ES2579935T3 - Cepa de vacuna de Mycoplasma Hyopneumoniae sensible a temperatura y uso de la misma - Google Patents

Cepa de vacuna de Mycoplasma Hyopneumoniae sensible a temperatura y uso de la misma Download PDF

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Abstract

Una cepa de la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae depositada ante el National Measurements Institute (Australia) bajo el número de acceso NM04/41259, cuya cepa es sensible a la temperatura y atenuada.

Description

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DESCRIPCION
Cepa de vacuna de Mycoplasma Hyopneumoniae sensible a temperatura y uso de la misma Campo
La presente invencion se relaciona con cepas de Mycoplasma hyopneumoniae, vacunas que comprenden dichas cepas y usos de dichas vacunas para proteger contra neumoma por micoplasma en cerdos.
Antecedentes
El Mycoplasma hyopneumoniae es el agente etiologico de la neumoma por micoplasma porcina (tambien llamada neumoma enzootica (EP)). Es una de las enfermedades respiratorias mas frecuentes y economicamente significativas que afectan a la produccion porcina en todo el mundo. La enfermedad se asocia con infecciones secundarias, alta tasas de morbilidad y bajas tasas de mortalidad, baja conversion alimenticia y se puede atribuir a perdidas economicas mundiales estimadas en aproximadamente USD$ 1 mil millones por ano.
En el documento EP, las bacterias de Mycoplasma hyopneumoniae se unen a los cilios de las celulas epiteliales en los pulmones de cerdos destruyendo los cilios normales y saludables lo que permite a organismos oportunistas establecerse por sf mismos en el tejido respiratorio provocando la enfermedad. Una vez establecida, la M. hyopneumoniae provoca lesiones en los pulmones de los cerdos.
La enfermedad es muy contagiosa y la transmision es usualmente a traves de contacto directo con las secreciones del tracto respiratorio infectado, por ejemplo gotas expulsadas desde el hocico o boca al estornudar o toser.
Actualmente existen diversas vacunas contra M. hyopneumoniae. La mayona de las vacunas actuales son proporcionadas por cerca de 10 empresas con 22 marcas de vacunas registradas, ya sea como sencilla o bi/multivalente. Todas son preparaciones de M. hyopneumoniae muertas o inactivas
El documento WO02/10343 divulga una vacuna viva sensible a la temperatura para Mycoplasma hyopneumoniae.
Ejemplos de vacunas de M. hyopneumoniae inactivadas de celulas completas incluyen RESPISURE™ y STELLAMUNE™ (Pfizer), SUVAXYN M. HYO™ (Fort Dodge), HYORESP™ (Meriel), M+PAC™ (Schering-Plough) y PORCILIS™ (Intervet).
Mientras que algunas vacunas pueden reducir la gravedad de la EP, ninguna de las vacunas de celulas completas inactivadas o muertas disponibles proporciona una proteccion completa contra la infeccion por M. hyopneumoniae. De acuerdo con lo anterior subsiste la necesidad de una vacuna mas efectiva.
Es un objetivo de una realizacion preferida de la presente invencion proporcionar una cepa viva de Mycoplasma pneumoniae adecuada para su uso en vacunacion para prevenir la neumoma enzootica.
Todas las referencias, incluyendo cualesquier patentes o solicitudes de patentes, citadas en esta especificacion se incorporan como referencia. Se entendera claramente que, aunque se conocen aqu una serie de publicaciones de la tecnica anterior, esta referencia no constituye una admision de que cualquiera de estos documentos forma parte del conocimiento general comun en la tecnica.
Resumen
La invencion proporciona de manera general una cepa de Mycoplasma hyopneumoniae atenuada viva que se puede utilizar para producir una vacuna viva que es efectiva en proteccion contra neumoma enzootica en cerdos.
Un primer aspecto proporciona una cepa de la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae depositada ante el National Measurements Institute (Australia) bajo el numero de acceso NM04/41259, cuya cepa es sensible a la temperatura y atenuada.
En una realizacion la cepa de vacuna comprende una mutacion en todos los genes enumerados en la Tabla 1.
Las vacunas atenuadas son generalmente ventajosas porque presentan todos los determinantes inmunogenicos pertinentes de un agente infeccioso en su forma natural al sistema inmunitario del anfitrion y la necesidad de cantidades relativamente pequenas de agente inmunizante debido a la capacidad del agente de multiplicarse en el anfitrion vacunado. Los metodos para atenuar incluyen pasar una cepa virulenta multiples veces o exponerla a radiacion o productos qmmicos. Se supone que estos metodos introducen mutaciones en el genoma que hacen al microorganismo menos virulento, pero todavfa capaz de replicacion.
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Las desventajas de estos metodos son que introducen mutaciones aleatorias que no se caracterizan a nivel molecular. Tambien los metodos para seleccionar atenuacion, tal como al seleccionar sensibilidad a la temperatura asociada a menudo consumen mucho tiempo, producen resultados falsos ya que una cepa sensible a la temperatura no puede ser atenuada y una cepa atenuada no necesita ser sensible a la temperatura, y requieren una gran cantidad de ensayo y error. Adicionalmente, la cepa atenuada puede experimentar mutacion adicional y revertir a virulencia.
Con el objetivo de proporcionar una vacuna viva contra la neumoma por micoplasma los inventores sometieron un aislado de Mycoplasma hyopneumoniae a mutagenesis qmmica y se seleccionaron clones que fueron sensibles a la temperatura. Los inventores secaron por congelacion las bacterias mutantes vivas y encontraron que las bacterias se podnan reconstituir despues de una semana y permanecer viables despues de pasajes en serie y por lo tanto son adecuadas como una cepa de vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae. La cepa de vacuna y cepa maestra se secuenciaron y se identifico la comparacion de las secuencias de genes que fueron mutados en la vacuna, lo que permite la caracterizacion genetica de la cepa atenuada.
Se muestra que la cepa de vacuna confiere inmunidad protectora y no muestra ninguna reversion a la virulencia a pesar de los pasajes en serie (datos no mostrados).
Un segundo aspecto proporciona una composicion de vacuna que comprende la cepa de vacuna de M. hyopneumoniae del primer aspecto y un portador, opcionalmente un adyuvante, y/o opcionalmente por lo menos un agente infeccioso adicional, cuya vacuna en una cantidad inmunizante es capaz de provocar inmunidad protectora contra una enfermedad provocada por M. hyopneumonia. El agente infeccioso puede ser un virus, una bacteria, un hongo o un parasito.
Un tercer aspecto comprende un metodo para elaborar la vacuna del segundo aspecto, el metodo comprende combinar la Mycoplasma hyopneumoniae del primer aspecto con un portador, opcionalmente un adyuvante y/o opcionalmente por lo menos un agente infeccioso adicional. Un agente infeccioso puede ser un virus, una bacteria, un hongo o un parasito.
Un cuarto aspecto proporciona el uso de la cepa de la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae del primer aspecto en la fabricacion de un medicamento para prevenir la enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae en un animal porcino.
En una realizacion preferida la “enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae” es la neumoma enzootica o neumoma de micoplasma porcina.
Breve descripcion de las Figuras
Figura 1: Colonizacion nasal de cepa de vacuna de ts19 en cerdos vacunados en altas sobredosis.
Figura 2: Colonizacion de traquea a 59 dfas despues de vacunacion (DPV) en cerdos vacunados en altas sobredosis con vacuna ts19.
Figura 3: Colonizacion nasal en cerdos vacunados con cepa de vacuna de ts19 en diversas dosis.
Figura 4: Pesos corporales totales diferenciales durante el periodo de estudio (105 dfas).
Figura 5: Determinacion de Dosis Protectora Minima para ts19.
Figura 6: fndice protector de ts19 y vacuna comercial con base en la reduccion en la severidad de lesiones pulmonares. Descripcion Detallada
La cepa de M. hyopneumoniae “LKR” se aislo originalmente de un especimen de matadero (Lloyd y Etheridge 1981, J Comp Path 91: 77-83). El organismo se volvio a aislar a partir de cerdos infectados experimentalmente antes de ser pasado aproximadamente 10 veces en un medio acelular para alcanzar el aislamiento clonal (CSIRO, Victoria). El clon luego se presento a la coleccion de Micoplasma de la Universidad de Adelaida, Australia del Sur. El aislado LKR luego se obtuvo por la Universidad de Melbourne, Departamento de Ciencias Veterinarias (Grupo de Mycoplasma), donde fue sometido a 3 pasajes in vitro en caldo de cultivo Friis modificado, para almacenamiento. Los frascos almacenados se designaron “lKr P3 29/5/97”. Este clon representa la cepa progenitora.
La LKR P3 29/5/97 se paso in vitro y se sometio a mutagenesis NTG (200 mg/ml) utilizando un metodo descrito previamente (Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). Se selecciono un clon sensible a temperatura (“ts-19”) de una placa de agar y se cultivo en 3 mL de caldo de cultivo modificado Friis. El numero de pasajes para este clon se designo “P0” y se habfa sometido posteriormente a cuatro pasajes in vitro adicionales en una dilucion 1: 4 v/v por pasaje en caldo de cultivo Friss modificado. El nivel de pasajes final se designo “LKR ts-19 P4 MS”.
La LKR ts-19 P4 MS se sometio a una serie de pasajes de dilucion in vitro en caldo de cultivo Friis Modificado para alcanzar una dilucion de 3.2 x 10-21. El clon mutante final se designo “LKR ts-19 de 3.2 x 10'21”.
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La LKR ts-19 3.2 x 10-21 se seco por congelamiento y se presento a los Laboratorios Analfticos del Gobierno de Australia (Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del deposito de microorganismos para proposito de procedimiento de patentes) bajo el numero de acceso NM04/41259.
Los micoplasmas tienen un tamano de genoma muy reducido que refleja sus capacidades biosinteticas limitadas y su dependencia parasitaria como la dependencia de su anfitrion. A la luz de la redundancia limitada en sus genomas, la mutagenesis NTG de un componente particular de una ruta puede tener un efecto significativo sobre la supervivencia de una celula de Mycoplasma. La mutagenesis NTG resulta en mutaciones aleatorias (transiciones de nucleotidos, transversiones, supresiones o inserciones) dentro del genoma. Esto dana lugar a una poblacion de genomas variantes que contienen cada uno ya sea una o mas mutaciones. Es de suponer que muchos de los genomas variantes no sobrevivinan debido a un gen o genes cnticos que permanecen disfuncionales. Si las mutaciones no incurren en un efecto perjudicial sobre la capacidad de los organismos para crecer entonces esos organismos supervivientes variantes se pueden someter a una seleccion adicional (por ejemplo, seleccion de temperatura). En el desarrollo de ts19, la seleccion se basa en la capacidad de la cepa variante de crecer a un tftulo alto a una temperatura de 33° C y disminuye la capacidad de crecer a 39.5° C. Sobre la base de la comparacion de secuencias del genoma completo entre la cepa de vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae ts19 y aquella de la cepa progenitora (LKR), se ha identificado un numero de mutaciones (cambios de nucleotidos) en el genoma de ts19. Estas mutaciones incluyen sustituciones de nucleotidos (transiciones y transversiones), asf como supresiones e inserciones.
Las mutaciones se encuentran alrededor del genoma completo e incluyen un rango de genes expresados, asf como protemas hipoteticas y secuencias no codificantes. La Tabla 1 enumera los genes que se han mutado por sustituciones, supresiones o inserciones de bases. Los genes se han clasificado de acuerdo a su funcion principal. Los expertos en la tecnica facilmente apreciaran como detectar si una cepa de M. hyo contema una mutacion en uno de los genes enumerados en la Tabla 1 al determinar de si existe una diferencia entre la secuencia de referencia proporcionada (por ejemplo YP_278901.1) y la secuencia de la cepa atenuada. La tsl9, depositado como NM04/41259 es una cepa atenuada que comprende la totalidad de las mutaciones enumeradas en la Tabla 1.
La cepa atenuada comprende por lo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o todas las mutaciones enumeradas en la Tabla 1. La cepa atenuada comprende una mutacion en uno o cada uno de los factores de virulencia, y/o uno o cada uno de los genes implicados en el metabolismo de carbohidratos, y/o el gen implicado en el metabolismo de fosfolfpidos, y/o el gen implicado en el metabolismo de cofactor, y/o uno o cada uno de los genes implicados en la transcripcion o traduccion, y/o uno o cada uno de los genes implicados en el transporte de membrana, y/o uno o cada uno de los genes implicados en la replicacion, reparacion o metabolismo del ADN y/o el gen de transposasa enumerado en la Tabla 1.
En una realizacion, la cepa atenuada comprende una mutacion en cada uno de los factores de virulencia.
Tabla 1: Mutaciones atenuantes dentro de los genes de cepa de vacuna de M. hyopneumoniae Tts19.
Factores de virulencia:
Protema de membrana externa putativa P95
YP 278901.1
Lipoprotema putativa (MHJ 0213)
YP 279015.1
Lipoprotema putativa (MHJ 0362)
YP 279161.1
Protema de superficie putativa P216
YP 279290.1
Protema similar a adhesion putativa P146
YP 279457.1
Metabolismo de carbohidratos:
Triosafosfato isomerasa
YP 278904.1
Transquetolasa
YP 279223.1
Componente ABC II espedfico a N-acetilglucosamina-II del sistema PTS putativo
YP 279370.1
Metabolismo de fosfolfpido:
CDP-diacilglicerol-glicerol-3-fosfato-3- fosfatidial transferasa
YP 279075.1
Metabolismo de co-factores:
Nicotinato de fosforribosiltransferasa
YP 279204.1
Transcripcion/traduccion:
Gen GidA [enzima de modificacion tARN uridina 5-carboximetilaminometil
YP 278808.1
Protema ribosomal L3 50S
YP 278992.1
Leucil-tARN sintetasa
YP 279441.1
Isoleucil tARN sintetasa
YP 278833.1
Transporte de membrana:
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35
Protema permeasa de transportador ABC putativo
YP 279164.2
Union ATP de transportador ABC putativo
YP 278823.1
Protema transportadora de cromato putativo
YP 278943.1
Protema permeasa y Union ATP de transportador ABC putativo
YP 278958.1
Componente Yidc de translocasa protema de membrana interna putativa
YP 279468.1
Protema permeasa similar a p69 del sistema de transporte ABC putativo
YP 279157.1
Protema permeasa de transportador ABC putativo
YP 279176.1
Union Pr1 de ATP de transportador ABC putativo
YP 279419.1
Replicacion /reparacion/metabolismo de ADN
Toposoimerasa I ADN
YP 279077.1
glicosilasa ADN Uracilo
YP 278929.1
ObgE GTPasa
YP 278842.1
Polimerasa IV de ADN
YP 278846.1
Subunidad alfa de ribonucleotido-reductasa disulfato
YP 279017.1
Timidilato quinasa
YP 279053.1
Subunidad delta de polimerasa III de ADN
YP 279054.1
ADN ligasa
YP 279060.1
Subunidad A de girasa ADN
YP 279326.
Ribonucleasa HII
YP 279388.1
Pirofosfatasa inorganica
YP 279400.1
Subunidad C ABC de excinucleasa
YP 278867.1
Transposasa
Transposasa ISMHp1 putativa
YP 279110.1
El numero YP indica secuencia de referencia NCBI
La cepa bacteriana descrita aqm es una cepa sensible a temperatura viva y atenuada y se puede utilizar en una vacuna viva.
Una cepa viva atenuada es una cepa bacteriana viva que ha sido cultivada bajo condiciones que redunden o “atenuan” sus propiedades virulentas. Las vacunas vivas normalmente provocan una respuesta inmunologica mas duradera que los microorganismos inactivados o muertos.
La cepa de vacuna de acuerdo con el primer aspecto se puede producir por mutacion qmmica de un aislado de Mycoplasma hyopneumoniae. La mutacion qmmica comprende particularmente mutagenesis mediante tratamiento con N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) (Nonamura y Imada (1982), Avian Diseases 26; 763-775). Las bacterias mutantes sensibles a temperatura se pueden seleccionar por su capacidad para crecer a una temperatura permisiva (33° C) y no es capaz de crecer a una temperatura no permisiva (39.5° C). Para uso en una vacuna los mutantes sensibles a temperatura se someten a pasajes en serie y dilucion.
La cepa de la vacuna bacteriana de Mycoplasma de acuerdo con el primer aspecto es viable (o viva). En general la viabilidad significa la “capacidad de supervivencia” general y se utiliza mas espedficamente en el sentido de una capacidad para vivir, desarrollarse o germinar bajo condiciones favorables. Una celula bacteriana es viable si es capaz de crecer en ya sea un caldo adecuado o medios de agar.
La cepa bacteriana depositada bajo el Tratado de Budapest como NM 04/41259 fue producida por pasajes in vitro tres veces (3x) a (1: 4 v/v en caldo de cultivo Friss modificado) de aislado de Mycoplasma hyopneumoniae LKR Australiano (obtenido de la coleccion Micoplasma de Universidad de Adelaide por el Grupo de Micoplasma de la Universidad de Melbourne) para producir LKR P3. Luego, el aislado de LKR P3 se sometio a mutagenesis NTG. El LKR P3 mutagenizado se cultivo en agar a 33° C (una temperatura permisiva) y a 39.5° C (temperatura no permisiva). Se seleccionaron clones mutantes que crecieron a 33° C pero no crecieron en 39.5° C. Los clones seleccionados se sometieron a varias rondas de pasajes in vitro y de dilucion en serie. En la ronda final de los pasajes, un clon seleccionado (ts19) se deposito bajo el Tratado de Budapest en el National Measurements Institute (luego llamado Laboratorios Analtticos del Gobierno de Australia) como un cultivo secado por congelamiento. Las muestras se reconstituyeron despues de una semana de almacenamiento y se encontro que son viables.
El termino “pasajes en serie in vitro” se refiere a la practica de pasajes repetidos de las bacterias en medios. Se trata de la inoculacion de un medio de caldo con un cultivo bacteriano vivo, al que luego se da un tiempo para incubar a la temperatura apropiada. Una porcion del cultivo incubado luego se utiliza para inocular un cultivo esteril fresco que a su vez se le da un tiempo para incubar. El ciclo continua para alcanzar el numero deseado de pasajes. Cada ronda de crecimiento y reinoculacion se refiere como un unico pasaje.
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El segundo aspecto proporciona una vacuna que comprende la cepa bacteriana del primer aspecto y un portador tal como medio de de crecimiento de M. hyopneumoniae, agua esteril o solucion salina isotonica esteril.
Una vacuna es una preparacion biologica que establece o mejora la inmunidad a una enfermedad particular. Las vacunas pueden ser profilacticas (por ejemplo, para prevenir o mejorar los efectos de una futura infeccion por el patogeno) o terapeuticas (por ejemplo, para tratar la infeccion). La vacuna del segundo aspecto es profilactica para una enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae.
El portador apropiado sera evidente para aquellos expertos en la tecnica y dependera en gran parte de la ruta de administracion. La vacuna puede comprender ademas uno o mas ingredientes adicionales que incluyen pero no se limitan a, agentes de suspension, estabilizantes o dispersantes.
Aun los componentes adicionales que pueden estar presentes en la vacuna son adyuvantes, conservantes, estabilizantes qmmicos, u otras protemas antigenicas. Normalmente, los estabilizantes, adyuvantes y conservantes se optimizan para determinar la mejor formulacion para eficacia en el animal objetivo. Los conservantes de ejemplo adecuados incluyen clorobutanol sorbato de potasio, acido sorbico, dioxido de azufre, galato de propilo, parabenos, vainillina de etilo, glicerina, fenol, y paraclorofenol. Los ingredientes estabilizantes adecuados que se pueden utilizar incluyen, por ejemplo, casaminoacidos, sacarosa, gelatina, rojo fenol, N-Z amina, difosfato de monopotasio, lactosa, hidrolizado de lactalbumina, y leche en polvo. Se utiliza un adyuvante convencional para atraer leucocitos o potenciar una respuesta inmunitaria. Dichos adyuvantes incluyen, entre otros, MPL.TM. (lfpido 3-O-desacilado monofosforil AA;. RIBI ImmunoChem Research, Inc., Hamilton, MT), aceite mineral y agua, hidroxido de aluminio, Amphigen, Avridina,
L121/escualeno, D-lactida-polilactida/glucosido, pliois Pluronicos, muramil dipeptido, Bordetella muerta, saponinas, tales como Quil A o StimulonTM. QS-21 (Aquila Biopharmaceuticals, Inc., Framingham, Mass.)) y toxina del colera (ya sea en una forma del tipo silvestre o forma mutante, por ejemplo, en donde el acido glutamico en la posicion del aminoacido 29 se sustituye por otro aminoacido, preferiblemente una histidina, de conformidad con la Solicitud de Patente Internacional No. WO2000/018434
En una realizacion, la vacuna, si se inyecta tiene poca o ninguna reaccion adversa o no deseada en el sitio de inyeccion, por ejemplo irritacion de la piel, hinchazon, erupcion cutanea, necrosis, sensibilizacion de piel.
La invencion se relaciona adicionalmente con la proteccion contra la enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae. La vacuna del segundo aspecto es profilactica para una enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae.
La “profilaxis” o terapia “profilactica” o “preventiva” o “proteccion contra” como se menciona aqrn incluye mantener la infeccion que ocurre u obstaculizar o defender de o proteger de la aparicion o gravedad de una enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae, que incluye prevenir, proteger o disminuir la gravedad de un smtoma o caractenstica de enfermedad en un sujeto que puede estar predispuesto a la enfermedad, pero todavfa no se ha diagnosticado que la tiene. Tambien incluye la reduccion del penodo de la infeccion o la incidencia de los smtomas y reducir el tamano de cualquier lesion.
“Profilaxis”, como se utiliza aqrn abarca la prevencion total de la enfermedad o una reduccion en la extension o smtomas de la enfermedad. Tambien se refiere a la reduccion o inhibicion de la transmision de Mycoplasma hyopnemonia o la prevencion de las bacterias que se establecen en el anfitrion o la proteccion contra la infeccion secundaria con otras cepas de Mycoplasma hyopnemonia u otros agentes infecciosos.
La vacuna del segundo aspecto se puede preparar para administracion a los cerdos en la forma de, por ejemplo, lfquidos, polvos, aerosoles, comprimidos, capsulas, comprimidos o capsulas con recubrimiento enterico, o supositorios. Las rutas de administracion incluyen, sin limitacion, administracion parenteral, administracion intraperitoneal, administracion intravenosa, administracion intramuscular, administracion subcutanea, administracion intradermica, administracion oral, administracion topica, administracion intranasal, administracion intrapulmonar, administracion rectal, administracion vaginal, y similares.
En una realizacion preferida se formula la vacuna para administracion al tracto respiratorio, por ejemplo, por administracion intranasal, administracion en aerosol o administracion por inhalacion por la boca o la nariz. Esta ruta de administracion se prefiere debido a la naturaleza de la inmunidad protectora por M. hyopneumoniae puede ser la inmunidad local (pulmonar) y la inmunidad mediada por celulas en la prevencion de la enfermedad en lugar de a partir de anticuerpos circulantes. La presentacion de la vacuna en el tracto respiratorio puede estimular una respuesta inmune local. Por lo tanto la administracion localizada de la vacuna puede ser mas efectiva. Adicionalmente al administrar la vacuna en el lugar o granero (administracion masiva de rociado grueso) y al permitir que los cerdos lo inhalen, se reduce la mano de obra involucrada en la vacunacion de un gran numero de animales. La vacunacion con aerosol (vacunacion por pulverizacion) se utiliza actualmente sobre una base comercial para vacunar a las aves de corral con eficacia contra ciertas enfermedades y se ha mostrado en nuestros ejemplos que son adecuadas para la vacunacion de los cerdos.
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La administracion intranasal cubre cualquier administracion a traves de las fosas nasales o el hocico. La vacuna se puede aplicar a la cavidad nasal como una solucion, suspension o polvo seco. Las soluciones y suspensiones se pueden administrar por via intranasal utilizando, por ejemplo, una pipeta, un cuentagotas o un aerosol, opcionalmente un pulverizador de aerosol. Los polvos secos se pueden administrar por via intranasal mediante inhalacion.
La administracion en aerosol se refiere a la administracion de la vacuna en forma de una suspension de partfculas solidas finas o gotitas lfquidas en un gas.
La inhalacion (tambien conocida como inspiracion) es el movimiento de aire desde el entorno externo, a traves de las vfas respiratorias, y en los alveolos en los pulmones.
Una dosis efectiva de la vacuna que se emplea terapeuticamente dependera, por ejemplo, de los objetivos terapeuticos, la ruta de administracion, y la condicion del cerdo.
Los niveles de dosificacion para la vacuna por lo general seran del orden de aproximadamente 104 a 108 unidades de cambio de color (CCU) por ml por dosis, y preferiblemente de aproximadamente 105 a 107 CCU por ml por dosis.
Se entendera, sin embargo, que el nivel de dosis espedfica para cualquier animal porcino particular dependera de una variedad de factores que incluyen la actividad del compuesto espedfico empleado, edad, peso corporal, salud general, sexo, dieta, tiempo de administracion y ruta de administracion.
La seleccion y ajuste hacia arriba o abajo de la dosis efectiva se encuentra dentro del alcance de la tecnica.
En una realizacion preferida, la vacuna se administra por via intranasal, por aerosol o mediante inhalacion.
Los terminos “cerdo” y “porcino” se utilizan aqrn de forma intercambiable y se refieren a los lechones, cerdos, cerdos jovenes, cerdos castrados, jabalfs y miembros de la familia de los suidos.
A lo largo de esta especificacion, a menos que el contexto requiera otra cosa, la palabra “comprenden”, o variaciones tales como “comprende” o “que comprende”, se entendera que implican la inclusion de un elemento indicado o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros pero no la exclusion de cualquier otro elemento o numero entero o grupo de elementos o numeros enteros.
Tambien hay que senalar que, tal como se utiliza en la especificacion objeto, las formas singulares “un”, “una” y “el” incluyen los aspectos plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario.
Sera evidente para el experto en la tecnica que mientras que la invencion se ha descrito con cierto detalle para propositos de claridad y comprension, diversas modificaciones y alteraciones a las realizaciones y metodos descritos aqrn se pueden hacer sin apartarse del alcance del concepto de la invencion descrito en esta especificacion.
La invencion se describe ahora con mas detalle mediante referencia al siguiente ejemplo. El ejemplo se proporciona solo con fines de ilustracion, y no se pretende que sean limitantes a menos que se especifique lo contrario. Por lo tanto, la invencion abarca cualquiera y todas las variaciones que se hacen evidentes como resultado de la ensenanza proporcionada aqrn.
Ejemplo 1: Preparacion de la cepa de la vacuna
La cepa LKR de Mycoplasma hyopneumoniae australiana es una muestra de matadero de pulmon de cerdo que presenta la enfermedad tfpica de neumoma enzootica (Lloyd and Etheridge (1981), J. Comp. Path. 91:77-83). El aislado se cultivo y se almaceno en la coleccion de cultivos de referencia de Mycoplasma en la Universidad de Adelaida, Australia del Sur. Un cultivo de esta cepa se obtuvo posteriormente por el grupo de Mycoplasma en la Universidad de Melbourne, Victoria.
El cultivo se paso in vitro tres veces antes de ser sometido a mutagenesis utilizando N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) a 200 mg/mL utilizando un metodo descrito previamente (Nonamura and Imada (1982) Avian Diseases 26:763-775). En pocas palabras, un cultivo de cepa LKR de M. hyopneumoniae se hace crecer hasta la fase logantmica tardfa y se sedimenta por centrifugacion. Las celulas se lavaron en solucion salina regulada con fosfato (PBS) y se expusieron a NTG. Las celulas se sedimentaron y se resuspendieron en medio Friis modificado (Friis, N.F. 1975) y se incubaron a 33° C durante 4 h. El cultivo se paso a traves de un filtro de 0.45 pm, se hacen diluciones apropiadas y se colocan alfcuotas sobre placas de agar y se incubaron a 33° C. Las colonias que habfan crecido se clonaron en 3 ml de caldo y se incubaron a 33° C. Las ampollas de los clones se almacenaron a -70° C y se determino la sensibilidad a la temperatura de cada clon.
La sensibilidad a la temperatura de tS19 se determino al realizar una valoracion por duplicado y la incubacion a 33 °C y 39.5 °C. El tftulo es normalmente> 1 x 108 CCU/ml a 33° C y <1 x 102 CCU/ml a 39.5 °C.
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La cepa TS19 se deposito bajo el Tratado de Budapest como NM 04/41259.
La cepa tS19 y la cepa LKR se secuenciaron utilizando tecnicas estandar, permitiendo de esta manera que la cepa atenuada sea caracteriza geneticamente. Se encontro que la cepa ts19 para contener una serie de mutaciones geneticas en comparacion con su cepa maestro y los genes que contienen estas mutaciones se identifican en la Tabla 1.
Ejemplo 2: Preparacion de vacuna
Para preparar una vacuna, un cultivo de ts19 se hace crecer a 33° C en medio de Friis modificado que contiene rojo fenol (indicador de pH) hasta que se observo un cambio de color acido. La vacuna se titulo en los medios Friis modificados utilizando una placa de microtitulacion de 96 pozos. Se realizo una serie de diluciones de diez veces a traves de las primeras 10 de las 12 columnas de la placa de microtitulacion. Los ultimos dos filas permanecieron no inoculadas y sirvieron como un medio de solo control (negativo). Hasta seis placas de microtitulacion fueron utilizadas en cada titulacion.
Despues de incubacion hasta 3 semanas las placas se calificaron pon cambio de color y el tftulo promedio medido a traves del numero mas probable (NMP). El tftulo promedio final se expresa como unidades de cambio de color (CCU) por mL.
El cultivo de vacuna ts19 se mantuvo en almacenamiento a largo plazo como un formato de “humedo congelado” a -70° C a -80° C. Como alternativa, se liofilizo el cultivo de vacuna ts19 (secado por congelamiento) y se mantiene en almacenamiento a a -20° C.
Ejemplo 3: Seguridad de vacuna y estudio de colonizacion
Un estudio se llevo a cabo con el fin de evaluar el perfil de seguridad de la cepa de la vacuna ts19. El diseno del estudio implico el uso de cerdos de 6 semanas de edad, obtenidos a partir de una piara de cerdos libre de Mycoplasma. El estudio se realizo bajo nivel de bioseguridad PC2 en el CSIRO Commonwealth Serum Industry Research Organisation), Werribee, Victoria, Australia. Un total de 20 cerdos fueron asignados aleatoriamente a dos grupos de 10 cerdos cada uno (ver Tabla 2).
Tabla 2: Estudio de seguridad en la cepa de la vacuna ts19
Grupo
Proposito Numero de cerdos tratados con medio de M. hyopneumoniae en el primer dfa del ensayo Numero de cerdos vacunados con ts-19 (CCU/dosis) en el primer dfa del ensayo Numero total de cerdos por grupo
1
Vacunado simulado (control negativo) 10 — 10
2
Seguridad (Alta Sobredosis) — 10 10
Total
20
La vacuna fue suministrada por via intranasal por lo cual solo las pruebas de seguridad para la presentacion de la mucosa de la vacuna. Grupo 1 (control no vacunado) y Grupo 2 (alta sobredosis de cerdos vacunados) se llevaron a cabo durante 59 dfas para la observacion clmica (Tabla 2).
Todos los cerdos en este estudio de seguridad se controlaron dos veces al dfa para la temperatura corporal rectal desde un dfa antes de la vacunacion, asf como cuatro dfas despues de la vacunacion. Todos los cerdos tambien fueron monitorizados para detectar signos respiratorios como tos, estornudos, disnea y taquipnea. Todos los cerdos fueron evaluados para lesiones pulmonares macroscopicas y microscopicas. Las lesiones pulmonares macroscopicas fueron evaluadas utilizando el metodo Hannan et al, 1982. Adicionalmente, se tomaron muestras de frotis nasal, de pulmon y traquea para propositos de analisis PCR.
Los cerdos de cada grupo tambien se ensayaron 3 semanas despues de vacunacion para la presencia de M. hyopneumoniae en sus cavidades nasales utilizando una tecnica de pCr. Por ultimo, se monitorizaron los cerdos para el aumento de peso durante el penodo de estudio. Los resultados mostraron que no se observaron signos clmicos en ninguno de los cerdos. No hubo un aumento significativo en la temperatura detectada entre los grupos vacunados y el grupo de control no vacunado. Adicionalmente, no se observaron diferencias significativas en la ganancia de peso corporal entre los grupos de control no vacunados y vacunados. En la necropsia, dos de cada diez cerdos del grupo de alta sobredosis cada uno tema una pequena lesion macroscopica tfpica de pneumoniae enzootica. No se observaron lesiones adicionales por el analisis microscopico del tejido pulmonar. En general, la cepa de la vacuna ts19 sensible a la temperatura demostro ser segura, incluso a una alta sobredosis.
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El analisis de PCR (utilizando cebadores espedficos para M. hyopneumoniae) mostro la presencia de M. hyopneumoniae en las fosas nasales de los cerdos vacunados a las 3 semanas y 8 semanas despues de vacunacion (vease Figura 1). Los estudios de colonizacion de M. hyopnuemoniae utilizando analisis de PCR tambien mostraron la presencia de M. hyopnuemoniae en la traquea (ya sea en las regiones superior, media e inferior) y colectivamente en por lo menos 60% de la traquea de los cerdos vacunados (vease Figura 2). Estos resultados indican la colonizacion de la cepa de la vacuna ts19 en las fosas nasales y de la traquea.
Ejemplo 4: Modelo de exposicion de estudio de eficacia de vacuna - Proteccion documentada
Se llevo a cabo un estudio con el fin de evaluar la eficacia de la cepa de la vacuna ts19. El diseno del estudio implico el uso de cerdos de 6 semanas de edad, obtenidos de un rebano de cerdos libres de Mycoplasma. El estudio se realizo bajo nivel de bioseguridad PC2 en el CSIRO Commonwealth Serum Industry Research Organisation), Werribee, Victoria, Australia. Un total de 56 cerdos fueron asignados aleatoriamente a tres grupos de 12 cerdos de cada grupo vacunado y 10 cerdos para cada uno de los grupos de control (vease Tabla 3).
Tabla 3: Estudio de eficacia sobre la vacuna ts19
Grupo
Proposito Numero de cerdos tratados con medio de M. hyopneumoniae en el primer dfa del ensayo Numero de cerdos vacunados con ts- 19 (CCU/dosis) en el primer dfa del ensayo Numero de cerdos expuestos con aislado de campo Australiano en el dfa 22 del ensayo Numero total de cerdos por grupo
1
Vacunado simulado (control negativo) 10 10
2
Eficacia — 106 12 12
3
Eficacia — 107 12 12
4
Eficacia — 108 12 12
5
Neon-vacunado (control positivo) 10 10
Total
56
La vacuna fue suministrada por ruta intranasal con ello solo se prueba la eficacia para la presentacion de la mucosa de la vacuna. Todos los grupos excepto el grupo negativo no vacunado, no expuesto fueron expuestos a los 22 dfas despues de vacunacion mediante administracion intranasal de un aislado de M. hyopneumoniae de campo Australiano. Las autopsias se realizaron durante 3 dfas (dfas 57, 58 y 59 despues de vacunacion). A lo largo del estudio se monitorizaron todos los grupos diariamente para detectar signos clmicos como tos, estornudos, disnea y taquipnea. Se tomaron mediciones de peso corporal al principio y al final del estudio. A los 22 dfas despues de vacunacion (y antes de exposicion) se tomaron frotis nasales para analisis de PCR para determinar la presencia de M. hyopneumoniae de cada grupo.
Los resultados mostraron que no se observaron signos clmicos y no hubo diferencias significativas en la ganancia de peso corporal en todos los grupos analizados. El analisis de frotis mostro presencia de M. hyopneumoniae a los 22 dfas despues de vacunacion en el 60 -70% de los cerdos vacunados pre-exposicion (vease la Figura 3). Todos los cerdos de control vacunados simulados fueron negativos para M. hyopneumoniae por analisis de PCR. En la necropsia, el analisis de lesion macroscopica (Hannan et al., 1982) indico la ausencia de lesiones en el grupo de control vacunado simulado vacunado, asf como los grupos vacunados a 106 y 107 CCU/ml/dosis. Uno de cada 10 cerdos vacunados a 108 CCU/ml/dosis mostro presencia de una pequena lesion macroscopica. Sin embargo, 4 de cada 10 cerdos que no fueron vacunados pero expuestos mostraron signos clmicos de tos y estornudos. En la necropsia, el examen de los pulmones de los cuatro cerdos mostro lesiones pulmonares macroscopicas tfpicas de infeccion por M. hyopneumoniae.
En general, la cepa de la vacuna ts19 sensible a temperatura mostro ser efectiva en la proteccion contra infeccion por M. hyopneumoniae.
Ejemplo 5: Eficacia de la vacuna en diferentes dosis y comparacion con una vacuna muerta comercial.
Se llevo a cabo un estudio con el fin de evaluar la eficacia de la cepa de la vacuna ts19 en cuatro dosis diferentes. El diseno del estudio implico el uso de cerdos spf de 3 a 4 semanas de edad. El estudio se realizo en una instalacion de PC2 en el Centro de Nacional de Servicios de Diagnostico en Salud Animal (CENASA) - una instalacion de pruebas del gobierno en Tecamac, Mexico. Un total de 70 cerdos fueron asignados aleatoriamente a siete grupos, conteniendo cada uno 10 cerdos (Tabla 4).
Tabla 4: Dosis protectora minima y estudio de eficacia comparativo
Grupo
Proposito
Dosis de vacuna ccu/ml/dosis
Numero de cerdos Numero de cerdos vacunados expuestos
Numero Total de cerdos por
5
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30
grupo
1
Control simulado NA 0 0 10
2
ts19a o CO O 10 10 10
3
ts19a o O 10 10 10
4
ts19a O cn o 10 10 10
5
ts19a 1060 10 10 10
6
Comercial inactivado b 2 mL 10 10 10
7
Control positivo NA 0 10 10
Total
NA NA 50 60 70
a La vacuna se suministro mediante pulverizacion intranasal b La vacuna se suministro mediante administracion intramuscular
Se suministraron cuatro dosis diferentes de vacuna ts19 (103, 104, 105, 106 CCU/ml) a cuatro grupos separados de los cerdos por ruta intranasal. Un quinto grupo recibio 2 mL de una vacuna inactivada comercial suministrada por ruta intramuscular. Los grupos positivos (no vacunados, pero expuestos) y negativos (no vacunados, no expuestos) tambien se incluyeron en este estudio. Todos los grupos excepto el grupo control negativo fueron expuestos en dos momentos. La primera exposicion se llevo a cabo a los 22 dfas despues de vacunacion por administracion intranasal utilizando un aislado de M. hyopneumoniae (cepa IOWA 194). La segunda exposicion se llevo a cabo a los 84 dfas despues de la vacunacion con la misma cepa de exposicion. A lo largo del estudio se monitorizaron todos los grupos diariamente para detectar signos clmicos como tos, estornudos, disnea y taquipnea. Las mediciones de peso corporal fueron tomadas al principio y al final del estudio.
Los resultados mostraron que no hubo signos clmicos durante todo el penodo de prueba de 105 dfas. El analisis de varianza para un rendimiento en peso entre el grupo de control positivo y cada uno de los grupos vacunados indico que ts19 a dosis de 105 y 106 CCU/ml mostro aumento significativo en el peso corporal en comparacion con el grupo de control positivo (Figura 4). El grupo vacunado con la vacuna comercial no mostro ninguna diferencia significativa en el aumento de peso en comparacion con el grupo de control positivo (Figura 4, Tabla 5). En la necropsia, se realizo un analisis de la lesion macroscopica para cada grupo. El criterio para determinacion de la dosis protectora minima se baso en un mdice de proteccion de >70% con respecto a la reduccion de la gravedad de las lesiones pulmonares. La dosis protectora minima para ts19 se determino que era 104 CCU/mL ya que se logro un mdice de proteccion del 70% a esta dosis con respecto a la reduccion de la gravedad de las lesiones pulmonares (Figura 5). Las dosis mas altas de ts19 (105 y 106 CCU/ml) tambien se probaron y se encontro que proporcionan inhibidores de proteasa de 83% y 88%, respectivamente, en relacion con la reduccion en la gravedad de las lesiones pulmonares (Figura 6). La vacuna inactivada comercial alcanzo un IP de solo el 37%, que es muy inferior a la dosis mas baja de ts19 utilizado (103 CCU/mL que alcanzo un IP del 60%).
Tabla 5. Analisis de Varianza de la ganancia de peso promedio de los grupos vacunados en comparacion con el grupo de control positivo en DPV-104/105
Grupo
Tratamiento Analisis de Varianza (P) en comparacion con el control positivo
1
Control negativo 0.001
2
ts 19 1030 0.394
3
ts 19 1040 0.175
4
ts 19 1050 0.033
5
ts 19 1060 0.004
6
Vacuna comercial 0.315
7
Control positivo NA
Dosis ts19 (CCU / mL). No hubo diferencias significativas (P> 0.05), una diferencia significativa (P <0.05).

Claims (10)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    Reivindicaciones
    1. Una cepa de la vacuna de Mycoplasma hyopneumoniae depositada ante el National Measurements Institute (Australia) bajo el numero de acceso NM04/41259, cuya cepa es sensible a la temperatura y atenuada.
  2. 2. Una composicion de vacuna que comprende la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae de la reivindicacion 1 y un portador, opcionalmente un adyuvante, y/o opcionalmente por lo menos un agente infeccioso adicional, cuya vacuna en una cantidad inmunizante es capaz de provocar inmunidad protectora contra una enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae.
  3. 3. La composicion de vacuna de la reivindicacion 2, en la que el agente infeccioso es un virus, una bacteria, un hongo o un parasito.
  4. 4. La composicion de vacuna de la reivindicacion 2 o reivindicacion 3 formulada para administracion al tracto respiratorio.
  5. 5. La composicion de vacuna de la reivindicacion 2 o reivindicacion 3 en formulacion de aerosol.
  6. 6. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5 para uso en prevenir una enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae en un animal porcino.
  7. 7. La vacuna para uso de acuerdo con reivindicacion 6, en la que la vacuna se administra mediante inhalacion, por via intranasal o a traves de un aerosol.
  8. 8. Un metodo para elaborar la vacuna de la reivindicacion 2 que comprende combinar la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae de la reivindicacion 1 con un portador, opcionalmente un adyuvante y/o opcionalmente por lo menos un agente infeccioso adicional.
  9. 9. Uso de la cepa de Mycoplasma hyopneumoniae de la reivindicacion 1 en la fabricacion de un medicamento para prevenir enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae en un animal porcino.
  10. 10. La vacuna de una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 7 o el uso de la reivindicacion 9 en la que la enfermedad provocada por Mycoplasma hyopneumoniae es la neumoma enzootica o neumoma de micoplasma porcina.
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