백질분해 활성으로 대두박의 상대적인 조단백질 함량을 농축시키는 효과가 있고 대두박의 항영양인자인 트립신억제인자와 라피노스와 스타키오스를 분해하는 효과가 있으며, 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박 제조공정은 기존의 고상발효법에 의한 것보다 생산비가 낮으며, 유리아미노산 및 어린가축에 필수아미노산인 아르기닌 및 히스티딘이 높고 저분자 단백질 및 펩티드로 가수분해되어 있어 본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 어린 돼지사료나 가축사료에 배합되어 사용되었을 때 가축의 성장을 촉진시켜 생산성을 증대시킬 수 있는 고품질 단백질 사료로 사료산업에 매우 유용한 발명인 것이다.
도1은 기존의 고상발효법과 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 대두박의 발효 가공법의 비교를 나타낸 도식이다.
도2는 대두박과 본 발명 발효대두박과 타사제품의 가수분해 정도를 나타내는 단백질 전기영동 사진이다 (컬럼 1: 경동시장 구입 대두박, 컬럼 2: 비교예 1, 컬럼 3: 비교예 2, 컬럼 4: 실시예 3).
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명할 것이나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 제한되는 의도는 아니다.
실시예 1: 대두박의 수분 함량에 따른 바이셀라 코리엔시스 ( Weissella koreensis , KCTC 10400 BP ) 발효에 의한 단백질분해효소 역가와 조단백 함량의 변화
대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)발효에 의한 조단백 함량의 변화를 조사하기 위하여, 조단백질 함량이 49.4중량%인 대두박(경동시장 구입)을 침지시켜 각각 수분함량 50중량%, 60중량%, 70중량%, 80중량%, 및 85중량%로 하여, 각각의 수분 함량 별 대두박 200g을 삼각플라스크에 넣고 121℃, 1.5기압에서 15분간 멸균한 후 30℃로 식혔다. 그 다음, 본 발명 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis, KCTC 10400BP)배양액 (2x108 cells/mL) 2ml을 상기 수분함량 50중량%, 60중량%, 70중량%, 80중량%, 및 85중량%로 하여 상기 준비된 대두박 배지에 넣고 잘 혼합한 후 30℃ 배양기에서 48시간 정치배양하였다.
상기 배양물을 50℃ 건조기에서 수분함량 8%가 될 때까지 건조하여 각 시료의 조단백질 함량을 구하였다. 조단백질의 함량은 킬달장치(Kjeldahl system, Kjeltec 2100)로 측정하였다. 단백질분해효소의 역가는 배양직후 시료로부터 구하였다. 시료로는 상기 얻어진 각각의 배양물 10g을 막자사발에 갈아 매스플라스크에 담은 후 증류수로 100 mL까지 채우고 30분간 교반하고, 2시간 정치한 후, 10분간 원심분리(10,000g x 4℃)하여 얻은 상등액을 사용하였다. 카세인 (20mM Tris-HCl 버퍼 내0.7%, pH 8.0)을 기질로 사용한 효소 반응 후 생성된 타이로신(Tyrosin)을 폴린(Folin)법[Park, Thesis Collection of Graduate school Chun-Buk University 4: 101, 1978]으로 측정하였고, 효소 1U(unit)는 분당 1 μmole의 생성물을 유리시키는 효소의 양으로 정하였다. 상기 방법에 의한 결과를 표 1에 나타내었다.
대두박의 수분 함량에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 발효에 의한 단백질분해효소의 역가와 조단백질 함량의 변화
대두박의 초기 수분함량 (중량%) 단백질분해효소 역가
(U/g)		 조단백질 함량
(중량%)
50 3.5 51.4
60 4.5 52.7
70 6.3 56.1
80 8.1 60.53
85 7.9 57.1
표 1에서 확인되는 바와 같이, 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)의 단백질분해효소의 역가와 발효대두박 내의 조단백질의 함량은 대두박의 초기 수분 함량이 높을수록 높게 나타났으며, 초기 수분함량이 70 중량% 이상, 특히 80 중량% 또는 85 중량%인 경우 높은 역가와 조단백질 함량을 나타내는 것으로 확인되었다.
실시예 2: 대두박의 열처리 조건에 따른 바이셀라 코리엔시스 ( Weissella koreensis , KCTC 10400 BP )발효에 의한 항영양인자들의 변화
대두박의 열처리 조건에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)발효에 의한 대두박의 항영양인자로 알려진 트립신억제인자 및 라피노스, 스타키오스 함량을 조사하였다.
본 실시예에서는 대두박을 물에 침지하여 수분함량 80중량%로 조절하고 열처리를 하지 않은 것과, 물에 침지하여 수분 함량을 80중량%로 한 후 60℃, 80℃, 또는 100℃에서 1시간 열처리한 것과, 물에 침지하여 수분 함량을 80중량%로 한 후 121℃, 1.5기압에서 15분간 열처리한 시료를 준비하였다. 상기 얻어진각각의 시료를 실시예 1의 방법에 따라 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)로 발효하여 50℃ 건조기에서 수분함량 8중량%가 될 때까지 건조하였다.
트립신저해인자 역가는 AACC-71-10(American association of cereal chemists, 1995)의 방법에 따라 측정하였고, 라피노스 및 스타키오스는 액상 크로마토그래피 (Liquid chromatography, LC)로 정량하였다(colum:Rezex RNM, detector:Shimadzu RID-6A, mobile phase : water, Temp:75℃). 상기 방법에 의한 결과를 표 2에 나타내었다.
대두박의 열처리 조건에 따른 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)발효에 의한 항영양인자의 변화
구분 트립신억제인자
(TImg/g)		 스타키오스
(중량%)		 라피노스
(중량%)
열처리하지 않은 대두박 3.23 3.51 1.31
열처리하지 않은 대두박 발효 1.31 0.12 0.05
60℃ 처리 후 발효 1.21 0.08 0.04
80℃ 처리 후 발효 0.82 0.04 0.02
100℃ 처리 후 발효 0.42 0.02 0.01
121℃ 처리 후 발효 0.12 0.01 0.01
표 2에 나타낸 바와 같이, 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)를 이용한 대두박 발효 가공에서 대두박을 80~100℃에서 1시간 동안 열처리하거나 121℃에서 15분간 열처리하는 것이 효율적이며, 특히 121℃에서 15분 열처리하여 발효하는 것이 가장 효율적인 것으로 나타났다.
실시예 3: 바이셀라 코리엔시스 ( Weissella koreensis , KCTC 10400 BP )를 이용한 발효대두박 성분 분석
액상발효기에 조단백질 함량이 47중량%를 포함하는 대두박을 30분간 침지하여 수분함량 80중량%로 맞춘 후, 121℃, 1.5기압에서 15분 열처리 한 후 품온이 35℃가 될 때까지 냉각하였다. 여기에 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis, KCTC 10400BP) 균주를 대두박 원료 1kg 당 1g 넣어서 잘 혼합한 후(대두박 1 Kg당 1x107cells), 30℃로 유지하면서 48시간 산소공급 없이 정치배양 하였다.
배양이 완료된 발효대두박을 50℃에서 열풍 건조한 후 분쇄하여 본 실시예에 사용하였다.
상기 바이셀라 코리엔시스를 이용한 발효대두박은 기존의 바실러스균이나 아스퍼질러스균을 이용한 발효대두박 가공 방법에서 가장 문제가 많은 호기적 과정과 냉각에 필요한 과다한 공기의 공급 등이 없어서 생산설비가 단순해지고 설비공간이 매우 적게 필요해서 생산비가 매우 저렴할 뿐만 아니라, 조단백질 함량이 높고 트립신억제인자 함량이 현저히 낮은 이점이 있다.
이를 입증하기 위하여, 상기 얻어진 발효대두박의 조단백질 함량과 트립신억제인자 함량을 각각 상기 실시예 1 및 실시예 2와 동일한 방법으로 측정하고, 그 결과를 기존의 고상발효공법 및 다른 균주를 사용하여 제조된 발효 대두박과 비교하여 아래의 표 3에 나타내었다.
본 발명 발효대두박과 기존 고상 발효 대두박과의 특성비교
구분 조단백질 함량
(중량%)		 트립신억제인자
(TImg/g)
본 발명 발효대두박 60.53 0.12
비교예 1* 57.62 0.82
비교예 2** 54.67 0.89
* 비교예 1: 대두박 내 수분 함량을 40중량%로 하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KCTC1022)를 이용하고 공기를 주입하면서 호기 조건하에서 발효시키는 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 발효대두박
** 비교예 2: 대두박 내 수분 함량을 40중량%로 하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae, KCTC2114)를 이용하고 공기를 주입하면서 호기 조건하에서 발효시키는 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 발효대두박
표 3에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스를 이용하여 얻어진 발효대두박은 기존의 고상발효법(수분함량 40%)에 의하여 바실러스 서브틸리스 균주 또는 아스퍼질러스 오리재 균주와 같이 통상 사용되던 균주를 이용하여 호기 조건하에서 얻어진 발효대두박과 비교하여 조단백질 함량이 현저하게 높은 반면, 트립신억제인자의 함량은 현저하게 낮은 것으로 나타났다.
실시예 4: 바이셀라 코리엔시스 ( Weissella koreensis , KCTC 10400 BP )를 이용한 발효대두박과 기존 고상발효법을 이용한 발효대두박의 조단백함량 및 구조아미노산 함량 비교
본 실시예의 조단백질 함량은 상기 실시예1과 동일한 방법으로 측정하였고, 구성아미노산 분석은 농진청 산하 농업기술실용화 재단에서 L-8500A(HITACHI)를 이용하여 분석을 하였다.
본 발명 발효대두박과 기존 고상발효 대두박과의 조단백질함량 및 구조아미노산 함량 비교 (발효대두박 내 수분 함량 8 중량%로 보정, 단위: 중량%)
　항목 본 발명 발효대두박* 대두박** 비교예 1*** 비교예 2****
　조단백질 60.53　 52.04　 57.62　 54.67　
필수
아미노산		 메티오닌(Met) 0.816　 0.752　 0.817　 0.719　
라이신(Lys) 3.582　 3.230　 3.378　 3.459　
트레오닌(Thr) 2.598　 2.149　 2.442　 2.296　
페닐알라닌(Phe) 2.938　 2.575　 2.821　 2.618　
발린(Val) 2.557　 2.077　 2.309　 2.196　
루신(Leu) 4.954　 4.087　 4.643　 4.388　
이소루신(Iie) 2.528　 2.065　 2.313　 2.178　
총 함량 19.973 16.935 18.723 17.854
어린이
필수
아미노산		 아르기닌(Arg) 4.224　 3.857　 3.962　 3.979　
히스티딘(His) 1.638　 1.499　 1.600　 1.479　
총 함량 5.862 5.356 5.562 5.458
비필수
아미노산		 글리신(Gly) 2.657　 2.179　 2.508　 2.391　
시스테인(Cys) 0.896　 0.772　 0.857　 0.830　
티로신(Tyr) 2.151　 1.813　 2.001　 1.902　
세린(Ser) 3.440　 2.781　 3.190　 3.050　
아스파르트산(Asp) 7.079　 6.037　 6.817　 6.385　
알라닌(Ala) 2.737　 2.196　 2.506　 2.384　
글루탐산(Glu) 11.722　 10.139　 11.474　 10.635　
프롤린(Pro) 3.094　 2.539　 2.974　 2.753　
총 함량 33.776 28.456 32.327 30.33
아미노산 총 함량 59.611 50.747 56.612 53.642
* 본 발명 발효대두박: 실시예 3에서 제조된 발효대두박
** 대두박: 경동시장 구입
*** 비교예 1: 대두박 내 수분 함량을 40중량%로 하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KCTC1022)를 이용하고 공기를 주입하면서 호기 조건하에서 발효시키는 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 발효대두박
**** 비교예 2: 대두박 내 수분 함량을 40중량%로 하고, 아스퍼질러스 오리재(Aspergillus oryzae, KCTC2114)를 이용하고 공기를 주입하면서 호기 조건하에서 발효시키는 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 발효대두박
표 4에서 확인되는 바와 같이, 본 발명의 바이셀라 코리엔시스 (Weissella koreensis, KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박이 조사된 17개의 구조아미노산 모두에서 대두박이나 다른 균주를 이용한 고상발효대두박에 비해 아미노산 함량이 높은 것으로 나타났다. 특히 식물성원료에서 가장 부족한 아미노산인 라이신이나 메티오닌이 높았으며 어린이 필수아미노산인 아르기닌과 히스티딘이 다른 제품들보다 높게 나타났다.
실시예 4: 바이셀라 코리엔시스 ( KCTC 10400 BP )를 이용한 발효대두박의 유리아미노산 및 가수분해화 정도 비교
대두박은 식물성사료원료 중 높은 단백질원료이지만 항영양인자와 함유된 단백질의 소화 흡수성에서 특히 어린 가축의 성장에 부족한 단점도 있다. 이런 단점을 개선하는 방법 중의 하나가 미생물을 이용한 발효를 통해 가수분해된 펩티드 형태로 만들거나 소화가 쉽게 일어나도록 저 분자량의 단백질로 분해를 하는 것이다. 본 발명에 의해 제조된 발효대두박은 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)에서 분비하는 단백질분해효소에 의해 대두단백질이 분해되어있고 있다.
이를 확인하기 위하여, 상기 실시예 3에서 제조된 발효대두박의 유리아미노산 함량을 측정하였다. 유리아미노산은 충남대학교 공동실험실습실 아미노산분석실에서　SYKAM S 7130(Hidachi사)를 이용하여 린하이드린(NINHYDRIN Reaction) 방법(Yu. M. Ostrovskii, M. A. Gvozdeva:1960 Colorimetric estimation of thiamin by the ninhydrin reaction) 을 통해 분석하였다.
유리아미노산 함량의 비교를 통하여, 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박과 일반대두박 및 타사 고상발효제품과의 비교를 하였고, 그 결과를 아래의 표 5에 나타내었다.
본 발명 발효대두박과 기존 고상발효 대두박과의 유리아미노산 함량 비교 (단위: mg/kg)
항목 본 발명 대두박* 대두박** 비교예 1***
메치오닌(Met) 108.39 0.00 47.53
라이신(Lys) 122.63 0.00 391.18
트레오닌(Thr) 99.94 0.00 25.45
페닐알라닌(Phe) 405.62 0.00 278.87
발린(Val) 348.27 38.58 200.12
루신(Leu) 791.62 0.00 78.24
이소루신(Iie) 322.60 0.00 0.00
아르기닌(Arg) 80.67 0.00 36.49
히스티딘(His) 52.91 0.00 47.52
트립토판(Trp) 0.00 0.00 0.00
총함량 2332.65 38.58 1105.4
* 본 발명 발효대두박: 실시예 3에서 제조된 발효대두박
** 대두박: 경동시장 구입
*** 비교예 1: 대두박 내 수분 함량을 40중량%로 하고, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis, KCTC1022)를 이용하고 공기를 주입하면서 호기 조건하에서 발효시키는 것을 제외하고 상기 실시예 3과 동일한 방법으로 얻어진 발효대두박
표 5에서와 같이 본 발명 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 이용한 발효대두박 내의 유리아민노산 함량이 전체적으로 높은 것으로 나타났다.　
단백질전기영동은 SDS-폴리아마이드젤(12.5%)을 이용하여 분자량에 따른 단백질 이동상을 확인하는 방법을 통해　Coomassie Brilliant R250을 이용하여 단백질 염색을 하여 조성물질의 단백질 조성과 분자량을 확인하였다. 전기영동의 결과를 도 2에 나타내었다. 또한 본 발명의 발효대두박은 대두박 또는 다른 균주를 이용한 고상발효법에 의한 발효대두박과 비교하여 크기가 작은 분자 쪽으로 단백질의 밀도가 치우쳐져 있는 것을 확인할 수 있다.
SDS-폴리아미드젤상에서 위의 밴드가 분자량이 큰 단백질이고 아래의 밴드가 분자량이 작은 단백질을 나타낸다. 도 2를 통하여 동일한 단백질량일 때 발효에 의해서 분자량이 큰 단백질이 분자량이 작은 단백질로 변화하게 되는 것을 확인할 수 있다.

Claims (13)

  1. 대두박을 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)로 발효시켜 얻어진 발효대두박.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 대두박은 수분함량이 70 내지 85 중량%인, 발효대두박
  3. 제1항에 있어서,
    상기 대두박은 60 내지 130 ℃에서 5 내지 100분간 열처리한 것인, 발효대두박.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 대두박은 80 내지 100℃에서 50 내지 70분 동안 열처리하거나, 110 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 열처리한 것인, 발효대두박.
  5. 제1항에 있어서,
    조단백질 함량이 57 내지 70 중량%이고,
    스타키오스 함량이 0.08 중량%이하이며, 라피노스 함량이 0.04 중량% 이하이고,
    메티오닌, 라이신, 트레오닌, 페닐알라닌, 발린, 루신, 이소루신, 아르기닌, 히스티딘, 글리신, 시스테인, 티로신, 세린, 아스파르트산, 알라닌, 글루탐산 및 프롤린의 17가지 구조 아미노산 총함량이 57 내지 65중량%이고,
    유리 메티오닌, 유리 라이신, 유리트레오닌, 유리 페닐알라닌, 유리 발린, 유리 루신, 유리 이소루신, 유리 아르기닌, 및 유리 히스티딘의 총 함량이 1500 내지 3000 mg/kg인,
    발효대두박.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발효대두박을 포함하는 사료 조성물.
  7. 제6항에 있어서, 반추동물, 돼지, 조류, 및 어류로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 가축에 적용하기 위한 것인, 사료 조성물.
  8. 1) 대두박을 준비하는 단계;
    2) 상기 대두박에 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 접종하는 단계; 및
    3) 상기 접종된 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)를 배양하여 대두박을 발효시키는 단계
    를 포함하는, 발효대두박 제조 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 단계 1)의 대두박은 수분 함량이 70 내지 85 중량%인 것인, 발효대두박 제조 방법.
  10. 제8항에 있어서,
    단계 2)에서 대두박에 접종되는 바이셀라 코리엔시스 (KCTC 10400BP)의 양은 대두박 1g당 1x102 내지 1x108 cells인,
    발효대두박 제조 방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 단계 3)의 발효 공정은 혐기 조건 하에서 수행되는 것인,
    발효대두박 제조 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 단계 1)과 단계 2) 사이에, 단계 1)에서 준비된 대두박을 60 내지 130 ℃에서 5 내지 100분간 열처리하는 단계를 추가로 포함하는,
    발효대두박 제조 방법.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 열처리는 단계 1에서 준비된 대두박을 80 내지 100℃에서 50 내지 70분 동안 열처리하거나, 110 내지 130℃에서 10 내지 20분 동안 열처리하여 수행하는 것인,
    발효대두박 제조 방법.
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