EA021102B1

EA021102B1 - Температурочувствительный вакцинный штамм mycoplasma hyopneumoniae и его применения

Info

Publication number: EA021102B1
Application number: EA201190311A
Authority: EA
Inventors: Рима Юйль; Юссеф Абс Эль-Оста; Гленн Браунинг; Филлип Маркхэм
Original assignee: Байопропертис Пти Лтд.; Де Юниверсити Оф Мельбурн
Priority date: 2009-05-19
Filing date: 2010-05-19
Publication date: 2015-04-30
Also published as: MX2011012362A; CN102458462B; KR20120016282A; BRPI1010679A2; CN102458462A; US8524252B2; EP2453913B1; KR101734590B1; CL2011002923A1; JP2012527218A; ZA201109185B; AU2010251761B2; CA2762587C; DK2453913T3; PE20120909A1; US20120135040A1; EA201190311A1; NZ596722A; AU2010251761A1; WO2010132932A1

Abstract

Настоящее изобретение относится к вакцинному штамму Mycoplasma hyopneumoniae, депонированному в National Measurements Institute, Австралия, под регистрационным номером NM04/41259, который является температурочувствительным и аттенуированным, к вакцинной композиции, содержащей этот штамм, к способам снижения вероятности возникновения и предупреждения заболевания, вызываемого Mycoplasma hyopneumoniae, у свиньи с использованием этого штамма и к способу получения такой вакцины.

Description

Настоящее изобретение относится к штамму Мусор1а5та Ьуорпеитошае, вакцинам, содержащим такой штамм, и применению таких вакцин для защиты от микоплазменной пневмонии у свиней.

Предшествующий уровень техники

Мусор1азта Ьуорпеитошае представляет собой этиологический фактор микоплазменной пневмонии свиней (также называемой энзоотической пневмонией (ЭП)). Это одно из наиболее распространенных и экономически значимых респираторных заболеваний, влияющих на продукцию свиней во всем мире. Данное заболевание ассоциировано со вторичными инфекциями, высоким уровнем заболеваемости и низким уровнем смертности, низкой конверсией корма и может относиться к глобальным экономическим потерям, оценивающимся приблизительно в 1 млрд долларов в год.

При ЭП бактерии Мусор1а5та Ьуорпеитошае прикрепляются к ресничкам эпителиальных клеток в легких свиней, разрушая здоровые нормальные реснички, давая тем самым возможность условнопатогенным организмам внедриться в ткань дыхательных путей, вызывая заболевание. Внедрившись, М. Ьуорпеитошае вызывает повреждения в легких свиней.

Заболевание является высокоинфекционным, и передача обычно осуществляется через прямой контакт с выделениями зараженных дыхательных путей, например капельками, вылетающими из рыла или ротовой полости при чихании или кашле.

В настоящее время существует несколько вакцин против М. Ьуорпеитошае. Большинство современных вакцин предлагаются приблизительно 10 компаниями, при этом 22 разновидности вакцин зарегистрированы как либо одно-, либо двух/многовалентные. Все они представляют собой убитые или инактивированные препараты М. Ьуорпеитошае.

Примеры цельноклеточных инактивированных вакцин М. Ьуорпеитошае включают ΚΕδΡΙδυΚΕ™ и ЗТЕЬЬАМиМЕ™ (РДгег), δυνΑΧΥΝ М. ΗΥΟ™ (Рой Эойуе). ΗΥΟΚΕδΡ™ (Мепе1), М+РАС™ (δίχτш§-Р1оидЬ) и ΡΟΚίΈ-Ιδ™ (1п!етуе!).

В то время как некоторые вакцины могут уменьшать тяжесть ЭП, ни одна из доступных цельноклеточных убитых или инактивированных вакцин не обеспечивает полную защиту от инфекции М. Нуорпеитошае. Таким образом, существует необходимость в более эффективной вакцине.

Задача предпочтительного воплощения настоящего изобретения состоит в предложении живого штамма Мусор1а5та рпеитошае, подходящего для использования в вакцинации для предупреждения энзоотической пневмонии.

Все ссылки, включая патенты или патентные заявки, цитируемые в этом описании, включены посредством ссылки. Следует ясно понимать, что, хотя здесь сделаны ссылки на ряд публикаций из уровня техники, такая ссылка не является признанием того факта, что любой из этих документов образует часть общего знания в данной области.

Краткое изложение сущности изобретения

Согласно данному изобретению предложен вакцинный штамм Мусор1а5та Ьуорпеитотае, депонированный в №-Цюпа1 Меа5игетеп15 1п5Й1и1е, Австралия, под регистрационным номером NМ04/41259, который является температурочувствительным и аттенуированным.

Согласно другому аспекту изобретения предложена вакцинная композиция, содержащая штамм Мусор1а5та Ьуорпеитотае по изобретению и носитель, которая в иммунизирующем количестве способна вызывать защитный иммунитет против заболевания, вызываемого Мусор1а5та Ьуорпеитотае.

Предпочтительно вакцинная композиция по изобретению содержит адъювант.

Согласно другому аспекту предложена вакцинная композиция по изобретению, содержащая по меньшей мере один дополнительный инфекционный агент, который представляет собой вирус, бактерию, гриб или паразитический организм.

Согласно еще одному аспекту предложена вакцинная композиция по изобретению, приготовленная в виде препарата для введения в дыхательные пути, предпочтительно в форме аэрозольного препарата.

Предпочтительно вакцинная композиция по изобретению способна вызывать защитный иммунитет против вызываемого Мусор1а5та Ьуорпеитотае заболевания, которое представляет собой энзоотическую пневмонию или микоплазменную пневмонию свиней.

Согласно другому аспекту изобретения предложен способ снижения вероятности возникновения заболевания, вызываемого Мусор1а5та Ьуорпеитотае, у свиньи, включающий введение свинье иммунизирующего количества вакцинной композиции, как она определена выше.

Согласно еще одному аспекту предложен способ предупреждения заболевания, вызываемого Мусор1а5та Ьуорпеитотае, у свиньи, включающий введение свинье иммунизирующего количества вакцинной композиции, как она определена выше.

Предпочтительно вакцинную композицию вводят в дыхательные пути, еще более предпочтительно вакцинную композицию вводят путем ингаляции, интраназально или посредством аэрозоля.

В предпочтительном воплощении вышеуказанных способов заболевание, вызываемое Мусор1а5та Ьуорпеитотае, представляет собой энзоотическую пневмонию или микоплазменную пневмонию свиней.

Согласно еще одному аспекту предложен способ получения вакцины, как она определена выше,

- 1 021102 включающий объединение штамма Мусор1азша йуорпеишошае по изобретению с носителем, адъювантом и, при необходимости, по меньшей мере с одним дополнительным инфекционным агентом, который представляет собой вирус, бактерию, гриб или паразитический организм.

Согласно еще одному аспекту изобретения предложена вакцинная композиция, содержащая адъювант и штамм Мусор1азша йуориеишошае, депонированный в Ναΐίοηαΐ Меазигешейз 1п5111и1е. Австралия, под регистрационным номером ΝΜ04/41259, который является температурочувствительным и аттенуированным и который получен путем химического мутагенеза штамма Мусор1азта йуориеишошае с отбором температурочувствительного мутанта, который остается жизнеспособным после серийного пассирования ίη уйго, которая в иммунизирующем количестве способна вызывать защитный иммунитет против заболевания, вызываемого Мусор1азша йуорпеишойае.

Краткое описание графических материалов

Фиг. 1 - назальная колонизация вакцинным штаммом 1з19 у свиней, вакцинированных высокой избыточной дозой;

фиг. 2 - трахеальная колонизация на 59-тые сутки после вакцинации (СПВ) у свиней, вакцинированных высокой избыточной дозой вакцины 1з19;

фиг. 3 - назальная колонизация у свиней, вакцинированных вакцинным штаммом 1з19 в различных дозах;

фиг. 4 - дифференциальные общие массы тела за период исследования (105 дней); фиг. 5 - определение минимальной защитной дозы для 1з19;

фиг. 6 - коэффициент защиты 1з19 и коммерческой вакцины, основанный на снижении тяжести поражений легких.

Подробное описание изобретения

Аттенуированные вакцины, как правило, полезны в силу того, что они представляют все релевантные иммуногенные детерминанты инфекционного агента в его естественной форме иммунной системе хозяина, и требуются относительно небольшие количества иммунизирующего агента благодаря способности этого агента размножаться в вакцинированном хозяине. Способы аттенуирования включают многократное пассирование вирулентного штамма или воздействие на него облучением или химическими веществами. Полагают, что эти способы вводят в геном мутации, которые делают микроорганизм менее вирулентным, но все еще способным к репликации.

Недостатки этих подходов состоят в том, что они вводят случайные мутации, которые не охарактеризованы на молекулярном уровне. Кроме того, способы селекции в отношении аттенуирования, такие как селекция по ассоциированной чувствительности к температуре, зачастую являются длительными, дают ложные результаты, поскольку температурочувствительный штамм может не быть аттенуированным, а аттенуированный штамм не обязательно является температурочувствительным, и требуют большого количества тестов методом проб и ошибок. Кроме того, аттенуированный штамм может претерпевать дальнейшей мутации и возвращаться к вирулентности.

Для решения задачи создания живой вакцины против микоплазменной пневмонии авторы изобретения подвергали изолят Мусор1азша йуорпеишошае химическому мутагенезу и отбирали клоны, которые являлись температурочувствительными. Авторы изобретения подвергали живую мутированную бактерию сушке вымораживанием и обнаружили, что бактерия могла быть восстановлена спустя неделю и оставалась жизнеспособной после серийного пассирования и, таким образом, подходит в качестве вакцинного штамма Мусор1азша йуорпеишошае. Вакцинный штамм и исходный штамм были секвенированы, и в результате сравнения последовательностей были идентифицированы гены, которые претерпели мутирование в вакцинном штамме, что дало возможность составления генетической характеристики аттенуированного штамма.

Показано, что вакцинный штамм согласно изобретению придает защитный иммунитет и он не демонстрирует реверсии к вирулентности при серийном пассировании (данные не представлены).

М. йуорпеишошае штамм ЬКК был первоначально выделен из образца со скотобойни (Ь1оуб апб ЕШепйде 1981, 1. о! Сошр Ра1й 91: 77-83). Организм был повторно выделен от экспериментально инфицированных свиней, после чего был примерно 10 раз пассирован в бесклеточной среде для достижения клонального выделения (С81КО, Виктория). Клон затем был передан в коллекцию микоплазм (Мусор1азша) университета в Аделаиде, Южная Австралия. ЬКК изолят был затем получен университетом в Мельбурне, факультет ветеринарных наук (группа микоплазм (Мусор1азша)), где он подвергался 3 пассажам щ уйго в модифицированной жидкой питательной среде Фрисса (Рттзз) для хранения. Флаконы для хранения были обозначены как ЬКК Р3 29/5/97. Этот клон представляет собой родительский штамм.

ЬКК Р3 29/5/97 пассировали ш уйго и подвергали ΝΤΟ (нирозогуанидин) мутагенезу (200 мг/мл), используя метод, описанный ранее Юопаишга апб 1шаба (1982) Ау1ап Эззеазез 26:763-775). Температурочувствительный клон (15-19) отбирали из чашки с агаром и культивировали в 3 мл модифицированной жидкой питательной среды Фрисса. Номер пассажа для этого клона обозначали как Р0, и затем его подвергали еще четырем пассажам щ уйго при разведении 1:4 об./об. на пассаж в модифицированной жидкой питательной среде Фрисса. Уровень конечного пассажа обозначали как ЬКК 15-19 Р4 М8.

ЬКК 1з-19 Р4 М8 подвергали ряду пассажей разведения ш уйго в модифицированной жидкой пита- 2 021102 тельной среде Фрисса для достижения разведения 3,2 х10^-21. Конечный мутантный клон обозначали как ЬКК 15-19 3,2х10^-21.

ЬКК 15-19 3,2х10^-21 сушили вымораживанием и передали в Австралийскую правительственную аналитическую лабораторию (Будапештский договор о международном признании депонирования микроорганизмов для целей патентной процедуры) под регистрационным номером ΝΜ04/412559.

Микоплазмы обладают чрезвычайно уменьшенным размером генома, что отражает их ограниченные биосинтетические возможности и их подобную паразитической зависимость от своих хозяев. В свете ограниченной избыточности их геномов ΝΤΟ мутагенез определенного компонента метаболического пути может оказывать существенное влияние на выживаемость клетки Мусор1а5та. ΝΤΟ мутагенез имеет результатом случайные мутации (транзиции нуклеотидов, трансверсии, делеции или инсерции) в геноме. Это может привести к совокупности вариантных геномов, каждый из которых содержит или одну или более чем одну мутацию. Вероятно, многие из вариантных геномов не выживут из-за того, что дисфункциональным станет критический ген или гены. Если мутации не оказывают вредного воздействия на способность организмов к росту, тогда такие выживающие вариантные организмы могут быть подвергнуты дальнейшей селекции (например, температурной селекции). При развитии 1519 селекция была основана на способности вариантного штамма к росту до высокого титра при температуре 33 °С и пониженной способности к росту при 39,5°С. На основании сравнения полной геномной последовательности вакцинного штамма 1519 Мусор1а5та йуориеитотае и родительского штамма (ЬКК) в геноме 1519 был идентифицирован ряд мутаций (изменений в нуклеотидах). Эти мутации включали нуклеотидные замены (транзиции и трансверсии), а также делеции и инсерции.

Мутации были локализованы по всему геному и включают ряд экспрессируемых генов, а также гипотетических белков и некодирующих последовательностей. В табл. 1 перечислены известные гены, которые были мутированы посредством замен, делеций или инсерций оснований. Г ены были распределены по категориям согласно их главной функции. Для специалистов в данной области достаточно очевидно, как определять, содержит ли штамм М. йуориеитотае мутацию в одном из генов, перечисленных в табл. 1, путем определения того, существует ли различие между референсной последовательностью (например, ΥΡ_278901,1) и последовательностью аттенуированного штамма. Τ519, депонированный под номером ΝΜ04/41259, представляет собой аттенуированный штамм, содержащий все мутации, перечисленные в табл. 1.

Таблица 1

Аттенуирующие мутации в генах вакцинного штамма Мусор1а5та йуориеитотае 1519

I Факторы вирулентности: !
Предположительный белок Р95 наружной мембраны	ΥΡ 278901.1 ι I
[Предположительный липопротеин (МНЦ0213)	ΥΡ_279015.1 !
ι Предположительный липопротеин (МШ_0362)	ΥΡ_279161.1 I
Предположительный поверхностный белок Р216	ΥΡ 279290.1 I
Предположительный адгезин-подобный белок Р146	ΥΡ_279457.1
!
Метаболизм углеводов: ι
Триозофосфатизомераза	ΥΡ_278904.1 ί
Транскетолаза	ΥΡ_279223.1 I
Вероятный Ν-ацетилглюкозамин-специфичный II АВС компонент РТ8 системы	ΥΡ_279370.11

Метаболизм фосфолипидов:	----------1

[сОР-диацилглицерин-глицерин-З-фосфат-З-фосфатидил- ΥΡ_279075.1

Трансфераза ί Метаболизм кофакторов:

ί Никотинатфосфорибозилтрансфераза ΥΡ_279204,1

- 3 021102

Транскрипция/трансляция:

Ген СйА [тРНК уридин-5-карбоксиметиламинометил- модификационный фермент]	ΥΡ_278808.1
505 Рибосомальный белок 13	ΥΡ_278992.1
Лейцил-тРНК синтетаза	ΥΡ_279441.1
Изолейцил-т-РНК синтетаза	ΥΡ 278833.1 . ..1

| Мембранный транспорт:

! Вероятный АВС транспортер, белок пермеаза	ΥΡ_279164.2
Вероятный АВС транспортер, АТФ - связывающий ί	ΥΡ 278823.1
1 Вероятный хромат - транспортный белок	УР_278943Д
\| Вероятный АВС транспортер, АТФ - связывающий и ί пермеазный белок	ΥΡ_278958.1
ί Предположительный компонент транслоказы белка внутренней мембраны УЙС	ΥΡ_279468.1
Вероятный р69-подобный белок пермеаза АВС- транспортной системы	ΥΡ_279157.1 ι
Вероятный АВС транспортер, белок пермеаза	ΥΡ_279176.1 !
Вероятный АВС транспортер, АТФ - связывающий - Рг1	ΥΡ_279419Ί ί
!_ - - - _ - ДНК репликация/ репарация/метаболизм:	ί I
ДНК топоизомераза I	ΥΡ_279077.1,
Урацил - ДНК - гликозилаза	ΥΡ_278929.1

, ГТФ-аза ОЬдЕ ΥΡ_278842.1 |ДНК полимераза IV ΥΡ_278846.1 ;

;Альфа субъединица рибонуклеотид-дисульфатредуктазы ΥΡ_279017.1 '

1Тимидилаткиназа ΥΡ 279053.1 :

)Дельта субъединица ДНК-полимеразы III ΥΡ_279054Ί г 'ДНК лигаза ΥΡ_279060.1

Субъединица А ДНК гиразы	ΥΡ 279326.1
Рибонуклеаза НН	ΥΡ_279388.1 ;
Неорганическая пирофосфотаэа	ΥΡ 279400.1
Субъединица С эксцинуклеазы АВС	ΥΡ 278867.1 ¹ 1
I ί - — - -.
Транспозаза: ’ ___ .. .... ... ..... .... .
Вероятная 15МНр1 транспозаза	ΥΡ 279110.1 ¹ .. ... .. .1

УР_номер показывает референсную последовательность согласно ΝΟΕΙ.

Бактериальный штамм, описанный здесь, представляет собой живой, температурочувствительный и аттенуированный штамм и может быть использован в живой вакцине.

Живой аттенуированный штамм представляет собой живой бактериальный штамм, который культивировали в условиях, которые снижают или аттенуируют их вирулентные свойства. Живые вакцины обычно вызывают более длительный иммунологический ответ, чем инактивированные или убитые микроорганизмы.

Вакцинный штамм согласно изобретению может быть получен посредством химического мутагенеза изолята Мусор1а§та йуориеитошае. Химическое мутирование, в частности, включает мутагенез путем обработки ^метил-№-нитро-^нитрозогуанидином (ΝΤΟ) Щоиатита аиб 1таба (1982), Ау1аи Э^еа^е

- 4 021102

26; 763-755). Температурочувствительные мутантные бактерии могут быть отобраны по их способности расти при пермессивной температуре (33°С) и неспособности расти при непермессивной температуре (39,5°С). Для использования в вакцине температурочувствительные мутанты подвергают серийному пассированию и разведению.

Вакцинный бактериальный штамм Мусор1а5та согласно изобретению является жизнеспособным (или живым). Жизнеспособность означает в общем способность к выживанию и более конкретно используется для обозначения способности жить, развиваться или прорастать при благоприятных условиях. Бактериальная клетка является жизнеспособной, если она способна расти либо в подходящей жидкой питательной среде, либо на агаровой среде.

Бактериальный штамм, депонированный согласно Будапештскому договору под номером ΝΜ04/41259, был получен путем ίη νίίτο пассирования три раза (3х) при (1:4 об./об. в модифицированной жидкой среде Фрисса) австралийского изолята Мусор1а5та Нуорпеитошае ЬКК (полученного из коллекции Мусор1а5та университета Аделаиды группой Мусор1а5та университета Мельбурна) с получением ЬКК. Р3. Изолят ЬКК. Р3 затем подвергали ΝΤΟ мутагенезу. Подвергнутый мутагенезу ЬКК. Р3 выращивали на агаре при 33°С (пермессивная температура) и при 39,5°С (непермессивная температура). Отбирали мутантные клоны, которые росли при 33°С, но не росли при 39,5°С. Отобранные клоны подвергали нескольким циклам ίη νίΙΐΌ пассирования и серийного разведения. На последнем цикле пассирования отобранный клон (1519) депонировали согласно Будапештскому договору в Национальном институте измерений (тогда именовавшемуся Австралийской правительственной аналитической лабораторией) в виде культуры, высушенной вымораживанием. Образцы были восстановлены спустя одну неделю хранения и, как установлено, они оказались жизнеспособными.

Термин ίη νίΙΐΌ серийное пассирование относится к практике повторного пассирования бактерий в среде. Оно включает инокулирование жидкой питательной среды живой бактериальной культурой, которую затем в течение определенного времени инкубируют при соответствующей температуре. Часть инкубированной культуры затем используют для инокулирования свежей стерильной культуры, которую в свою очередь инкубируют в течение определенного времени. Цикл продолжается до достижения желаемого числа пассажей. Каждый цикл роста и реинокуляции называют одним пассажем.

В вакцине по настоящему изобретению, содержащей бактериальный штамм согласно изобретению и носитель, этот носитель может представлять собой питательную среду для М. Ьуорпеитошае, стерильную воду или стерильный изотонический физиологический раствор.

Вакцина представляет собой биологический препарат, который формирует или улучшает иммунитет к определенному заболеванию. Вакцины могут быть профилактическими (например, для предупреждения или ослабления эффектов будущего инфицирования патогеном) или терапевтическими (например, для лечения инфекции). Вакцина согласно изобретению является профилактической в отношении заболевания, вызываемого Мусор1а5та Ьуорпеитошае.

Соответствующей носитель будет очевидным для специалиста в данной области и будет зависеть в большей степени от способа введения. Вакцина может дополнительно содержать один или более чем один дополнительный ингредиент, включая, но не ограничиваясь ими, суспендирующие, стабилизирующие или диспергирующие агенты.

Также дополнительными компонентами, которые могут присутствовать в вакцине, являются адъюванты, консерванты, химические стабилизаторы или другие антигенные белки. Обычно стабилизаторы, адъюванты и консерванты оптимизируют для определения наилучшего состава препарата в отношении эффективности у целевого животного. Подходящие примеры консервантов включают хлорбутанол, сорбат калия, сорбиновую кислоту, двуокись серы, пропилгаллат, парабены, этилванилин, глицерин, фенол и парахлорфенол. Подходящие стабилизирующие ингредиенты, которые могут быть использованы, включают, например, казаминовые кислоты, сахарозу, желатин, феноловый красный, Ν-Ζ амин, дифосфат монокалия, лактозу, гидролизат лактальбумина и сухое молоко. Общепринятый адъювант используют для привлечения лейкоцитов или усиления иммунного ответа. Такие адъюванты включают, среди прочих, МРЬ.ТМ. (3-0-деацилированный монофосфорил-липид А; ΚΙΒΙ 1ттипоСНет Кекеагсй, 1пс., НатШоп, МоШ.). минеральное масло и воду, гидроксид алюминия, Амфиген, Авридин, Ь121/сквален, Όлактид-полилактид/гликозид, плюроновые полиолы, мурамилдипептид, убитые клетки Вогйе1е11а, сапонины, такие как Цш1 А или §йти1оп.ТМ. 08-21 (Ас.|ш1а ВюрНагтасеийсаЦ, 1пс., РгатШдЬат, Ма55.) и холерный токсин (дикого типа или в мутантной форме, например, где глутаминовая кислота в положении аминокислоты 29 заменена другой аминокислотой, предпочтительно гистидином, в соответствии с международной заявкой на патент № РТС/ϋδ 99/22520).

В одном воплощении вакцина при инъецировании вызывает незначительную побочную или нежелательную реакцию в месте инъекции, например в виде раздражения кожи, опухания, сыпи, некроза, повышения чувствительности кожи, либо не вызывает ее вообще.

Термин профилактика, или профилактическая, или превентивная терапия, или защита от, который упоминается здесь, включает предотвращение возникновения инфекции, или затруднение развития, или защиту против развития, или ослабление тяжести заболевания, вызываемого Мусор1а5та Нуорпеитошае, включая предупреждение, защиту или ослабление тяжести симптома или проявления забо- 5 021102 левания у субъекта, который может быть предрасположен к данному заболеванию, но которому еще не был поставлен этот диагноз. Он также включает уменьшение периода инфицирования или частоты распространения симптомов и снижения размера поражений.

Термин профилактика, используемый здесь, охватывает общее предупреждение заболевания или ослабление степени или симптомов заболевания. Он также относится к снижению или подавлению передачи Мусор1азта Ьуориеитошае, или предупреждению внедрения бактерий в хозяине, или защите от вторичной инфекции другими штаммами Мусор1азта Ьуориеитотае или другими инфекционными агентами.

Вакцина согласно изобретению может быть приготовлена для введения свиньям в форме, например, жидкостей, порошков, аэрозолей, таблеток, капсул, таблеток или капсул с энтеросолюбильным покрытием или суппозиториев. Способы введения включают, без ограничения ими, парентеральное введение, интраперитонеальное введение, внутривенное введение, внутримышечное введение, подкожное введение, интрадермальное введение, пероральное введение, местное введение, интраназальное введение, внутрилегочное введение, ректальное введение, вагинальное введение и тому подобное.

В предпочтительном воплощении вакцину готовят в виде препарата для введения в дыхательные пути, например, путем интраназального введения, аэрозольного введения или введения путем ингаляции через рот или нос. Этот способ введения является предпочтительным, поскольку по своей природе защитный иммунитет против М. Ьуориеитошае может быть локальным (легочным) иммунитетом и клеточно-опосредованным иммунитетом в плане предупреждения заболевания, а не результатом циркуляции антител. Введение данной вакцины в дыхательные пути может стимулировать локальный иммунный ответ. Поэтому локализованное введение вакцины может быть более эффективным. Кроме того, путем введения вакцины в закрытый хлев или пространство (массовое введение в виде крупнодисперсного спрея) и предоставление свиньям возможности вдыхать ее, снижает усилия, затрачиваемые для вакцинации большого числа животных. Аэрозольная вакцинация (вакцинация спреем) в настоящее время используется на коммерческой основе для эффективной вакцинации домашней птицы против определенных заболеваний и, как было показано в наших примерах, подходит для вакцинации свиней.

Интраназальное введение охватывает любое введение через носовые ходы или рыло. Вакцину можно применять для носовой полости в форме раствора, суспензии или сухого порошка. Растворы и суспензии можно вводить интраназально, используя, например, пипетку, капельницу или спрей, возможно аэрозольный спрей. Сухие порошки можно вводить интраназально ингаляцией.

Аэрозольное введение относится к введению вакцины в форме суспензии мелких твердых частиц или капель жидкости в газе.

Ингаляция (также известная как инспирация) представляет собой движение воздуха из внешней среды через воздушные пути и в альвеолы в легких.

Эффективная доза используемой вакцины терапевтически будет зависеть, например, от терапевтических целей, способа введения и состояния свиньи.

Уровни дозирования для вакцины обычно составляют порядка примерно от 10⁴ до 10⁸ цветоизменяющих единиц (ЦИЕ) на 1 мл на дозу и предпочтительно около 10⁵ до 10⁷ ЦИЕ на 1 мл на дозу.

Следует понимать, однако, что уровень индивидуальной дозы для любой определенной свиньи будет зависеть от разнообразия факторов, включая активность конкретного используемого соединения, возраста, массы тела, общего состояния здоровья, пола, диеты, времени введения и способа введения.

Выбор и корректировка эффективной дозы в сторону увеличения или уменьшения находится в компетенции специалистов в данной области.

В предпочтительном воплощении вакцину вводят интраназально, посредством аэрозоля или ингаляции.

Термин свинья относится к поросятам, свиноматкам, подсвинкам, боровам, хрякам и членам семейства 8шбае.

На всем протяжении описания, если по контексту не требуется иного толкования, слово содержать или его варианты, такие как содержит или содержащий, следует понимать как подразумевающее включение указанного элемента, или некоей целостности, или группы элементов или целостностей, но не исключение любого другого элемента, или целостности, или группы элементов или целостностей.

Нужно также отметить, что при использовании в данном описании формы единственного числа включают аспекты множественного числа, если по контексту ясно не требуется иного.

Для специалиста в данной области очевидно, что хотя изобретение было описано с определенной детализацией для ясности и возможности понимания, возможны различные модификации и изменения в описанных здесь воплощениях и методах в пределах объема изобретательской концепции, раскрытой в этом описании.

Данное изобретение ниже дополнительно детально раскрыто посредством следующего примера. Данный пример предложен только с иллюстративными целями и не является ограничивающим, если не указано иного. Таким образом, данное изобретение охватывает любые и все варианты, которые становятся очевидными как результат предложенной здесь доктрины.

- 6 021102

Пример 1. Получение вакцинного штамма.

Австралийский изолят Мусор1а8та Ьуорпеитошае ЬКК представляет собой полученный со скотобойни образец свиного легкого, проявляющего признаки типичного заболевания энзоотической пневмонии (Ь1оуб апб ЕШепбде (1981), 1. Сотр. Ра1П. 91:77-83). Изолят культивировали и хранили в коллекции эталонных культур Мусор1а8та в университете Аделаиды, Южная Австралия. Культура этого изолята была впоследствии получена группой Мусор1а8та в университете Мельбурна, Виктория.

Культуру пассировали ίη νίΙΐΌ три раза, после чего подвергли мутагенезу, используя Л-метил-Л'нитро-Л-нитрозогуанидин (ΝΤΟ) в концентрации 200 мг/мл, используя описанный ранее способ (Лопатига апб 1таба (1982) Ау1ап И18еа8е8 26:763-775). Кратко, культуру штамма Мусор1а8та Ьуорпеитошае ЬКК выращивали до поздней логарифмической фазы и осадок получали путем центрифугирования. Клетки промывали забуференным фосфатом физиологическим раствором (РВ8) и подвергали воздействию ΝΤΟ. Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в модифицированной среде Фрииса (Рш8, Ν.Ρ. 1975) и инкубировали при 33°С в течение 4 ч. Культуру затем пропускали через фильтр 0,45 мкм, делали соответствующие разведения и аликвоты помещали на чашки с агаровой средой и инкубировали при 33°С. Выросшие колонии клонировали в 3 мл жидкой среды и инкубировали при 33°С. Ампулы с клонами хранили при -70°С и определяли чувствительность к температуре для каждого клона.

Чувствительность к температуре 1519 определяли путем выполнения двойного титрования и инкубированием при 33 и 39,5°С. Титр обычно составляет менее 1х10⁸ ЦИЕ/мл при 33°С и менее 1х10²ЦИЕ/мл при 39,5°С.

Штамм 1к19 депонировали в соответствии с Будапештским договором под номером ЛМ04/41259.

Штамм 1819 и штамм ЬКК секвенировали, используя стандартные методики, тем самым обеспечивая возможность получения генетической характеристики аттенуированного штамма. Было обнаружено, что штамм 1819 содержит ряд генетических мутаций по сравнению с его исходным штаммом, и гены, содержащие эти мутации, идентифицированы в табл. 1.

Пример 2. Получение вакцины.

Для приготовления вакцины культуру 1819 выращивали при 33°С в модифицированной среде Фрииса, содержащей феноловый красный (индикатор рН) до тех пор, пока не наблюдали изменение окраски в кислой среде. Вакцину титровали в модифицированной среде Фрииса, используя 96-луночный титрационный микропланшет. В первых 10 из 12 столбцов по горизонатли титровального микропланшета выполняли серии десятикратных разведений были выполнены. Последние две ряда оставались неинокулированными и служили в качестве (отрицательного) контроля, содержащего только среду. При каждом титровании использовали вплоть до шести титровальных микропланшетов.

После инкубирования в течение вплоть до 3 недель планшеты оценивали по изменению окраски и среднему титру, определяемому с помощью метода наиболее вероятного числа (НВЧ). Конечный средний титр выражают в цветоизменяющих единицах (ЦИЕ) на 1 мл.

Вакцинную культуру 1819 хранили в режиме длительного хранения во влажно-замороженном формате при температуре от -70 до -80°С. В качестве альтернативы вакцинную культуру 1819 лиофилизировали (сушка вымораживанием) и хранили в режиме длительного хранения при -20°С.

Пример 3. Изучение безопасности вакцины и колонизации.

Проводили исследование для оценки профиля безопасности вакцинного штамма 1819. Схема исследования предполагала использование 6-недельных поросят, полученных из свободного от Мусор1а8та стада. Исследование проводили под РС2 уровнем биологической защиты в С81КО (СоттопетеаИЬ 8егит 1пби81гу Ке8еатсй Огдаш/аОоп). ХУегпЬее. УюЮпа. Аи81гаНа. В общей сложности 20 свиней случайным образом распределяли на две группы по 10 свиней в каждой (см. табл. 2).

- 7 021102

Таблица 2

Исследование безопасности на вакцинном штамме 1819

Г ’		Количество I	Количество свиней,	Общее
Группа ! 1 1 —⁵	Назначение	свиней, обработанных I средой \| МАуорлеитолдо I в первый день ' исследования ι I	вакцинированных (5-19 (ЦИЕ/доза) в первый день исследования	количество свиней на ^:группу I I I I I
! ¹ I	Ложно- вакцинироаанные (отрицательный контроль)	¹⁰ I I	-	10 « I I
²	Безопасность (высокая	- I	10	10 , I
' ' избыточная доза)			I
I---— —Г	---------ί	. —------г		— __ __ _.]

ДЗсего ¹ I 7 ¹ 20

I I ¹ !

Вакцину вводили интраназально, тем самым тестируя только безопасность презентации вакцины в слизистой оболочке.

Группу 1 (невакцинированный контроль) и группу 2 (свиньи, вакцинированные высокими избыточными дозами) содержали в течение 59 дней для клинического наблюдения (табл. 2).

У всех свиней в этом исследовании безопасности проводили контроль дважды в день за ректальной температурой тела, начиная за один день до вакцинации, а также четыре дня после вакцинации. У всех свиней также проводили наблюдение за респираторными симптомами, включая кашель, чихание, одышку и учащенное дыхание. У всех свиней оценивали микроскопические и макроскопические повреждения легких. Макроскопические повреждения легких оценивали, используя метод Наппап с1 а1., 1982. Кроме того, брали мазки из носовой полости, легкого и трахеи для ПЦР (полимеразная цепная реакция) анализа.

Свиней из каждой группы также тестировали через 3 недели после вакцинации на присутствие М. йуорпеитошае в их носовых полостях, используя метод ПЦР-анализа. Наконец, у свиней проводили наблюдение за увеличением массы тела за период исследования. Результаты показали, что ни у одной из свиней не наблюдали клинических признаков. Не было значительного увеличения температуры, выявленного между вакцинированными группами и невакцинированной контрольной группой. Кроме того, не было отмечено существенных различий в увеличении массы тела между вакцинированной и контрольной невакцинированной группами. При вскрытии у двух свиней из десяти из группы с высокой избыточной дозой было выявлено небольшое макроскопическое повреждение, типичное для энзоотической пневмонии. При микроскопическом анализе ткани легкого дополнительных повреждений не наблюдали. В итоге установлено, что температурочувствительный вакцинный штамм 1819 является безопасным, даже при высокой избыточной дозе.

ПЦР анализ (используя праймеры, специфичные для М. йуорпеитошае) показал присутствие М. йуорпеитошае в носовых ходах вакцинированных свиней через 3 недели и 8 недель после вакцинации (см. фиг. 1). Изучение колонизации М. йуорпеитошае, используя ПЦР анализ, также показало присутствие М. йуорпеитошае в трахее (в верхнем, в среднем и нижнем участках) и в совокупности по меньшей мере в 60% трахей вакцинированных свиней (см. фиг. 2). Эти результаты свидетельствуют о колонизации 1819 вакцинным штаммом носовых и трахеальных путей.

Пример 4. Модель контрольного заражения для изучения эффективности вакцины - демонстрация защиты.

Проводили исследование для того, чтобы оценить эффективность вакцинного штамма 1819. Схема исследования включает использование 6-недельных поросят, полученных из свободного от Мусор1а8та стада свиней. Исследование проводили под РС2 уровнем биологической защиты в С81КО (Соттопетеайй §егит 1пби81гу Ке8еагсй Огдаш/айоп). ХУегпЬее. УюЮпа. Ли81гайа. 56 свиней случайным образом распределяли на три группы по 12 свиней для каждой вакцинированной группы и по 10 свиней для каждой из контрольных групп (см. табл. 3).

- 8 021102

Таблица 3

Изучение эффективности на вакцине ΐδ19

Г рупп- па	Назначение	Количество свиней, обработанных средой М.Ьуорлеи- топ1ае в первый день исследования	Вакцинация ($19 в первый день исследова- ния (ЦИЕ/доза)	Количество свиней, зараженных австралийским полевым изолятом на 22-ой день исследования	Общее количество свинеи на группу
¹	Ложно (зпат)вакцинированные (отрицательный контроль)	10			10 ' I I
2	Эффективность		10⁶	12	12 !
3	Эффективность		ю⁷	12	12 _;
4 ι Эффективность	_	10^е ,	12 . 12 /
” 5 ” I I	Невакцинирован- ные (положительный контроль)	Ξ γ---τ-“Ίό —' 1 , ' ¹ 1 ί	10 I _ 3

Вакцину вводили интраназальным путем, тем самым тестируя только эффективность презентации вакцины для слизистой оболочки. Все группы, за исключением невакцинированной, не подвергнутой контрольному заражению отрицательной группы, подвергали контрольному заражению через 22 дня после вакцинации путем интраназального введения австралийского полевого изолята М. йуорпеитошае. Посмертные исследования проводили в течение 3 дней (дни 57, 58 и 59 после вакцинации). На всем протяжении исследования у всех групп проводили ежедневно наблюдение за клиническими симптомами, включая кашель, чихание, одышку и учащенное дыхание. Измерения массы тела проводили в начале и в конце исследования.

Через 22 дня после вакцинации (и перед контрольным заражением) брали мазки из носовых ходов для ПЦР анализа, чтобы определить присутствие М. йуорпеитошае для каждой группы.

Результаты показали, что во всех тестировавшихся группах не наблюдалось ни клинических признаков, ни существенной разницы в увеличении массы тела. Анализ мазков из носовых ходов показал присутствие М. йуориеитошае на 22-й день после вакцинации у 60-70% вакцинированных свиней перед контрольным заражением (см. фиг. 3). Все ложно-вакцинированные контрольные свиньи показали отрицательный результат на присутствие М. йуориеитошае согласно ПЦР-анализу. При вскрытии анализ макроскопических повреждений показал (Наппап е1 а1., 1982) отсутствие повреждений у ложновакцинированной контрольной группы, а также у групп, вакцинированных 10⁶ и 10⁷ ЦИЕ/мл/дозу. У одной из 10 свиней, вакцинированных 10⁸ ЦИЕ/мл/дозу, было обнаружено присутствие небольшого макроскопического повреждения. Однако у 4 из 10 свиней, которые не были вакцинированы, но подвергались контрольному заражению, были выявлены клинические признаки кашля и чихания. При аутопсии исследование легких от четырех свиней показало макроскопические повреждения легких, типичные для инфекции М. йуорпеитошае.

В целом показано, что чувствительный к температуре вакцинный штамм 1к19 является эффективным в защите от инфекции М. йуорпеитошае.

Пример 5. Эффективность вакцины в различных дозах и сравнение с коммерческой убитой вакциной.

Исследование проводили для того, чтобы оценить эффективность вакцинного штамма ΐδ19 в четырех различных дозах. Схема исследования предполагала использование 3-4 недельных поросят, свободных от инфекции (крТ). Исследование проводили на оборудовании РС2 в Национальном центре службы диагностики здоровья животных (Сейто йе Ыасюиа1 йе 8етуюю5 йе Эхадпокйсо еп §а1ий Ашта1, ίΈΝΛδΛ) - государственном испытательном оборудовании в 1есатас, Мехюо. В общей сложности 70 свиней случайным образом распределяли в 7 групп, содержащих по 10 свиней в каждой (табл. 4).

- 9 021102

Таблица 4

Минимальная защитная доза и сравнительное исследование эф( активности

Групп- па	Назначение	Доза вакцины ЦИЕ/мл/доза	Кол-во вакциниро- ванных свиней	Кол-во свиней, подвергнутых контрольному заражению	Общее кол- во свиней на группу
1	Ложн. контроль	Нет данных	0	0	10
2	1з19^а	\| 1 ! ί о 1 1	10	10	10
3	1з19^а	10^4,°	10	10	10
4	Ы9*	Ю⁶⁰	10	10 ί 10
5	1519’	10^в’°	10	10	10
6	Коммерческая инактивирован- ная¹’	2 мл	10	10	10 : I I

ί Положительный Нет данных ¹ контроль : Всего^! Нет данных | Нет данных 50 60 ^а Вакцину вводили в виде интраназального спрея ^ь Вакцину вводили посредством внутримышечного введения.

Четыре различные дозы вакцины 4819 (10³, 10⁴, 10⁵, 10⁶ ЦИЕ/мл) вводили четырем отдельным группам свиней интраназальным путем. Пятая группа получила 2 мл коммерческой неактивной вакцины, вводимой внутримышечным путем. Положительная (невакцинированная, но подвергнутая контрольному заражению) и отрицательная (невакцинированная и не подвергнутая контрольному заражению) группы были также включены в это исследование. Все группы, за исключением отрицательной контрольной группы, подвергали контрольному заражению в двух временных точках. Первое контрольное заражение проводили на 22-й день после вакцинации интраназальным введением, используя И8 изолят М. йуорпеитошае (4О\УЛ штамм 194). Второе контрольное заражение проводили на 84-й день после вакцинации, используя тот же самый штамм для заражения. На всем протяжении исследования у всех групп проводили ежедневное обследование в отношении клинических симптомов, включая кашель, чихание, одышку и учащенное дыхание. Измерения массы тела проводили в начале и в конце исследования.

Результаты показали отсутствие клинических симптомов на протяжении всего периода тестирования продолжительностью 105 дней. Анализ дисперсии для различий по массе между положительной контрольной группой и каждой из вакцинированных групп показал, что 1819 в дозах 10⁵ и 10⁶ ЦИЕ/мл продемонстрировал существенное увеличение в массе тела по сравнению с положительной контрольной группой (фиг. 4). Группа, вакцинированная коммерческой вакциной, не показала какого-либо значительного изменения в увеличении массы по сравнению с положительной контрольной группой (фиг. 4, табл. 5). При аутопсии проводили анализ макроскопического повреждения для каждой группы. Критерий для определения минимальной защитной дозы был основан на коэффициенте защиты (КЗ), составляющем не менее 70% в отношении снижения тяжести повреждений легких. Определили, что минимальная защитная доза для 4к19 составляет 10⁴ ЦИЕ/мл, поскольку в этой дозе был достигнут коэффициент защиты, составляющий 70%, в отношении снижения тяжести повреждений легких (фиг. 5). Также тестировали более высокие дозы 4819 (10⁵ и 10⁶ ЦИЕ/мл) и обнаружили, что они обеспечивают КЗ, составляющие 83 и 88% соответственно в отношении снижения тяжести повреждений легких (фиг. 6). Коммерческая инактивированная вакцина обеспечивала КЗ, составляющий только 37%, что значительно ниже самой низкой использованной дозы 48 1 9 (10³ ЦИЕ/мл, которая обеспечивала КЗ, равный 60%).

- 10 021102

Таблица 5

Анализ дисперсии среднего увеличения массы вакцинированных групп по сравнению с положительной контрольной группой на ИРУ-104/105

Г Р П Анализ дисперсии (Р) по . I I

1 ί Группа 1 1	Обработка	> сравнению с положительным контролем
! 1	Отрицательный контроль	^Г 0,001
²	1з1910^{3 0}	0,394
! ³	(81910⁴’	0,175
! 4	(з19 10®°	0,033
5	(819 10^е°	0,004
6	Коммерческая вакцина	0,315
7	Положительный контроль	Нет данных

дозы 1к19 (ЦИЕ/мл), незначимое различие (Р>0,05), значимое различие (Р<0,05).

Claims

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

1. Вакцинный штамм Мусор1акта Еуорпеитошае, депонированный в Ναΐίοηαΐ МеакигетеШк ΙηκΙίΙιιΙο. Австралия, под регистрационным номером ΝΜ04/41259, который является температурочувствительным и аттенуированным.
2. Вакцинная композиция, содержащая штамм Мусор1акта Еуорпеитошае по п.1 и носитель, которая в иммунизирующем количестве способна вызывать защитный иммунитет против заболевания, вызываемого Мусор1акта Еуорпеитошае.
3. Вакцинная композиция по п.2, содержащая адъювант.
4. Вакцинная композиция по любому из пп.2 или 3, содержащая по меньшей мере один дополнительный инфекционный агент, который представляет собой вирус, бактерию, гриб или паразитический организм.
5. Вакцинная композиция по любому из пп.2-4, приготовленная в виде препарата для введения в дыхательные пути.
6. Вакцинная композиция по п.5 в форме аэрозольного препарата.
7. Вакцинная композиция по любому из пп.2-6, где заболевание, вызываемое Мусор1акта Еуорпеитотае, представляет собой энзоотическую пневмонию или микоплазменную пневмонию свиней.
8. Способ снижения вероятности возникновения заболевания, вызываемого Мусор1акта Еуорпеитотае, у свиньи, включающий введение свинье иммунизирующего количества вакцинной композиции по любому из пп.2-7.
9. Способ предупреждения заболевания, вызываемого Мусор1акта Еуорпеитошае, у свиньи, включающий введение свинье иммунизирующего количества вакцинной композиции по любому из пп.2-7.
10. Способ по любому из пп.8 или 9, при котором вакцинную композицию вводят в дыхательные пути.
11. Способ по любому из пп.8 или 9, при котором вакцинную композицию вводят путем ингаляции, интраназально или посредством аэрозоля.
12. Способ по любому из пп.8 или 9, где заболевание, вызываемое Мусор1акта Еуорпеитошае, представляет собой энзоотическую пневмонию или микоплазменную пневмонию свиней.
13. Способ получения вакцины по любому из пп.2-7, включающий объединение штамма Мусор1акта Еуорпеитошае по п.1 с носителем, адъювантом и, при необходимости, по меньшей мере с одним дополнительным инфекционным агентом, который представляет собой вирус, бактерию, гриб или паразитический организм.
14. Вакцинная композиция, содержащая адъювант и штамм Мусор1акта Еуорпеитошае, депонированный в №Юопа1 МеакигетеШк 1пкЙи1е, Австралия, под регистрационным номером N^4/41259, который является температурочувствительным и аттенуированным и который получен путем химического мутагенеза штамма Мусор1акта Еуорпеитошае с отбором температурочувствительного мутанта, который остается жизнеспособным после серийного пассирования ш νίϋΌ, которая в иммунизирующем количестве способна вызывать защитный иммунитет против заболевания, вызываемого Мусор1акта Еуорпеитотае.