ES2312948T3 - Biomasa enriquecida con selenio, procedimiento para su preparacion y productos probioticos y nutraceuticos que contienen dicha biomasa.-. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento de preparar una biomasa enriquecida con selenio que tiene un contenido en selenio de al menos 0,7 mg/gp.s., caracterizada porque dicha biomasa se obtiene (i) cultivando microorganismos que se seleccionan a partir del grupo que consiste en Lactobacillus reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus buchneri/parabuchneri y sus combinaciones en un medio de cultivo con nutrientes que comprende una sal de selenio, de tal forma que dichos microorganismos acumulen selenio; y (ii) separando los microorganismos enriquecidos con selenio del medio de cultivo.
Description
Biomasa enriquecida con selenio, procedimiento
para su preparación y productos probióticos y nutracéuticos que
contienen dicha biomasa.
La presente invención se refiere a una biomasa
enriquecida con selenio, un procedimiento para prepararla, y
productos probióticos y nutracéuticos que contienen dicha biomasa.
La invención además se refiere a nuevas cepas de microorganismos
que pertenecen al género Lactobacillus adecuadas para usar en
el procedimiento de la invención.
El selenio es un elemento esencial tanto para
animales y como para los seres humanos, dado que está incluido,
principalmente en forma de selenocisteína, en la composición de
enzimas importantes tales como glutationa peroxidasa y
5'-yodotirosina desyodinasa de tipo I. La primera
enzima cataliza la reducción de los hidroperóxidos evitando la
degeneración celular y la formación de radicales hidroxilo; la
segunda convierte tiroxina en triyodotironina, la hormona activa
que es esencial para el metabolismo de las hormonas tiroideas.
Se ha observado que los estados graves de
deficiencia de selenio en los seres humanos se correlacionan con un
mayor riesgo de patologías tales como cáncer, enfermedades
cardiovasculares, hipertensión, apoplejía y enfermedades renales y
hepáticas. Estas afecciones por la deficiencia, sin embargo, pueden
corregirse con una dieta rica en selenio o mediante la
administración de selenio en forma inorgánica u orgánica, por
ejemplo mediante suplementos alimentarios. La administración de
selenio también ha demostrado ser eficaz para contrarrestar los
procesos de degeneración celular y de formación de radicales
libres.
La utilización de selenatos o selenitos por el
cuerpo humano se produce mediante procesos de reducción con
formación de selenuros, que después se incorporan a aminoácidos no
convencionales, en particular Se-metionina y
Se-cisteína.
Muchos microorganismos (bacterias, levaduras y
hongos) pueden crecer en presencia de selenito y reducirlo a
selenio elemental o a un selenuro para ser incorporado a las
proteínas en forma de selenio-aminoácidos.
La capacidad de sintetizar biomoléculas que
contienen selenio ha sido descrita en algunas bacterias productoras
de ácido láctico del género Lactobacillus (Calomme y cols. J.
Appl. Bacteriol., vol. 79, n.º 3, 1995 páginas
331-340; Andreoni y cols. Ann. Microbiol., vol. 50,
n.º 1, 2000, páginas 77-88).
Por lo tanto, actualmente se emplean cepas de
lactobacilos para fines probióticos y la capacidad de estos
microorganismos de concentrar selenio en forma orgánica puede
extender su uso como suplementos también. V. Andreoni y cols., Ann.
Microbiol., vol. 50, n.º 1, 2000, páginas 77-88,
describen la capacidad de algunos lactobacilos de diversos orígenes
de acumular selenio.
Ahora, se ha encontrado sorprendentemente, que
microorganismos que pertenecen a las especies Lactobacillus
buchneri/parabuchneri, Lactobacillus ferintoshensis y Lactobacillus
reuteri, aislados de muestras fecales humanas pueden acumular
selenio en cantidades que son al menos 2-20 veces
mayores que las cepas que se reseñan en la bibliografía (Calomme y
cols. J. Appl. Microbiol., 1995; Andreoni y cols. Ann. Microbiol.
Enzimol., 2000). Estas especies de Lactobacillus son por lo
tanto particularmente adecuadas para la preparación de una biomasa
enriquecida con selenio, especialmente con el objetivo de usar dicha
biomasa como agente prebiótico y/o nutracéutico.
Un primer objetivo de la presente invención es
por lo tanto un procedimiento de preparar una biomasa enriquecida
con selenio, caracterizada porque dicha biomasa se obtiene
(i) cultivando microorganismos que se
seleccionan a partir del grupo que consiste en Lactobacillus
reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus
buchneri/parabuchneri y sus combinaciones en un medio de cultivo
con nutrientes que comprende una sal de selenio, de tal forma que
dichos microorganismos acumulen selenio; y
(ii) separando los microorganismos enriquecidos
con selenio del medio de cultivo.
Con el procedimiento de la invención, se obtiene
una biomasa que comprende microorganismos que contienen un gran
cantidad de selenio acumulado en las células, como queda claro a
partir de los estudios que se reseñan más adelante. Estos estudios
han demostrado, además, que una proporción del selenio acumulado por
la biomasa está en forma orgánica, en particular en forma de
Se-metionina y Se-cisteína, lo que
constituye una ventaja si se prevé usar la biomasa como agente
prebiótico porque el selenio, en forma de
Se-aminoácidos e incorporado en las
selenoproteínas, es fácilmente absorbido por el cuerpo humano.
El procedimiento de la invención para la
preparación de biomasa enriquecida con selenio contempla una primera
etapa de fermentación, en la que los microorganismos se cultivan en
un medio con nutrientes que es adecuado para el crecimiento de
microorganismos del género Lactobacillus suplementado con una
sal de selenio, por ejemplo selenito, preferiblemente selenito
sódico. El medio nutriente preferiblemente es un medio líquido que
contiene fuentes de carbono, por ejemplo glucosa, sacarosa y/o
lactosa; fuentes de nitrógeno, por ejemplo peptonas, hidrolizados
de caseína, extractos de carne y/o extractos de levaduras; sales
inorgánicas; fuentes de elementos traza y vitaminas, por ejemplo
licor de maíz en remojo y similares.
La fermentación preferiblemente se realiza a una
temperatura entre 25ºC y 45ºC, más preferiblemente entre 32ºC y
40ºC. El valor del pH del medio líquido está preferiblemente entre
2,5 y 8,0, más preferiblemente entre 3,5 y 7,5. El tiempo de
fermentación es preferiblemente entre 6 y 40 horas, más
preferiblemente entre 8 y 36 horas. La fermentación puede
realizarse en condiciones aerófilas, microaerófilas y/o
anaeróbicas.
Después de la etapa de fermentación, durante la
cual se produce un crecimiento de la biomasa y una acumulación de
selenio en las células, la biomasa obtenida se separa del medio de
cultivo, preferiblemente por centrifugación o microfiltración, de
tal forma que las células se mantengan intactas. El procedimiento de
la invención, por lo tanto hace que sea posible obtener una biomasa
de microorganismos enriquecidos con selenio que comprende
microorganismos vivos.
Si se desea, la biomasa obtenida puede someterse
después a una operación de liofilización o secado, que se realiza
de acuerdo con procedimientos convencionales.
Además, los presentes inventores aislaron, de
muestras fecales humanas, tres cepas de microorganismos que
pertenecían al género Lactobacillus, denominadas
respectivamente LB2 BM, LB6 BM y LB26 BM, que demostraron ser
particularmente ventajosas para usar en el procedimiento de la
invención, ya que poseen una gran capacidad de concentración de
selenio, especialmente en forma de Se-metionina y
Se-cisteína. Estas cepas se han identificado como
pertenecientes a las especies Lactobacillus reuteri
(LB2 BM), Lactobacillus ferintoshensis (LB6 BM) y
Lactobacillus buchneri/parabuchneri (LB26 BM) (véase
el ejemplo 11). Los cultivos de estas cepas de microorganismos se
han depositado en el organismo depositario internacional Deutsche
Sammlung für Míkroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Braunschweig,
Alemania) bajo el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento
internacional del depósito de microorganismos con el fin de la
tramitación de patentes:
Tal como se ha descrito anteriormente, la
biomasa enriquecida con selenio que puede obtenerse mediante el
procedimiento de la invención es particularmente adecuada para usar
como agente probiótico, ya que contiene concentraciones elevadas de
selenio tanto en forma inorgánica como en forma orgánica.
Con este fin, la biomasa puede prepararse de
formas diversas. Por ejemplo, puede añadirse a un producto
alimentario, preferiblemente leche o un producto lácteo tal como
yogur, para obtener una preparación alimentaria que posea actividad
probiótica. De forma alternativa, puede usarse para la preparación
de una composición que posee actividad probiótica, por ejemplo un
suplemento alimentario o una preparación no alimentaria para la
administración oral, tal como una preparación nutracéutica,
combinada con vehículos y/o excipientes adecuados. Con este fin, la
biomasa preferiblemente se usa en forma de una composición
liofilizada o seca.
La carga bacteriana del producto liofilizado o
seco que puede usarse en la composición probiótica o nutracéutica
es preferiblemente al menos de 10^{10} UFC/g a 10^{11}
UFC/g.
Para preparar la composición liofilizada o seca,
la biomasa húmeda se suspende en un medio líquido, por ejemplo agua
o solución fisiológica estéril, añadiendo agentes protectores tales
como leche desnatada, lactosa, glucosa, extracto de levadura,
almidón de patata, glutamato sódico, inositol, citrato sódico,
gelatina, maltodextrina, estearato de magnesio, ácido ascórbico,
ácido esteárico y sus combinaciones.
La composición liofilizada y/o seca después se
diluye para la preparación prebiótica con sustancias inertes entre
las que se mencionan anteriormente para la liofilización, de forma
que se obtenga una carga bacteriana preferiblemente de al menos
10^{9} UFC/g.
Se esterilizaron 200 ml de medio MRS, al que se
había añadido 8 mg/l de selenito sódico (Na_{2}SeO_{3}) en un
matraz de 500 ml. Se inoculó un licor de siembra de cultivo de
Lactobacillus buchneri/parabuchneri L26 BM -
DSM 16341, cultivado previamente durante 18 horas a 37ºC sin agitar,
en el matraz en una cantidad de 5%. El cultivo se dejó crecer
después durante 24 horas en agitadores a 80 rpm. Al completar el
cultivo, la biomasa se recolectó por centrifugación. La biomasa se
trató y se analizó mediante las técnicas que se describen en el
ejemplo 9. El selenio total acumulado por las células era de 1,87
mg/g_{p.s.}; la cantidad de Se-metionina era de
36,57 ng/mg_{p.s.}, y la cantidad de Se-cisteína
era de 135,70 ng/mg_{p.s.}.
Lactobacillus ferintoshensis Lb6
BM - DSM 16144 se cultivó tal como se describe en el Ejemplo 1.
Después de 24 horas de cultivo, el selenio total acumulado era de
1,1 mg/g_{p.s.}; la cantidad de Se-metionina era
de 12,63 ng/mg_{p.s.}, mientras que la de
Se-cisteína era de 6,60 ng/mg_{p.s.}.
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus reuteri Lb2 BM - DSM
16143 se cultivó tal como se describe en el Ejemplo 1. Después de
24 horas de cultivo, el selenio total acumulado era de 0,7
mg/g_{p.s.}; la cantidad de Se-metionina era de
11,39 mg/g_{p.s.}, mientras que la de Se-cisteína
era de 83,78 ng/mg_{p.s.}
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus buchneri/parabuchneri Lb26 BM - DSM 16341 se cultivó
en un fermentador con 15 l/10 l de medio MRS al que se le había
añadido 5% de licor de maíz a remojo (pretratado a pH 7,0 y a 100ºC
durante 15 minutos) y se añadió selenito sódico 8 mg/l, y después 4
adiciones de 5 mg/l cada 4 horas empezando desde log6 (es decir 6
horas después del inicio de la fermentación). El fermentador se
inoculó con 5% de siembra a log16 y se mantuvo a pH 6,6 hasta
log20. El cultivo se agitó lentamente (60 rpm) con aire 0,51 l/min y
se estimó que se había completado a log25. La biomasa se recolectó
mediante centrifugación, obteniendo 4,2 g/l de peso en seco. Se
obtuvo una acumulación de selenio total de 2,21 mg/g_{p.s.}
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus ferintoshensis Lb6
BM - DSM 16144 se cultivó en un fermentador de 15 l tal como se
indicó en el Ejemplo 4. Se obtuvo 4,8 g_{p.s.} de biomasa. El
selenio total acumulado era de 2,09 mg/g_{p.s.}
\vskip1.000000\baselineskip
Lactobacillus reuteri Lb2 BM - DSM
16143, se cultivó en un fermentador de 15 l tal como se indica en
el Ejemplo 4. Se obtuvo 4,1 g_{p.s.} de biomasa. El selenio total
acumulado era de 1,91 mg/g_{p.s.}
\vskip1.000000\baselineskip
Se lavó 100 g de biomasa húmeda igual a 28,1
g_{p.s.} de Lactobacillus ferintoshensis Lb6 BM -
DSM 16144 con solución fisiológica estéril y después se resuspendió
en 520 ml de una solución que contenía ácido ascórbico al 3%,
glutamato sódico al 3%, inositol al 4%, ajustado a pH 6,2 con NaOH,
y después se liofilizó. Se obtuvo 54 g de una composición
liofilizada con una carga bacteriana de 4,3 * 10^{11} UFC/g.
\vskip1.000000\baselineskip
Se preparó 100 g de biomasa húmeda igual a 28,1
g_{p.s.} de Lactobacillus reuteri Lb2 BM - DSMZ
16143 como en el Ejemplo 7, se resuspendió a una concentración de
aprox. 40% (p/v) en una solución acuosa que contenía ácido
ascórbico al 3%, glutamato sódico al 3%. La suspensión se secó con
un "secador por pulverización" obteniendo una composición seca
con una carga bacteriana de 3,4 * 10^{10} UFC/g.
\vskip1.000000\baselineskip
La biomasa obtenida en los ejemplos 1, 2 y 3 se
separó del medio de cultivo agotado mediante centrifugado. La
biomasa se lavó y el agua del lavado se añadió al medio agotado.
Acto seguido se determinó la cantidad de selenio del medio de
cultivo en el tiempo cero (T_{0}) y después de 24 horas de
fermentación (T_{24}), así como la cantidad de selenio acumulado
por las células. Los resultados obtenidos se muestran en la
siguiente tabla.
\vskip1.000000\baselineskip
Se determinó la cantidad de Se(IV) de la
fracción soluble del citoplasma y de la fracción de partículas
mediante análisis potenciométrico a corriente constante. Este
análisis se realiza usando el Trace Lab PSU 20. Este instrumento
determina los elementos traza incluso a un nivel inferior a ppb y
usa un procedimiento de análisis muy sensible. Se usan tres
electrodos estándar para el análisis: el electrodo de carbono
vítreo, el electrodo de platino y el electrodo de calomelanos.
Electrodo de carbono vítreo: este es el
electrodo que mide el Se. Su punta se recubre con una película muy
fina de mercurio durante el análisis.
Electrodo de platino: éste actúa de
contraelectrodo durante la electrólisis.
Electrodo de calomelanos: este es el
electrodo de referencia, no absorbe metales y contiene KCl
saturado.
Dependiendo de la naturaleza y de la
concentración del metal, éste último se deposita de forma diferente
sobre el electrodo en funcionamiento. La cantidad de metal
depositado sobre la película de mercurio es proporcional a la
concentración de iones metálicos de la muestra y al tiempo de
electrólisis (la cantidad de metal depositado sobre el electrodo
aumenta al aumentar el tiempo de electrólisis).
El procedimiento que se usa para determinar el
contenido en selenio es el procedimiento de SE-ADD,
que contempla la adición de 250 \mul del patrón (5 ppm de Se). El
intervalo de lectura para el selenio debe estar entre 10 ppb y 100
ppb.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el contenido en
Se-aminoácidos, primero se preparó un extracto
celular en bruto. Para ello, el sedimento celular se resuspendió en
la solución de lisado (Tris HCl 50 mM - NaCl 0,3 mM) a pH 8,0, en la
proporción de 1 a 5 (1 g de sedimento en 5 ml de solución de
lisado). Para completar el lisado de la pared celular, se añadió
una solución de lisozima (50 mg/ml) en una cantidad de 20 \mul/g
de sedimento. La mezcla se agitó durante 1 hora a 4ºC y después se
sometió a 8 ciclos de ultrasonidos (ciclos de 30 segundos con una
pausa de 1 minuto sobre hielo) (ultrasonidos Bandelin HD
2070-U). La mezcla se centrífugo a 15000 rpm.
(Beckman, rotor JA20) durante 1 hora a 5ºC para separar la fracción
soluble del citoplasma de la fracción particulada (membranas y
paredes). Después de la precipitación, las proteínas citoplásmicas
se analizaron para determinar el contenido de selenio incorporado y
los aminoácidos que contenían selenio.
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar el contenido en
Se-aminoácidos, se añadió 1 ml de agua destilada a
cada muestra, previamente mineralizada y liofilizada, y la solución
así obtenida se ajustó a pH 7,5 con NaOH. Después, se añadió una
solución acuosa de proteinasa K a cada muestra en una proporción de
1 a 10. La mezcla se incubó a 37ºC, agitando durante 24 h. Las
proteínas se precipitaron añadiendo ácido tricloroacético a una
concentración final del 10%. La suspensión se centrifugó y el
sobrenadante se recolectó y se almacenó a -20ºC hasta su uso. El
contenido total en selenio se determinó en una alícuota de la
muestra y la cantidad de Se-metionina y
Se-cisteína se determinó en otra alícuota usando el
procedimiento de CL/EM que se describe en: J. Agric. Food Chem.,
2002; 50, 5722 - 5728.
La resistencia a la acidez de las cepas de la
presente invención se analizó evaluando su supervivencia después de
90 minutes de contacto con una solución gástrica (J. App. Microb.
2001; 90, 268-278) a pH 2,00. Las células
recolectadas después de 18 horas de cultivo a 37ºC en condiciones
anaeróbicas en medio de cultivo MRS se resuspendieron en agua con
peptona. Se añadieron volúmenes iguales de esta suspensión
bacteriana (0,1 ml) a 6 ml de solución gástrica y a 6 ml de la
solución del "tubo de control", para alcanzar una concentración
final de aprox. 1 x 10^{8} UFC/ml. Ambas suspensiones microbianas
se incubaron a 37ºC durante 90 minutos. El recuento de los
organismos viables se realizó con muestras tomadas a T_{0} y
después de 90 minutos, mediante diluciones decimales y plaqueando
en medio de agar MRS. El resto de los volúmenes se centrifugaron a
9500 rpm (Beckman, rotor JA20) durante 20 minutos a 5ºC para
obtener las células para suspender en la solución de sales biliares
para determinar la resistencia a la bilis. Para este fin, las
células se volvieron a suspender en 6 ml de tampón de fosfato 0,1
M, a pH 6,5, suplementado con peptona (1 g/l) y bilis (3 g/l) y se
incubaron a 37ºC durante 3 horas. Al mismo tiempo, las células de
control se volvieron a suspender en 6 ml de la misma solución de
tampón pero en ausencia de bilis y se incubaron como se indica
anteriormente.
La determinación de la carga bacteriana, tal
como se describe anteriormente, se realizó en muestras tomadas a
T_{0} y después de 3 horas de exposición a la bilis.
El efecto protector de la leche sobre las
células incubadas en medio ácido se evaluó en 2 cepas, L.
reuteri Lb2 BM y L. buchneri/parabuchneri Lb26 BM,
que son sensibles, respectivamente, a la exposición a sales y a la
acidez. Para este fin, las células se inocularon en una solución de
leche desnatada acidificada a pH 2,0 y se determinó el número de
UFC/ml después de la exposición a esta solución (pH 2,0 durante 90
minutos) y a la solución de sales biliares (180 minutos).
Las cepas LB2 BM, LB6 BM y LB26 BM de la
presente invención se identificaron usando la técnica ARDRA
(Análisis de ADN ribosómico amplificado por restricción) que
contempla la amplificación de la región de ADN que codifica el gen
de ADNr 16S usando cebadores universales y después digestión del
producto amplificado obtenido con enzimas de restricción. Los
fragmentos de restricción después se secuenciaron y las secuencias
obtenidas se alinearon con secuencias conocidas para identificar la
cepa basándose en la homología porcentual.
El ADN se extrajo de las células de un cultivo
en caldo en medio MRS estéril incubado a 37ºC durante 24 h. Se
centrifugaron aproximadamente 2 ml de cultivo en caldo a 13000 rpm
durante 5 minutos y el sedimento recolectado se resuspendió de
forma homogénea en 1,85 ml de solución de suspensión celular; a la
mezcla se añadió lo siguiente: 50 \mul de mezcla de ARNasas y,
después de agitar rápidamente, 100 \mul de solución de lisis
celular/desnaturalizante. La suspensión se calentó con termostato a
55ºC durante 15 minutos, se suplementó con 25 \mul de mezcla de
proteasas y se mantuvo a 55ºC durante 2 h. Después de añadir 500 de
mezcla de precipitación salina, se mantuvo 1,5 ml a 4ºC durante 10
minutos y se centrifugó a 13000 rpm durante 10 minutos. Al
sobrenadante se añadió 2 ml de TE (Tris-HCl 10 mM y
EDTA 1 mM, a pH 8, estéril) y 8 ml de etanol al 100%. La hebra de
ADN, recuperada con una varilla de cristal, se suplementó con 500
\mul de etanol al 70% y se centrifugó a 11000 rpm durante 30
minutos. Se mantuvo, después de eliminar la fase acuosa, a 37ºC
durante 24 horas, después se resuspendió en TE (aprox. 200 \mul)
y se almacenó a -20ºC hasta su uso. La extracción del ADN se
verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,7% (p/v) en
tampón TAE 1X.
Se amplificaron porciones específicas del genoma
mediante la técnica de PCR. Las reacciones de amplificación por PCR
se realizaron en un volumen de reacción predefinido de 25 \mul
usando tubos Eppendorf estériles de 200 \mul.
La mezcla de reacción estaba constituida
por:
- ADN de la cepa (plantilla de ADN), la
plantilla sobre la que se ceba la reacción de amplificación en
cadena de la polimerasa, se usa en una proporción de 1/25 del
volumen de reacción final;
- Una solución de MgCl_{2} (1,75 mM) que
proporciona los iones de Mg^{2+} necesarios para estabilizar la
actividad enzimática de la polimerasa Taq.
- Dos cebadores oligonucleotídicos (0,2 \muM),
uno para la reacción "directa" (f) y uno para la reacción
"inversa" (r) que se emparejan con las hebras de ADN
complementarias previamente desnaturalizadas en puntos
complementarios de las secuencias. El extremo 3' libre del cebador
proporciona el punto inicial para la actividad enzimática. Las
secuencias de los cebadores varían dependiendo de la región a
amplificar y se indican más adelante.
- Una mezcla de trifosfatos
desoxirribonucleótidos (0,2 mM) (dNTP = dAPT+dCTP+dGTP+dTTP).
- La enzima termoestable polimerasa Taq
(Bioline, Reino Unido), que cataliza la reacción de síntesis del
nuevo ADN sobre la plantilla inicial; la temperatura óptima para su
actividad es de 70ºC; la enzima que se usa se proporciona a una
concentración de 5 unidades/\mul.
- Se añade un tampón para la enzima polimerasa
Taq constituida por Tris-HCl (100 mM, a pH
8,3) y KCl (500 mM), con la función de crear una potencia iónica y
pH óptimos para la reacción enzimática, a una proporción de 1/10
del volumen final.
- Agua estéril destilada, que representa el
medio por el que la reacción tiene lugar y hace posible alcanzar el
volumen deseado.
Se tomaron las siguientes precauciones para
evitar la contaminación de la reacción con ADN exógeno:
- preparación de la mezcla de reacción bajo una
campana estéril con flujo de aire laminar;
- esterilización de todo el material usado;
- inclusión de un control negativo, que contenía
todos los reactivos excepto la plantilla de ADN, en cada reacción
de amplificación.
\newpage
La mezcla de reacción, que contenía todos los
reactivos que se especifican anteriormente en cantidades adecuadas,
excepto la plantilla de ADN, se preparó en un tubo Eppendorf de 1,5
ml. La mezcla de reacción después se dividió en alícuotas en tubos
Eppendorf de 0,2 ml, a los que después se añadió la plantilla. Las
muestras se introdujeron rápidamente en hielo para evitar que la
Polimerasa Taq actuara de forma no específica.
Los resultados de la amplificación se
verificaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%
(p/v). Si no hay bandas en el perfil de electroforesis del control
negativo, se considera que la reacción no se ha contaminado.
La tabla que se muestra a continuación muestra
las concentraciones de los reactivos que se usan en la mezcla de
reacción para la amplificación del ADNr de 16S que codifica la
subunidad 16S de los ribosomas bacterianos.
Se usaron los cebadores universales
eubacterianos 27f 5' -AGA GTT TGA TCC TGC CTC AG-3'
(SEQ ID N.º: 1) y 1495r 5' -CTA CGG CTA CCT TGT TAC
GA-3' (SEQ ID N.º: 2) (Invitrogel), que están
localizados respectivamente en los nucleótidos 27 y 1495 del gen de
ADNr 16 S de E. coli, permitiendo una amplificación casi
completa.
* La unidad se define como la cantidad de enzima
que incorpora 10 ng de dNTP en 30 minutos a una temperatura de
74ºC. La enzima es termoestable y cataliza la reacción de síntesis
del nuevo ADN sobre la plantilla inicial.
Los tubos de ensayo que contenían la reacción,
inmediatamente después de la preparación, se introdujeron en el
ciclador térmico de PCR GeneAmp PCT System 2400 (Perkin Elmer)
aplicando el siguiente ciclo térmico: desnaturalización a 95ºC
durante 3 minutos; 35 ciclos a 94ºC durante 1 minuto; 55ºC durante 1
minuto; 72ºC durante 2 minutos; después una fase de extensión final
a 72ºC durante 15 minutos.
Los resultados de la amplificación se
verificaron mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1,5%
(p/v) en tampón TAE 1X. Cualquier amplificación del ADNr de 16S
puede detectarse por la presencia de una banda de amplificación de
aprox. 1500 nucleótidos. El peso molecular del ADN, que corresponde
a la banda visible en el gel, se encuentra comparando con las
bandas producidas por la Ladder 100 bp Plus, una mezcla de
fragmentos de ADN con longitudes que son múltiplos de 100 pb.
\vskip1.000000\baselineskip
El producto amplificado obtenido se digirió con
las enzimas de restricción HhaI, HinfI, Afa.
La reacción de digestión del ADNr de 16S de cada
cepa se llevó a cabo en un volumen de 10 \mul usando los
siguientes reactivos:
- ADN amplificado, en cantidades variables
dependiendo de la intensidad de la banda de amplificación;
- tampón específico para cada enzima 10 x
(Amersham Biosciences);
- enzima de restricción (Amersham Biosciences)
(10 U/\mul);
- agua MilliQ para llevar el volumen hasta 10
\mul.
La siguiente tabla muestra las cantidades de los
reactivos que se usan en la mezcla de reacción para la digestión
del fragmento de ADNr de 16S.
\vskip1.000000\baselineskip
Los reactivos se introdujeron en tubos Eppendorf
y se incubaron a 37ºC durante 12 h. Las muestras se almacenaron a
-20ºC y después se analizaron mediante electroforesis en gel de
agarosa al 3% (p/v) en tampón TAE 1X usando Ladder 50 bp para
evaluar el peso de las bandas que caracterizan las muestras.
La digestión enzimática del ADNr de 16S crea un
perfil formado por diversas bandas de diferente peso molecular en
función de los sitios reconocidos por la enzima presente en la
secuencia que se analiza. El total de las bandas no debe superar la
longitud del fragmento amplificado (1500 pb).
\vskip1.000000\baselineskip
Las condiciones de operación contemplan el uso
de un gel de agarosa horizontal en tampón de realización de
Tris-acetato-EDTA (TAE) que consiste
en: base Tris 0,04 M, ácido acético glacial 0,02 M,
Na_{2}-EDTA 0,001 M, a pH 8. La prueba se realiza
a temperatura ambiente, manteniendo un voltaje constante entre 90 V
y 110 V en función de las dimensiones del gel. La prueba se detiene
cuando los fragmentos de ADN han recorrido aprox. 2/3 de la
longitud del gel.
La concentración de la agarosa varía de 0,7% a
3% dependiendo del tamaño de las moléculas de ADN que vayan a
separarse:
- 0,7% para verificar la extracción del ADN
- 1,5% para verificar la amplificación del ADNr
de 16S
- 3% para verificar la digestión del ADN con
enzimas de restricción.
El gel para la prueba de electroforesis se
preparó disolviendo la agarosa en tampón TAE 1X. Antes de cargarlo
en los pocillos, el ADN se mezcló en una proporción de 1:5 (v/v) con
la solución de carga en gel constituida por sacarosa al 40% (p/v),
azul bromofenol al 0,05% (p/v), EDTA 0,1 M a pH 8, y dodecilsulfato
sódico (SDS) al 0,5% (p/v).
El primer y el último pocillo del gel se
cargaron con marcadores de peso molecular conocido, que contenían
bandas separadas de ADN, que se usan para evaluar la longitud de las
muestras, expresada en pares de bases (pb). Al completar la prueba,
el marcador revela un perfil de electroforesis con bandas separadas,
que corresponden a las longitudes de ADN conocidas.
Cuando las bandas han recorrido aprox. 2/3 del
gel, éste se sumerge en una solución 0,5 mM de bromuro de etidio
(Sigma) apartado de la luz durante 15-30 minutos. El
gel después se lava en agua destilada durante aproximadamente 15
minutos y se fotografía bajo luz UV de un transiluminador conectado
a un sistema de obtención de imágenes Gel Doc (Biorad).
\vskip1.000000\baselineskip
Se usó el protocolo de extracción de gel
QIAquick para la purificación de 70 pb-10 kb de los
productos de la amplificación. El producto purificado (aprox. 450
\mul) se almacenó a -20ºC, en un microtubo de 2 ml, hasta su
uso.
\vskip1.000000\baselineskip
Se añadió acetato sódico (pH 5; 3 M) al producto
purificado en una proporción de 1/10 del volumen del ADN obtenido y
después se añadió 100% de etanol en una proporción de 2,5 volúmenes
del ADN.
Se centrifugó a 4ºC durante 20 minutos a 14000
rpm para eliminar el sobrenadante. El precipitado, después de
añadir 500 \mul de etanol al 70%, se centrifugó a 4ºC durante 15
minutos. Después de eliminar el sobrenadante, el etanol que quedaba
en el Eppendorf se evaporó con termostato a 37ºC durante
aproximadamente 15 minutos y después en la campana. El precipitado
se volvió a suspender en 23 \mul de TE a pH 8 y se almacenó a 4ºC
hasta su uso.
Los productos amplificados se cuantificaron
comparando la fluorescencia de la muestra con la del marcador a
concentración conocida mediante el sistema de obtención de imágenes
Gel Doc (Biorad).
Se preparó un gel de agarosa al 1,5%. Los
pocillos se cargaron con dos mezclas de marcadores de peso molecular
conocido, formadas respectivamente por:
1) 20 \mul de marcador Low Range Mass
Ruler^{TM} (MBl Fermentas)
2) 10 \mul de marcador Low Range Mass
Ruler^{TM} (MBl Fermentas).
Se mezcló 2 \mul del ADN de muestra con 2
\mul de azul bromofenol y 6 \mul de agua MilliQ. Se cargó 10
\mul de la mezcla en el gel.
La reacción de secuenciación se realizó mediante
amplificación por PCR usando 200 ng del producto de PCR, 6 pmol de
cebadores 27f y 1495r (Invitrogen), 4 \mul de tampón (2,5X) y 4
\mul de premezcla de "DyeTerminator" (Amersham Biosciences),
que contenía una mezcla de nucleótidos marcados con fluorocromos. El
volumen final es de 20 \mul. Se usó un ciclador térmico para la
reacción de amplificación, aplicando el siguiente ciclo térmico:
desnaturalización a 95ºC durante 2 min; 25 ciclos a 94ºC durante 30
segundos, 55ºC durante 30 segundos, 60ºC durante 4 min; después una
fase de extensión final a 60ºC durante 15 minutos. Después, se
realizó la purificación de los nucleótidos: las muestras del QUICK
RUN se centrifugaron y transfirieron a tubos Eppendorf de 1,5 ml, a
los que se añadió 2 \mul de acetato sódico y 80 \mul de etanol
al 100%. Todo esto se centrifugó a 13000 rpm durante 5 minutos y,
una vez se hubo eliminado el sobrenadante, se añadió 1 ml de etanol
al 70%. Después de centrifugar a 13000 rpm durante 5 minutos, el
sobrenadante se retiró y el etanol residual se evaporó, colocando
la mezcla en una campana durante 15 minutos. El residuo se volvió a
suspender en aproximadamente 13 \mul de tampón Mega BAC y se agitó
en un vórtice durante 20 segundos. El QUICK RUN se centrifugó, las
muestras se transfirieron a Eppendorfs de 1,5 ml y después se
introdujeron en un secuenciador Applied Biosystem 310A, donde se
realizó una prueba de electroforesis capilar de Applied
Biosystem.
Las secuencias obtenidas se alinearon con
secuencias presentes en las bases de datos de GenBank y EMBL usando
el programa Fasta3 y GeneSteam Align. Las secuencias que se usaron
para cada cepa, el número de bases secuenciadas, el porcentaje de
homología y la especie a la que se atribuye cada cepa se muestran a
continuación.
LB2 BM - DSM 16143
número de bases secuenciadas 860
% de homología: 99,5
LB2 BM directo (SEQ ID N.º: 3)
LB2 BM inverso (SEQ ID N.º: 4)
\vskip1.000000\baselineskip
LB6 BM - DSM 16144
número de bases secuenciadas 748
% de homología: 98,9
LB6 BM directo (SEQ ID N.º: 5)
LB6 BM inverso (SEQ ID N.º: 6)
LB26 BM - DSM 16341
Lactobacillus buchneri/parabuchneri
número de bases secuenciadas 485
% de homología: 99,4
LB26 BM directo (SEQ ID N.º: 7)
LB26 BM inverso (SEQ ID N.º: 8)
<110> BioMan S.r.l.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> BIOMASA ENRIQUECIDA CON SELENIO,
PROCEDIMIENTO PARA PREPARARLA, Y PRODUCTOS PREBIÓTICOS Y
NUTRACÉUTICOS QUE CONTIENEN DICHA BIOMASA
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> E057074
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador universal eubacteriano
26f
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm8
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 20
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> cebador universal eubacteriano
1495r
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 357
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (301)..(301)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = c, a, g, o t
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 501
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus reuteri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (54)..(54)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = c, a, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 304
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus
ferintoshensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (251)..(251)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = c, a, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> característica miscelánea
\vskip0.400000\baselineskip
<222> (288)..(288)
\vskip0.400000\baselineskip
<223> n = c, a, g, o t
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 448
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus
ferintoshensis
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 192
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus
buchneri/parabuchneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 306
\vskip0.400000\baselineskip
<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Lactobacillus
buchneri/parabuchneri
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
Claims (19)
1. Procedimiento de preparar una biomasa
enriquecida con selenio que tiene un contenido en selenio de al
menos 0,7 mg/g_{p.s.}, caracterizada porque dicha biomasa
se obtiene
(i) cultivando microorganismos que se
seleccionan a partir del grupo que consiste en Lactobacillus
reuteri, Lactobacillus ferintoshensis, Lactobacillus
buchneri/parabuchneri y sus combinaciones en un medio de cultivo
con nutrientes que comprende una sal de selenio, de tal forma que
dichos microorganismos acumulen selenio; y
(ii) separando los microorganismos enriquecidos
con selenio del medio de cultivo.
2. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que los microorganismos separados del medio
de cultivo se someten además a una operación de liofilización o
secado para obtener una biomasa enriquecida con selenio liofilizada
o seca.
3. Procedimiento de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, en el que los microorganismos se seleccionan a
partir del grupo que consiste en Lactobacillus
reuteri DSM 16143, Lactobacillus ferintoshensis
DSM 16144 y Lactobacillus buchneri/parabuchneri DSM
16341.
4. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 3, en el que la sal de selenio es
selenito.
5. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que el medio de cultivo es un
medio líquido.
6. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el medio de cultivo comprende
los nutrientes habituales para el cultivo de dichos microorganismos,
que se seleccionan a partir del grupo que consiste en sales
inorgánicas, fuentes de carbono, de nitrógeno, de vitaminas, de
elementos traza y sus mezclas.
7. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho medio de cultivo tiene
un pH en el intervalo de 2,5 a 8, preferiblemente 3,5 a 7,5.
8. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos se
cultivan en dicho medio de cultivo a una temperatura en el intervalo
de 25 a 45ºC, preferiblemente 32 a 40ºC.
9. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que dichos microorganismos se
cultivan en dicho medio de cultivo durante 6 a 40 horas,
preferiblemente 8 a 36 horas.
10. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que dichos microorganismos se
separan del medio de cultivo mediante centrifugación o
microfiltración.
11. Biomasa enriquecida con selenio que se
selecciona a partir del grupo que consiste en Lactobacillus
reuteri, Lactobacillus ferintoshensis,
Lactobacillus buchneri/parabuchneri y sus
combinaciones y que tienen un contenido en selenio de al menos 0,7
mg/g_{p.s.}
12. Biomasa de acuerdo con la reivindicación
11, que comprende microorganismos vivos.
13. Biomasa de acuerdo con la reivindicación 11
ó 12, en la que los microorganismos se seleccionan a partir del
grupo que consiste en Lactobacillus reuteri cepa LB2
BM depositada en el DSMZ el 17 de enero de 2004 con el número de
acceso DSM 16143, Lactobacillus ferintoshensis cepa
LB6 BM depositada en el DSMZ el 17 de enero de 2004 con el número
de acceso DSM 16144, Lactobacillus
buchneri/parabuchneri cepa LB26 BM depositada en el
DSMZ el 5 de abril de 2004 con el número de acceso DSM 16341, y sus
combinaciones.
14. Uso de biomasa enriquecida con selenio de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 como agente
probiótico.
15. Uso de acuerdo con la reivindicación 14,
para la preparación de suplementos alimentarios, productos
nutracéuticos o preparaciones alimentarias.
16. Composición que tiene actividad probiótica
que contiene biomasa enriquecida con selenio de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 11 a 13 combinada con vehículos
y/o excipientes adecuados.
17. Composición de acuerdo con la
reivindicación 16, que tiene una carga bacteriana de al menos
10^{9} UFC/g.
18. Preparación alimentaria, suplemento
alimentario y producto nutracéutico que comprende una composición
que tiene actividad probiótica de acuerdo con la reivindicación 16 ó
17.
\newpage
19. Microorganismos que se seleccionan a partir
del grupo que consiste en Lactobacillus ferintoshensis
cepa LB6 BM depositada en el DSMZ el 17 de enero de 2004 con el
número de acceso DSM 16144 y que tiene las secuencias parciales de
ADNr de 16S SEQ ID N.º: 5 y 6, y Lactobacillus
buchneri/parabuchneri cepa LB26 BM depositada en el
DSMZ el 5 de abril de 2004 con el número de acceso DSM 16341 y que
tiene las secuencias parciales de ADNr de 16S SEQ ID N.º: 7 y
8.
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