KR101758578B1

KR101758578B1 - 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 균주, 이를 이용한 발효칡 및 사료 조성물

Info

Publication number: KR101758578B1
Application number: KR1020160173341A
Authority: KR
Inventors: 신영근; 조상범
Original assignee: 신영근
Priority date: 2016-12-19
Filing date: 2016-12-19
Publication date: 2017-07-18

Abstract

본 발명은 칡의 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시켜 가축 사료용으로 사용가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주, 이를 이용한 발효칡 및 사료 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주는 베타 글루 코시다아제 효소활성이 매우 우수하고, 칡에 함유된 아글리콘 계열 이소플라본을 발효전(15.34%) 대비 발효후(56.84%) 약 3.7배 향상시키는 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 MK56 균주를 이용한 칡 발효물은 아글리콘 계열의 이소플라본을 거의 4 배 정도 향상시킬 수 있으므로 여성 호르몬 활성이나 체내 흡수율을 높여 가축 사료로서 충분히 활용될 수 있다.
또한, 본 발명의 칡 발효물은 마늘을 단독으로 사용하는 경우 발생할 수 있는 부정적 효과를 상쇄시키고 오히려 마늘과의 상승 작용을 유도하여 육계 등 가축 성장에 유리한 효과를 제공할 수 있다.

Description

아글리콘 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 균주, 이를 이용한 발효칡 및 사료 조성물{Saccharomyces cerevisiae strain for the improving aglycon isoflavone content, fermented arrowroot and animal feed composition using the same}

본 발명은 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지애 균주, 이를 이용한 발효칡 및 사료 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 칡의 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시켜 가축 사료용으로 사용가능한 사카로마이세스 세레비지애 균주, 이를 이용한 발효칡 및 사료 조성물에 관한 것이다.

콩과류 식물의 섭취는 다양한 내분비계통 암발생을 억제하는 것으로 보고된 바 있다. 콩과류 식물의 생리활성에 관련된 물질로서 이소플라본을 들 수 있다. 아시아에 주거하는 사람들과 같이 콩과류 식물의 섭취량이 많은 사람들은 그렇지 않은 사람들에 비하여 전립선암 및 유방암 발생 빈도가 낮은 것은 콩과류 식물의 섭취가 다양한 암 발생을 억제할 수 있다는 사실을 뒷받침하고 있다(Pesq. Agropec. Bras. Brasilia, 2000, 35:873~878). 콩과류 식물에 존재하는 이소플라본계 화합물들에는 글루코시딕결합으로 이루어진 제니스틴(genistin), 말로닐 제니스틴(malonyl genistin), 다이드진(daidzin), 말로닐 다이드진(malonyl daidzin), 글리시틴(glycitin) 그리고 말로닐 글리시틴(malonyl glycitin). 글루코시딕 결합 이소플라본 외에 아글리콘 형태의 이소플라본 또한 존재하며, 이것들에는 다이드제인(daidzein), 글리시테인(glycitein) 그리고 제니스테인(genistein)등이 포함된다. 그러나 아글리콘 형태의 화합물들은 자연상태에서 존재하기 보다는 글루코사이드 이소플라본류 화합물들을 기질로하여 효소에 의하여 변형된 것으로 알려져 있다. 즉 자연계에는 아글리콘 형태보다는 글루코사이드 형태의 이소플라본류 화합물이 더 풍부하게 존재한다.

콩과류 식물의 섭취 효과는 이소플라본류 화합물의 생리적 기능에서 기인한다고 할 수 있다. 특히 이들 화합물들이 생체내에서 여성호르몬과 유사한 기능을 수행하여 다양한 건강 증진 효과를 나타내게 된다. 그리고 이소플라본류 화합물 들 중에서 글루코사이드 계열 화합물 보다는 아글리콘 계열 화합물의 효과가 더욱 우수한 것으로 알려져 있다. 글루코사이드와 아글리콘 계열 화합물들의 여성호르몬 유사 활성을 조사한 연구에서 아글리콘 계열 화합물이 글루코사이드 계열 화합물들 보다 매우 높은 수준으로 우수한 것으로 나타난바 있다. 실제로 17-베타 에스트라디올을 표준물질로하여 여성호르몬 활성을 비교할 경우, 아글리콘 계열의 다이드제인은 표준물질 대비 약 99%의 활성을 나타낸 것에 비하여 글루코사이드 계열인 다이드진은 표준물질 대비 17% 수준인 것으로 나타났다. 또한 제니스테인과 제니스틴의 경우 각각 172% 및 85%로 보고됨으로서 아글리콘 계열의 이소플라본의 우수성이 입증된 바 있다(한국식품영양과학회지, 2004, 33:16~21). 여성호르몬 활성 외에도 아글리콘 계열의 이소플라본 화합물들이 글루코사이드 계열의 것들에 비하여 체내 흡수율이 높아서 그 이용성 측면에서 더욱 우수하다고 보고된 바 있다(Food chemistry, 2009, 115:1247~1252).

글루코사이드 계열 이소플라본의 아글리콘 계열 화합물로의 전환에는 대두나 칡을 이용하는 방법이 개시되어 있다.

한국 공개 10-2015-0079234호에는 대두를 추출하여 유산균으로 접종하고, 이를 침전시켜 메타아크릴레이트 수지로 흡착하는 방법을 포함하는 고순도 이소플라본 아글리콘 제조방법을 개시하고 있다.

한국공개 10-2008-0102773호에는 배당체 이소플라본을 비배당체 형태로 전환하여 이소플라본의 체내 흡수를 촉진하는 항산화 및 내산성을 갖는 락토바실러스 플란타럼이 개시되어 있다.

한국등록 10-1416752호에는 아글리콘 이소플라본 함량을 향상시킬 수 있는 신규한 락토바실러스 플란타룸 균주와 이를 이용한 발효 칡 함유 사료첨가용 조성물이 개시된다.

이들 특허들은 유산균을 이용하여 대두나 칡의 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시키고 있는데, 유산균 이외의 균주를 이용하여 보다 효율적으로 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시킨 칡 발효물을 제조 방법이 요청된다. 또한, 아글리콘 이소플라본을 다량 함유한 칡 발효물을 우수한 효능을 가진 가축 사료로 활용할 수 있는 방법이 요구된다.

본 발명은 칡의 아글리콘 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있는 효모 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명은 상기 효모를 이용한 칡 발효물과 마늘을 포함한 사료 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 하나의 양상은 칡에 포함된 아글리콘 형태의 이소플라본 함량을 증가시킬 수 있는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)에 관계한다.

본 발명의 다른 양상은 상기 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유하는 아글리콘 형태의 이소플라본 함량 증가용 조성물에 관계한다.

본 발명의 또 다른 양상은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)를 칡에 접종하여 발효시킨 칡 발효물에 관계한다.

본 발명의 다른 양상은 칡을 열수 추출하는 단계, 추출액에 상기 MK56 균주를 접종하는 발효시키는 단계 및 숙성과 건조 단계를 포함하는 칡 발효물 제조방법에 관련된다.

본 발명의 또 다른 양상은 칡 발효물과 마늘을 포함하는 사료 조성물에 관련된다.

본 발명의 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주는 베타 글루 코시다아제 효소활성이 매우 우수하고, 칡에 함유된 아글리콘 계열 이소플라본을 발효전(15.34%) 대비 발효후(56.84%) 약 3.7배 향상시키는 생물 전환 활성을 나타내었다. 따라서, 본 발명의 MK56 균주를 이용한 칡 발효물은 생리활성이 우수한 아글리콘 계열의 이소플라본을 3.7 배 정도 향상시킬 수 있어 가축 사료 첨가제로 적용할 경우, 가축의 생산성 향상에 큰 기여를 할 것이다.

또한, 본 발명의 균주를 활용하여 발효한 칡과 마늘을 혼합하는 조성물을 구성하여 각 유효물질들의 활성을 향상시키는 상승효과를 제공할 수 있으며, 이러한 상승효과는 육계 등 가축 생산성을 향상시키는 효과를 제공할 수 있다.

도 1은 선발된 효모균주들의 유전자 염기서열을 이용한 분자생물학적 분류계통도이다.
도 2는 선발된 효모 균주들간의 분류계통학적 비교 결과이다.
도 3은 선발균주들의 칡 이소플라본 생물전환효율(bioconversion ratio)을 비교한 것이다.
도 4는 MK56 균주의 23S rRNA 유전자 염기서열이다.
도5는 첨가제가 육계 출하 체중에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과를 보여준다.
도 6은 사료 첨가제가 육계 일당증체량에 미치는 영향에 대한 메타분석결과이다.
도 7은 사료 첨가제가 육계 사료섭취량에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과이다.
도 8은 사료 첨가제가 육계 사료전환율에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과이다.

본 발명자들은 먼저 본 발명은 베타글루코시다아제 활성이 우수한 균주를 확보하기 위하여 우리나라 전통 막걸리 찌게미로부터 효소활성이 우수한 균주를 조사하였다.

후보 균주들을 선발한 후에 칡을 포함하는 배지에서 발효과정을 진행 시키고, 아글리콘 계열 이소플라본 함량을 조사하여, 이소플라본의 전환효율이 우수한 효모를 최종적으로 선발하여 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주로 동정 및 명명하였다.

상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주를 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다(KACC93257P).

개발된 균주를 이용하여 칡을 발효시킨 후에 마늘과 혼합하여 육계 사료에 급여한 후에 체중변화, 폐사율, 생산성 지수, 장내 유해균 변화에 대한 효과를 조사하였고, 그 결과 사료효율이 개선되는 효과를 얻을 수 있었다.

본 발명의 조성물은 상기 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주 또는 이의 배양액을 유효성분으로 함유한 아글리콘 형태의 이소플라본 함량 증가용 조성물이다.

상기 조성물에는 사료로 첨가 가능한 물질(예를 들면, 곡물류, 조강류, 식물성 유박류)들을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 칡 발효물(또는 발효칡)은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)를 칡에 접종하여 발효시킨 발효물질로서 대두박 등 첨가제를 포함할 수 있다. 상기 칡 발효물은 슬러리 상태일 수 있고, 이를 건조 및 분쇄한 분말형태 일 수 있다.

본 발명의 칡 발효물의 제조방법은 추출단계, 접종과 발효단계 및 숙성과 건조 단계를 포함할 수 있다.

상기 추출단계는 칡을 물에 넣어 90~100℃ 정도의 온도로 가열하여 추출액을 제조하는 열수 추출 단계이다.

상기 방법은 상기 추출단계에서 제조된 추출액을 발효기로 옮긴 후 살균과정을 수행할 수 있다.

상기 접종과 발효단계는 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)를 1~5%(v/v) 비율로 상기 추출액에 접종하고 약 30도에서 하루 정도 발효시키는 단계이다.

숙성 및 건조 단계는, 예를 들면, 30℃에서 하루 정도 숙성시킨 다음, 온도를 40~50℃로 상승시켜 1일 정도 숙성과 건조를 진행할 수 있다.

상기 발효 단계 이후에 발효액에 대두박을 (발효액 : 대두박) 1 : 0.5~1.5 의 비율로 혼합하고, 이를 숙성 및 건조시킬 수 있다.

상기 칡 발효물은 칡 추출물에 대두박 등 첨가제를 혼합하여 분말화한 것일수 있다. 상기 칡발효물에는 수분이 10% 이내로 포함될 수 있다. 칡발효물에는 상기 칡 추출물이 50 중량% 이내, 바람직하게는 30~50 중량% 함유될 수 있다.

상기 방법은 칡 열수 추출액에 상기 효모균(MK 56)을 접종시켜 칡 발효물을 제조하는 방법이다. 상기 방법은 칡 분말에 상기 효모균을 접종하여 배양하는 고체 배양 공정에 비해 총 이소플라본 함량뿐만 아니라 아글리콘 함량이 수배 이상 향상될 수 있다, 고체 발효(고체 배양)시에는 칡 뿌리에 함유되어 있는 섬유상 물질이 상당량 잔존하지만, 열수 추출을 거치면 섬유상 물질이 대부분 제거되기 때문에 발효 효율이 매우 높게 나타난다.

본 발명은 상기 칡 발효물을 포함하는 사료 조성물일 수 있다.

상기 사료 조성물에는 사료용으로 사용가능한 첨가물질(후술하는 사료원료일 수 있음)이 추가로 포함될 수 있다.

상기 사료 조성물은 포유류, 조류, 파충류, 양서류, 어류 등의 동물, 바람직하게는 포유류에 대한 사료로서 사용된다. 예를 들면, 본 발명의 사료는 개, 고양이, 쥐 등의 애완 동물용 사료, 소, 돼지 등의 가축용 사료, 닭, 칠면조 등의 가금용 사료, 도미, 방어 등의 양식어용 사료 등으로서 사용되고, 바람직하게는 애완 동물용 사료 또는 가축용 사료로서 사용된다.

본 발명의 사료 조성물은 사료 원료에 상기 칡 발효물을 적절하게 배합하여 만들 수 있다. 사료 원료로서는 곡물류, 조강류, 식물성 유박류, 동물성 사료 원료, 기타 사료 원료, 정제품 등을 들 수 있다.

곡물류로서는, 예를 들면 마이로, 밀, 보리, 귀리, 호밀, 현미, 메밀, 조, 수수, 피, 옥수수, 대두 등을 들 수 있다.

조강류로서는, 예를 들면 쌀겨, 탈지 쌀겨, 밀기울, 말분, 밀, 배아, 보리겨, 스크리닝, 펠렛, 옥수수겨, 옥수 배아 등을 들 수 있다.

식물성 유박류로서는, 예를 들면 대두박, 콩가루, 아마박, 면실박, 낙화생 박, 홍화박, 야자박, 팜박, 호마박, 해바라기박, 유채박, 케이폭박, 겨자박 등을 들 수 있다.

동물성 사료 원료로서는, 예들 들면 어분(북양 밀, 수입 밀, 홀 밀, 연안 밀), 피쉬솔불, 육분, 어골분, 혈분, 분해모, 골분, 가축용 처리 부산물, 페더 밀, 누에, 탈지 분유, 카제인, 건조 유장 등을 들 수 있다.

그 밖의 사료 원료로서는 식물 경엽류(알팔파, 헤이큐브, 알팔파잎 분말, 유사 아카시아 분말 등), 옥수수 가공공업부산물(콘 글루텐, 밀, 콘 글루텐 피드, 콘스테이프리카 등), 전분 가공품, 설탕, 발효 공업 산물(효모, 맥주박, 맥아근,알코올박, 장유박 등), 농산 제조 부산물(감귤 가공박, 두부박, 커피박, 코코아박 등), 그 외(카사바, 잠두콩, 구아밀, 해조, 크릴, 스피룰리나, 클로렐라, 광물 등) 등을 들 수 있다.

정제품으로서는 단백질(카제인, 알부민 등), 아미노산, 당질(전분, 셀룰로오스, 슈크로우스, 글루코오스 등), 미네랄,비타민 등을 들 수 있다.

본 발명의 사료 조성물은 상기 칡 발효물에 알리신 첨가제를 포함한다.

상기 알리신 첨가제는 알리신 등 마늘의 유효성분인 알리신을 함유하고 있는 마늘 추출물이나 마늘 제품일 수 있으며, 마늘을 분쇄한 것일 수 있다. 상기 알리신 첨가제로서 출원인이 생산하는 알리콤(제품명임, 알리신 함유량 0.5~2중량%)을 사용할 수 있다.

알리신 첨가제를 사료 조성물로 공급하는 경우, 적정 급여량이 전체 사료조성물 대비 약 0.05중량%이며, 상기 양을 초과하여 공급하는 경우 오히려 육계 성장에 부정적인 미쳤다.

하지만, 본원발명의 칡 발효물을 알리신 첨가제와 함께 사료 조성물에 넣어주는 경우, 마늘의 급여량 증가로 인한 부정적 효과를 상쇄시키고 육계 성장에 긍적적인 영향을 줄 수 있다.

상기 알리신 첨가제와 칡 발효물의 중량비가 0.2~0.9 : 0.8~0.1, 바람직하게는 0.5~0.8 : 0.5~0.2일 수 있고, 가장 바람직하게는 0.8:0.2일수 있다. 여기서, 알리신 성분은 마늘추출물에 0.5~2중량%, 바람직하게는 1중량% 내외 함유될 수 있으며, 상기 칡 발효물은 칡추출물을 30~50중량% 함유한다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미생물 분리 및 균주 동정

1. 시험방법

1) 분리원의 준비

경상북도 상주시에 위치한 은자골 탁백기 제조사에서 발생한 막걸리 찌게미를 분리원으로 사용하였다.

2) 베타글루코시다아제 활성 균주의 선발

베타글루코시다아제 활성 균주는 MUG (4-methylumbelliferyl-베타-D-Glucopyranoside)를 기질로하여 형광색을 나타내는 균주 집락을 선별하는 방법을 사용하였다(World Journal of Microbiology and Biotechnology 2004,20:633-637).

3) 선발균주의 효소활성 평가

선발된 MUG+ 균주들은 다시 MRS 액상 배지에서 24시간동안 배양한 후에, 배양액내 효소활성을 평가하였다. 효소활성의 평가는 Riou 등 (1998, Applied and Environmental Microbiology 64, 3607-3614)의 방법에 따라서 진행하였다.

4) 세균(유산균)과 효모의 분리

세균과 효모는 평판 배지에서 형셩된 콜로니들을 희석하여 광학현미경으로 관찰하여 형태학적 특징으로 세균과 효모를 분리하였다. 효모의 경우, 출하 또는 출하흔이 세표 표면에 남아 있어 이러한 특징을 기준으로 분리하였다.

5) 선발균주의 동정

선발 효모의 동정은 26S rRNA 유전자 염기서열을 분석하여 수행하였다. 유전자 염기서열을 분석한 후에 표준균주 (type strain)와 유전자 염기서열 비교를 수행하고, 가장 유사성이 높은 균주를 기준으로 명명하였다. 염기서열 비교분석은 MEGA4 프로그램을 이용하여 수행하였다.

2. 시험결과

1) 균주 선발

베타글루코시다아제 활성과 형태학적 분류 기준을 통하여 총 6개의 효모 균주를 선발하였고, 유전자 분석을 수행하였다. 그 결과 도면 1에서 보는 것과 같이 선발된 균주들이 모두 Saccharomyces cerevisiae 에 속하는 것으로 확인되었다.

2) 선발균주들의 분류학적 비교

선발된 총 6종의 효모들의 유전자 염기서열을 기준으로 분자생물학적 분류계통을 조사한 결과 MK40과 MK54가 서로 유사한 것으로 나타났다(도 2). 또한 MK44와 MK48균주가 서로 유사한 것으로 나타났다. 그리고 나머지 MK47, MK50 및 MK56 균주는 상호 계통학적 거리가 먼 것으로 나타났다.

실시예 2 : 칡 이소플라본 전환율을 이용한 최종 균주의 선발

본 실시예는 선발된 효모균주들 중에서 실제 칡 이소플라본의 생물전환효율이 우수한 균주를 선발하기 위한 목적으로 수행되었다.

1. 시험방법

(1) 종균의 준비

선발 균주 스톡의 얼음조각을 무균적으로 MRS 평판배지에 옮기어 streaking 하였고, 30℃ 항온기에서 2일 동안 배양하여 revive를 수행하였다. 배양후 평판배지에 형성된 콜로니하나를 MRS 액상배지 10 mL에 옮기어 30℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 교반속도로 24시간동안 배양하였다. 배양이 완료된 액상배지 0.5 mL를 다시 50 mL의 MRS 액상배지가 담긴 250 mL 용량의 삼각플라스크 접종한 후에 30℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 교반속도로 24시간동안 배양하여 종균을 준비하였다.

(2) 칡 함유 배지의 준비

칡 이소플라본의 생물전환 효율을 분석하기 위한 배지는 다음과 같이 준비하였다. 건조 및 분쇄된 칡 분말 10 g을 MRS 배지 90 mL와 혼합하여 배지를 준비하였다.

(3) 배양

준비된 종균 1 mL를 준비된 천연식물함유 배지에 1% (v/v)의 비율로 접종한 후에 30℃ 진탕배양기에서 150 rpm의 교반속도로 24시간동안 배양하였다.

(4) 이소플라본 분석을 위한 전처리

배양이 완료된 천연식물 함유 배지를 60℃ 건조기에서 24시간 동안 건조하였다. 건조가 완료된 배양액을 막자사발로 옮기어 곱게 분쇄한 후에 건조 중량 10배에 해당하는 99.9% methanol과 혼합하여 150 rpm의 속도로 2시간 동안 추출하였다. 추출이 완료된 후에 여과지(Whatman No 1)를 이용하여 추출액을 여과하였다. 그 후 감압농축기를 이용하여 농축한 후에 최종적으로 다시 99.9% methanol에 용해시켰고, HPLC 분석을 위하여 syringe filter로 여과하였다.

(5) 이소플라본 분석

전처리가 완료된 추출액은 HPLC를 이용하여 daidzin, genistin, daidzein 및 genistein함량을 분석하였다. 이소플라본 분석조건은 다음과 같다: 이동상조건 0.1% acetic acid in water (A), 0.1% acetic acid in acetonitrile (B) in gradient (Linear gradient profile: 15 to 35% B in 50 min), 이동상 유속 1.0 mL/min, 검출기 파장 254nm.

2. 시험결과

선발 균주들을 이용하여 칡을 발효시킨 후에 글루코사이드와 아글리콘을 비교 분석한 결과는 도면 3과 같다. 일반적으로 발효하지 않은 칡의 경우 글루코사이드 함량이 약 85%이고 아글리콘 함량인 15% 수준이데 반하여, 선발된 균주들은 모두 아글리콘의 함량을 향상시켜 생물전환이 효율적으로 일어나고 있음을 확인하였다(도면 3A). 특히 선발균주 MK56의 경우, 다른 균주들에 비하여 탁월하게 높은 아글리콘 함량을 나타내었다(도면 3A). 생성된 글루코사이드와 아글리콘 함량을 기준으로 전환율을 산출한 결과, MK56균주가 다른 균주들에 비하여 월등하게 높게 나타났다(도면3B). 좀 더 자세히 살펴보면, MK 56 균주를 이용하여 발효한 칡에 함유된 이소플라본을 분석한 결과, 글루코사이드 계열이 약 43.16% 그리고 아글리콘 계열이 약 56.84%로, 발효전에 비하여 약 3.7배 이상의 생물전환이 나타났다. 이에 최종적으로 MK56균주를 선발하였다. 선발된 Saccharomyces cerevisiae MK56균주(KACC 93257P)의 유전자 염기서열은 도면 4에서 보는 것과 같다.

실시예 3 : MK 56 균주를 이용한 발효칡 제조

1) 칡의 열수 추출

칡 20kg을 물 200L에 침지시킨 후 3일 동안 100도의 온도로 가열하여 추출액을 제조하였다. 칡을 타공망에 넣고 추출액에 침지시키고, 스킴을 이용하여 물의 온도를 100도까지 상승시킨 후 보온을 유지한 후 추출을 개시하였다. 추출은 3일 동안 진행하였다. 추출액을 발효기로 이송한 후 살균하였다.

2) 칡발효

선발된 효모균(MK56)을 1%(v/v)의 비율로 접종하고 배양온도는 30도로 유지하였으며, 80rpm의 온도로 교반하여 24시간 동안 발효하였다.

3) MK56으로 발효한 칡함유 첨가제 제조

발효가 완료된 후에는 발효칡 추출물과 대두박을 1:1의 중량비율로 혼합하였다. 혼합이 완료된 후에 30℃에서 1일간 숙성한 후에 온도를 40 ~ 50℃로 상승시켜 1일간 숙성과 건조를 진행하였다. 건조가 완료된 후에는 발효칡 함유 첨가제(수분함량 10% 이내)를 분쇄하였다.

실시예 4 : 육계사양시험

1.시험방법

본 실시예는 경상북도 상주시 청리면에 소재한 육계사육 농가에서 3회에 걸처 진행하였다.

1) 실험동물

충북 청주시 상당구 미원면 소재 D부화장에서 구입한 부화 1일령의 무감별 육계 Hubbard 품종을 시험동물로 사용하였다.

2) 사양관리

사양시험은 540㎡(12m × 45m) 면적의 실험계사에서 수행되었다. 온도는 처음 1주간은 33± 1℃로 한 뒤 매주 2℃씩 감소시켜 시험 종료 마지막 주에는 23± 1℃가 유지되도록 하였으며, 습도는 입추시 70%로 하였고, 이후에는 50%로 사육환경을 유지하였다. 또한 신선한 산소 공급을 위하여 적정한 환기 상태를 유지하였다. 점등은 전 기간 24시간 점등하였다.

3) 시험사료

본 실험에서는 실험 사료로 시판중인 옥수수와 대두박 위주의 크럼블 형태인 육계 초이사료(ME 3,096 kcal/kg, CP 23.00%, Ca 1.0%), 펠렛 형태의 육계 전기사료(ME 3,135 kcal/kg, CP 20.50%, Ca 0.95%)와 육계 후기 사료(ME 3,164 kcal/kg, CP 19.50%, Ca 0.90%)를 사용하였고, 각각 1주, 1주, 2주간 급여하였다.

4) 실험설계

표 1과 같이 총 11개의 처리구를 대조구와 비교하여 평가하였다. 총 3회의 사양시험을 수행하였다. 제 1회차 사양시험에서는 발효하지 않은 칡과 대조구를 비교하였다. 제 2회차 사양시험에서는 대조구(아무런 첨가제도 급여하지 않은 시험구)와 본 발명에서 분리한 신규한 균주 MK56을 이용하여 발효시킨 칡을 포함하는 첨가제(실시예 3에 의한 분말)를 사료에 각각 0.05%(w/w), 0.1%(w/w) 그리고 0.2%(w/w) 첨가한 처리구 3개로 구성하였다. 제 3회차 사양시험에서는 알리신을 함유하는 첨가제, 제1회차 사양시험에서 사용한 MK 56 발효칡 함유 첨가제 그리고 알리신과 MK56 발효칡을 혼합한 첨가가제를 대조구와 비교하였다.

알리신 함유 첨가제로 알리콤을 사용함. 알리콤은 MK 생명공학에서 제조하는 마늘 알리신 사료 제품으로서, 알리신 함량은 전체 알리콤 중량대비 1% 내외이고, MK56으로 발효한 칡함유 첨가제는 상기 실시예 3에서 제조한 칡 발효물(칡추출물과 대두박 1: 1 혼합)을 사용하였다.

5) 통계분석

본 실시예는 서로 다른 시간에 수행된 3개의 사양시험에서 얻어진 결과를 상호 비교하였다. 서로 다른 시간에 수행된 연구의 경우, 동일 조건에 수행된 시험이라고 볼 수 없다. 따라서 각각의 결과를 상호비교하기 위해서는 표준화 과정이 필요하다. 본 비교예에서는 상호간의 비교를 위하여 메타분석에서 사용되는 표준화평균차(standardized mean difference) 분석방법을 사용하였다. 표준화평균차이는 처리구의 평균에서 대조구의 평균값을 빼는 방식으로 진행된다. 따라서 결과값이 처리구가 대조구 보다 클 경우에는 양의 평균차이 값을 나타내게 된다. 반대로 처리구의 결과값이 대조구에 비하여 작을 경우에는 음의 평균차이 값을 나타내게 된다. 표준화평균차이 분석과 forest plot 비교에 관한 작업은 R program을 사용하여 수행하였다.

2. 시험결과

1) 출하체중

육계의 출하체중은 농가 수익과 직결되는 요인이다. 출하시 체중은 클수록 농가에 도움이 된다. 3 회에 걸친 사양시험 결과를 종합한 결과는 표 2와 도 5에서 보는 것과 같다. 표준화 평균차이값이 양의 값을 나타내는 것이 우수한 출하시 체중을 의미하며, 효과의 크기(표준화 평균차)가 가장 큰 값은 알리신 함유 첨가제와 MK56 발효칡 첨가제를 0.8:0.2의 비율로 혼합하여 사료에 0.1% 첨가 급여한 처리구에서 가장 크게 나타났다. 표 2는 첨가제가 육계 출하 체중(kg)에 미치는 영향을 나타내고, 도 5는 첨가제가 육계 출하 체중에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과를 보여준다.

¹ 표준화 평균차이(standardized mean difference) = (처리구 평균 대조구 평균)/표준화된 표준편차

² 평균±표준편차

2) 일당증체량

일당 증체량은 육계가 출하시까지 증체하는 과정을 나타낸다. 3 회에 걸친 사양시험 결과를 종합한 결과는 표 3와 도 2에서 보는 것과 같다. 표준화 평균차이값이 양의 값을 나타내는 것이 우수한 일당 증체량을 의미하며, 효과의 크기(표준화 평균차)가 가장 큰 값은 알리신 첨가제와 MK56 발효칡 첨가제를 0.8:0.2의 비율로 혼합하여 사료에 0.1% 첨가 급여한 처리구에서 가장 크게 나타났다. 표 3은 사료첨가제가 육계 일당증체량(kg/d)에 미치는 영향을 나타내고, 도 6은 사료 첨가제가 육계 일당증체량에 미치는 영향에 대한 메타분석결과이다.

² 평균±표준편차

3) 사료섭취량

사양시험을 통하여 얻어진 사료섭취량 결과는 표 4와 도 3에서 보는 것과 같다. 표준화 평균차이 값에서 가장 낮은 값은 칡분말 0.2% 급여 시험구에서 나타났고, 가장 높은 값은 알리신 첨가제와 MK 56 발효칡을 0.2:0.8의 비율로 혼합한 시험구에서 높게 나타났다. 표 4는 사료첨가제가 육계 사료섭취량(g)에 미치는 영향을 나타내고, 도 7은 사료 첨가제가 육계 사료섭취량에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과이다.

² 평균±표준편차

4) 사료전환율

사료전환율은 섭취한 사료가 증체로 전환된 효율을 의미한다. 따라서 사료전환율이 높을수록, 섭취한 사료가 증체에 효과가 우수한 것으로 판단할 수 있고, 표준화 평균차이 값이 양의 값을 갖으며 클수록 우수한 효과라고 할 수 있다. 본 시험에서는 알리신 첨기제와 MK56 발효칡 첨가제를 0.8:0.2의 비율로 혼합하여 사료에 0.1% 첨가 급여한 처리구에서 가장 크게 나타났다. 표 5는 사료첨가제가 육계 사료 전환율(출하체중/섭취사료량)에 미치는 영향을 나타내고, 도 8은 사료 첨가제가 육계 사료전환율에 미치는 영향에 대한 메타분석 결과이다.

² 평균±표준편차

일련의 시험결과을 통하여 알리신 첨가제(알리콤)와 칡 발효물의 혼합물이 육계 성장에 큰 도움을 주는 것을 확인할 수 있었다.

알리신 첨가제 단독 급여구들의 결과를 통하여 적정 급여량은 0.05% 수준임을 알 수 있었으며, 그 이상을 급여할 경우, 오히려 사양성적이 부정적인 효과를 미칠 수 있음을 확인할 수 있었다. MK 56 발효칡의 경우에도 첨가량이 0.05% 인 경우에 육계 일당증체량에 미치는 영향이 칡 분말에 비해 상대적으로 높았으나 함량이 증가할수록 효과가 반감되는 경향을 보였다. 다만, 알리신 첨가제의 급여량 증가로 인한 부정적인 효과는 본 발명의 발효칡을 혼합함으로서 효과적으로 상쇄될 수 있음을 알 수 있었다.

본 명세서와 도면에 개시된 본 발명의 실시 예들은 본 발명의 기술 내용을 쉽게 설명하고 본 발명의 이해를 돕기 위해 특정 예를 제시한 것뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하고자 하는 것은 아니다. 여기에 개시된 실시예들 이외에도 본 발명의 기술적 사상에 바탕을 둔 다른 변형 예들이 실시 가능하다는 것은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 자명한 것이다.

농업생명공학연구원

KACC93257

20160721

<110> SHIN, Young Keun <120> Saccharomyces cerevisiae strain for the improving aglycon isoflavone content, fermented arrowroot and animal feed composition using the same <130> 2016-MK-01 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 596 <212> DNA <213> Saccharomyces cerevisiae <400> 1 aaagcggagg aaaagaaacc aaccgggatt gccttagtaa cggcgagtga agcggcaaaa 60 gctcaaattt gaaatctggt accttcggtg cccgagttgt aatttggaga gggcaacttt 120 ggggccgttc cttgtctatg ttccttggaa caggacgtca tagagggtga gaatcccgtg 180 tggcgaggag tgcggttctt tgtaaagtgc cttcgaagag tcgagttgtt tgggaatgca 240 gctctaagtg ggtggtaaat tccatctaaa gctaaatatt ggcgagagac cgatagcgaa 300 caagtacagt gatggaaaga tgaaaagaac tttgaaaaga gagtgaaaaa gtacgtgaaa 360 ttgttgaaag ggaagggcat ttgatcagac atggtgtttt gtgccctctg ctccttgtgg 420 gtaggggaat ctcgcatttc actgggccag catcagtttt ggtggcagga taaatccata 480 ggaatgtagc ttgcctcggt aagtattata gcctgtggga atactgccag ctgggactga 540 ggactgcgac gtaagtcaag gatgctggca taatggttat atgccgcccg tcttga 596

Claims

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칡을 물에 넣어 90~100℃ 정도의 온도로 가열하여 추출액을 제조하는 단계 ;
사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)를 상기 추출액에 접종하여 발효시키는 단계 ;
발효 단계를 거친 상기 추출액에 대두박을 1; 0.5~1.5의 비율로 혼합한 후 30~50℃로 숙성시킨 후 건조시켜 칡 발효물을 제조하는 단계 ;
알리신 첨가제와 상기 칡 발효물을 사료원료에 넣어 혼합하는 단계를 포함하되, 상기 알리신 첨가제와 상기 칡 발효물은 0.5~0.8 : 0.5~0.2 중량비로 혼합되고, 상기 알리신 첨가제는 알리신을 0.5~2중량% 함유하는 것을 특징으로 하는 사료 제조방법.
제 4항에 있어서, 상기 혼합단계는 알리신 첨가제와 상기 칡 발효물을 0.8 : 0.2의 중량비로 혼합하여 전체 사료 중량 대비 0.1중량%로 첨가하는 것을 특징으로 하는 사료 제조방법.
칡 발효물 및 알리신 첨가제를 포함하는 사료 조성물로서,
상기 칡 발효물은 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) MK56 균주(기탁번호 KACC 93257P)를 칡에 접종하여 발효한 것이고,
알리신 첨가제는 알리신을 0.5~2중량% 함유한 마늘 추출물이나 마늘 제품이고,
상기 알리신 첨가제와 상기 칡 발효물은 0.5~0.8 : 0.2~0.5 중량비율로 혼합되어 사료 조성물에 0.1중량%로 첨가된 것을 특징으로 하는 사료 조성물.