CN102753679A - 新的幽门螺杆菌菌株及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于递送生物活性剂的幽门螺杆菌菌株，特别的是，本发明提供幽门螺杆菌的分离的菌株，所述菌株具有：(a)低致病性；(b)天然转化能力；和(c)无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。

Description

新的幽门螺杆菌菌株及其用途
技术领域
本发明涉及对于递送生物活性剂有用的幽门螺杆菌的菌株。
背景技术
活的细菌，例如益生菌或活的减毒病原体，代表了递送一系列生物活性剂，如疫苗抗原、生物活性分子或甚至DNA的引人注目的运载体(vehicle)。细菌递送运载体的固有优势包括口服施用，以及化合物在一段延迟的时间内的持续释放消除了重复服药的必要。
目前商业上可获得的疫苗和药物主要是胃肠外施用、需要多次服用并依赖于医务人员和冷链的。由于活细菌运载体可以口服递送，可能只需要单一服用并能递送大分子，例如，多个抗原，它们为常规的预防和治疗剂提供了备选方案。此外，细菌运载体非常适合大规模生产和配制，并且冻干时稳定。这些属性使这种递送形式很有吸引力，并可能导致各种疫苗和药物的合规性提高，分配更佳和成本降低。
已经推荐了几种基于多种细菌，包括志贺氏菌属菌种(Shigella spp.)(美国专利No.7,235,234)、沙门氏菌属菌种(Salmonella spp.)(美国专利申请No.20090022691)和乳杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)(美国专利申请No.20090074734)的细菌递送系统，但在这些系统中仍存在一些固有问题。
一般而言，为了用作递送运载体，要操作细菌以产生具有所要求特性的菌株。重要的是，应确保细菌的安全性概况(profile)。传统的用作递送运载体的细菌已经减毒为低病原性或非致病性；然而，由于致病基因可以重新获得并导致细菌回复为具有致病能力的有毒形式，很难保证这些细菌的安全。此外，操纵细菌菌株使其可进行转化或定殖(colonize)于动物模型，可导致间接的(secondary)不良特性的产生，或最低限度妨碍实验和细菌递送运载体转入临床的延迟。例如，为使实验可以在动物模型，如小鼠中进行，对于菌株的操作可导致此株系不定殖于目标宿主，通常为人。因此，应该尽可能地避免为产生具有所需特点的菌株而操纵细菌。
本发明的发明人先前已经建议在细菌递送系统中使用幽门螺杆菌(美国专利申请号20070134264)，其解决了上述鉴定的许多问题；然而，尽管美国专利申请号：2007013464提供了丰富的关于使用幽门螺杆菌作为细菌递送运载体的信息，开发具有特定性质的特定细菌菌株将是有用的。
发明内容
在第一个方面，本发明提供幽门螺杆菌的分离的菌株，其具有以下特征：(a)低致病性；(b)天然转化能力；和(c)无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。
幽门螺杆菌具有独特的特点，使其适合用作生物活性剂的活细菌递送运载体。本发明的幽门螺杆菌菌株分离自无症状并显示最小的病理学的个体，使菌株安全用于人。此外，本发明的菌株是天然可转化的并且能够定殖于幽门螺杆菌-小鼠模型而无需事先适应。这促进了临床前试验并意味着最小程度地操纵菌株，允许准确、直接地翻译对人的结果。因此，本发明的幽门螺杆菌菌株高度适于用作活细菌递送运载体。
在一些实施例中，本发明的幽门螺杆菌能够在哺乳动物受试者中形成慢性感染。
在一些实施例中，本发明的幽门螺杆菌菌株不表达一种或多种功能性致病因子，例如vacA s1或cagA。
在第二个方面，本发明提供幽门螺杆菌的分离的菌株，其或者是：
(i)vacA s1或cagA阴性；或者是
(ii)vacA s2和cagA阳性；并且
其中所述的幽门螺杆菌菌株具有：
(a)低致病性，
(b)天然转化能力；及
(c)无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。
在一些实施例中，本发明提供幽门螺杆菌菌株，其具有选自下组的菌株的特性：以登录号V09/009101保藏于国家计量研究院(National MeasurementInstitute)的OND737；以登录号V09/009102保藏于国家计量研究院的OND738；以登录号V09/009103保藏于国家计量研究院的OND739；以登录号V10/014059保藏于国家计量研究院的OND248；以登录号V10/014060保藏于国家计量研究院的OND256；和以登录号V09/009104保藏于国家计量研究院的OND740，或其具有如上述定义的能力的突变体或衍生株。
在第三个方面，本发明提供幽门螺杆菌菌株OND737，以登录号V09/009101保藏于国家计量研究院。
在第四个方面，本发明提供幽门螺杆菌菌株OND738，以登录号V09/009102保藏于国家计量研究院。
在第五个方面，本发明提供幽门螺杆菌菌株OND739，以登录号V09/009103保藏于国家计量研究院。
在第六个方面，本发明涉及幽门螺杆菌菌株OND740，以登录号V09/009104保藏于国家计量研究院。
在第七个方面，本发明涉及幽门螺杆菌菌株OND248，以登录号V10/014059保藏于国家计量研究院。
在第八个方面，本发明涉及幽门螺杆菌菌株OND256，以登录号V10/014060保藏于国家计量研究院。
可转化分离的幽门螺杆菌菌株以产生表达感兴趣的基因的重组菌株。在一些实施例中，感兴趣的基因由核酸编码，其优选是以分离的形式获得的。本领域技术人员应知道，本发明的分离的核酸分子可以是cDNA、基因组DNA、RNA、或其杂合分子。优选地，分离的核酸是cDNA。
优选地，分离的核酸整合入重组菌株的基因组中。
分离的核酸可编码与幽门螺杆菌同源或异源的多肽。
在某些方面，分离的核酸编码生物活性剂如抗原、有机分子、药理剂例如治疗剂或预防剂，如基因产物或基因序列(分离的核酸)。
幽门螺杆菌感染的天然特征，如特异性、非保护的循环抗体和终身持久性的存在，意味着幽门螺杆菌在递送疫苗抗原中特别有用。因此，在一些实施例中，本发明提供通过施用表达感兴趣的抗原的幽门螺杆菌的重组菌株，在个体中诱导抗体应答的方法。
在第九个方面，本发明提供鉴定适于体内递送生物活性剂的幽门螺杆菌菌株的方法，包括：(a)从无幽门螺杆菌感染症状的个体分离幽门螺杆菌菌株；(b)确定所述菌株是否具有天然转化能力；及(c)确定所述菌株是否具有无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力，其中具有天然转化能力和无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力的菌株适于体内递送生物活性剂。
在第十一个方面，本发明提供一个优化的螺杆菌属感染的动物模型，其中所述动物以富含酪蛋白的食物和/或酸化水饲养，以使相对于没有以富含酪蛋白的食物和/或酸化水饲养的动物，其幽门螺杆菌的定殖是增强的。
在一些实施例中，所述动物以富含酪蛋白的食物和酸性水饲养，其中水是约pH2。在一些实施例中，所述动物是小鼠。
在第十二个方面，本发明提供随机扩增的多态DNA聚合酶链式反应用于鉴定螺杆菌属菌种的用途。
在一些实施例中，使用具有SEQ ID NO：1所示序列的正向引物和具有SEQID NO：2所示序列的反向引物通过聚合酶链式反应扩增螺杆菌属DNA。
附图简述
图1：测试幽门螺杆菌临床分离株的天然转化。基于其抗生素抗性表型，将来自Karolinska(K)研究所的14株和来自SCGH(H)的28株鉴定为可用DNA转化的。通过选择平板上获得的转化菌落数指示可转化的菌株：+低(＜20)，++(20-50)，+++(＞50)，++++(＞100)。
图2：测试可转化的幽门螺杆菌菌株在DBA/2小鼠模型的胃部定殖。小鼠(n＝3)感染1x109 CFU/ml的细菌。4周后培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。根据获得的菌落数对定殖水平进行分级：+低(＜20)，++(20-50)，+++(＞50)，++++(＞100)。
图3：测试可转化的幽门螺杆菌菌株在DBA/2小鼠模型的胃部定殖。小鼠(n＝10-12)感染1x109 CFU/ml的细菌。4周后培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。通过每组中感染幽门螺杆菌的小鼠数目确定定殖频率。结果表示为个体和每组平均％定殖。
图4：测试幽门螺杆菌菌株在DBA/2小鼠模型中的长期胃部定殖。小鼠(n＝4-6)感染1x109 CFU/ml的细菌。6个月后培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。通过每组中感染幽门螺杆菌的小鼠数目确定定殖频率。结果表示为个体和每组平均％定殖。
图5：使用定殖和非定殖的幽门螺杆菌菌株感染DBA/2小鼠并测量幽门螺杆菌特异性免疫反应。小鼠(n＝5)感染1x109 CFU/ml的细菌。三个月后收集血清并通过ELISA测量IgG特异性抗体。结果表示为405nm的OD。
图6：使用定殖的幽门螺杆菌菌株感染DBA/2小鼠并测量幽门螺杆菌特异性免疫反应。小鼠(n＝5)感染1x109 CFU/ml的细菌。在感染后1、2、3和5个月收集血清并通过ELISA测量IgG特异性抗体。结果表示为405nm的OD。
图7：测试幽门螺杆菌菌株在C57BL/6小鼠模型中2周后的胃部定殖。小鼠(n＝3)感染1x109 CFU/ml的细菌。培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。通过每组中感染幽门螺杆菌的小鼠数目确定定殖频率。结果表示为个体和每组平均％定殖。
图8：测试幽门螺杆菌菌株在各小鼠株系中在经口感染后4周的胃部定殖。小鼠(n＝10)感染1x109 CFU/ml的细菌。培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。通过每组中感染幽门螺杆菌的小鼠数目确定定殖频率。
图9：幽门螺杆菌菌株基因型与临床病理学。
图10：使用来自经口感染幽门螺杆菌菌株3个月后的DBA/2小鼠的汇集的血清的免疫印迹。小鼠(n＝5)感染1x109 CFU/ml的细菌。收集血清并汇集用于针对细菌全细胞裂解液(w)和外部(o)和内部(i)膜蛋白进行免疫印迹分析。
图11：使用引物1254或1281扩增的幽门螺杆菌菌株的RAPD PCR。泳道M或M1：1kb的DNA阶梯标记物(ladder)，泳道N：各引物的阴性对照，泳道OND：分别是单一的幽门螺杆菌菌株，泳道M2，100bp的DNA阶梯标记物。命名参考见表10。
本发明优选实施方案的说明
在详细描述本发明之前，可以理解的是本发明不限于特别例示的方法而当然可以有所变化。也是可以理解的是，本文所使用的术语只是出于描述本发明的特定实施方案的目的，而不意欲限制，其只受限于所附的权利要求。
本文引用的所有的出版物、专利和专利申请，无论前文或下文，通过提述以其整体并入本文。然而，引用本文中提及的出版物目的在于描述和披露出版物中报道的、可能与本发明相关而使用的试验方案、试剂和载体。此处任何信息均不应理解为承认本发明无权早于凭借先前发明的这些公开内容。
此外，本发明的实施，除非另有指示，在本领域的技能内采用传统的微生物学、免疫学和分子生物技术和药理学。这些技术对于技术人员是熟知的，并在文献中已充分解释。参见，例如Prescott等，“Microbiology”(1999)第4版，WCB McGraw-Hill；Sambrook等，“Molecular Cloning：A LaboratoryManual”(1989)(2001)，第2和3版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，和Roitt等，“Immunology”(1998)，第5版，Mosby。
必须指出的是，本文中以及所附权利要求中使用的，单数形式的“a”、“an”和“the”包括复数涵义，除非上下文清楚地另有规定。因此，例如，提及“核酸”包括多种这样的核酸，而提及“分离的菌株”是指一个或多个菌株，等等。除非另有定义，否则，本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域普通熟练技术人员的通常理解具有相同的涵义。虽然类似或等同于本文描述的任何材料和方法可以用来实施或测试本发明，现在描述优选的材料和方法。
在随后的权利要求和本发明前面的描述中，除由于表达语言或必然含意而上下文另有要求外，词语“包括”或变型，如“包含”或“含有”，以广义范围的含义使用，即指定存在所述特征，但不排除存在或添加本发明的多个实施方案中的其他特征。
本文所述的术语“基本上由...组成”用来定义组合物和方法时，是指排除对组合具有任何实质意义的其他元素。因此，如本文定义的基本上由元素组成的组合物不排除来自分离和纯化方法的痕量污染物和药学上可接受的载体，如磷酸盐缓冲盐水、防腐剂等。“由...组成”是指排除多于痕量元素的其他成分和用于施用本发明的组合物的基本方法步骤。由这些转变术语的每一个所限定的实施例在本发明的范围内。
本发明涉及作为活细菌递送运载体有用的幽门螺杆菌菌株。这些菌株的一个关键特征是其低致病性。术语“低致病性”是指幽门螺杆菌菌株能够建立无症状的感染，即不会导致消化性溃疡或胃癌并导致胃粘膜最小的病理，即很少或根本不存在胃上皮的萎缩、淋巴细胞浸润或粒细胞浸润。
在一些实施方案中，本发明的幽门螺杆菌菌株不表达一种或多种功能性致病因子。由致病基因编码的致病因子通过损坏上皮细胞破坏粘膜屏障并造成明显的疾病，包括消化性溃疡和胃癌。例如，致病基因vacA s1编码空泡毒素，而致病基因cagA编码通过IV型分泌注入宿主细胞的毒素。在一个特定的实施方案中，本发明的菌株缺乏vacA s1或cagA，即不表达功能性vacAs1或cagA。不希望受限于任何特定的假说，已表明这两种致病因子均是致病性所需的。
虽然细菌递送运载体具有低致病性是重要的，它们形成慢性感染也是所希望的。术语“慢性感染”是指进行6个月以上的感染。因此，在一些实施方案中，本发明的幽门螺杆菌菌株可具有在哺乳动物受试者中形成慢性感染的能力。
本文所用的术语“哺乳动物受试者”是指人、灵长类动物、马科、犬科或猫科动物。
本发明的幽门螺杆菌菌株还具有天然转化的能力。术语“天然转化”和其语法上等同的词，是指在实验室条件下(不使用通常天然不发生的条件，例如电穿孔)摄取、基因组并入和表达外源DNA、而产生的细胞的遗传改变。这种特性促进感兴趣的编码生物活性剂的基因并入细菌的基因组和“重组菌株”的产生。
本发明的幽门螺杆菌菌株还具有无需事先宿主适应而感染和定殖于小鼠的能力。取自人的细菌不一定感染不同的物种，如小鼠。因此，在小鼠模型中的实验可以开始前往往需要宿主适应。小鼠宿主适应一般涉及从小鼠到小鼠的细胞传代以产生宿主适应的变体。而且，一旦在小鼠中实验结束(conclude)，则菌株可不能感染和定殖于人，导致需要进一步操作。因此，使用能够感染小鼠而无需宿主适应的分离自人的幽门螺杆菌菌株限制了对幽门螺杆菌菌株的操作，并允许菌株对人直接的翻译。
如上所述，本发明的发明人已经鉴定具有细菌递送运载体所需特性的幽门螺杆菌的临床分离株的非专有的实例。鉴定的幽门螺杆菌菌株按照布达佩斯条约的条款，于2009年4月22日(OND737，OND738，OND739和OND740)和2010年5月28日(OND248和OND256)保藏于国家计量研究院(NMI)，1/153Bertie Street，Port Melboume，Victoria，澳大利亚。幽门螺杆菌菌株已指定以下登录号：V09/009101(OND737)；V09/009102(OND738)；V09/009103(OND739)；V09/009104(OND740)；V10/014059(OND248)和V10/014060(OND256)。
本发明还涵盖幽门螺杆菌菌株OND737、OND738、OND739、OND740、OND248和OND256的突变体或衍生株。本文所述的术语“突变体”或“衍生株”，是指基因组DNA与幽门螺杆菌菌株OND737、OND738、OND739、OND740、OND248和OND256及如本文所述具有所述菌株的相应特征的菌株具有至少约80％，优选至少约90％，和最优选至少约95％相同的细菌。
本发明的幽门螺杆菌菌株可用于递送生物活性剂。活细菌递送运载体通过表达编码生物活性剂的基因递送生物活性剂。一般来说，感兴趣的基因由核酸编码，其优选是以分离的形式获得。本领域熟练技术人员应知道，本发明分离的核酸分子可以是cDNA、基因组DNA、RNA，或其杂合分子。优选地，分离的核酸是cDNA。
如本文所用的术语“分离的核酸”，是指一种核酸，其结构不同于任何天然存在的核酸或天然存在的基因组核酸的跨越多于三个分隔的基因的任何片段。因此，该术语含盖，例如，(a)DNA分子，其具有天然存在的基因组DNA分子的部分序列，但其两侧并不均是位于其天然存在的生物体的基因组中该分子的那部分侧翼的编码序列；(b)核酸，其以这样的方式整合入载体或原核或真核生物的基因组DNA中使所得分子不同于任何天然存在的载体或基因组DNA；(c)分隔的分子，如cDNA、基因组片段、聚合酶链式反应(PCR)产生的片段、或限制酶切片段；和(d)重组核苷酸序列，其是杂合基因(即编码融合蛋白的基因)的部分。分离核酸的方法是本领域技术人员所熟知的。
分离的核酸可以是同源或异源的，然而，一般地分离的核酸是异源的，即在自然界中或引入细菌或其祖先之前，不是由幽门螺杆菌表达的。
在一些实施方案中，分离的核酸编码生物活性剂。技术人员应知道，本发明的方法可用于递送各种生物活性剂。合适的制剂的实例包括那些能够在局部或全身有功能的，例如能够发挥内分泌活性影响局部或全身的代谢的活性剂，和/或能够调节属于免疫/造血系统的细胞的活性的活性剂，和/或能够在体内影响各种正常或肿瘤细胞的生存、生长和分化或影响免疫调节或诱导对损伤和感染的急性期炎症反应的活性剂，和/或能够增强或诱导由作用于靶细胞受体上的趋化因子介导的对细胞和组织的感染的抗性，或上皮细胞增殖或促进伤口愈合的活性剂，和/或调节体内细胞的物质的表达或产生的活性剂。
这种生物活性剂的具体实例包括胰岛素、生长激素、促乳素、降钙素、促黄体激素、甲状旁腺素、生长抑素、促甲状腺激素、血管活性肠肽、采用反平行4α螺旋束结构的结构组1细胞因子，例如IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，GM-CSF，M-CSF，SCF，IFN-γ，EPO，G-CSF，LIF，OSM，CNTF，GH，PRL或IFN α/β；常常与细胞表面相关的、形成对称同源三聚体和亚基采取某些病毒外壳蛋白所述的β-凝胶卷(jelly roll)构象的结构组2的细胞因子，例如肿瘤坏死因子(TNF)家族的细胞因子，如TNFα，TNFβ，CD40，CD27或FAS配体，IL-1家族的细胞因子，成纤维细胞生长因子家族，血小板衍生的生长因子，转化生长因子β和神经生长因子；结构组3的细胞因子包括短链α/β分子，其产生为大的跨膜前体分子，其中每个都在细胞外区域包含至少一个表皮生长因子(EGF)域，如EGF家族的细胞因子，以它们具有在保守的半胱氨酸残基周围集群的氨基酸序列为特征的趋化因子(C-C或C-X-C趋化因子亚组)或胰岛素相关的细胞因子；结构组4的细胞因子表现出镶嵌结构，如由不同的结构域，如EGF、免疫球蛋白样和kringle域组成的神经调节蛋白heregulin或neuregulin。
此外，生物活性剂可以是如上定义的生物活性剂的受体或拮抗剂。
因此，本发明提供表达生物活性剂的重组幽门螺杆菌菌株，其用于医药用途，例如用于人体或动物体的治疗方法，而且特别是预防(“疫苗”)。
幽门螺杆菌感染的天然特征，如特异性、非保护的循环抗体和终身持续性的存在，意味着幽门螺杆菌在递送疫苗抗原和在个体中诱导抗体反应中特别有用。因此，在特定的实施方案中，本发明提供表达抗原的幽门螺杆菌重组菌株和通过对个体施用该细菌在个体中诱导抗体反应的方法。“抗体反应”是指针对重组细菌表达的感兴趣的抗原的特异性抗体的诱导。
编码生物活性剂的分离的核酸可以通过本领域已知的任何方法整合入幽门螺杆菌菌株的基因组。例如，表达载体和/或载体质粒可用于将以分离的核酸形式存在的感兴趣的基因插入到细菌染色体中。在优选的实施方案中，分离的核酸将通过天然转化和同源重组并入细菌染色体。例如，将5-15μl TE缓冲液中0.3-2μg的包含抗生素标记或突变的rpsL等位基因(Dailidiene等，(2006)“Contraselectable streptomycin susceptibility determinant for geneticmanipulation and analysis of Helicobacter pylori”，Appl Environ Microbiol，72，5908-5914)的DNA片段加入幽门螺杆菌培养液中并混合。然后将细菌在气室中温育24小时。收集DNA处理的细胞并铺于补充卡那霉素(10μg/ml)、氯霉素(10μg/ml)、链霉素(10μg/ml)和红霉素(10μg/ml)的选择性血琼脂板上并温育。细菌的生长指示转化是成功的。
本发明还提供鉴定幽门螺杆菌菌株适于用作细菌递送运载体的方法。所述方法的第一步包括从对幽门螺杆菌感染无症状的个体分离幽门螺杆菌菌株。优选的所述个体为至少50岁、对幽门螺杆菌感染无症状、并显示没有或很少的胃上皮萎缩的个体。然后测试分离株以确定该菌株是否具有天然转化能力和无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。指定能够天然转化和无需宿主适应而定殖与小鼠胃粘膜的分离的菌株适于用作细菌递送运载体和在体内递送生物活性剂。
现在将以仅参考以下非限制性的实施例的方式进一步说明本发明。然而应该理解，以下实施例仅供说明，而不应以任何方式将其作为上述发明的一般性的限制。
实施例1  临床菌株的分离
从瑞典Karolinska研究所获得23株幽门螺杆菌临床分离株和从SirCharles Gardiner Hospital，Western Australia获得50株幽门螺杆菌临床分离株。临床分离株从甘油贮存物复苏并在控气室中在6-抗生素的选择性血琼脂平板上生长(万古霉素10μg/ml，甲氧苄啶μg/ml，多粘菌素B 2500 IU/L，两性霉素B 2.5μg/ml)。生长24小时后从板上拭下细菌和重悬于BHIB(Oxoid)。从板上直接收集细菌以通过在600nm处测量光密度(OD600)给出每毫升约1×109细菌。菌株的基因分型如前所述进行(Tiwari等，(2007)“A simplemultiplex PCR assay for diagnosing virulent Helicobacter pylori infection inhuman gastric biopsy specimens from subjects with gastric carcinoma and othergastro-duodenal diseases”，J Appl Microbiol，103，2353-2360)。
对所有临床分离株的摄取DNA和通过同源重组将其整合入其基因组的能力进行了筛选。幽门螺杆菌临床分离株从甘油贮存物接种到选择性琼脂平板。平板在37℃在包含两个Campygen套件气包的气控室温育2-4天。传代培养细菌并重铺于新鲜平板上。将平板进一步在所述室中在37℃培养18-20小时并将单菌落铺于补充DENT(Oxoid，SR0147)的新鲜平板上。将平板在CO2培养箱中温育5个小时。接着，将5-15μl TE缓冲液中的0.3-2μg包含抗生素标记或突变的rpsL等位基因(Dailidiene等，(2006)“Contraselectable streptomycinsusceptibility determinant for genetic manipulation and analysis of Helicobacterpylori”，Appl Environ Microbiol，72，5908-5914)的DNA片段加入幽门螺杆菌菌株并混合。将细菌在气室中再温育24小时。收集DNA处理的细胞并铺于补充卡那霉素(10μg/ml)、氯霉素(10μg/ml)、链霉素(10μg/ml)和红霉素(10μg/ml)的选择性血琼脂板上并温育。转化后确定细菌的生长。
图1显示能够经受天然转化并成为抗生素抗性的菌株的频率。在筛选的73株中，基于其抗生素抗性表型，将大约60％(42/73)(14株来自Karolinska(K)研究所和28株来自SCGH(H))鉴定为可用DNA天然转化。随后，在体内在小鼠模型中测试了这些菌株的定殖能力(实施例2)。
实施例2  幽门螺杆菌DBA/2J小鼠模型中定殖于胃的临床分离株的鉴定
在DBA/2J小鼠模型中，测试了实施例1(图1)中鉴定的42株临床分离株的定殖于胃粘膜的能力。
雌性、6-8周龄的DBA/2J小鼠购自澳大利亚动物资源中心。所有小鼠无幽门螺杆菌并允许其于实验开始前有2周的驯化期。无限制地为动物提供酸化水和标准的(基于鱼粉的)啮齿动物饮食，除非另有规定。在一些实验中，为动物喂食素食(无鱼粉)或半合成的、富含酪蛋白的蛋白质饮食和中性(非酸性)饮用水。饮食来自Specialty Feeds，Western Australia。所有的实验工作根据许可RA 3/100/676由西澳大利亚动物伦理委员会批准。
小鼠(n＝3)感染BHIB中的1x109 CFU/ml的细菌。为确定定殖水平，感染后4或24周从动物收获胃组织。沿大弯(greater curvature)解剖胃通过轻轻地用PBS洗涤去除残余的食物。将打开的胃放置在500μl PBS中并用5mm不锈钢珠以30的频率(Qiagen TissueLyser II)匀浆30秒。将样品进一步以10的频率匀浆2分钟。将系列稀释的匀浆液铺于补充两性霉素B(8μg/ml)、甲氧苄啶(5μg/ml)和万古霉素(6μg/ml)、萘啶酸(10μg/ml)、多粘菌素B(10μg/ml)和杆菌肽(200μg/ml)的BHI琼脂板上。将平板放入含有两个Campygen套件气包(Oxoid，CN0025A)的气控室中并在37℃温育。铺板后5-7天确定细菌生长。
在鉴定为天然可转化的42株中，只有15株能够成功地定殖于DBA/2J幽门螺杆菌小鼠模型中(图2)。原始来源的初步结果汇总于表1。鉴定了最佳定殖菌株并进一步验证了体内感染频率和定殖鲁棒性(robustness)。
表1  可转化的、定殖的幽门螺杆菌临床分离株的总结
Figure BDA0000133666520000111
实施例3  感染的鲁棒性和频率
为进一步研究实施例2中定殖于小鼠模型的15株菌株的鲁棒性，进行了更多的具有更大动物数目的实验。这允许选择出作为真正的定殖者的临床分离株。对以上鉴定为天然可转化的且能够定殖于小鼠胃粘膜的每个菌株进行了多轮实验。简言之，小鼠(n＝10-12)感染1x109 CFU/ml的细菌。4周后培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。
结果表明，在初步体内筛选中鉴定的5株(K6、K8、K18、H27和H40)是鲁棒的定殖者，而其余的10株是小鼠胃粘膜的不良定殖者。由于SCGH临床分离株显示不良的和不一致的定殖结果，在第二轮后终止了实验(图3)。SCGH菌株与来源自Karolinska研究所的菌株相比，生长也更缓慢。这些差异可归因于在不同地点的培养和存储技术中的差异。
实施例4  在DBA/2J小鼠模型中的长期定殖
通过进行长期的定殖实验，研究了建立幽门螺杆菌菌株的慢性感染的能力。基于初始(第1轮)定殖数据，测试了最强和最弱定殖的临床分离株的选择。将如购买和在实施例2中处理的小鼠(n＝4-6)经口感染1×109 CFU/ml的定殖幽门螺杆菌菌株(K6、K8、K11、K18、H27和H41)和非定殖菌株(K12、K14、K16、K17、H23和H44)。经口感染6个月后，如上述实施例中所述从小鼠胃组织收获并培养细菌并进行定量。鲁棒的定殖株；K6、K8、K18和H27仍然能够感染约50％的动物(图4)。如所预期的，用非定殖菌株感染的小鼠没有定殖，而弱定殖株K11和H41未能长期定殖于小鼠胃粘膜。这表明不同菌株具有不同的定殖于小鼠胃的能力，并且在此我们已鉴定了能够做到这些而无需在宿主中适应的至少4株菌株。
实施例5  定殖的幽门螺杆菌临床分离株的免疫原性
接着，我们确定了在体内小鼠模型中鉴定的定殖幽门螺杆菌菌株的免疫原性并将其与非定殖菌株进行比较。在DBA/2J小鼠模型中，测试了幽门螺杆菌临床分离株在经口感染后3个月的诱导特异性IgG抗体反应的能力。小鼠(n＝5)经口感染1×109 CFU/ml的定殖幽门螺杆菌菌株(K6、K8、K11、K18、H27和H41)和非定殖株(K12、K14、K16、K17、H23和H44)。感染后3个月，将动物放血，收集血清并ELISA测量幽门螺杆菌特异性IgG抗体。
用10μg/ml的幽门螺杆菌X47细胞裂解物涂覆96孔板(NUNC
Figure BDA0000133666520000121
)并在4℃温育过夜。然后将板在PBS/0.05％Tween-20中洗涤5次并用2％BSA在37℃封闭2个小时。将板洗涤两次并将血清样本(1/20稀释)一式两份加入孔中。然后将板在室温(RT)下温育1小时，随后洗涤并加入检测抗体(缀合于碱性磷酸酶的抗-小鼠IgG，1/1000，Sigma)。将板在室温再温育1小时然后洗涤。用P-NPP将板显色(develop)40分钟然后用2M NaOH终止反应。抗体效价表示为在405nm测量的光密度值。
结果显示，K6和K8，两个最强的定殖菌株，是免疫原性最强的(图5)。临床分离株，K11、K18、H27和H41是免疫原性弱得多的。有趣的是，尽管在小鼠模型中感染后4周不能定殖于胃粘膜，但临床分离株H44在经口感染后三个月显示强的幽门螺杆菌-特异性IgG反应，表明此菌株可以在实验进程中的早期瞬时感染所述小鼠。
在进一步分析中，在定殖菌株感染的小鼠中测量幽门螺杆菌-特异性IgG抗体多至5个月。结果表明，K6和K8菌株诱导最强、最持久的幽门螺杆菌-特异性抗体反应多至感染后5个月(图6)。这些数据支持了K6和K8菌株免疫原性最强，而K11、K18、H27和H41免疫原性较弱的观察。
实施例6  在幽门螺杆菌C57BL/6小鼠模型中定殖于胃部的临床分离株 的鉴定
为了确保候选的幽门螺杆菌菌株没有错过我们在DBA/2小鼠模型中的筛选(实施例2)，我们在C57BL/6小鼠模型中重复了筛选，该小鼠模型对于临床分离株的感染的宽容性低得多(far less permissive)。
雌性、6-8周龄的C57BL/6小鼠购自澳大利亚动物资源中心。所有小鼠无幽门螺杆菌并允许其于实验开始前有2周的驯化期。无限制地为动物提供酸化水和标准的(基于鱼粉的)啮齿动物饮食，除非另有规定。在一些实验中，为动物喂食素食(无鱼粉)或半合成的、富含酪蛋白的蛋白质饮食和中性(非酸性)饮用水。饮食来自Specialty Feeds，Western Australia。所有的实验工作根据许可RA 3/100/676由西澳大利亚动物伦理委员会批准。
对实施例1中鉴定的14株可转化的幽门螺杆菌菌株以与实施例2中使用的相同的程序测试了定殖。我们鉴定了额外的菌株K4，其在C57BL/6小鼠模型中成功定殖，并且还检测到另一菌株K12，尽管此菌株的定殖不鲁棒的多(far less robust)(图7)。在此模型中，还选出了K8菌株作为弱定殖者。所有其余的幽门螺杆菌临床分离株不能定殖于C57BL/6小鼠。
实施例7  幽门螺杆菌小鼠模型的优化
由于小鼠模型不是幽门螺杆菌的天然宿主，在此模型中建立感染可能是困难的，为了改进幽门螺杆菌菌株在体内的定殖，我们通过测试对包括食物和水的饮食改变来开始优化该小鼠模型。
首先，我们比较不同食物的饮食，包括标准的基于鱼粉的饮食、素食(无鱼粉)和半合成的富含酪蛋白的蛋白质饮食(93G)。
其次，对应中性饮用水(pH 6)，我们评估酸性(pH 2.5)的影响。测试这些方法以确定使用X47实验室菌株，在C57BL/6和DBA/2小鼠模型中是否有一些因素能够提供定殖中的改善。
结果显示，与标准的鱼粉饮食相比，在喂食富含酪蛋白的93G饮食(SpecialtyFeeds，Western Australia)的小鼠中幽门螺杆菌的定殖得到改进(表2)。素食(无鱼粉)饮食不显示定殖中的任何改进(数据未显示)。使用半合成、富含酪蛋白的饮食增加了小鼠中幽门螺杆菌的定殖率，因而产生改进的小鼠模型。有趣的是，从标准酸化水(pH 2)至中性水(pH 6)改变饮用水对小鼠模型有负面影响，其胃部的细菌载量降低(表2)。事实上，使用酸性水对小鼠是更好的。
表2  在小鼠模型中饮食对幽门螺杆菌定殖的影响
Figure BDA0000133666520000141
在C57BL/6和DBA/2小鼠模型中测试幽门螺杆菌菌株X47在2-4周后的胃部定殖。小鼠(n＝3)感染1×109 CFU/ml的细菌。培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。对于每个动物确定每毫升胃组织的定殖载量。结果表示为每组的平均细菌载量。
模型最有可能由于在小鼠胃部的其他细菌的抑制。随后的体内筛选实验在这些饮食条件下进行。
实施例8  在其他小鼠模型中幽门螺杆菌定殖菌株的筛选
由于每株幽门螺杆菌临床分离株具有独特的性质且特性上的差异，遗传背景不同的其他小鼠株系可能会更适合作为体内模型。因此，我们筛选了5株先前鉴定的幽门螺杆菌菌株(K4、K8、K12、K11和K18)在包括C3H、FVB/n，CBA、DBA/2、129/s和Swiss(ARC)的6个小鼠株系中的定殖。
雌性、6-8周龄的DBA/2J、C3H、CBA、FVB/n、129/s、Swiss(ARC)和C57BL/6小鼠购自澳大利亚动物资源中心。所有小鼠无幽门螺杆菌并允许其于实验开始前有2周的驯化期。无限制地为动物提供酸化水和标准的(基于鱼粉的)啮齿动物饮食，除非另有规定。在一些实验中，为动物喂食素食(无鱼粉)或半合成的、富含酪蛋白的蛋白质饮食和中性(非酸性)的饮用水。饮食来源于Specialty Feeds，Western Australia。所有的实验工作根据许可RA3/100/676由西澳大利亚动物伦理委员会批准。
由于培养困难，K6菌株不包括在实验中。此外，包括小鼠-适应株X47作为比较物并且采用喂食半合成的富含酪蛋白的蛋白质饮食(93G饮食)和酸化水的小鼠进行所有实验。
结果表明，K4、K8和K18菌株能够良好定殖于几乎所有的小鼠株系并达到高的程度。K11和K12菌株能够定殖于多种小鼠尽管以低得多的频率进行。正如所预期的，X47能够鲁棒地定殖于所有小鼠株系并具有高水平的细菌载量。这些结果描述于如下的表3和图8中。
总之，认为K4、K8和K18是广谱的、鲁棒的小鼠定殖者并在多种小鼠模型中表现最好，而K11和K12是较差的小鼠定殖者。
表3  幽门螺杆菌临床菌株在多种小鼠株系中的定殖率
在多种小鼠株系中测试了幽门螺杆菌菌株经口感染后4周的胃部定殖。小鼠(n＝10)感染1×109 CFU/ml的细菌。培养来自小鼠胃组织的细菌并进行定量。通过每组中幽门螺杆菌感染小鼠的数目确定定殖频率。
实施例9  在沙鼠模型中幽门螺杆菌定殖菌株的筛选
为了验证是否鉴定的6株幽门螺杆菌菌株(K4、K6、K8、K12、K11及K18)是否是鲁棒的和广泛的定殖者，在沙鼠模型中筛选它们。沙鼠模型是幽门螺杆菌感染更相关的模型，因为其接近地模拟人感染中观察到的病理(胃炎)。
简言之，8-12周龄的动物连续五天用在补充马血清(8％)、万古霉素(10mg/l)、甲氧苄啶(5mg/l)、制霉菌素(1mg/l)的琼脂平板(GC琼脂培养基，Oxoid，德国)上生长的约1×109有活力的幽门螺杆菌(单个株或5株混合)经口感染3次。感染3-5周后处死动物，沿大弯打开胃并将胃组织分别保存为窦部(antrum)和本体(corpus)。每个窦部和本体组织标本在1ml Brucella培养液中匀浆并将适当的稀释液铺于选择性血清板(GC琼脂，见上文)上并在微需气条件下(85％N2，10％CO2，5％O2)在37℃温育多至5天。菌落形成单位(CFU)的数目以每克胃组织表示。
在初步筛选中，所有4株菌株(单独感染)均未能定殖于沙鼠胃粘膜。随后，进行第二次筛选以测试其余的10株可转化的K菌株。沙鼠感染5株的混合物并培养来自胃部活检的定殖菌株并进行基因分型指纹印记来鉴定。有趣的是，两个菌株，K4和K12，能够定殖于沙鼠宿主(图9)而在DBA/2小鼠模型的原始筛选中两个菌株均未被鉴定出。
此外在小鼠中的广泛筛选后，显示K4菌株在小鼠和沙鼠模型中均是良好的、鲁棒的定殖者。这些数据反映出幽门螺杆菌菌株的多样性，以及在临床前动物模型中使用人临床分离株的困难。
实施例10  在猴模型中幽门螺杆菌定殖菌株的筛选
非人灵长类动物(猴)被视为是与人密切相关的，因此其是包括幽门螺杆菌感染的人类疾病的相关模型。在此我们在猴模型中开始验证先前鉴定的幽门螺杆菌菌株。
首先，使用在猴中为95％敏感的和94％特异性的血清学(Solnick等，(2001)，Infect.Immun.，69：6887-6892)对从Valley Biosystems(West Sacramento，CA)获得的成年(＞5岁龄)短尾猴进行幽门螺杆菌感染的筛选。血清学阴性的猴子也接受内窥镜检查并将那些幽门螺杆菌培养和组织学阴性的猴子转移到在Davis的California National Primate Research Center(加州国家灵长类动物研究中心)以用于幽门螺杆菌感染实验。我们估计大约有25％的动物是血清阴性的而且其中75％是胃活检阴性的。
随机分配没有幽门螺杆菌感染的猴子接受幽门螺杆菌感染或作为对照。幽门螺杆菌菌株K6(OND737)、K8(OND738)及K11(OND739)的混合物用于感染。由于培养困难，在本实验中没有使用OND740。将大约1×109有活力的幽门螺杆菌通过经口管饲接种于以氯胺酮(10mg/kg IM)镇静的猴子。感染后一个月进行胃活检以证实幽门螺杆菌感染。如先前所述定量CFU。
两个菌株，K6和K11成功定殖于猴子胃部(图9)。
实施例11  菌株的临床和基因型特性
四株选定的小鼠定殖菌株和2株沙鼠定殖菌株(K4、K12)的临床和组织学数据汇总于图9。将六株选定的菌株分别命名为OND737、OND738、OND739、OND740、OND248和OND256(表4)。
表4  幽门螺杆菌菌株的命名
  菌株   OND#   菌株   OND#
  K1   245   K12   256
  K4   248   K14   258
  K6   737   K16   260
  K8   738   K17   261
  K9   253   K18   740
  K10   254   K19   263
  K11   739   K21   265
幽门螺杆菌临床分离株的命名系统的参考。每个可转化的K菌株已分配一个唯一的OND号。
所有菌株源自超过52岁的无症状患者。内窥镜检查很少或没有观察到胃上皮的萎缩，而且只有K18(OND740)菌株显示了较高级别的粒细胞浸润。通过用于vacA s1、vacA s2、cagA、cagT、cagPAI和hrgA等位基因存在的多重PCR测试了菌株的基因型。有趣的是，菌株或者是vacA s1或cagA阴性(K6)或者是vacA s2和cagA阳性，表明vacA s1等位基因和cagA的存在是无症状患者特有的(exclusive)。
结果表明，幽门螺杆菌的人临床分离株可能在其致病性、免疫原性和毒力上显著变化。在此我们已经显示，幽门螺杆菌菌株在摄取DNA和通过同源重组将其整合入它们的基因组、定殖小鼠胃部和诱导特异性抗体的能力上也是变化的。本研究鉴定了无需宿主适应的6株幽门螺杆菌菌株，在幽门螺杆菌动物模型中是鲁棒的定殖者。
此外，鉴定的菌株中的两株诱导高效价的特异性抗体，而且一株在两个模型中均是鲁棒的定殖者。总之，基于它们分离自无症状的老年患者，低度的胃部临床病理，基因操作，在动物模型中定殖于动物胃部的能力和引起强烈的免疫反应的能力，这项研究已鉴定出多个适于用作细菌递送运载体的幽门螺杆菌菌株。
实施例12  幽门螺杆菌临床分离株的免疫印迹分析
为了确定幽门螺杆菌菌株是否在免疫原性谱上是不同的，使用DBA/2小鼠模型中获得的血清，进行免疫印迹分析来鉴定所选的幽门螺杆菌临床分离株(K6、K8、K11、K18和H41)的蛋白样式(pattern)。对于每个各自的幽门螺杆菌菌株，比较了针对全细胞裂解物和外层和内层膜蛋白的免疫印迹。使用X47作为基准，因为已知此株在小鼠中具有免疫原性。
将从平板培养物收获的细菌稀释到在400μl 1xPBS中10个OD600nm单位的浓度和声处理两次30秒。声处理后，通过加热至95度5分钟并冷却至室温，将细菌悬液在100μl用于SDS-PAGE的5x样品缓冲液中变性。
或者收获细菌并通过甘氨酸提取来提取外膜蛋白。将相当于10 OD600nm单位的细胞沉淀重悬于200μl甘氨酸缓冲液(pH2.2)，并在室温下温育5分钟。然后将细胞离心(2分钟，14000rpm，室温)。将上清与30μl的Tris(pH10.8)混合以中和蛋白质组分。将甘氨酸提取的沉淀重悬于400μl 1xPBS，如上所述的进行声处理并在用于SDS-PAGE的5x样品缓冲液中变性。
使用
Figure BDA0000133666520000181
Tetra Cell电泳装置(BioRad)，在SDS聚丙烯酰胺微型凝胶上使用4％的浓缩胶和10％的分离胶进行样品(10μl每道)的电泳。使用Trans-
Figure BDA0000133666520000182
SD Semi-Dry Transfer Cell(BioRad)将分离的抗原转移到Immobilon-P Transfer(0.45μM)膜(Millipore)。在4℃用1xTBS+0.2％Tween20中的5％脱脂乳粉(non-fat dry milk)将膜封闭过夜。
将膜与来自用各幽门螺杆菌菌株感染的小鼠的血清(在1xTBS+0.1％Tween20中按1∶50稀释)在室温下温育1小时。膜用1xTBS+0.1％Tween20洗涤三次，然后与在1xTBS+0.1％Tween20中稀释的HRP Conjugated Goat Anti-小鼠IgGFcγ(Jackson Immunoresearch)的1∶5000稀释物在室温温育1小时。如上所述，用1xTBS+0.1％ Tween20洗膜，并与Chemiluminescent Peroxidase Substrate-3溶液(Sigma)温育。用FujiFilm LAS-3000 Imager评估膜的条带样式。
结果表明，对于每个细菌菌株存在免疫源性蛋白的一般样式，其仅在样式谱上略有变化。K6、K8和K18菌株显示更强的条带样式，表明这些菌株可能在体内具有更强的免疫原性(图10)，这与先前描述的血清学数据相一致。
实施例13  幽门螺杆菌临床分离株的遗传指纹印记
遗传指纹印记可用于评估细菌种群中的遗传可变性。这些指纹提供了每一株独特的识别样式。为能够在宿主已感染几种菌株混合物的实验条件下鉴定的输出细菌分离株，产生了14株可转化的K菌株的遗传指纹。RAPD PCR测定法允许分析独特的遗传样式以辨认每株幽门螺杆菌菌株。
将细菌菌株在微需气气氛中在Columbia血琼脂平板上在37℃培养48小时。将来自大约一半汇合生长的琼脂平板的细菌细胞团小心收获到0.85％氯化钠溶液中，并以4000g离心8分钟。弃去上清并在180μl消化缓冲液中悬浮沉淀。将20μl蛋白酶K样品在55℃温育4-12小时并偶然涡旋振荡，然后使用购自Invitrogen的Purelink Genomic DNA微型试剂盒根据说明纯化基因组DNA。
如Akopyanz等(1992)，Nucl.Acids Res.，20：5137-5142所述进行RAPD。
使用引物1254和1281。在PCR反应中引物总是分开使用。
1254(5′-CCGCAGCCAA-3′)  SEQ ID NO：1
1281(5′-AACGCGCAAC-3′)  SEQ ID NO：2
PCR反应(50μl体积)终浓度：
-缓冲液  100mM Tris-HCl，500mM KCl，pH 8.3
-dNTPs   250μM每种
-引物    0.8μM的1254或1281
-MgCl2   3mM
-BSA     0.01％(w/v)
-模板    10-100ng DNA(一般为5μl提取的gDNA样本)
-Taq酶   2单位(来自Roche的重组Taq聚合酶)
扩增循环：
4个循环[94℃，5min；36℃，5min；和72℃，5min]
30个循环[94℃，1min；36℃，1min；和72℃，2min]
72℃ 10min
凝胶电泳：通过1.5％(w/v)的脂糖凝胶电泳，在90V分离10-15μl的PCR产物1小时。
正如所预期的，使用两种引物获得了14株单个K菌株的任意扩增的基因组DNA样本的独特条带样式(图11)。对于某些菌株，一种或另一引物产生了更具特色的条带样式。OND258(K14)和OND253(K9)是最相似的并可能代表了一个家族株系。参考OND识别号，表4总结了幽门螺杆菌菌株的命名。

Claims (23)

1.一种幽门螺杆菌的分离的菌株，所述菌株具有以下特征：(a)低致病性；(b)天然转化能力；和(c)无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。
2.依照权利要求1所述的幽门螺杆菌的分离的菌株，其中所述的幽门螺杆菌能够在哺乳动物受试者中形成慢性感染。
3.依照权利要求1或权利要求2所述的幽门螺杆菌的分离的菌株，其中所述的幽门螺杆菌不表达一种或多种功能性致病因子。
4.依照权利要求3所述的幽门螺杆菌的分离的菌株，其中所述的致病因子是vacA s1或cagA。
5.一种幽门螺杆菌的分离的菌株，所述菌株或者是：
(i)vacA s1或cagA阴性；或者是
(ii)vacA s2和cagA阳性；并且
其中所述的幽门螺杆菌菌株具有
(a)低致病性，
(b)天然转化能力；及
(c)无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力。
6.依照权利要求1-3中任一项所述的幽门螺杆菌的分离的菌株，其中所述的幽门螺杆菌选自下组：以登录号V09/009101保藏于国家计量研究院的OND737；以登录号V09/009102保藏于国家计量研究院的OND738；以登录号V09/009103保藏于国家计量研究院的OND739；以登录号V10/014059保藏于国家计量研究院的OND248；以登录号V10/014060保藏于国家计量研究院的OND256；和以登录号V09/009104保藏于国家计量研究院的OND740，或其突变体或衍生株。
7.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND737，其以登录号V09/009101保藏于国家计量研究院。
8.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND738，其以登录号V09/009102保藏于国家计量研究院。
9.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND739，其以登录号V09/009103保藏于国家计量研究院。
10.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND740，其以登录号V09/009104保藏于国家计量研究院。
11.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND248，其以登录号V10/014059保藏于国家计量研究院。
12.一种分离的幽门螺杆菌菌株OND256，其以登录号V10/014060保藏于国家计量研究院。
13.依照权利要求1-12中任一项所述的分离的幽门螺杆菌菌株，其是用由核酸分子编码的感兴趣的基因转化的。
14.依照权利要求13所述的分离的幽门螺杆菌菌株，其中分离的核酸分子整合到所述幽门螺杆菌菌株的基因组中。
15.依照权利要求13或权利要求14所述的分离的幽门螺杆菌菌株，其中所述分离的核酸分子编码与幽门螺杆菌同源的多肽。
16.依照权利要求13或权利要求14所述的分离的幽门螺杆菌菌株，其中所述分离的核酸分子编码与幽门螺杆菌异源的多肽。
17.一种在哺乳动物受试者中诱导抗体反应的方法，所述方法包括施用权利要求1-16中任一项所述的幽门螺杆菌的分离的菌株的步骤。
18.一种鉴定适于体内递送生物活性剂的幽门螺杆菌菌株的方法，包括以下步骤：
(a)从无幽门螺杆菌感染症状的个体分离幽门螺杆菌菌株；
(b)确定所述菌株是否具有天然转化能力；以及
(c)确定所述菌株是否具有无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力，
其中具有天然转化能力和无需宿主适应而定殖于小鼠胃粘膜的能力的菌株适于体内递送生物活性剂。
19.一种优化的螺杆菌属感染的动物模型，其中所述动物以富含酪蛋白的食物和/或酸化水饲养，使得相对于没有以富含酪蛋白的食物和/或酸化水饲养的动物，其螺杆菌属菌种的定殖是增强的。
20.依照权利要求19所述的优化的动物模型，其中所述动物以富含酪蛋白的食物和酸化水饲养，其中所述水是约pH2。
21.依照权利要求19或权利要求20所述的优化的动物模型，其中所述动物是小鼠。
22.随机扩增多态DNA聚合酶链式反应用于鉴定螺杆菌属菌种的用途。
23.依照权利要求22所述的用途，其中螺杆菌属DNA分离自所述的螺杆菌属菌种并使用具有SEQ ID NO：1所示序列的正向引物和具有SEQ IDNO：2所示序列的反向引物通过聚合酶链式反应扩增。
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