CN110333208B - 一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，属于微生物领域。本发明提供的研究方法包括如下步骤：步骤1，荧光标记；步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长；步骤3，体外光谱评估；步骤4，判断荧光强度；步骤5，实验动物活体成像；步骤6，ROI分析。根据本发明所涉及的研究方法，因为成功构建了两个不同颜色蛋白基因的质粒，所以，本发明通过将两种不同的颜色蛋白基因的质粒转入两种不同菌中，得到两种荧光标记菌株。同时由于本发明中因为荧光标记的两种均各自的最优激发和发射波长下，都有较强的荧光表达，且能与另一株菌明显区分开，所以能够利用活体成像技术观察两种菌在体内的相互作用。

Description

一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法
技术领域
本发明涉及一种研究方法，具体涉及一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，属于微生物领域。
背景技术
益生菌是一类定殖于动物肠道、生殖系统中，产生有机酸或其他抑菌物质从而发挥有益作用的活性有益微生物的总称。由于益生菌能够顺利通过胃肠道环境，并黏附在肠道中，被认为是发挥其潜在益生作用的关键，因此益生菌对人体肠道上皮细胞模型的黏附能力已经被广泛用于益生菌筛选的体外评价指标。益生菌种类很多，其中干酪乳杆菌是其中典型的代表。益生菌在促进肠道健康、抑制癌症、提高机体免疫力、降低血清胆固醇、降低高血压等方面的作用已经得到多方面的证实，并且越来越多的研究表明益生乳酸菌可能具有更多潜在的功能性质，在整个机体健康和防止疾病发生过程中发挥着重要的调节作用，益生菌已经成为国内外相关领域的研究热点。各种益生菌对病原菌的拮抗作用，以及对病原菌感染引起的疾病防治作用的研究也逐渐成为热点。现有的研究发现Lactobacillusfermentum ME-3和 Bifidobacterium lactis Bb12可以拮抗志贺氏菌，Bifidobacteriumlactis DR10可以抑制大肠杆菌对肠道上皮细胞的黏附，Lactobacillusplantarum ZJ008对金黄色葡萄球菌有抑制作用，Lactobacillus acidophilus IBB801可以抑制沙门氏菌对肠道上皮细胞的入侵。
然而，上述研究都来自于体外实验和细胞实验，并不能完全反映益生菌与病原菌在体内实际的相互作用。而活体光学成像技术的发展，为研究益生菌和致病菌在小鼠肠道的实际运动情况和相互作用提供了可能性。
现有技术中，活体光学成像中最重要的是对研究对象进行荧光标记，目前主要有生物发光与荧光发光两种技术。生物发光技术是利用萤光素酶基进行标记，观察时需加入外源性底物荧光素，在荧光素酶的催化下发生氧化反应，转变为可见光能释放，从而信号可被光学成像系统检测到。而荧光技术是采用荧光蛋白等新型标记材料标记细胞，荧光发光需要利用激发光使荧光基团达到较高的能量水平，然后发射出较长波长的光，最后通过活体荧光成像系统检测。由于荧光素酶需要底物，很难进行长时间的实时观察，因而荧光蛋白质应用的较多。将荧光蛋白引入靶细胞或者转基因动物体内，通过活体荧光成像系统，在体的、非侵入的、动态地观察生物过程近几年已经广泛应用于肿瘤研究。但较少的应用于标记益生菌，目前的研究也是主要针对单荧光蛋白质标记益生菌，目前还没有报道同时利用荧光蛋白质标记益生菌和致病菌。因为现有技术中，一旦同时利用荧光蛋白质标记益生菌和致病菌，两种荧光会互相干扰，在活体荧光成像过程中难以分辨两种细菌，达不到研究的效果。
发明内容
本发明是为了解决上述问题而进行的，目的在于提供一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法。
本发明提供了一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，细菌种类为两种，分别为益生菌以及致病菌，具有这样的特征，包括如下步骤：步骤1，荧光标记：分别对益生菌以及致病菌分别进行基因改造，使其分别表达出不同颜色的荧光蛋白基因，分别得到荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，进入步骤2；步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长：分别确定荧光标记的益生菌的最优激发波长λAa以及最优发射波长λAb以及荧光标记的致病菌的最优激发波长λBa以及最优发射波长λBb，进入步骤3；步骤3，体外光谱评估：固定激发波长为λAa，对荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λAb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA1以及荧光标记的致病菌的荧光强度FB1；固定激发波长为λBa，对荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λBb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA2以及荧光标记的致病菌的荧光强度FB2；固定发射波长为λAb，对荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λAa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA3以及荧光标记的致病菌的荧光强度FB3；固定发射波长为λBb，对荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λBa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA4以及荧光标记的致病菌的荧光强度FB4，进入步骤4；步骤4，判断|λAa-λBa|≤100,|λAb-λBb|≤100，1/50≤FA1/FB1≤50，1/50≤FA2/FB2≤50，1/50≤FA3/FB3≤50，1/50≤FA4/FB4≤50六个式子是否均不成立时，当判断为是时进入步骤5，否则进入步骤1；步骤5，实验动物活体成像：对实验动物进行同时灌胃荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，在灌胃后每隔一段时间对实验动物分别在λAa、λBa、λAb、λBb下成像，得实验动物活体成像图，进入步骤6；步骤6，ROI分析：对实验动物活体成像图进行ROI定量分析。
在本发明提供的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法中，还可以具有这样的特征：其中，荧光标记的方法包括如下步骤：步骤1，取含有荧光基因的质粒加入冰上融解的细菌的感受态细胞中，冰上放置15-30min后，35-45℃水浴锅中放置50-80s，再冰上放置1～2min，加入LB培养基至体积为1mL，得培养液，进入步骤2；步骤2，培养液在150-200rpm/35-40℃振荡培养0.8-1.2h后，取 80-120μL涂布到含250ng/mL-300ng/mL红霉素抗性的LB固体平板上，35-40℃过夜培养。待平板上长出单菌落后，挑取进行菌落PCR 验证，将验证正确的阳性菌落保藏待用，即得荧光标记的细菌。
在本发明提供的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法中，还可以具有这样的特征：其中，荧光标记的方法包括如下步骤：步骤1，将感受态细胞置于冰上解冻，取含有荧光基因的质粒与感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的电击转化杯中，使混合物落入底部，调整电压仪到1.8-2.5kV，电击转化杯，迅速向转化杯中加入MMRS复苏培养基，得中间体A；步骤2，将中间体A混匀后转移至离心管中，35-40℃静置培养1-3h。涂布到含有8-12μg/mL 红霉素抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养40-50h，待平板上长出单菌落后，挑取单菌落，在靶向基因上下游同源臂外侧基因组80-120 bp处设计验证引物，进行菌落PCR验证；步骤3，将验证有正确条带的阳性转化子挑取到MRS液体培养基吹吸重悬，沾取菌液划线接种于无任何抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养至单菌落长出，挑取单菌落，用验证引物进行菌落PCR验证；步骤4，重复步骤3直至有纯种菌株出现，即得荧光标记的细菌。
在本发明提供的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法中，还可以具有这样的特征：其中，含有荧光基因的质粒为 pLCNICK-1628-RFP质粒或pIB184-GFP质粒，pLCNICK-1628-RFP质粒为敲除LC2W-1628基因并插入RFP基因的CRISPR/Cas9D10A质粒，pIB184-GFP 质粒为GFP基因的过表达质粒。
在本发明提供的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法中，还可以具有这样的特征：其中，确定最优激发波长和最优发射波长的方法为从LB固体平板上挑取活化好的荧光标记的细菌的单菌落接种到含有3-5mL液体LB培养基的试管中，于35-40℃摇床振荡，过夜培养12-16h，再以3500-4500rpm/3-5min离心菌液收集菌体，用无菌磷酸缓冲盐溶液冲洗菌体2-3次并重悬，调节菌浓至109-1010 CFU/mL，取150-220μL置于黑色平底的96孔板中，利用酶标仪扫描出最佳激发波长和最佳发射波长。
发明的作用与效果
根据本发明所涉及的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，因为本发明通过将两种不同的颜色蛋白基因的质粒转入两种不同菌中，得到两种荧光标记菌株，所以荧光标记的两种均各自的最优激发和发射波长下，都有较强的荧光表达，且能与另一株菌明显区分开，所以能够利用活体成像技术观察两种菌在体内的相互作用。
附图说明
图1是本发明基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法的实施例中细菌光谱扫描图；以及
图2是本发明的实施例中基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法的实施例中灌胃后的小鼠的活体成像图。
具体实施方式
为了使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，以下结合实施例及附图对本发明作具体阐述。
下述实施例中菌株和质粒来源如下：
干酪乳杆菌LC2W：为干酪乳杆菌野生型菌株，光明乳业股份有限公司馈赠。
肠出血性大肠杆菌O157:H7，购自ATCC(American type culture collection)
质粒pSY1026，为含有RFP基因的质粒，中科院上海植生所馈赠。
质粒pIB184-GFP，为GFP基因的过表达质粒，江南大学馈赠。
下述实施例中的引物均由上海生工生物工程有限公司合成，具体序列如电子序列表所示。
下述实施例中培养基成分如下：
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，NaCl 10g，加水至1L。 121℃灭菌15min。固体培养基另加琼脂粉20g。
MRS培养基：细菌蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏10g，柠檬酸氢二胺2g，葡萄糖20g，乙酸钠8.3g，K2HPO4 2g，MgSO4 0. 58g，MnSO4 0.25g，吐温-80 1mL，加水至1L。115℃灭菌20min。固体培养基另加琼脂粉20g。
GMRS培养基：甘氨酸1g，加MRS培养基至100mL，115℃灭菌20min。
MMRS：蔗糖0.5M，CaCl2 2mM，MgCl2 20mM，加MRS培养基至100mL，115℃灭菌20min。
下述实施例中试剂材料来源如下：
限制性内切酶，购自Thermo Scientific。无缝克隆试剂盒，购自南京诺唯赞生物科技有限公司。质粒抽提和琼脂糖凝胶回收试剂盒，购自Axygen。抗生素，购自上海生工生物有限公司。高保真酶，购自大连宝生物公司。质粒抽提试剂盒购自Axygen。其他试剂均来自于国药集团分析纯。
下述实施例中实验动物为小鼠，具体来源如下：
实验所用小鼠为6周龄雄性无特定病原体(Specific pathogen free，SPF)级C57BL/6小鼠，体重18～20g，购自上海杰思捷实验动物有限公司。每笼饲养3只小鼠，在恒温23℃±2℃，暗/光周期为12 h的环境下，自由饮食，所用饲料购自上海杰思捷实验动物有限公司，普通饮食适应一周后进行实验。
<实施例>
一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，步骤如下：
步骤1，荧光标记：分别对干酪乳杆菌LC2W以及肠出血性大肠杆菌O157:H7分别进行不同颜色的荧光标记，分别得到荧光标记的 O157:H7-GFP以及荧光标记的LC2W△1628：RFP，进入步骤2；
对干酪乳杆菌LC2W进行荧光标记的方法为将重组质粒 pLCNICK-1628-RFP电转入L.casei LC2W感受态细胞中，电转化方法如下：将感受态细胞置于冰上解冻，取1μgpLCNICK-1628-RFP 质粒，将其与感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的2mm电击转化杯中，轻敲使混合物落入底部，调整电压仪到2.0kV，电击转化杯，迅速向转化杯中加入950μL的MMRS复苏培养基。混匀后转移至干净的离心管中，37℃静置培养2h。涂布到含有10μg/mL红霉素(Em)抗性的MRS固体平板上，37℃培养48h，待平板上长出单菌落后，挑取单菌落，在靶向基因上下游同源臂外侧基因组约100 bp处设计验证引物Y1628-F(SEQ：9)/Y1628-R(SEQ：10)，进行菌落PCR验证。将验证有正确条带的阳性转化子挑取到MRS液体培养基吹吸重悬，沾取菌液划线接种于无任何抗性的MRS固体平板上， 37℃培养至单菌落长出，挑取单菌落，用Y1628-F(SEQ：9)/Y1628-R (SEQ：10)进行菌落PCR验证，重复此过程，直到有纯种菌株出现。将菌株保藏起来待用，记作LC2W△1628：RFP。在菌株分离纯化的过程中，所用培养基都是无抗MRS，基因编辑质粒 pLCNICK-1628-RFP会丢失掉，便于后续试验。将最后获得的纯种突变株划线接种于MRS无抗平板上，长出的单菌落同时接种到MRS 的有抗和无抗平板上，比较两板上的生长状态，判断质粒是否消除成功。
其中，L.casei LC2W感受态细胞制备方法为从MRS固体平板上挑取新活化的L.casei LC2W单菌落接种到5mL液体MRS培养基中， 37℃，静置过夜培养12-16h。将培养液按3：100的比例接种于50mL GMRS液体培养基中，37℃静置培养至OD600＝0.5-0.6。将菌液转移至 50mL离心管中，冰上放置10min后，4℃，5000g离心10min，弃上清。用冰上预冷的10％甘油溶液重悬洗涤菌体3次，最后用1mL 10％甘油溶液重悬菌体，每100μL分装于冰上预冷的离心管中，-80℃保存待用。
重组质粒pLCNICK-1628-RFP构建的方法为以L.casei LC2W基因组为模板，用1628-1-F(SEQ：1)/1628-1-R(SEQ：2)和1628-2-F(SEQ： 3)/1628-2-R(SEQ：4)这两对引物扩增，分别获得上下游同源臂 1628-1和1628-2。以pSY1026质粒为模板，RFP-F(SEQ：7)/RFP-R(SEQ：8)为引物，扩增红色荧光蛋白基因片段RFP，以pLCNICK-1628质粒为模板，P23-F(SEQ：5)/P23-R(SEQ：6)为引物，扩增RFP的启动子片段P23。PCR反应体系(50μL)：PrimeStar 预混酶25μL，上下游引物各1μL，模板1μL，ddH2O 22μL。PCR 反应条件：95℃预变性3min，98℃变性10s，55℃退火15s，72℃延伸(1min/kb)，30个循环，72℃，10min。PCR产物进行凝胶电泳检测，并用纯化试剂盒回收。将回收后的P23和RFP片段按摩尔数比为1:1混合后为模板，以P23-F(SEQ：5)/RFP-R(SEQ：8)为引物，通过overlap PCR反应，将2个片段连接在一起，记作P23-RFP。PCR 产物进行凝胶电泳检测，并用纯化试剂盒回收。将质粒pLCNICK-1628 用ApaⅠ和XbaⅠ双酶切，酶切产物进行凝胶电泳检测，并用割胶试剂盒回收大片段。以pLCNICK-1628双酶切的大片段产物为质粒骨架，以1628-1，1628-2和P23-RFP为片段，通过多片段无缝克隆试剂盒连接，连接产物转化到E.coli TOP10感受态细胞中，涂布到含有 50μg/mL卡那霉素(Kan)抗性的LB固体平板上，30℃培养48h，待平板上长出单菌落后，挑取单菌落，用引物1628-1-F(SEQ：1) /1628-2-R(SEQ：4)进行菌落PCR验证。将验证正确的阳性转化子挑取到含有50μg/mL Kan抗性的LB液体培养基，30℃，200rpm过夜培养，提取质粒后送上海生工测序，测序正确的质粒命名为 pLCNICK-1628-RFP。
E.coli TOP10感受态细胞制备方法为从LB固体平板上挑取新活化的TOP10单菌落接种到含有4mL液体LB培养基的试管中，于37℃摇床振荡(≥200rpm)，过夜培养12～16h。按1:100的比例将过夜培养的E.coli TOP10接种到含有50mL液体LB培养基的三角瓶中，200rpm，37℃摇床振荡培养至OD600＝0.4～0.5。将菌液转移至50mL离心管中，冰上放置10min后，4℃，5000g离心10min。弃上清，用30mL 冰上预冷的CaCl2溶液重悬菌体，冰上预冷10min后，4℃，5000g离心10min，弃上清，将收集的菌体用1mL CaCl2甘油溶液重悬，每100 μL分装于冰上预冷的离心管中，-80℃保存待用。
步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长：
将野生型L.casei LC2W和LC2W△1628：RFP菌株分别接种于无抗的MRS液体培养基，37℃过夜静置培养。4500rpm离心3min，收集菌体，用无菌的PBS洗涤三次并重悬，调节至两者菌浓相同，用酶标仪扫描LC2W△1628：RFP的最优激发和发射波长，荧光标记的 LC2W△1628：RFP的最优激发波长λBa＝600nm以及最优发射波长λBb＝635nm，
从LB固体平板上挑取活化好的O157:H7-GFP单菌落接种到含有4 mL液体LB培养基的试管中，于37℃摇床振荡(≥200rpm)，过夜培养12-16h。以4500rpm，3min离心菌液收集菌体，用无菌磷酸缓冲盐溶液(PBS)冲洗三次并重悬，调节菌浓至1010CFU/mL，取200μL 置于黑色平底的96孔板中，利用酶标仪扫描出最佳激发和发射波长，确定荧光标记的O157:H7-GFP的最优激发波长λAa＝465nm以及最优发射波长λAb＝515nm，进入步骤3；
图1是本发明基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法的实施例中细菌光谱扫描图。
步骤3，体外光谱评估：固定激发波长为465nm，发射波长扫描范围为485-700nm，每隔5nm测定一次，对荧光标记的O157:H7-GFP 以及荧光标记的LC2W△1628：RFP进行发射光谱扫描，如图1中的A 图所示，在发射光波长为515nm时，分别确定荧光标记的O157: H7-GFP的荧光强度为1.0×108，所述荧光标记的LC2W△1628：RFP 的荧光强度为2.7×105；
固定激发波长为600nm，发射波长扫描范围为620-750nm，每隔 5nm测定一次，对荧光标记的O157:H7-GFP以及荧光标记的 LC2W△1628：RFP进行发射光谱扫描，如图1中的B图所示，在发射光波长为635nm时，分别确定荧光标记的O157:H7-GFP的荧光强度为2.0×103以及荧光标记的LC2W△1628：RFP的荧光强度为1.1× 105；
固定发射波长为515nm，激发波长扫描范围为360-495nm，每隔 5nm测定一次，对荧光标记的O157:H7-GFP以及荧光标记的 LC2W△1628：RFP进行激发波长光谱扫描，如图1中的C图所示，在激发光波长为465nm时，分别确定荧光标记的O157:H7-GFP的荧光强度为2.0×108以及荧光标记的LC2W△1628：RFP的荧光强度为2.6 ×106；
固定发射波长为635nm，激发波长扫描范围为360-615nm，每隔 5nm测定一次，对所述荧光标记的O157:H7-GFP以及荧光标记的 LC2W△1628：RFP进行激发波长光谱扫描，如图1中的D图所示，在激发光波长为600nm时，分别确定荧光标记的O157:H7-GFP的荧光强度7.1×103以及荧光标记的LC2W△1628：RFP的荧光强度为4.6× 105，进入步骤4；
步骤4，判断|λAa-λBa|≤100,|λAb-λBb|≤100，1/50≤FA1/FB1≤50， 1/50≤FA2/FB2≤50，1/50≤FA3/FB3≤50，1/50≤FA4/FB4≤50六个式子是否均不成立时，当判断为是时进入步骤5，否则进入步骤1，在本实施例中，由于|465-600|≤100,|515-635|≤100，1/50≤2.7×105/1.0× 108≤50，1/50≤1.1×105/2.0×103≤50，1/50≤2.6×106/2.0×108≤50， 1/50≤4.6×105/7.1×103≤50六个式子均不成立，所以进入步骤5；
步骤5，实验动物活体成像：将雄性C57BL/6小鼠随机分为三组，每组3只，分别为干酪乳杆菌LC2W组，肠出血大肠杆菌O157:H7组，干酪乳杆菌LC2W和肠出血大肠杆菌O157:H7混合组，所有小鼠在整个实验过程中正常饮食。活体成像实验开始前，干酪乳杆菌LC2W组小鼠灌胃200μL浓度为2.5×1010CFU/mL的红色荧光蛋白标记的干酪乳杆菌LC2W无菌水悬液；肠出血大肠杆菌O157:H7组小鼠灌胃 200μL浓度为2.5×1010CFU/mL的绿色荧光标记的肠出血性大肠杆菌O157:H7无菌水悬液；干酪乳杆菌LC2W和肠出血大肠杆菌O157: H7混合组小鼠同时灌胃100μL浓度为5.0×1010CFU/mL的绿色荧光标记的肠出血性大肠杆菌O157:H7无菌水悬液和100μL浓度为5.0× 1010CFU/mL的红色荧光蛋白标记的干酪乳杆菌LC2W无菌水悬液，分别在灌胃后的5min，1h，2h，4h，6h，8h，12h将各组小鼠经麻醉后放入活体成像仪操作室内，选定波长为465nm、515nm、600nm 以及635nm的滤光片，进行活体成像系统内观察拍照，得实验动物活体成像图，进入步骤6；
步骤6，ROI分析：对实验动物活体成像图进行ROI定量分析，
图2是本发明的实施例中基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法的实施例中灌胃后的小鼠的活体成像图。小鼠体内随时间变化的荧光强度表如表1 所示。
表1 小鼠体内随时间变化的荧光强度(x108p/s/cm2/sr)
Figure BDA0002121509780000141
如图2及表1 所示，干酪乳杆菌组小鼠在灌胃后的5min辐射强度为3.63×107p/s/cm2/sr，1h辐射强度达到最大值2.66×108p/s/cm2/sr，随后辐射强度开始逐渐减弱，在12h时减弱到5.41×107p/s/cm2/sr。混合组小鼠在灌胃后的5min辐射强度为8.58×107p/s/cm2/sr，在1h也达到最大值1.85×108p/s/cm2/sr，随后辐射强度也逐渐减弱，在12h 时只有7.06×106p/s/cm2/sr。可以看出混合组小鼠体内干酪乳杆菌的辐射强度低于干酪乳杆菌组小鼠体内干酪乳杆菌的辐射强度，且对于1 h干酪乳杆菌辐射强度的最大值，混合组的也明显低于干酪乳杆菌组。
单独给小鼠灌胃肠出血性大肠杆菌O157:H7后5min，O157:H7 的辐射强度为1.92×108p/s/cm2/sr，灌胃1h辐射强度达到2.18×108 p/s/cm2/sr，随后辐射强度减弱程度较为缓慢，一直保持在108 p/s/cm2/sr，即使到12h最低值也能达到1.02×108p/s/cm2/sr，说明肠出血性大肠杆菌O157:H7在小鼠体内不易被排出，相比于干酪乳杆菌更能保持稳定存在。而同时灌胃干酪乳杆菌LC2W和肠出血性大肠杆菌O157:H7的混合组小鼠的辐射强度则整体小于肠出血性大肠杆菌组小鼠的辐射强度，灌胃后5min O157:H7的辐射强度为1.26×108 p/s/cm2/sr，随后1h即有微弱的减少，直到12h降低为 1.08×107p/s/cm2/sr。与肠出血性大肠杆菌组小鼠的辐射强度减弱速度相比，混合组小鼠的辐射强度减弱的速度明显增大。说明干酪乳杆菌 LC2W能加速肠出血性大肠杆菌O157:H7在小鼠体内的运动，缩短菌在小鼠体内的停留时间，加快菌从小鼠体内排出。
实施例的作用与效果
根据本实施例所涉及的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，因为成功构建了CRISPR/Cas9D10A基因编辑质粒 pLCNICK-1628-RFP，所以，本实施例实现将红色荧光蛋白基因插入干酪乳杆菌LC2W基因组中，得到荧光标记菌株。同时由于本实施例中因为荧光标记的两种均各自的最优激发和发射波长下，都有较强的荧光表达，且能与另一株菌明显区分开，所以能够利用活体成像技术观察两种菌在体内的相互作用。
进一步地，根据本实施例所涉及的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，由于实施例使用了活体成像技术来对荧光标记的菌株在体内进行观察，所以本实施例使用的观察方法无需杀死老鼠，节约实验动物。
上述实施方式为本发明的优选案例，并不用来限制本发明的保护范围。
序列表
<110> 上海理工大学
<120> 一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法
<160> 10
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cacatctttt tctaaactag ggccccgatg aaggcaaaca agatg 45
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
taagatggca tttcacaacg ac 22
<210> 3
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cattgatgtg ccaccctttc ttatatg 27
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aagaaaggat gatatcacct ctagacaatc ttatgtcatc gg 42
<210> 5
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ttcgtcgttg tgaaatgcca tcttacgaaa agccctgaca accc 44
<210> 6
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
aacatcattg tcattcatat ttttc 25
<210> 7
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
atatgaatga caatgatgtt atggcgagta gcgaagacg 39
<210> 8
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tataagaaag ggtggcacat caatgttaag caccggtgga gtgac 45
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aagacgcgca ggccgttgga agc 23
<210> 10
<211> 27
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
cgcgcagtca ggtgcaaaaa tggttgc 27

Claims (5)

1.一种基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，所述细菌种类为两种，分别为益生菌以及致病菌，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1，荧光标记：分别对所述益生菌以及所述致病菌分别进行基因改造，使其分别表达出不同颜色的荧光蛋白基因，分别得到荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，进入步骤2；
步骤2，确定最优激发波长和最优发射波长：分别确定所述荧光标记的益生菌的最优激发波长λAa以及最优发射波长λAb以及所述荧光标记的致病菌的最优激发波长λBa以及最优发射波长λBb，进入步骤3；
步骤3，体外光谱评估：固定激发波长为λAa，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λAb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA1以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB1；
固定激发波长为λBa，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行发射光谱扫描，在发射光波长为λBb时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA2以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB2；
固定发射波长为λAb，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λAa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA3以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB3；
固定发射波长为λBb，对所述荧光标记的益生菌以及所述荧光标记的致病菌进行激发波长光谱扫描，在激发光波长为λBa时，分别确定荧光标记的益生菌的荧光强度FA4以及所述荧光标记的致病菌的荧光强度FB4，进入步骤4；
步骤4，判断|λAa-λBa|≤100,|λAb-λBb|≤100,1/50≤FA1/FB1≤50，1/50≤FA2/FB2≤50，1/50≤FA3/FB3≤50，1/50≤FA4/FB4≤50六个式子是否均不成立时，当判断为是时进入步骤5，否则进入步骤1；
步骤5，实验动物活体成像：对实验动物进行同时灌胃荧光标记的益生菌以及荧光标记的致病菌，在灌胃后每隔一段时间对实验动物分别在λAa、λBa、λAb、λBb下成像，得实验动物活体成像图，进入步骤6；
步骤6，ROI分析：对所述实验动物活体成像图进行ROI定量分析，
其中，所述益生菌为干酪乳杆菌，对所述益生菌进行基因改造所使用的含有荧光基因的质粒为pLCNICK-1628-RFP质粒，所述pLCNICK-1628-RFP质粒为敲除LC2W-1628基因并插入RFP基因的CRISPR/Cas9D10A质粒。
2.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：
其中，所述荧光标记的方法包括如下步骤：
步骤1，取含有荧光基因的质粒加入冰上融解的细菌的感受态细胞中，冰上放置15-30min后，35-45℃水浴锅中放置50-80s，再冰上放置1～2min，加入LB培养基至体积为1mL，得培养液，进入步骤2；
步骤2，所述培养液在150-200rpm/35-40℃振荡培养0.8-1.2h后，取80-120μL涂布到含250ng/mL-300ng/mL红霉素抗性的LB固体平板上，35-40℃过夜培养； 待平板上长出单菌落后，挑取进行菌落PCR验证，将验证正确的阳性菌落保藏待用，即得荧光标记的细菌。
3.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：
其中，所述荧光标记的方法包括如下步骤：
步骤1，将感受态细胞置于冰上解冻，取含有荧光基因的质粒与所述感受态细胞充分混合均匀，转移至冰上预冷的电击转化杯中，使混合物落入底部，调整电压仪到1.8-2.5kV，电击转化杯，迅速向转化杯中加入MMRS复苏培养基，得中间体A；
步骤2，将所述中间体A混匀后转移至离心管中，35-40℃静置培养1-3h； 涂布到含有8-12μg/mL红霉素抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养40-50h，待平板上长出单菌落后，挑取所述单菌落，在靶向基因上下游同源臂外侧基因组80-120bp处设计验证引物，进行菌落PCR验证；
步骤3，将验证有正确条带的阳性转化子挑取到MRS液体培养基吹吸重悬，沾取菌液划线接种于无任何抗性的MRS固体平板上，35-40℃培养至单菌落长出，挑取单菌落，用验证引物进行菌落PCR验证；
步骤4，重复步骤3直至有纯种菌株出现，即得荧光标记的细菌。
4.根据权利要求2或3所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：
其中，含有荧光基因的质粒为pLCNICK-1628-RFP质粒或pIB184-GFP质粒，
所述pLCNICK-1628-RFP质粒为敲除LC2W-1628基因并插入RFP基因的CRISPR/Cas9D10A质粒，
所述pIB184-GFP质粒为GFP基因的过表达质粒。
5.根据权利要求1所述的基于活体成像系统研究细菌在体内相互作用的方法，其特征在于：
其中，所述确定最优激发波长和最优发射波长的方法为从LB固体平板上挑取活化好的所述荧光标记的细菌的单菌落接种到含有3-5mL液体LB培养基的试管中，于35-40℃摇床振荡，过夜培养12-16h，再以3500-4500rpm/3-5min离心菌液收集菌体，用无菌磷酸缓冲盐溶液冲洗菌体2-3次并重悬，调节菌浓至109-1010CFU/mL，取150-220μL置于黑色平底的96孔板中，利用酶标仪扫描出最佳激发波长和最佳发射波长。
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基于CRISPR/Cas9系统对干酪乳杆菌进行红色荧光蛋白标记;张莹等;《工业微生物》;20190222;第49卷(第1期);第1.2.4节 *

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