상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 김치유산균으로서 바이셀라 속 균주의 균체, 및 균체 파쇄액, 및 상기 균체를 포함하는 배양액, 이의 농축액, 및 이의 건조물, 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 항바이러스제에 관한 것이다.
바람직하게는, 상기 바이셀라 속 균주가 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensi), 바이셀라 하니아이(Weissella hanii), 바이셀라 김치아이(Weissella kimchii), 바이셀라 솔리(Weissella soli), 바이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 및 이들의 혼합 유산균으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하이며, 더욱 바람직하게는 바이셀라 코리엔시스(Weissella Koreensis) KCTC 10400BP일 수 있다. 또한 본 발명의 바람직한 항바이러스 효과는 조류 인플루엔자 바이러스이다. 상기 바이셀라 코리엔시스 KCTC10400BP는 특허 0454591 호에 기재된 균주로서, 2002년 12월 10일자로 상기 균주를 한국생명공학연구원 유전자 은행에 기탁하였다(기탁번호: KCTC 10400BP).
본 발명에 따른 항바이러스는 통상의 바이러스의 감염을 억제 및 치료할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 조류 인플루엔자 바이러스이다.
또한, 본 발명은 상기 항바이러스제를 포함하는 음료, 식품 및 기능성 식품; 사료; 및 의약품에 관한 것이다.
이하, 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 본 발명은 김치의 숙성 과정에서 출현하는 김치 유산균, 바람직하게는 김치 유산균 중 우점종인 바이셀라속 균주, 균체를 포함하는 배양액, 배양액 의 농축액, 배양액의 건조물, 균체, 균체파쇄액 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나의 천연 항바이러스제를 제공한다.
상술한 바와 같은 본 발명에 따른 천연 항바이러스제에 있어서, 상기 바이셀라(Weissella)속 김치 유산균이 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis), 바이셀라 하니아이(Weissella hanii), 바이셀라 김치아이(Weissella kimchii), 바이셀라 솔리(Weissella soli), 바이셀라 콘푸사(Weissella confusa) 및 이들의 혼합 유산균으로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것이 바람직하며, 상기 바이셀라(Weissella)속 김치 유산균은 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis)인 것이 더욱 바람직하고, 바이셀라 코리엔시스(Weissella koreensis KCTC 10400BP)인 것이 가장 바람직하다.
본 발명에서는, 무,배추 및 오이 등을 소금에 절인 것 또는 이 절인 것을 고추,마늘,파,생강,젓갈 등의 양념을 버무린 후 젖산 생성에 의해 숙성되어 저온에서 발효된 제품인 김치의 발효 과정에서 출현하는 김치 유산균, 바람직하게는 바이셀라속 균주의 균체 자체가, 인플루엔자 바이러스 및 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 우수한 항바이러스제의 역할을 수행하며, 항바이러스 스펙트럼이 광범위한 다기능성 천연 항바이러스제의 역할을 할 수 있다.
기존의 유산균을 이용한 항바이러스 특허 등은 유산균의 세포가 제외된 배양액, 즉 박테리오신의 효능을 강조하고 있으나, 본 발명에 따르면 세포가 제외된 배양액의 효과보다 균체 자체에 의한 바이러스 감염억제 효과가 크며, 특히 세포파쇄액을 이용해도 효과가 큰 것으로 나타났다. 이는 생균상태가 아닌 사균체 상태로도 항바이러스 효능이 있음을 보여 주는 것으로 향후 여러 제형의 제품으로 개발하는데 유용하고 박테리오신을 이용한 것보다 생산비용이나 생산 수율을 증가시키는데도 산업적인 효율이 높은 장점이 있다.
또한, 본 발명은 상기의 천연 항바이러스제가 포함된 음료, 사료, 식품, 기능성 식품 및 의약품을 제공한다.
본 발명에서 음료란 갈증을 해소하거나 맛을 즐기기 위하여 마시는 것의 총칭을 의미하고 주류, 청량음료, 물, 시럽, 차, 커피, 과실음료 등이 이에 해당되며 유산균 음료를 포함한다. 유산균 음료란 유산균을 배양하여 유산발효시킨 것에 살균수를 가해서 희석하고 당분, 향료 등을 가한 음료를 의미한다. 상기 음료는 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 생균활성제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 본 발명에서 사료란 가축의 생명을 유지하고 젖, 고기, 알, 털가죽 등을 생산하는 데 필요한 유기 또는 무기 영양소를 공급하는 물질을 말한다. 사료는 영양가, 주성분, 유통, 수분함량 배합상태 및 가공형태 등에 따라 여러 가지로 분류할 수 있으며 본 발명의 사료는 조사료, 농후사료, 보충사료, 단백질사료, 녹말사료, 지방질사료, 섬유질사료 등을 포함한다.
본 발명에서 식품이란 영양소를 한 가지 또는 그 이상 함유하고 있는 천연물 또는 가공품을 의미하며, 바람직하게는 어느 정도의 가공 공정을 거쳐 직접 먹을 수 있는 상태가 된 것을 의미하며 그 예로는 과일, 야채, 과일이나 야채의 건조제품이나 절단제품, 과일쥬스, 야채쥬스, 이들의 혼합쥬스 이거나 칩류, 면류, 축산 가공식품, 수산가공식품, 유가공식품, 발효식품, 두류식품, 곡류식품, 미생물발효식품, 제과제빵, 양념류, 육가공류, 산성음료수, 감초류, 허브류 등이 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 식품은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 천연 항바이러스제를 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며, 통상의 식품과 같이 여러 가지 향미제 또는 탄수화물 등을 추가 성분으로 함유할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기의 천연 항바이러스제는 식품류, 음료, 건강음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류의 제조시 원료 물질에 첨가되거나 조리된 식품에 적절히 혼합하는 방법으로 첨가될 수 있으며, 식품학적으로 허용 가능한 식품 보조 첨가제와 함께 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 천연 항바이러스제의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 90 중량 %로 가할 수 있으며, 음료의 경우 100 mL를 기준으로 0.02 내지 20 g, 바람직하게는 0.5 내지 10 g의 비율로 가할 수 있다.
본 발명에서 기능성 식품이란 식품에 물리적, 생화학적, 생물공학적 수법 등을 이용하여 해당 식품의 기능을 특정 목적에 작용, 발현하도록 부가가치를 부여한 식품군이나 식품 조성이 갖는 생체방어리듬조절, 질병방지와 회복 등에 관한 체조절기능을 생체에 대하여 충분히 발현하도록 설계하여 가공한 식품을 의미한다.
본 발명에서 의약품이란 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 의약품의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 생균 활성제의 약학적 투여 형태와 관련하여 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태가 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다. 본 발명의 생균활성제의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 생균활성제는 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식이 예상될 수 있다. 상기 의약품에도 역시 필요에 따라 다양한 보조 생약제, 비타민, 미네랄, 식이섬유 및 기타 의약용, 식품용 보조제(예컨대, 부형제, 증강제, 코팅제 등)등이 함유될 수 있을 것이다.
이하, 실시예를 통하여 상세하게 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 설명하고자하는 예시적인 것일 뿐, 이에 의해 본 발명의 기술적 사상의 범위가 변경되거나 축소되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1: 항 바이러스제의 제조
1-1: 바이셀라 코리엔시스의 배양
김치 유산균을 배양하기 위하여 김치유산균 중에서 바이셀라 코리엔시 스(Weissella Koreensis KCTC 10400BP)를 이용하였다.
1L의 MRS broth(Difco)를 121℃에서 15분간 고압 멸균 후, 상기 바이셀라 코리엔시스(Weissella Koreensis KCTC 10400BP)를 접종하고 30℃에서 24시간 동안 진탕 배양하였다.
1-2:바이셀라 코리엔시스 균체 파쇄액 제조
상기 배양액 중 일부를 5,000 X g로 5분간 원심 분리하여 상등액을 버리고 균체를 취한다. 수확된 균체를 PBS 완충액(Phosphate buffered saline, pH 7.4) 50 ml에 희석한 후, 초음파파쇄기로 균체를 파쇄하고 현미경으로 세포의 파괴를 관찰하였다.
1-3:Cell-free 배양액 제조
위에서 원심분리된 상등액을 10,000 Da membrane을 통과시켜 여과액을 취한 후 다시 1,000 Da membrane으로 농축한 후 다시 pore size 0.22 ㎛ 여과막으로 bacteria-free 상태를 얻었다.
실시예 2: 조류 독감 바이러스의 분리
경기도 광주 인근의 산란계 농장에서 약병원성 조류독감 의심 계군의 분변을 채취하였다. 채취된 분변은 즉시 실험실로 운반하여 멸균된 PBS buffer(pH 7.4)로 현탁한 후에 0.45 ㎛ 여과지로 여과한 후에 다시 0.22 ㎛ 여과지로 여과하여 세균 의 감염을 방지하였다. 이 여과액을 다시 멸균된 PBS 완충액으로 연속 희석한 후 단층 배양된 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK, KCLB 10034) 세포에 감염을 시켰다. 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하면서 70~80% 정도의 세포병변효과(Cytophatic effect, CPE)가 관찰되면, 이를 수확하여 원심분리 (4℃, 10,000rpm, 15 min)하여 상층개과 세포침전물을 분리하였으며, 이 상층액을 -70℃에 보관하였다.
인플루엔자 바이러스의 확인은, 위에서 보관된 상층액에서 RNA를 Viral RNA kit (Qiagen Inc.)를 이용하여 분리한 후에 Real-Time Reverse Transcripase PCR을 이용하여 인플루엔자 바이러스임을 확인하였다. 이에 사용된 PCR 프라이머 서열은 하기 표 1 및 표 2에 나타냈으며, SEQ ID NO: 1 내지 6에 나타냈다. 표 1 및 표 2의 서열번호 3 및 6에 기재된 서열중 5'말단과 3'말단에 연결된 FAM과 TAMRA는 형광을 나타내는 발색염료이다. 상기 PCR은 real time PCR 기계를 사용하여 Primer 2개로 PCR을 수행하면서 probe로 증폭된 PCR 산물을 직접 실시간으로 정량할 수 있는 방법이다.
[표 1]
인플루엔자 A 바이러스의 PCR 프라이머
명칭 |
서열 (5'-3') |
SEQ ID NO |
Primer M+25 |
AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TGG |
1 |
Primer M-124 |
TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG |
2 |
probe M+64 |
FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA-TAMRA |
3 |
[표 2]
Avian H5 바이러스의 PCR 프라이머
명칭 |
서열 (5'-3') |
SEQ ID NO |
PrimerH5+1456 |
ACG TAT GAC TAT CCA CAA TAC TCA G |
4 |
PrimerH5-1685 |
AGA CCA GCT ACC ATG ATT GC |
5 |
probe H5+1637 |
FAM-TCA ACA GTG GCG AGT TCC CTA GCA-TAMRA |
6 |
실시예 3: 바이셀라 코리엔시스의 항 조류독감 효과
인플루엔자 바이러스에 감수성이 높은 Madin-Darby Canine Kidney (MDCK, KCLB 10034) 세포를 한국세포주은행으로부터 분양 받아 사용하였다. 세포배양은 10% 우태아 혈청(fetal bovine serum, FBS)을 포함하는 최소영양배지 (Minimum Essential Medium; GIBCO BRL, USA)를 이용하여 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
플레이트에 단층으로 80%이상 자란 MDCK 세포주에 PBS(pH 7.4)로 10
-3 비율로 희석된 조류 독감 바이러스와 동일한 완충용액으로 희석된 바이셀라 코리엔시스 배양액, 바이셀라 코리엔시스 균체 및 바이셀라 코리엔시스 균체파쇄액을 혼합하여 감염시킨 후 3일간 배양하고 0.6% agarose로 고정화하고 neutral red로 플라크를 염색하여 형성된 플라크를 계수하였다. 그 결과를 표 3에 제시하였다. 억제율은 다음식을 통해 계산하였다. 모든 실험은 triplicate로 실험하였고 평균을 계산하였다.
[표 3]
|
플라크 수(개) |
억제율(%) |
대조군 (바이러스 콘트롤) |
145 |
0.0 |
균체를 포함하지 않는 배양액 |
113 |
22.1 |
균체를 포함한 배양액 |
47 |
67.6 |
균체 파쇄액 |
24 |
83.5 |
균체 자체 |
38 |
73.8 |
표 3에서 보는 바와 같이 바이셀라 코리엔시스가 포함되지 않은 대조군의 경 우 145개의 플라크가 형성된 반면에 바이셀라 코리엔시스가 포함된 배양액, 균체, 혹은 균체파쇄액이 있는 경우 조류독감 바이러스에 대한 매우 강한 항바이러스 활성이 있음을 알 수 있었다.
상기 결과에 의하면, 본 발명에 따른 김치 유산균의 균체 등은 매우 우수한 항바이러스 효과를 가지고 있음을 알 수 있다. 그리고 본 발명에 따른 김치 유산균 배양액의 안정성에 대해서는 실험을 생략 하였으나, 김치는 오랜 기간 동안 인간에 섭취되면서 그 안전성이 입증된 것이므로 별도의 실험이 없어도 본 발명에 김치 유산균 배양액의 안정성은 확보되었다고 할 수 있다.