CN102272332A - 乳酸菌及其在猪的直接饲喂微生物中的应用 - Google Patents

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Abstract

本文提供了可用于鉴定目标菌株的TRF。本发明还提供了用于鉴定可用作直接饲喂微生物的一种或多种菌株的方法。本发明还提供了通过所述方法鉴定的一种或多种菌株。本发明还提供了用于向动物施用有效量的所述一种或多种菌株的方法。此外，本发明还提供了一种分离的菌株，其选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种。本发明还提供了一种分离的菌株，其具有上文所列菌株之一的所有鉴定特征。一种或多种菌株可作为直接饲喂微生物施用给动物。本发明还提供了用于制备直接饲喂微生物的方法。

Description

乳酸菌及其在猪的直接饲喂微生物中的应用
相关申请的交叉引用
本申请要求根据35U.S.C.§119(e)于2009年1月12日提交的美国临时专利申请No.61/143,990的优先权，其全文通过引用并入本文。
参考文献
本文中通过括号内第一作者姓氏和出版年度引用的所有参考文献均可见于紧位于权利要求书之前的参考文献部分。
技术领域
本发明涉及可用于农业的生物学方法和产品。更具体地，本发明涉及乳酸菌、向诸如猪的动物施用乳酸菌的方法和制造乳酸菌的方法，但不限于此。
背景技术
为了有效且经济进行猪生产，猪产业中已采用了早期断奶操作(Wilson，1995)。断奶的明显结果是饲料从母猪乳到固体饲料的急剧变化，以及猪所在社会环境的变化(McCracken等，1995)。在第一周中，出现饲料摄取减少，并伴随着动物消化道(gut)解剖学和生理学的不良变化，例如绒毛萎缩、隐窝加深，以及未成熟肠上皮细胞对绒毛顶端的浸润。绒毛萎缩是指可用于营养摄取的吸收面积减少，而隐窝加深则体现了大的组织转化(turnover)(Cera等，1988)。此前的研究报道了绒毛高度与隐窝深度的比例发生改变以响应不同的断奶环境和胃肠固有微生物群的种群(Tang等，1999)。肠微生物区系(microflora)的破坏常与突然断奶一起发生，不利地影响胃肠道的稳定性，并且这种破坏可能是促使饲料摄取和消化道解剖学发生变化的推动力，其导致在断奶后的时期中的生长不良和健康危害(Dritz等，1996)。综上所述，这些条件对仔猪(piglet)的生长和健康具有显著的不良影响，对成熟消化系统的发育和有效的免疫防护具有负面影响，并且通过随后的生产周期对猪的生长性能具有派生影响(ramification)。
在现代猪生产中发展出多个方法，以用于在解决这些问题的同时仍获得早期断奶(包括管理和饲料变化)的功效以及经济利益。在不到21日龄进行早期断奶，随后将猪转移到第二分离地点，这通常被称作早期隔离断奶(SEW)。这种方法减少了病原出现的数量，从而降低了免疫应激，导致生长改进和饲料利用效率较高(Fangman等，1997)。这种方案成功地减少了病原的数量，但并未成功地消除所有病原。其前提是在猪因母体抗体而获得的免疫力仍然较高时，将其与母猪分离。这种源自母体的被动免疫将防止固有病原(indigenous pathogen)的垂直传播。尽管SEW没有消除由突然断奶导致的胃肠破坏，但在将猪早期断奶并转移到农场外的分离场地(isolated facility)时，此问题的流行程度和严重性要低得多。这很可能由于对断奶猪(此时其先天防御受损)的病原攻击较少的结果。
利用高质量的蛋白源和添加剂来减轻断奶过渡期不适的饲料配方是保护仔猪健康的另一种方法。所使用的两种最常见选择是包含喷雾干燥的血浆蛋白质和饲用(in-feed)抗生素。向猪饲料补充抗生素的益处已经得到充分证明，与后续生长阶段的猪相比，断奶仔猪(weanling pig)在响应上所发生的最大改进在于对添加抗生素的响应(Cromwell的综述，2001)。科技文献中还充分证明了喷雾干燥动物血浆(SDAP)的性能增强益处(van Dijk等的综述，2001a)，并且SDAP被特别高度地视为断奶仔猪起始饲料的成分。SDAP的添加一向导致增重和饲料摄取改进，以及断奶后腹泻减轻，特别是在断奶后一周至两周的时期中(Coffey和Cromwell，1995；van Dijk等，2001a；Bikker等，2004)。此前在科技文献报道中提出的机制包括：饲料适口性改进，营养消化性改进，存在有益生长因子，结合/阻断病原的糖蛋白，毒素的中和；存在免疫球蛋白，免疫调节能力，肠形态改进，和消化道微生物生态的变化(Bosi等，2001，2004；Hammer等，2004；Mouricout等，1990；Nollet等，1999；Perez-Bosque等，2004；Roche等，2000；Torrallardona等，2003；van Dijk等，2001a；van Dijk等，2002b)。
这些以及其他饲料添加剂的作用支持以下观点，即肠内营养物和添加剂的作用对猪的直接影响较小，但其通过介导微生物转变以响应外源营养利用度来发挥作用(Gaskins，2001)。这使得直接饲喂微生物(DFM)添加剂的应用得到极大的关注，使用DFM添加剂通过防止胃肠生态系统的破坏(这为病原入侵铺平了道路)而有助于断奶过渡(weaning transition)，从而促进幼猪(youngpig)生长并保持其健康。据报道，补充杆菌(Bacillus)培养物通过向猪提供对抗病原攻击的保护而改进了断奶仔猪的生长性能(Yang等，2003；Kyriakis等，1999；Adami等，1997)。尽管通常饲喂给猪的大多数DFM添加剂以杆菌为基础，但是补充乳杆菌(lactobacilli)也可为幼猪提供性能益处。受到沙门氏菌(Salmonella)攻击并且补充了5种乳杆菌菌株组合的猪，与受到沙门氏菌攻击但没有进行补充的猪相比，增重改进、症状严重性较低，以及粪便沙门氏菌脱落减少(Casey等，2007)。此外，向初生仔猪补充短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)导致小肠中杯状细胞成熟以及断奶后增重明显改进，这似乎是通过toll样受体信号转导控制消化道中炎症信号的结果(Davis等，2006，2007)。考虑到与饲喂给牲畜的抗微生物剂的生长促进水平相关的抗生素抗性缺点(stigma)，以及如血浆蛋白的动物副产品的应用与最近对传染性海绵状脑病的关注，补充益生菌以提供某些相同的益处已经在畜牧业赢得了广泛应用。
尽管其功效仅有极少的科技支持并且对其作用模式的理解有限，但益生菌产品的补充在人和农业部门中已经变得越来越流行。在历史上，益生菌起源于以下观念，即食用大量诸如酸奶和奶酪的发酵乳制品的个体特别长寿(Tannock，2004)。大部分益生菌生物被选择的原因是其易于繁殖，并且易于从食品发酵过程获得，但引导其选择的科技支持很少(Fuller，1997)。因此，用于牲畜用DFM产品的细菌通常未被选择来提供理想地适合存在于牲畜生产系统中的攻击的细菌生物。
所需要的是可用于猪和其他动物的细菌菌株。还需要制备和使用细菌菌株的方法。此外，还需要用于鉴定这些菌株的DNA序列和利用所述DNA序列鉴定菌株的方法。
发明内容
由本公开末尾处所示的权利要求书限定的本发明旨在解决至少部分上述问题。
本发明提供了DNA序列。所述DNA序列包含乳酸菌16S rRNA基因编码区的部分，其5′末端包含5’AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’的序列，其3′末端包括Bfa I、Hae III和Msp I之一的限制性酶识别位点。当所述限制性酶识别位点为Bfa I时，所述DNA序列的长度为约99个碱基对至约103个碱基对，约268个碱基对至约273个碱基对，约260个碱基对至约265个碱基对，约279个碱基对至约284个碱基对，约278个碱基对至约282个碱基对，或约273个碱基对至约277个碱基对。当所述限制性酶识别位点为Hae III时，所述DNA序列的长度为约329个碱基对至约334个碱基对，约352个碱基对至约357个碱基对，约277个碱基对至约282个碱基对，或约335个碱基对至约339个碱基对。当所述限制性酶识别位点为Msp I时，所述DNA序列的长度为约188个碱基对至约192个碱基对。
本发明还提供了用于鉴定可用作直接饲喂微生物的一种或多种菌株的方法。在所述方法中，从来自动物胃肠道的细菌分离DNA。扩增DNA。使用T-RFLP分析扩增的DNA以获得TRF数据。建立所述TRF数据与目标特征的相关性。由该相关性鉴定目标菌株。确认TRF存在于所述菌株中。
本发明还提供由所述方法鉴定出的一种或多种菌株。本发明还提供了用于向动物施用有效量的一种或多种菌株的方法。
此外，本发明还提供了分离的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌株PlJ e3(NRRL B-50101)，以及包括分离的乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRLB-50101)和分离的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株o246e 33w(NRRLB-50102)的组合。
本发明还提供了分离菌株，其选自嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRLB-50101)中的至少一种。本发明还提供了具有上文所列菌株之一的所有鉴定特征的分离菌株。
本发明还提供了其他方法。在一种方法中，向动物施用有效量的选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRLB-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种菌株。
另一种方法是用于制备直接饲喂微生物的方法。在该方法中，在液体营养肉汤(broth)中培养选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRLB-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种菌株。从所述液体营养肉汤分离所述菌株以获得直接饲喂微生物。
附图说明
参考附图说明本发明的示例性实施方式。
图1是显示在断奶后的第1、3、10和24天(或20、22、29和43日龄)，从在常规室内场地分娩的保育猪(nursery pig)的外周血分离出的淋巴细胞浓度，并与在室外场地分娩的保育猪进行比较的图示(处理×日期相互作用，P＜0.01；a，b：使用不同字母表示每日内平均值不同，P＜0.05)。
图2A-2B是显示通过RAPD引物1和4指纹确定的9个候选DFM菌株之间相似性的两个树状图部分。还显示了所述9个菌株的限制性内切酶Bfa I、Hae III和Msp I的TRF带型。
图3是显示在哺乳期中向母猪施用益生菌组合而导致的同窝幼仔(litter)内的初始和终末体重变异系数的图示(处理×时间相互关系，P＝0.06；SE＝1.22)。PA＝乳酸片球菌PlJ e3；LA＝嗜酸乳杆菌PlB c6；LS＝唾液乳杆菌o246e 33w。
在详细解释本发明的实施方式之前，应理解本发明的应用并不限于在以下说明列出的或在附图中显示的组件构成和排列细节。本发明能够以其他实施方式或通过多种方式实施或实现。此外，还应理解本文采用的措词和术语是用于说明的目的，而不应理解为对本发明的限制。
具体实施方式
根据本发明，可采用本领域技术范围之内的常规分子生物学和微生物学技术。文献中对此类技术进行了充分解释。参见，例如Sambrook，Fritsch以及Maniatis，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，第3版(2001)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y。
本文描述了新型的乳酸菌株及其组合。这些菌株可单独或组合地施用给诸如猪的动物。在饲喂给猪时，这些菌株提供了很多益处。将所述菌株饲喂给妊娠母猪或小母猪(gilt)或哺乳期母猪时，所述益处见于其后代中。在将所述菌株饲喂给其他年龄段，例如保育猪和生长期/育肥期的猪(finish pig)时，所述菌株也提供益处。
本发明还描述了用于鉴定可用作直接饲喂微生物(DFM)的一种或多种菌株的方法。在所述方法中，从来自动物胃肠道的细菌分离DNA。扩增DNA。使用末端限制性片段长度多态性(T-RFLP)分析扩增的DNA以产生末端限制性片段(TRF)数据。建立所述TRF数据与目标特征的相关性。由该相关性鉴定目标菌株。利用菌株的RAPD PCR分析或任何其他适合的方法减少菌株的数量。确认TRF存在于菌株中。
末端限制性片段(TRF)
本文描述了可用于鉴定目标菌株的TRF。这些TRF包括但不限于：包含乳酸菌16S rRNA基因编码区的部分的DNA序列。所述DNA序列的5′末端包含5’AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’的序列，其3′末端包含Bfa I、Hae III和Msp I之一的限制性酶识别位点。当所述限制性酶识别位点为Bfa I时，所述DNA序列的长度为约99个碱基对至约103个碱基对，约268个碱基对至约273个碱基对，约260个碱基对至约265个碱基对，约279个碱基对至约284个碱基对，约278个碱基对至约282个碱基对，或约273个碱基对至约277个碱基对。当所述限制性酶识别位点为Hae III时，所述DNA序列的长度为约329个碱基对至约334个碱基对，约352个碱基对至约357个碱基对，约277个碱基对至约282个碱基对，或约335个碱基对至约339个碱基对。当所述限制性酶识别位点为Msp I时，所述DNA序列的长度为约188个碱基对至约192个碱基对。
乳酸菌
本文还描述了使用末端限制性片段(TRF)鉴定出的乳酸菌菌株：嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w、乳酸片球菌o246e 42和乳酸片球菌PlJ e3。如下所述，这些菌株保藏在美国农业研究菌种保藏中心(NRRL，AgriculturalResearch Service Culture Collection)，地址为美国伊利诺斯州皮奥里亚市北大学街1815号(1815 North University Street，Peoria，Illinois，61604)。嗜酸乳杆菌PlB c6于2008年1月18日保藏且所得登录号为NRRL B-50103；唾液乳杆菌o246e 33w于2008年1月18日保藏且所得登录号为NRRL B-50102；乳酸片球菌o246e 42于2008年8月29日保藏且所得登录号为NRRL B-50171；乳酸片球菌PlJ e3于2008年1月18日保藏且所得登录号为NRRL B-50101。使用本文所述TRF鉴定的其他菌株也在本发明的范围之内。
乳酸菌菌株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)1E1可与上文列出的一种或多种菌株一起使用。菌株1E-1(也写作菌株1E1)分离自健康断奶猪的肠道。菌株1E-1可得自于美国模式培养物保藏所(American Type Culture Collection)，地址为美国弗吉尼亚州马纳萨斯市大学街10801号(10801 University Blvd.，Manassas，Va.20110)，登录号为PTA-6509，保藏日为2005年1月12日。所有保藏均按照“国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约”的规定进行。
具有上文所列菌株的所有鉴定特征(如下文提供)的菌株也被认为在本发明的范围之内。
简要而言，使用如下TRF鉴定乳酸菌的菌株，与此有关的更多细节在下文的实施例部分。将猪分成具有不同条件的两组，以产生性能和免疫测量的差别，例如在免疫细胞的特异免疫亚群方面的差别。本文使用的“性能”是指通过以下参数测量的动物生长情况：平均每日增重、总增重、饲料转化，其包括饲料：增重和增重：饲料，饲料功效、死亡率和饲料摄取量。本文使用的“性能的改进”是指在性能的定义下，上文列出的至少一个参数的改进。
从来自性能和免疫特征经测量的猪组的胃肠道的乳酸菌鉴定TRF。这些TRF存在于具有有益测量值的猪组中，而不存在于缺少有益测量值的猪组中。使用RAPD PCR分析缩小潜在有用的菌株的数量。确认TRF存在于缩小的菌株组中。因为这些TRF发现于具有较好测量值的猪组中，本发明人相信这些菌株应该对性能和/或免疫调节具有积极影响。在饲喂给动物时，发现4种乳酸菌菌株对性能具有积极影响。
这些菌株可单独或组合地饲喂。在一种示例性实施方式中，将嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJ e3菌株进行组合并施用于动物，例如哺乳期母猪和/或仔猪。在另一种示例性实施方式中，将乳酸片球菌PlJ e3和唾液乳杆菌o246e 33w菌株进行组合并施用。在另一种示例性实施方式中，将乳酸片球菌PlJ e3单独施用于动物，例如哺乳期母猪和/或仔猪。
直接饲喂微生物
在本发明全文中可与“益生菌”相互替换使用的直接饲喂微生物(DFM)包括上文列出的一种或多种乳酸菌菌株。可向DFM中添加一种或多种载体或其他成分。DFM可表现为多种物理形式，例如作为营养加强剂(top dress)，作为水溶性浓缩物以用作液体灌喂剂(liquid drench)，或添加到代乳品、明胶胶囊或凝胶中。在营养加强剂形式的一种实施方式中，将冻干的乳酸菌发酵产物添加到诸如乳清、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和硅铝酸钠之类的载体中。在用于液体灌喂剂或代乳品补充物的水溶性浓缩物的一种实施方式中，将冻干的乳酸菌发酵产物添加到诸如乳清、麦芽糊精、蔗糖、葡萄糖、干燥淀粉和硅铝酸钠之类的水溶性载体中，并添加液体以形成灌喂剂，或将补充物添加到乳品或代乳品中。在明胶胶囊形式的一种实施方式中，将冻干的乳酸菌发酵产物添加到诸如乳清、麦芽糊精、蔗糖、石灰石(碳酸钙)、稻壳、酵母培养物、干燥淀粉和/或硅铝酸钠之类的载体中。在一种实施方式中，乳酸菌和载体包封在可降解的明胶胶囊中。在凝胶形式的一种实施方式中，将冻干的乳酸菌发酵产物添加到诸如植物油、蔗糖、二氧化硅、聚山梨酸酯80、聚乙二醇、丁基化羟基茴香醚、柠檬酸、乙氧基喹啉(ethoxyquin)和人工着色剂之类的载体中，以形成凝胶。
为了获得乳酸菌并形成DFM，可将乳酸菌发酵至适合的水平。在一个非限定性实例中，所述水平在约1×109CFU/ml的水平至约1×1010CFU/ml的水平之间。这些乳酸菌可在MRS(de Man，Rogosa and Sharpe)肉汤中于37℃培养24小时。可通过离心并弃去上清来收集这些细菌。
随后，可将沉淀的乳酸菌作为DFM饲喂给诸如猪的动物。在一些实施方式中，将DFM饲喂给母猪、小母猪、断奶前的仔猪、断奶后的仔猪，或任意年龄的猪。可将乳酸菌饲喂给哺乳期的母猪，但也可以在不同的时间以不同的持续时间饲喂乳酸菌。在饲喂给小母猪或母猪时，菌株被转移到所述小母猪或母猪生产的仔猪。通常认为，这是通过粪口途径和/或通过其他途径实现的。在一种实施方式中，将沉淀的乳酸菌冻干以直接饲喂给动物。在至少一些实施方式中，将乳酸菌添加到动物饲料中。
在饲喂给动物时，乳酸菌会定殖在其胃肠道中。可按照约1×108CFU/动物/天至约5×1010CFU/动物/天饲喂乳酸菌，而无论总CFU是源自一种生物还是多种生物的组合。在一种示例性的实施方式中，按照1×109总CFU/动物/天饲喂乳酸菌，而无论总CFU是源自一种生物还是多种生物的组合。在一种实施方式中，使用等量的各种菌株。在另一种实施方式中，使用不同的量。
实施例
以下提供的实施例仅用于说明的目的。本文包括的实施例仅用于辅助更完整地理解本文描述的发明。这些实施例不以任何方式限制本文描述或要求保护的本发明的范围。
实施例1
常规与早期隔离断奶生长性能模型比较
使用在场外(off-site)早期隔离断奶管理条件下饲养的猪，并与在相同农场地点(其中出生和饲养通过存在的坝)常规饲养的猪进行比较，从而建立用于提供生长性能分离的模型。来自11窝的88只杂交阉猪和小母猪在19日龄时断奶。将一组44只猪转移到距离母猪群(sow herd)12km的隔离保育场地，而将其他猪转移到位于断奶前地点的保育场地。将猪分配到每个场地的16个圈栏(pen)中，并在断奶后的第11、18和25天测量体重和饲料减少量，以测定平均每日增重(ADG)、平均每日饲料摄取(ADFI)和增重：饲料。在断奶后的第1、3、11和25天，从每个场地选择4只猪进行取样，其中通过腔静脉穿刺获得血液样品以进行细胞分离，并对猪处以安乐死以获得胃肠道组织以用于微生物分析和免疫细胞分离。下表1说明与常规饲养的猪相比，在早期隔离断奶管理系统中饲养的猪中观察到平均每日增重和平均每日饲料摄取反应改进(P＜0.10)，并且研究结束时(断奶后25天)，在早期隔离断奶猪中观察到更高的(P＜0.01)猪体重。
表1：与常规现场饲养(CONV)的猪相比，在场外早期隔离断奶(SEW)管理系统中饲养的断奶仔猪的生长性能响应
  CONV   SEW   SEM1   P＝
  断奶后第0天至第11天
  ADG，g   217   388   12.37   0.001
  ADFI，g   181   410   14.36   0.001
  增重：饲料   1.47   0.94   0.21   0.088
  断奶后第11天至第25天
  ADG，g   466   470   21.30   0.904
  ADFI，g   587   591   29.80   0.927
  增重：饲料   0.83   0.86   0.06   0.737
  断奶后第0天至第25天
  ADG，g   383   442   23.66   0.081
  ADFI，g   452   531   30.87   0.075
  增重：饲料   0.85   0.83   0.09   0.585
  猪体重，kg
  初始   5.94   5.87   0.07   0.479
  第11天   8.10   9.51   0.27   0.001
  第18天   11.95   12.71   0.28   0.064
  第25天   15.85   17.38   0.35   0.003
1平均值的标准误差(SEM)
实施例2
室外与常规饲养生长性能模型比较
建立第二模型以在幼猪之间的生长性能方面提供更强的分离，其中将猪饲养在常规的圈养分娩场地或使其在室外管理系统中被分娩。确定每个场地有144只猪进行试验。常规饲养的猪位于印地安那州，而室外饲养的猪位于科罗拉多州。这两个场地的猪具有相似的遗传背景(PIC C-22×PIC 280)。在6和14日龄的各时间间隔和断奶前24小时(18日龄)处死从每个场地(即室外和室内)随机选择的6只猪，以测量在断奶前的时期中的胃肠道微生物群和免疫细胞发育。来自每个场地的126只猪在19日龄断奶，并被转移到位于阿肯色州的场外保育场地。在抵达后，将每组的猪放置在相同场地内的不同房间内以监测断奶后的时期内的生长性能，同时保持组相互隔离以防止两组之间微生物区系的暴露。在每个饲料阶段的结束时测定猪体重和饲料减少量，所述饲料阶段被定义为阶段1(断奶后第0-11天)、阶段2(断奶后第11-25天)和阶段3(断奶后第25-39天)。在断奶后的第1、3、7、10和24天，从每组选择6只猪进行取样，其中通过腔静脉穿刺获得血液样品以进行细胞分离，并对猪处以安乐死以获得胃肠道组织以用于微生物分析和免疫细胞分离。与在室外场地饲养的猪相比，在常规母猪场地出生的猪具有数值较大的初始体重(5.18 vs.5.74±0.28；P＝0.16)。然而，在每个阶段结束时，与在常规圈养场地出生的猪相比，曾在室外饲养的猪具有较大(P＜0.01)的平均每日增重、平均每日饲料摄取和体重(参见下表2)。
表2：由饲养于常规圈养场地内的母猪和饲养于室外牧场场地的母猪分娩的保育猪的平均每日增重(ADG)、平均每日饲料摄取量(ADFI)和增重：饲料(G：F)(将猪的初始体重用作分析的协变量)
Figure BPA00001403349800111
2平均值的标准误差(SEM)
实施例3
免疫测量和流式细胞分析
从血液和胃肠道样品分离免疫细胞，并且从实施例1和2的两种生长性能模型获得一系列免疫测量值，包括：白细胞分类计数；外周血单核细胞增殖和细胞因子增殖；胃肠道形态、杯状细胞计数，和来自空肠组织的免疫组织化学；并对从外周血和空肠组织分离的细胞进行流式细胞分析。细胞分离的方法和实验室方法此前已公开在科技文献中(Davis等，2004；Brown等，2006a；Brown等，2006b)。用于定义免疫组织化学和流式细胞分析的免疫细胞亚类的抗体组显示在下表3中。
表3：免疫组化和流式细胞分析中用于限定源自外周血的白细胞的细胞表面分子表达及其不同群体的猪白细胞特异性单克隆抗体
Figure BPA00001403349800121
a单克隆抗体为小鼠抗猪
1用于免疫组化分析
2用于流式细胞分析
*购自Southern Biotechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL
**购自Veterinary Medical Research and Development，Inc.，Pullman，WA
此前的文献中已经报道了根据肠道形态、杯状细胞分化和胃肠道免疫细胞群定义的，常规断奶的猪和早期隔离断奶的猪之间在胃肠道发育和健康方面的区别(Brown等，2006a)。与室外饲养生长模型相比，在常规饲养中使用的两种断奶前管理系统还改变了免疫发育。特别地，在断奶后的时期中，在常规和室外管理系统之间外周血中的淋巴细胞群不同，其中与常规饲养的猪相比，曾在室外饲养的猪在断奶后第3天血液中的淋巴细胞比例较低(P＜0.05)，但在断奶后第10天血液中的淋巴细胞比例较高(P＜0.05)(管理系统×天数相互作用，P＜0.01；图1)。此外，外周血单核细胞的流式细胞分析表明，哺乳期在常规圈养场地中饲养的猪在断奶前的时期(40.90 vs.26.95±4.99；P＜0.05)和断奶后的时期(34.78 vs 19.26±4.55；P＜0.05)中具有较大比例的表达活化分子CD25的淋巴细胞。这些数据说明了，在各系统内的猪被分离(断奶前)时，以及两个组被带入类似的断奶后管理系统时，不同的饲养系统如何改变免疫发育。胃肠道发育中的差异也很明显，其中在断奶前，与室外饲养的猪相比，在常规圈养场地中饲养的猪在十二指肠内具有较高的(P＜0.01)绒毛高度和较浅的(P＜0.05)隐窝深度，而在断奶后，室外饲养的猪的十二指肠绒毛高度、隐窝深度和面积大于(P＜0.01)常规饲养的猪(参见下表4)。胃肠道空肠内的免疫细胞发育差异进一步证实了这一点。其实例包括：曾在室外饲养24天的猪在断奶前表达CD25活化分子的淋巴细胞比例更大(12.44 vs.8.99±1.22；P＜0.05)，在断奶后表达CD8的淋巴细胞比例更大(25.08 vs.16.49±3.49；P＜0.05)，并且根据免疫组织化学分析证明，与哺乳期中的常规圈养系统相比，将猪饲养在室外系统中时，在断奶前(30.6 vs.18.4±4.4)和断奶后(26.0 vs.35.1±3.7)的时期中，表达抗原呈递分子主要组织相容性复合体II(MHC-II)的淋巴细胞比例更大。
表4：在室外和室内管理系统中出生的猪的十二指肠、空肠和回肠中的胃肠道形态学(隐窝深度、绒毛高度和绒毛面积)测量结果
Figure BPA00001403349800131
3，4平均值的标准误差(SEM)
实施例4
胃肠道细菌的分离和鉴定
组织加工：收集包括食道、十二指肠、空肠和回肠部分的胃肠道部分以用于细菌细胞的分离。通过使用25mL无菌清洗缓冲液(0.3mM KH2PO4、1mM MgSO4和0.05％盐酸半胱氨酸，pH 7.0)清洗两次以除去各消化道部分的肠内物质。使用无菌镊子横向切割管道(tract)部分，并再次使用25mL无菌的0.1％蛋白胨稀释缓冲液除去任何剩余的肠内物质。将消化道部分放置在具有99mL无菌蛋白胨稀释缓冲液的无菌Whirl-pak袋中，并在匀浆器(stomacher)中拍打30秒以释放定殖或与粘液结合的细菌。将经拍打的溶液倒入保留了消化道部分的250mL无菌离心管中。将包含细菌细胞的溶液在13,170×g离心10分钟。随后弃去上清，并向沉淀添加10mL无菌MRS+10％甘油肉汤，重悬并在-20℃冷冻，直至随后的DNA分离。
DNA的分离：在分离DNA前，将冷冻的断奶后胃肠道部分的样品(N＝128)在冰上解冻。将溶液涡旋30秒以获得非均匀的样品并打碎聚集的细胞或可能在冷冻期间与珠状材料(globule material)结合的细胞。随后，通过无菌的1MWhatman乳滤纸过滤2mL的混合细胞，以除去干扰DNA分离过程的珠状材料。按照如下所述继续进行DNA分离过程：向无菌的15mL锥形管中添加0.5mL细胞，并使用15mL的50mM Tris-HCl、10mM EDTA(T50E10)溶液(pH7.5)清洗，随后在2,485×g离心10分钟以除去抑制PCR的物质。将此清洗和离心步骤重复一次。按照Roche基因组DNA分离试剂盒(Roche DiagnosticsCorp.，Indianapolis，IN)的指导分离沉淀的细胞，但略有不同。将所有的磷酸盐缓冲盐水溶液替换成T50E10，并用溶于T50E10的100mg/mL溶菌酶溶液替换推荐的5mg/mL溶菌酶溶液。在分离后，使用Picogreen dsDNA定量试剂盒(Molecular Probes，Eugene，OR)和TD-360迷你荧光计(Turner Biosystems，Sunnyvale，CA)对DNA进行定量。
PCR扩增和T-RFLP分析：使用来自每个消化道部分的样品(除了食道部分之外)的50ng DNA进行扩增反应，一式三份，从而提供足量的扩增产物并减少PCR差异。来自食道部分的DNA通常在此范围内检测不到，因此将2μL来自食道部分的DNA分离样品添加到PCR反应中。使用5’-四氯荧光素标记的8F结构域引物(5’AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’)和1406R通用引物(5’ACGGGCGGTGTGTRC 3’)扩增大部分的16S rRNA基因编码区(Baker等，2003)。
100μL的反应混合物包含1×PCR缓冲液、浓度为280μM的各种三磷酸脱氧核苷(dNTP)、1.5mM MgCl2、12.5pM的氯化四甲铵(TMAC)、77pM的各引物和10U的Platinum Taq(Invitrogen，Madison，WI)。本发明人的实验室确定高浓度的Taq作为克服微量PCR抑制剂影响的方式。包含阳性和阴性对照以监测见于商业Taq酶中的污染DNA的影响。PCR条件为：95℃持续5分钟，94℃变性30秒、57.5℃退火30秒和72℃延伸120秒的30个循环。最后的循环包括在72℃持续7分钟的最后延伸。通过在1％琼脂糖凝胶中电泳、使用溴化乙锭染色并使用UV透照仪目测观察来确定PCR产物的纯度。将由每种样品一式三份进行而获得的荧光标记PCR扩增子汇集，随后从引物纯化，并使用Qiagen PCR纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)浓缩至80μL。随后，将纯化的样品分成等体积的四份。随后，分别使用10U的Bfa I、HaeIII或Msp I将3份试样分别在37℃酶切4小时，同时将第4份试样在-20℃贮存以备在需要时进行第四限制性酶分析。使用Bfa I酶切的TRF由字母B表示，使用字母H表示来自Hae III的TRF，使用字母M表示来自Msp I的TRF。所有的TRF命名还包括片段的大小，例如B100.79是由Bfa I产生的101bp TRF。三种限制性酶的应用将每种TRF的分类学鉴定的可能性改进至最少数量的细菌种类。随后，使用核苷酸纯化试剂盒(Qiagen)清洗经酶切的DNA以改进DNA测序仪的分辨率。将2μL的T-RFLP产物与3μL预混合上样缓冲液混合，所述预混合上样缓冲液包含2μL的BlueDextran/EDTA缓冲液(Applied Biosystems)、0.5μL的GeneScan 500TAMARA分子量标准品(Applied Biosystems)和0.5μL的甲酰胺。使用Genescan模式(Laragen，LosAngeles，CA)的ABI PRISM 377型基因分析仪(Applied Biosystems)，通过电泳分析T-RF。由使用局部Southern方法(local Southern method)的GeneScan 3.1软件(Applied Biosystems)评估片段大小。将大小在50-500bp范围以外的T-RF和峰高度低于50个相对荧光单位的T-RF从分析中去除。
通过T-RF匹配鉴定细菌：将来自各取样日的每只猪个体消化道部分的样品的T-RFLP数据输入到使用专门T-RFLP延伸的Bionumerics Gel ComparII软件包(Applied Maths，Austin，TX)。以0.5％的位置公差(position tolerance)，使用Gel Compar II程序促进所有三种限制性酶的准确条带匹配，从而通过源自三种限制性酶的T-RF定义被鉴定为运算分类单位(OTU)的细菌种类。
实施例5
胃肠道细菌与生长性能和免疫特征的相关性
分别建立实施例1和2中鉴定的细菌群与每个试验的生长性能因子和免疫特征测量值之间的相关性。用于两个分析的方法描述为：将OTU输入到Excel，转化成有/无的二进制字符(0，1)或保持为定量形式并进行log10转化以提供正态分布。对每个数据组作图，并使用圈栏(pen)作为试验单位，相对于每只猪的性能数据(ADG、ADFI、猪体重和饲料功效)做回归分析。对来自每只猪个体的免疫数据结果进行log10转化，并相对于各时间点的每只动物个体的T-RFLP数据做回归分析。通过两个基本方式分析这些数据。使用Canoco软件包(v 4.5-Biometris，Wageningen，Netherlands)实施带有图表的第一排序法，以理解作为整体的群落或群体OTU与所研究的参数(肠部分、性能、免疫因子或管理实践)之间的关系。第二，将个体OTU相对于各个体变量或参数做回归分析，以确定直接单变量关系。应用约束序数法(constrained ordinalmethod)可在控制变量(dominating variable)的存在下确定OTU群与变量的关系。
换算(scaling)集中于种类间的相关性，并由标准差除种类评分。将样品和种类数据集中，但不进行标准化以避免稀少种类的权重高估。对于免疫学回归分析(immunological regression)，在分析数据前对所有免疫因子数据进行log10转化。通过使用499个无限制置换(unrestricted permutation)的蒙特卡罗置换检验(Monte Carlo Permutation)确定与每种环境变量相关的种群(所有种类或OTU)数据的统计显著性。还以单变量模式，使用SAS分析包(SASInstitute，Cary，NC)进行一般线性模型(GLM)-最小二乘法以确定与性能或免疫结果相关的每个个体OTU的统计显著性，并且还使用Canoco实施利用高斯分布的一般线性模型。后一个方法是经典GLM法的延伸。随后，通过使用爱达荷大学的微生物群落分析(MiCA，Microbial Community Analysis(MiCA)at the University of Idaho)和来自核糖体数据库工程的T-RFLP分析程序(TAP；Marsh等，2000)比较所有三种限制性酶的结果，从而推定出带有积极或消极性能关系的OTU。三种酶的应用显著降低了可能提示特定OTU组的潜在细菌种类的数量，并且有助于筛选出潜在假TRF的作用。使用群聚回归(RDA)和个体OTU回归(GLM)程序来分析OTU，而与诸如处理或天数之类的变量无关。
实施例6
基于与生长性能的相关性鉴定益生菌
基于TRF与性能标准(特别是平均每日增重、猪体重和平均每日饲料摄取)的显著相关性，选择作为潜在益生菌的细菌。在实施例1中描述的常规和早期隔离断奶管理模型较中，与嗜酸乳杆菌相关的TRF最常与保育期早期(阶段1)中的平均每日增重、保育期的所有三个阶段的猪体重以及保育期早期和晚期的平均每日饲料摄取正相关(P＜0.05)(参见下表5)。
表5：与早期隔离断奶系统中饲养的猪相比，在常规现场保育场地饲养的猪在断奶后的时期中，鉴定特定细菌的TRF与生长性能测量结果的相关性1
1显示的数值代表P值，此P值说明在保育期的阶段1(断奶后第0天至第10天)和阶段2(断奶后第10天至第24天)期间，性能测量结果和特异TRF之间的显著(P＜0.10)正(没有括号)相关或负(带括号)相关；
2阶段2a＝断奶后第10天至第17天；
3阶段2b＝断奶后第17天至第24天。
与唾液乳杆菌、乳酸片球菌和德氏乳杆菌(L.delbruredkii)相关的其他TRF也与改进的增重、体重和饲料摄取正相关(P＜0.10)。在基于与室外牧场分娩场地对比的常规圈养分娩场地饲养的猪的模型中，与嗜酸乳杆菌相关的多个TRF与平均每日增重、猪体重和平均每日饲料摄取正相关(P＜0.10)(参见下表6)。
Figure BPA00001403349800191
如实施例1所示，与唾液乳杆菌和乳酸片球菌相关的其他TRF也与生长性能正相关(P＜0.10)。同样，与德氏乳杆菌、乳酸乳杆菌和卷曲乳杆菌相关的少数TRF与室内和室外模型中的生长性能因子间断性正相关。在常规和早期隔离断奶管理模型中，没有收集与断奶前性能相关的数据。同样，与嗜酸乳杆菌、乳酸片球菌和卷曲乳杆菌相关的TRF与室内和室外饲养模型中断奶前时期的仔猪体重正相关(P＜0.10)，特别是在6、13和18日龄。
表7：与室外分娩管理系统饲养的猪相比，在常规室内分娩场地中饲养的猪在断奶后的时期内，鉴定特定细菌的TRF与猪体重的相关性1
Figure BPA00001403349800201
1显示的数值代表P值，此P值说明在保育期的阶段1(断奶后第0天至第10天)和阶段2(断奶后第10天至第24天)期间，性能测量结果和特异TRF之间的显著(P＜0.10)正(没有括号)相关或负(带括号)相关。
与TRF和天数的相关性可用于确定与特异TRF相关的细菌应在何时存在于猪的胃肠道中，从而开发出用于解决益生菌菌株施用时间的策略。在常规和早期隔离断奶管理模型中，与嗜酸乳杆菌相关的TRF与在断奶前(18日龄)存在具有正相关性(P＜0.07)，并且与在生命早期(7日龄)和断奶后存在具有负相关性(P＜0.05)(参见下表8)。
与之相比，与德氏乳杆菌相关的TRF与在生命早期(7和14日龄)存在具有正相关性(P＜0.10)，但与在18日龄及此后存在具有负相关性(P＜0.10)。与唾液乳杆菌和乳酸片球菌相关的一些TRF与在断奶前后期间多天存在具有正相关性和负相关性(P＜0.10)。在室内和室外饲养模型中，与嗜酸乳杆菌相关的TRF显示出与在断奶前和断奶早期过渡期(20日龄)期间存在之间的明显负相关性，以及与在22日龄后存在之间的正相关性(参见下表9)。尽管断奶前的时期和断奶后的时期之间没有明显的间隔，通常与唾液乳杆菌、德氏乳杆菌、乳酸乳杆菌和卷曲乳杆菌相关的TRF与在22日龄和此后存在具有正相关性(P＜0.05)，而乳酸片球菌则与在断奶前以及断奶过渡期存在具有正相关性(P＜0.05)。
Figure BPA00001403349800231
实施例7
基于与免疫特征的相关性鉴定益生菌
可建立将特异TRF与猪的系统循环(外周血)和胃肠道内的免疫群相关联的相关性，从而可以预期益生菌的施用将如何影响幼猪的这些组织的免疫特征。与来自两个生长模型的特异TRF正相关和负相关的免疫群列于下表10和表11中。一般而言，与潜在益生菌有关的TRF与外周血和胃肠道中的活化T细胞、记忆T细胞和γ-δT细胞亚类正相关(P≤0.05)。
表10：在常规现场保育场地饲养的猪和早期隔离断奶(SEW)系统饲养的猪的外周血和胃肠道(GIT)中，鉴定特定细菌的TRF与免疫细胞群的相关性1。
Figure BPA00001403349800241
Figure BPA00001403349800251
1所列免疫细胞群与特异TRF在显著水平上(P≤0.05)正相关或负相关。
Figure BPA00001403349800261
Figure BPA00001403349800271
Figure BPA00001403349800281
实施例8
通过RAPD PCR分析鉴定益生菌菌株
选择性地将产生高峰值高度的目标TRF的肠样品铺板以培养生产乳酸的细菌。将菌落挑入培养基中，并培养24小时，并在此时从细胞培养物分离DNA。通过比较5’-四氯荧光素标记的8F结构域引物(5’AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’)和1406R  通用引物(5’ACGGGCGGTGTGTRC 3’)的RAPD PCR指纹，评估分离物的相似性。对分离物进行使用Bfa I、Hae III和Msp I的TRFLP以确保其具有目标TRF。目标TRF均为表5、6、7和8中与提高的性能相关的TRF。由于Bionumerics软件使用的位置公差和优化设置，表5和表6中来自现场/场外试验和室内/室外试验的TRF大小略有差别，但在菌株选择过程中认为其相同。表12显示了具有TRF长度和TRF长度±2个碱基对的目标TRF，以解释上述微小差别。本发明人相信，如果菌株具有相同的TRF，则在比较来自一种乳酸菌的TRF序列与来自另一种乳酸菌的TRF序列时，存在约90％的序列同一性。
图2中显示了RAPD PCR指纹、TRFLP谱和与包含上文显示的一个或多个目标TRF的9个RAPD簇相关的所得树状图。4个簇包含与嗜酸乳杆菌相关的TRF；3个簇包含与唾液乳杆菌相关的TRF；2个簇包含与乳酸片球菌相关的TRF。从每个簇中选出典型菌株：嗜酸乳杆菌o246iL7fv、嗜酸乳杆菌PlBc8、嗜酸乳杆菌PlB c6、嗜酸乳杆菌PLGf1、唾液乳杆菌o246e8、唾液乳杆菌PL2i4、唾液乳杆菌o246e 33w、乳酸片球菌o246e 42和乳酸片球菌PlJ e3。
表12：将TRF与性能和免疫因子关联的相关性而确定的目标TRF。
Figure BPA00001403349800301
在包含来自所有乳酸菌分离物的RAPD谱的树状图内鉴定出这9个候选菌株，表明即便在相同种类的菌株之间，这9个候选DFM菌株也具有彼此不同的RAPD谱。例如，根据其RAPD谱，乳酸片球菌菌株o246e 42与乳酸片球菌菌株PIJ e3仅有约10％的相似性，而不同种类的很多细菌菌株与相同种类的这些菌株之间的相似性高于其彼此之间的相似性。
实施例9
测定断奶前和断奶后时期中的补充益处的益生菌菌株的动物试验
选择上文列出的每个种类的一个菌株用于初步动物测试，以验证这些特定细菌的存在与幼猪改进的生长性能之间的相关性。选择包括嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJ e3在内的3种益生菌进行测试，以确定所选益生菌改进幼猪在断奶前和断奶后的生产时期内的生长性能的功效。将嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJ e3组合地包含在母猪饲料中并分别包含在断奶后的保育猪饲料中。将母猪分成8个处理组，每个处理组4只，并将同窝幼仔随机分入8个处理组之一以确定在断奶前和断奶后期间，以及在保育期组合或分别施用益生菌的作用(参见下表13)。母猪(断奶前)接受营养加强，对于保育猪(断奶后)，将DFM作为完全定量(complete ration)的一部分混入饲料中。无论总cfu是源自一种生物还是三种所选生物的组合，配制8种益生菌处理，以1×109总cfu/猪/天向母猪或猪进行递送；在使用多种生物的情况下，所包含的每种生物的量相等(基于CFU)。
表13：在哺乳期1和保育期2，给母猪及其幼仔施用的饲料益生菌处理。
Figure BPA00001403349800311
1通过以递送1×109cfu/母猪/天将益生菌处理添加母猪饲料中，从而将饲料施用于幼仔；
2在断奶后两周内对保育猪饲料给予益生菌处理；
3向三种益生菌的组合中加入短乳杆菌。在先文献中表明短乳杆菌对幼猪有益(Davis等，2006)。
将三种处理与三种菌株组合对比的对比陈述(contrast statement)证明，在施用于母猪时，嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJe3的组合提高了(P＝0.03)哺乳期第三周期间的仔猪体重和平均每日增重(参见下表14)。由于在保育期内的重复有限(4个重复/处理)，不能检测出由益生菌处理产生的保育猪性能的任何差异(数据未显示)。
实施例10
用于确定并进一步定义向哺乳期的母猪补充三种益生菌菌株的组合的有益响应的动物测试
在进一步评估了这些菌株的第二试验中，证实了向哺乳期的母猪饲喂嗜酸乳杆菌PlB c6、唾液乳杆菌o246e 33w和乳酸片球菌PlJ e3的三菌株益生菌组合的有益响应，所述第二试验通过按照以下的处理安排，以每种处理20个圈栏来检测乳酸片球菌PlJ e3和唾液乳杆菌o246e 33w以及单独的乳酸片球菌PlJ e3：(1)对照饲料；(2)以1×109总cfu/猪/天的总量补充所有三种直接饲喂微生物菌株的对照饲料，包括乳酸片球菌PlJ e3、唾液乳杆菌o246e33w和嗜酸乳杆菌PlB c6各3.34×108cfu/猪/天；(3)以1×109的总量补充两种直接饲喂微生物菌株的对照饲料，包括乳酸片球菌PlJ e3和唾液乳杆菌o246e 33w各5.0×108；和(4)仅补充1×109乳酸片球菌PlJ e3的对照饲料。在所有处理中母猪均接受营养加强。
与来自未补充的母猪的仔猪相比，补充三种菌株的组合提高了(P＜0.05)哺乳期第三周期间的仔猪平均每日增重(参见下表15)。尽管与对照没有显著差别，由仅补充了乳酸片球菌PlJ e3的母猪哺育的仔猪的平均每日增重在数量上较大，并且类似于由补充了三种菌株组合的母猪哺育的仔猪。向母猪补充三种菌株的组合或仅补充乳酸片球菌PlJ e3抑制了同一窝中仔猪体重的差异增大；而单独补充乳酸片球菌PlJ e3降低了整个哺乳期内同一窝中仔猪体重的差异(处理×时间相互关系，P＝0.06；参见图3)。
表15：在整个哺乳期施用益生菌补充物的母猪的幼仔的断奶前幼仔性能。
1PA＝乳酸片球菌PlJ e3；LS＝唾液乳杆菌o246e 33w；LA＝嗜酸乳杆菌PlB c6；
2将每窝幼仔的猪数量等同后的平均重量；
a，b没有上标的平均值具有显著差异，P＜0.05。
实施例11
用于测定在生产的保育期中进行补充的益处的益生菌菌株的动物试验
将总计480只仔猪断奶，基于初始体重分组，并按照4只猪/栏圈养在总计120个圈栏中。在保育期的前两周期间向保育猪施用6种饲料处理(20栏/处理)。饲料处理为：1)在保育期的前两周向断奶仔猪施用的对照饲料；2)以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物嗜酸乳杆菌PlB c6且在保育饲料中施用两周的对照饲料；3)以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌o246e 8且在保育饲料中施用两周的对照饲料；4)以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌Pl2 i4且在保育饲料中施用两周的对照饲料；5)以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌o246e 33w且在保育饲料中施用两周的对照饲料；6)以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物乳酸片球菌o246e 42且在保育饲料中施用两周的对照饲料。
在试验的后四周向所有仔猪饲喂常规的保育饲料。每周测定仔猪体重和饲料减少量；并且在为期6周的试验期间，计算每栏的ADG、ADFI和饲料功效。
与未补充的仔猪和饲喂了唾液乳杆菌Pl2 i4的仔猪相比，在断奶第二周期间补充唾液乳杆菌o246e 33w提高了(p＜0.05)饲料功效(表15)。尽管与对照处理之间没有统计显著性(P＞0.05)，但饲喂了乳酸片球菌O246e 42的仔猪在试验的第6周期间具有最低的FE。与饲喂了嗜酸乳杆菌和PlB c6和唾液乳杆菌Pl2i4的仔猪相比，此相同菌株和唾液乳杆菌O246e 8产生了提高的(P＜0.05)饲料功效(表16)。
表16：生长性能1
Figure BPA00001403349800351
Figure BPA00001403349800361
1数据是6次处理中20个重复的平均值；
2饲料处理为处理1＝对照；处理2＝以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物嗜酸乳杆菌PlB c6的对照饲料；处理3＝以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌o246e 8的对照饲料；处理4＝以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌Pl2 i4的对照饲料；处理5＝以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物唾液乳杆菌o246i 33w的对照饲料；处理6＝以1×109cfu/猪/天补充直接饲喂微生物候选生物乳酸片球菌o246e 42的对照饲料；
3平均值的标准差(SEM)；
4饲料功效(FE)；
a，b，c行内带有不同上标的平均值具有显著差异，P＜0.05。
实施例12
基于与潜在病原菌的负相关性鉴定益生菌
可建立将表现所选益生菌菌株的胃肠道中的特异TRF与病原限定的TRF的存在相关联的相关性，从而可以预期益生菌的施用将如何影响病原生物在幼猪的这些组织中的存在。被限定为嗜酸乳杆菌(表17)和唾液乳杆菌(表18)的TRF的存在与被限定为梭菌(Clostridium spp.)、分枝杆菌(Mycobacteriumspp.)和巴斯德菌(Pasteurella spp.)的多个病原限定的TRF的存在具有负相关性(P＜0.05)，这表明当这些益生菌存在于胃肠道时，这些病原存在的可能性较低。
表17：与猪胃肠道中嗜酸乳杆菌限定的末端限制性片段(TRF)(B100.79、H330.95、M189.62)的存在具有负相关性的TRF。
Figure BPA00001403349800371
表18：与猪胃肠道中唾液乳杆菌限定的TRF存在具有负相关性的末端限制性片段(TRF)
应理解，上文展示和描述的多种实施方式是用于说明本发明的不同可能特征，并且这些特征可通过不同方式组合。除了按照不同方式组合上述实施方式的不同特征之外，其他改变也应在本发明的范围之内。本发明不应被限定为上文所述的实施方式，而仅由下文列出的权利要求书限定。因此，本发明包括在文字上或等同地落入这些权利要求范围的所有替代实施方式。
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Claims (28)

1.DNA序列，其包含乳酸菌16S rRNA基因编码区的部分，其5′末端包含5’AGAGTTTGATYMTGGCTCAG 3’的序列，其3′末端包含BfaI、Hae III和Msp I之一的限制性酶识别位点，
当所述限制性酶识别位点为Bfa I时，所述DNA序列的长度为约99个碱基对至约103个碱基对，约268个碱基对至约273个碱基对，约260个碱基对至约265个碱基对，约279个碱基对至约284个碱基对，约278个碱基对至约282个碱基对，或约273个碱基对至约277个碱基对；
当所述限制性酶识别位点为Hae III时，所述DNA序列的长度为约329个碱基对至约334个碱基对，约352个碱基对至约357个碱基对，约277个碱基对至约282个碱基对，或约335个碱基对至约339个碱基对；和
当所述限制性酶识别位点为Msp I时，所述DNA序列的长度为约188个碱基对至约192个碱基对。
2.用于鉴定可用作直接饲喂微生物的一种或多种菌株的方法，所述方法包括：
从来自动物胃肠道的细菌分离DNA；
扩增所述DNA；
使用T-RFLP分析扩增的DNA以获得TRF数据；
建立所述TRF数据与目标特征的相关性；
由所述相关性鉴定目标菌株；和
确认所述TRF存在于所述菌株中。
3.一种菌株，其通过权利要求2所述的方法鉴定。
4.如权利要求3所述的菌株，其中所述菌株是潜在的益生菌。
5.如权利要求3所述的菌株，其中所述菌株是潜在的病原。
6.一种方法，其包括向动物施用有效量的至少一种权利要求3所述的菌株。
7.分离的乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)菌株PlJ e3(NRRLB-50101)。
8.一种组合物，其包含：
权利要求7所述的菌株；和
分离的唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)菌株o246e 33w(NRRLB-50102)。
9.如权利要求8所述的组合物，其还包含分离的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)菌株PlB c6(NRRL B-50103)。
10.一种分离的菌株，其选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种。
11.一种分离的菌株，其具有权利要求10所述菌株之一的所有鉴定特征。
12.如权利要求10所述的菌株，其还包含载体。
13.一种方法，其包括向动物施用有效量的选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种菌株。
14.如权利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)。
15.如权利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)和唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)。
16.如权利要求13所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)。
17.如权利要求13所述的方法，其中所述动物是猪。
18.如权利要求17所述的方法，其中以约1×108总cfu/猪/天至约5×1010总cfu/猪/天向所述猪施用一种或多种所述菌株。
19.如权利要求13所述的方法，其中所述动物是母猪。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述母猪是哺乳期的母猪。
21.如权利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)；且
所述方法还包括与未施用所述菌株的母猪生育的仔猪相比，使所述施用了菌株的母猪生育的仔猪的体重和平均每日增重得到改进。
22.如权利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)和嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRL B-50103)；且
所述方法还包括与未施用所述菌株的母猪生育的仔猪相比，防止所述已施用菌株的母猪生育的同窝仔猪体重的差异增大。
23.如权利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)；且
所述方法还包括与未施用所述菌株的母猪生育的仔猪相比，防止所述已施用菌株的母猪生育的同窝仔猪的体重差异增大。
24.如权利要求19所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRLB-50101)；且
所述方法还包括与未施用所述菌株的母猪生育的仔猪相比，降低了所述已施用菌株的母猪生育的同窝仔猪的体重差异。
25.如权利要求13所述的方法，其中所述动物是处于生产保育期的猪，并且其中所述菌株是乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)。
26.如权利要求13所述的方法，其还包括使用所述菌株调节动物的免疫系统。
27.一种用于制备直接饲喂微生物的方法，所述方法包括：
(a)在液体营养肉汤中培养选自嗜酸乳杆菌菌株PlB c6(NRRLB-50103)、唾液乳杆菌菌株o246e 33w(NRRL B-50102)、乳酸片球菌菌株o246e 42(NRRL B-50171)和乳酸片球菌菌株PlJ e3(NRRL B-50101)中的至少一种菌株；和
(b)从所述液体营养肉汤分离所述菌株以获得所述直接饲喂微生物。
28.如权利要求27所述的方法，其中所述菌株是乳酸片球菌菌株PlJ e3B-50101。
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