CN102884174B - 肠道免疫抑制剂的筛选方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种可有效筛选能有效抑制肠内诱发的炎症性免疫作用的免疫生物的方法。本发明涉及抑制肠道上皮细胞中炎症性免疫作用的抑制剂的筛选方法、通过该筛选方法分离的菌株、含有该菌株的组合物。

Description

肠道免疫抑制剂的筛选方法
技术领域
本发明涉及在肠内可抑制炎症性免疫作用的免疫生物（Immunobiotics）的筛选方法、通过该方法筛选的菌株、具有所述抑制作用的新菌株及具有所述菌株的组合物。
背景技术
抗生物质（Antibiotics）的发现和使用对于现今的医学发展来说非常重要。但是，近年来，抗生物质的副作用或因突变出现多重耐药性等问题成为讨论话题。因此，相对于“抗生物质”，“益生菌（probiotics）”这一想法在现今世间被广为认知。益生菌，是指“可改善消化道内的细菌群、为宿主带来有益效果的有益微生物及其增殖促进物质”，近来萌生出了使用这些益生菌作用于消化道内（口腔内或肠内）的菌群（细菌群），在试图使菌群健康化的同时进行预防、改善疾病这一想法。
在哺乳类消化道中，在将体外物质摄入体内的肠道中，存在体内最大的免疫系统。因而，调节肠道免疫，对哺乳类的健康而言非常重要。近年来，在“益生菌”中，作为具有肠道免疫系统调节功能的物质，出现了“免疫生物”这一概念，其应用性倍受瞩目。
Toll样受体（TLR）存在于多种免疫类细胞中，因其可识别细菌、真菌、寄生物及病毒等病原体的特异分子模式而被众所周知。TLR家族由被称为TLR1到TLR11的11种蛋白质构成，可认为其各自的识别分子即细菌性调控蛋白（modulin）不同。可认为免疫生物通过作用于在肠道免疫系统中表达的TLR来调节免疫。
最近，人们开始研究这些免疫生物会对肠道免疫系统产生怎样的影响，尝试筛选作为免疫生物的适宜的菌株。例如专利文献1公开了通过TLR9识别特定的来自格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri菌）的寡核苷酸，在淋巴细胞母细胞化中显示出活性。在非专利文献1中，公开了通过以乳酸菌刺激表达猪TLR2的转化细胞，研究该细胞中的细胞因子表达，从而评价作为免疫生物的乳酸菌的方法。在非专利文献2中，公开了将人Caco2细胞与大肠杆菌k88株共培养的情况下，如果进一步与特定的乳酸菌共培养，则炎症性应答被抑制。在非专利文献3中，公开了在猪肠道上皮细胞中，关于抑制因产毒性大肠杆菌（EnterotoxigenicE.coli）诱发炎症的免疫生物，根据对IL-6或IL-8产生的抑制，筛选出发挥抗炎症性的免疫生物。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2006-232790号
非专利文献
非专利文献1：Tohno等,动物科学杂志(2007)78,195-205（Tohnoetal.,AnimalScienceJournal(2007)78,195-205）
非专利文献2：Roselli等,英国营养学杂志(2006),95（Rosellietal.,BritishJournalofNutrition(2006),95）
非专利文献3：岛津等《免疫生物在肠道上皮细胞中的抗炎作用》日本畜产学会第110次大会演讲主题X27-05
发明内容
发明要解决的技术问题
发明人等研究发现，在使用牛的肠道上皮细胞研究免疫生物时，如果使用IL-6、IL-8、MCP-1，则能有效评价具有炎症性免疫抑制性的免疫生物。并且，在进一步的研究中发现，使用肠道上皮细胞，将从IL-6、IL-8及MCP-1中选择出的至少两种用于评价，用该评价方法成功分离了具有良好炎症性免疫抑制性的免疫生物，使用该菌株发现了其功能机理。并且通过进一步深入研究，结果证实了如果使经口摄入的组合物中含有该菌株，则能够改善个体的免疫能力，从而完成了本发明。
解决技术问题的技术手段
即，本发明涉及乳杆菌属（Lactobacillus菌属）菌，将其与肠道上皮细胞共培养2天以上，从而抑制暴露在促炎性细胞因子中的肠道上皮细胞中选自IL-6、IL-8及MCP-1中的两种以上炎症性免疫相关细胞因子与未共培养的肠道上皮细胞中的上述炎症性免疫相关细胞因子相比较的表达量。
此外，本发明的所述乳杆菌属菌，抑制IL-6、IL-8及MCP-1这三种的表达量。
进而，本发明的所述乳杆菌属，炎症免疫相关细胞因子的表达量的30%以上变为抗炎症性。
此外，本发明的所述乳杆菌属为干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、罗依氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）、唾液乳杆菌（Lactobacillussalivarius）、詹氏乳杆菌（Lactobacillusjensenii）或格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri）。
本发明还涉及干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）OLL2768菌株（保藏号：FERMBP-11244）。
此外，本发明还涉及詹氏乳杆菌（Lactobacillusjensenii）TL2937菌株（保藏号：FERMBP-11272）。
进而，本发明还涉及一种抑制肠道上皮细胞中炎症性免疫作用的抑制剂的筛选方法，其包括下述工序：
（1）以候补抑制剂刺激表达Toll样受体（TLR）2及4的细胞的工序；
（2）以促炎性细胞因子刺激在（1）中刺激后的细胞的工序；
（3）测量在（2）中刺激后的细胞中一种或两种以上的炎症性免疫相关细胞因子的表达量的工序；
其中，一种或两种以上的所述炎症性免疫相关细胞因子的表达量，与未进行所述（1）工序的对照相比，变为抗炎症性的情况下，所述候补抑制剂具有炎症性免疫作用抑制性。
并且，本发明的所述方法，在（1）与（2）之间，还进一步包括（1’）清洗（1）中刺激后的细胞的工序。
另外，本发明的所述方法，当炎症性免疫相关细胞因子的表达量与对照相比，30%以上变为抗炎症性的情况下，视作候补抑制剂具有炎症性免疫作用抑制性。
另外，本发明的所述方法，TLR2及4来自于牛、猪或人。
另外，本发明的所述方法，促炎性细胞因子为产毒性大肠杆菌（ETEC）。
另外，本发明的所述方法，表达TLR2及4的细胞为肠道上皮细胞。
另外，本发明的所述方法，测量表达量的炎症性免疫相关细胞因子为IL-6、IL-8及MCP-1。
另外，本发明的所述方法，炎症性免疫作用抑制剂为免疫生物或其衍生物（免疫原性微生物（immunogenics））。
另外，本发明还涉及通过所述筛选方法分离出的免疫生物。
另外，本发明的所述免疫生物为乳杆菌属菌或双歧杆菌属菌。
本发明还涉及一种炎症抑制剂组合物，其包含所述菌或免疫生物中的至少一种。
另外，本发明的所述炎症抑制剂组合物，其用于预防及/或处置肠内炎症性疾患。
另外，本发明还涉及一种食品组合物，其包含所述炎症抑制剂组合物。
另外，本发明还涉及一种饲料组合物，其包含所述炎症抑制剂组合物。
发明效果
通过本发明的筛选方法，能够有效筛选出可有效抑制肠内诱发的炎症性免疫作用的免疫生物。并且，通过本发明的筛选方法筛选分离出的免疫生物，一旦被免疫细胞识别，则对免疫细胞的mRNA表达谱产生影响，即使无该免疫生物存在时，也能抑制炎症性免疫作用。
附图说明
图1是表示以各供试乳酸菌刺激的BIE细胞中的IL-6、IL-8及MCP-1的表达量的附图。以Student’st检验解析相对于ETEC对照的2组间的统计学显著性差异。作为抑制在各细胞因子中表达量尤其高的IL-6及IL-8的表达，进而也可抑制MCP-1的表达的菌株，筛选出了OLL2768。
图2是表示以OLL2768菌株刺激后的BIE细胞中的各细胞因子mRNA的表达量的图表。横轴表示刺激开始后的时间，纵轴表示以无刺激表达为1时的相对强度。
图3是表示OLL2768菌株刺激48小时后，进一步给予ETEC刺激时，BIE细胞中的各细胞因子mRNA的表达量的变化的图表。横轴表示ETEC刺激后经过的时间，纵轴表示以无刺激表达为1时的相对强度。
图4a表示BIE细胞接种3日后以ETEC进行刺激，测量刺激12小时后的12种细胞因子的mRNA表达量的图表。纵轴表示以无刺激表达为1时的相对强度。以Student’st检验解析相对于对照的2组间的统计学显著性差异。结果，作为强诱导的候补细胞因子选择出了IL-1α、IL-6、IL-8及MCP-1。图4b）表示BIE细胞接种5日后以ETEC进行刺激，测量刺激12小时后的上述4种候补细胞因子的mRNA表达量的图表。以Student’st检验解析相对于对照的2组间的统计学显著性差异。结果，作为在实施例中应测量的细胞因子筛选出了IL-6、IL-8及MCP-1。
图5是表示以免疫生物候补菌株对猪肠道上皮细胞进行0、12、24及48小时的预刺激，然后以聚肌胞苷酸（polyI:C)刺激12小时后的IFN-β的表达量的图表。
图6是表示以免疫生物候补菌株对猪肠道上皮细胞进行0、12、24及48小时的预刺激，然后以聚肌胞苷酸刺激12小时后的MCP-1的表达量的图表。
图7是表示各饲料区中，粪便中的病原性大肠杆菌的检测结果的附图。上图表示k99、下图表示k88，箭头所示位置上的黑带表示检测出了各抗原。如图所示即使添加抗菌剂也均不能预防13~15周龄中的产毒性大肠杆菌的感染。
图8是表示各饲料区中，血浆中的C反应蛋白（CRP）的浓度的图表。众所周知血浆中的CRP浓度可作为体内炎症反应的指标，浓度高表示体内发生炎症反应。
图9是表示各饲料区中，粒细胞数相对于淋巴细胞数的比值的图表。粒细胞比例越高，表示越易激活自然免疫。
图10是表示各饲料区中，粪便中的病原性大肠杆菌ETEC987的检测结果的附图。3区（无抗菌剂、投入TL2937菌株）即使在13~15周龄中也未检测出ETEC987。
图11是表示各饲料区中，13~15周龄时的CRP浓度的图表。在3区中，与其他区相比，CRP浓度显著低。
图12是表示各饲料区中，补体第2经路活性的图表。与CRP浓度相同，可以确认在3区中显著性高的补体第2经路活性。
图13是表示各饲料区中，22周龄对象的体重的图表。
图14是表示出栏时的屠体重量的图表。
具体实施方式
本发明是一种可抑制肠道上皮细胞中炎症性免疫作用的抑制剂的筛选方法，其包括下述工序：
（1）以候补抑制剂刺激表达Toll样受体（TLR）2的细胞的工序；
（2）以促炎性细胞因子刺激在（1）中刺激后的细胞的工序；
（3）测量在（2）中刺激后的细胞中的一种或两种以上的炎症性免疫相关细胞因子的表达量的工序；
其中，1或2种以上的所述炎症性免疫相关细胞因子的表达量，与未进行所述（1）工序的对照相比，变化为抗炎症性的情况下，所述候补抑制剂具有炎症性免疫作用抑制性。
在本发明中，“炎症性免疫作用抑制性”是表示抑制炎症性免疫作用的性质，“炎症性免疫作用抑制剂”是表示具有炎症性免疫作用抑制性的制剂。炎症性免疫作用抑制剂包括例如免疫生物等微生物、多肽等化合物，但并不限定于此。在本发明中，“免疫生物”是指益生菌中具有免疫调节功能的益生菌。
在本发明中，“变化为抗炎症性”是表示通过促炎性细胞因子的刺激表达的炎症性免疫相关细胞因子的表达量，超过统计误差的范围向抑制炎症反应方向变化。因而，例如如果是促进炎症反应的细胞因子，向使其表达量降低的方向变化，如果是抑制炎症反应的细胞因子，则向使其表达量增大的方向变化，或者向抑制一时性地表达增强后的表达降低的方向变化，但并不限定于此。统计解析可以广泛使用本领域技术人员众所周知的一切统计解析法，可以例举如Student’st检验等，但并不限定于此。筛选时，在一种或两种以上的炎症性免疫相关细胞因子中，表达量变化为抗炎症性的情况下，可以判断候补剂为炎症性免疫作用抑制剂。优选在两种以上炎症性免疫相关细胞因子中表达量变化为抗炎症性的情况，更加优选3种以上的情况。更加优选测量的全部炎症性免疫相关细胞因子的表达量均变化为抗炎症性的情况。
在本发明的一个实施方式中，当表达量的30%以上变化为抗炎症性的情况下，判断候补抑制剂具有炎症性免疫作用抑制性。
在本发明中，炎症性免疫相关细胞因子，包含与炎症反应相关的全部的细胞因子。炎症性免疫相关细胞因子，能够区分具有促进炎症反应性质的细胞因子与具有抑制炎症反应性质的细胞因子。作为具有促进炎症反应性质的细胞因子，可以例举如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-γ、MCP-1、TNF-α、LIF等炎症性细胞因子等，但并不限定于此。作为具有抑制炎症反应性质的细胞因子，可以例举如IL-4、IL-10、TGF-β等抗炎性细胞因子，IFN-α、IFN-β等抗病毒性细胞因子等，但并不限定于此。
众所周知Toll样受体（Tolllikereceptor：TLR）是一种模式识别受体，通过其活化，诱发对病原体的免疫应答信号级联放大。另外，众所周知TLR家族高度存在于脊椎动物中。TLR家族中，TLR2为将脂蛋白、革兰氏阳性菌的肽聚糖、脂磷壁酸、真菌的多糖、病毒的糖蛋白等作为配体进行识别的TLR，TLR4为将脂多糖、病毒的糖蛋白等作为配体进行识别的TLR。其中，认为产毒性大肠杆菌通过TLR4诱发炎症，病毒通过TLR3诱发炎症，但是免疫生物通过TLR2调节炎症应答。
表达TLR2的细胞，可以是任何细胞，没有限定，包括分离细胞、培养细胞、转化细胞。TLR2即可以是自然地表达，也可以通过细胞转染，使其强制表达。如上所述，由于TLR家族高度存在于脊椎动物中，因此可以使用任何一种动物，但是优选具有肠内细菌群的动物，尤其优选哺乳动物。在哺乳动物中，包括大鼠、小鼠等啮齿类，兔子、牛、马、猪、羊、猴、山羊、人等，但并不限定于此。
表达TLR2的细胞，最好还表达一种或两种以上其他TLR。作为其他TLR，可以例举如TLR1、TLR3、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9等，但并不限定于此。作为与病毒性炎症相关的TLR，可以例举如TLR3、TLR9，优选TLR3。作为与细菌性炎症相关的TLR，可以例举如TLR1、TLR4、TLR5、TLR6、TLR9等，优选TLR4。
在本发明中，“肠道上皮细胞”是存在于脊椎动物肠道管腔面上的细胞，是指参与肠道中的营养吸收或生物防御等相关免疫应答的细胞。众所周知，在肠道上皮细胞中，以TLR为首的模式识别受体发生表达，因而肠道中的免疫应答中包含介由TLR的信号经路的应答。如上所述，TLR家族高度存在于脊椎动物中，作为脊椎动物可以是任意的脊椎动物，但优选具有肠内细菌群的动物，尤其优选哺乳动物。
本发明的筛选方法，首选以候补抑制剂刺激表达TLR2的细胞。然后，以促炎性细胞因子进行刺激。刺激方法可以使用本领域技术人员公知的任意方法。作为刺激方法，可例举如将细胞与候补抑制剂或促炎性细胞因子共培养的方法等，但并不限定于此。以促炎性细胞因子刺激后，测量所述细胞中的炎症性免疫相关细胞因子的表达量。对炎症性免疫相关细胞因子的表达量的测定方法无特别限定，可以使用本领域技术人员公知的所有方法。例如即可以测量mRNA的表达量，也可以测量分泌的蛋白量。测量方法可以根据测量的炎症性免疫相关细胞因子表达量的指标而改变。作为其实例，在测量RNA量的情况下，可以例举实时定量PCR法，在测量分泌蛋白的情况下，可以例举吸光光度法等，但并不限定于此。
基于促炎性细胞因子的刺激，从排除候补抑制剂作用于促炎性细胞因子本身产生的影响方面考虑，优选在无候补抑制剂条件下进行。因而，优选在（1）工序与（2）工序之间，进一步包括清洗（1）中刺激后的细胞的工序。这样，可以避免候补抑制剂对促炎性细胞因子本身造成的影响，可以更准确地筛选直接作用于TLR表达细胞的炎症性免疫作用抑制剂。
如上所述，本发明中的细胞可以使用任意细胞，但是从筛选在肠内发挥效果的炎症性免疫作用抑制剂方面考虑，优选使用来自猪或人的肠道上皮细胞。
作为促炎性细胞因子，只要能诱发炎症性免疫即可，可以使用任何本领域技术人员已知的促炎性细胞因子。例如有脂多糖、病毒性dsRNA、聚肌胞苷酸（PolyI:C）（合成dsRNA）等化合物、大肠杆菌等菌体等，但不限于此。从在肠内诱发炎症性免疫方面考虑，优选产毒性大肠杆菌（ETEC）。
如上所述，表达TLR2的细胞，既可以是转化细胞，也可以是分离细胞，但是如果考虑细胞内的蛋白质表达谱，则优选使用天然表达TLR的细胞。并且，作为本发明的目的之一，为了发现优良的免疫生物，优选使用肠道上皮细胞、Caco2细胞等肠道细胞，最优选使用正常的肠道上皮细胞。
测量表达量的炎症性免疫相关细胞因子，只要是与炎症反应相关的细胞因子，可以测量任意一种，也可以筛选一种或两种以上优选的炎症性免疫相关细胞因子进行测量。作为在本发明中所用的与炎症反应相关的细胞因子，可以例举如IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、IL-13、IL-17、IL-18、IFN-α、IFN-β、IFN-γ、MCP-1、TNF-α、TGF-β、LIF等，但并不限定于此。本发明人进行了深入研究，结果从通过产毒性大肠杆菌在肠道上皮细胞中进行试验的12种细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、MCP-1、TNF-α、TGF-β、LIF）中筛选出了最强诱导的三种细胞因子（IL-6、IL-8及MCP-1）。因而，测量的炎症性免疫相关细胞因子优选IL-6、IL-8及MCP-1三种。
上述筛选例如可以通过下述方法进行，但是并不限定于该方法。
将BIE细胞按照与下述实施例1相同的方法进行接种培养，3日后以ETEC对其进行刺激。ETEC刺激12小时后，使用实时PCR法对12种细胞因子（IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-12、MCP-1、TNF-α、TGF-β、LIF）测定mRNA的表达量。将该结果与未实施刺激的对照相比较，IL-1α、IL-6、IL-8及MCP-1的表达量显著增大，因此将这些作为候补细胞因子。接着，BIE细胞接种3日后进一步进行继续培养，作为预刺激预计时间为2日，然后以ETEC进行刺激。ETEC刺激12小时后，使用实时PCR法对所述候补细胞因子测定mRNA的表达量。将结果与未实施刺激的对照相比较，IL-6、IL-8及MCP-1的表达量显著增大，因此将该三种筛选为测量的炎症性免疫相关细胞因子（参照图4）。
作为炎症性免疫作用抑制剂，由于其抑制肠道上皮细胞中的炎症性免疫作用，因此优选可经口摄入的炎症性免疫作用抑制剂。并且，炎症性免疫作用抑制剂更优选免疫生物或其衍生物（免疫原性微生物）。
在本发明中，“免疫原性微生物”是指来自于免疫生物的免疫调节因子。作为包含在免疫原性微生物中的物质，可例举如作为菌体表层成分构成细胞壁的肽聚糖、磷壁酸、脂磷壁酸及菌体外多糖（EPS）；并且，作为菌体内成分，可以例举如染色体DNA等的核酸成分、作为其限制性内切酶水解片段的寡DNA或者是包括各种酶蛋白等的细胞质成分，但不限定于此。
根据本发明的筛选方法，可以筛选出优良的炎症性免疫作用抑制剂。因而在本发明中，还包括通过本发明的方法筛选出的炎症性免疫作用抑制剂，优选炎症性免疫作用抑制性免疫生物。作为该免疫生物，从广义上属于益生菌的观点来看，优选乳杆菌属菌或双歧杆菌属菌。
本发明人根据本发明的筛选方法，从众多的乳杆菌属菌中分离出了具有本发明中包含的炎症性免疫作用抑制性的免疫生物，其中作为令人满意的免疫生物，分离出了OLL2768菌株及TL2937菌株。
本发明中包合的乳杆菌属菌，具有如下特征，通过将其与肠道上皮细胞共培养2日以上，抑制暴露在促炎性细胞因子中的肠道上皮细胞中的一种或两种以上炎症性免疫相关细胞因子与未共培养的肠道上皮细胞中的上述炎症性免疫相关因子相比较的表达量。乳杆菌属菌是乳酸菌的代表属之一，是革兰氏阳性杆菌，根据种的不同，包括只产生乳酸（同型乳酸发酵）和产生乳酸以外产物的（异型乳酸发酵）类型。
抑制的炎症性免疫相关细胞因子，只要是成为炎症反应原因的细胞因子即可，但优选通过促炎性细胞因子的刺激表达量显著增大的炎症性免疫相关细胞因子。在BIE细胞中，从通过产毒性大肠杆菌的刺激表达量显著增大的方面考虑，优选IL-6、IL-8或MCP-1中的任一种，更加优选抑制从IL-6、IL-8及MCP-1中选出的两种因子，最优选抑制IL-6、IL-8及MCP-1三种因子。
在本发明的一个实施方式中，本发明的乳杆菌属菌抑制30%以上所述炎症性免疫相关细胞因子的表达量。
作为本发明中包含的乳杆菌属菌，，可以例举如德氏乳杆菌保加利亚亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Burgaricus）、德氏乳杆菌乳亚种（Lactobacillusdelbrueckiisubsp.Lactis）、干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、瑞士乳杆菌（Lactobacillushelveticus）、嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）、卷曲乳杆菌（Lactobacilluscrispatus）、食淀粉乳杆菌（Lactobacillusamylovorus）（以下称为L.amylovorus）、鸡乳杆菌（Lactobacillusgallinarum)、格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri）（以下称为L.gasseri）、口乳杆菌（Lactobacillusoris）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）、约氏乳杆菌（Lactobacillusjohnsonii)、发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum）、短乳杆菌（Lactobacillusbrevis）、植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum）等，但并不限定于此。优选干酪乳杆菌（Lactobacilluscasei）、罗依氏乳杆菌（Lactobacillusreuteri）、鼠李糖乳杆菌（Lactobacillusrhamnosus）、唾液乳杆菌（Lactobacillussalivarius）、詹氏乳杆菌（Lactobacillusjensenii）或格氏乳杆菌（Lactobacillusgasseri)等。
本发明的OLL2768株于2010年3月17日在独立行政法人产业技术综合研究所（日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）进行了保藏，保藏号为：FERMBP-11244，所述OLL2768株是具有下述特征的干酪乳杆菌。
（a）形态性质
杆菌
（b）培养性质
培养基名称：乳酸杆菌MRS培养基（胰蛋白酶（Difco）,Ref.No.288130）
pH值：无调整
培养温度：37℃
培养时间：18小时
（1）形状：圆形
（2）直径：1~2mm
（3）色调：白色
（4）隆起状态：半球状
（5）边缘：全缘
（6）表面形状：平滑
（7）透明度：不透明
（8）粘稠度：黄油状
（c）生理学性质
（1）革兰氏染色性：阳性
（2）乳酸发酵形式：同型乳酸发酵
（3）需氧性：兼性厌氧
（4）发育温度：15℃+、45℃-
本发明的TL2937株于2010年5月14日在独立行政法人产业技术综合研究所（日本茨城县筑波市东1丁目1番地1中央第6）进行了保藏，保藏号为：FERMBP11272，其是具有下述特征的詹氏乳杆菌。
（a）形态性质
杆菌
（b）培养性质
培养基名称：乳酸杆菌MRS培养基（胰蛋白酶,Ref.No.288130）
pH值：无调整
培养温度：37℃
培养时间：18小时
（1）形状：圆形
（2）直径：1~2mm
（3）色调：白色
（4）隆起状态：半透镜状
（5）边缘：全缘
（6）表面轮廓：平滑
（7）透明度：不透明
（8）粘稠度：黄油状
（c）生理学性质
（1）革兰氏染色性：阳性
（2）乳酸发酵形式：同型乳酸发酵乳酸旋光性：D型
（3）需氧性：兼性厌氧
（4）发育温度：15℃-、45℃+
本发明的菌或免疫生物，可抑制肠道上皮细胞的炎症性免疫作用，因此包含所述菌或免疫生物中至少一种的炎症抑制剂组合物也属于本发明。该炎症抑制剂组合物，由于含有免疫生物，通过经口给药，可改善给药对象的肠内环境，其结果可预防和/或处置肠内炎症性疾患。因而，优选的是本发明的炎症抑制剂组合物为用于该目的的炎症抑制剂组合物。
本发明的炎症抑制剂组合物，由于可通过经口给药，因此可使其包含在食品组合物中。该食品组合物是一种通过所含有的炎症抑制剂组合物的作用，可改善摄取个体的肠内环境的食品组合物。作为食品组合物的形态，只要是菌可生存的形态即可，无特殊限定。作为该食品组合物的可获得的形态，可例举如酸奶、奶酪等乳制品、粉末或片剂、动物用饲料等，但并不限定于此。
因而，本发明的炎症抑制剂组合物，可以使其包含在动物用饲料组合物中。该饲料组合物也可以改善摄取个体的肠内环境。本发明的饲料组合物，可以用作具有肠内菌群的动物中的任一种动物的饲料，可以例举如用于犬、猫、鼠、豚鼠等宠物动物，或用于包括牛、马、猪、鸡等的家畜。
以下，根据实施例对本发明进行说明，但是实施例是本发明的示例，本发明并不限定于此。
实施例
例1：基于BIE细胞的抗炎症性免疫生物的筛选
使用小牛的肠道上皮（BIE）细胞，作为促炎性细胞因子使用肠产毒性大肠杆菌E.coli（ETEC987P株），对下述表1中记载的18株乳酸菌进行研究。将其各自在56℃进行30分钟热灭菌处理。
表1试验菌株表
菌株 种属
MEP221101 罗依氏乳杆菌
MEP221102 罗依氏乳杆菌
MEP221103 干酪乳杆菌
OLL2768 干酪乳杆菌
MEP221104 干酪乳杆菌
MEP221105 干酪乳杆菌
MEP221106 干酪乳杆菌
MEP221107 干酪乳杆菌
MEP221108 干酪乳杆菌
MEP221109 干酪乳杆菌
MEP221110 鼠李糖乳杆菌
MEP221111 鼠李糖乳杆菌
MEP221112 鼠李糖乳杆菌
MEP221113 鼠李糖乳杆菌
MEP221114 干酪乳杆菌
MEP221115 干酪乳杆菌
TL2937 詹氏乳杆菌
MEP221117 格氏乳杆菌
（a）乳酸菌的制备
以MRS培养基(胰蛋白酶,Detroit,美国)对菌株进行3次继代培养后（37℃、16h），以PBS充分清洗。清洗后于56℃进行30分钟热灭菌。再次以PBS清洗两次，然后在DMEM（10%FCS、1%链霉素/青霉素）中再悬浮。
（b）BIE细胞刺激
在24孔板中以1.5×104个/孔接种BIE细胞，培养3日。培养第3日以供试乳酸菌（100MOI）刺激2日。刺激后，以PBS清洗3次板孔，以5×107个/ml的ETEC刺激。
（c）由BIE细胞提取总RNA（TotalRNA）及合成cDNA
除去培养基并清洗后，通过使用TRIzol试剂的试剂盒提取出总RNA。使用QuantiTect逆转录试剂盒（试剂盒（Qiagen））由总RNA合成cDNA。
（d）通过实时PCR法对牛细胞因子mRNA定量
使用得到的cDNA进行实时RT-PCR。PCR反应溶液通过使用了PlatinumTMSYBRTMGreenqPCRSuperMix-UDGwithROX（英杰公司（Invitrogen））的系统来实施，通过使用7300实时PCR系统（应用生物系统公司,Lincoln,CDF,美国）而进行分析及解析。通过得到的增幅曲线组，由指数函数的增幅区域的任意荧光值Ct（阈值循环（Thresholdcycle））计算得到标准曲线。由该标准曲线算出各试样中的各种细胞因子的mRNA表达量，用该值除以各试样中的β-肌动蛋白的mRNA表达量，与以ETEC对照为1时的相对表达强度进行比较。以Student’st检验解析相对于ETEC对照的2组间的统计学显著性差异。
结果如图1所示。从因ETEC刺激诱导的三个细胞因子指标中，筛选出了OLL2768株，其尤其抑制强表达的IL-6及IL-8，且抑制MCP-1表达。
例2：基于BIE细胞中的免疫生物，Toll样受体的信号抑制因子的表达
在24孔板中以1.5×104个/孔接种BIE细胞，培养3日。培养第3日以化学合成三酰化脂肽Pam3CSK4（200ng/ml）或OLL2768株（5×107个/1ml）刺激12、24、36、48小时，通过实时RT-PCR法解析Toll样受体信号抑制因子（MKP-1（MAPKphosphatase1：MAPK磷酸酶1）、IRAK-M（Interleukin-1Recepter-AssociatedKinaseM：白介素-1受体相关激酶M）、SIGIRR（SingleIgIL-1-RelatedRecepter：单一IgIL-1相关受体）、BCL-3（B-cellCLL/Lymphoma3：B细胞CLL/淋巴瘤3）、Tollip（Toll-InteractingProtein：Toll作用蛋白）、A20（TNFAIP3（（TumorNecrosisFactor,Alpha-InducedProtein3：肿瘤坏死因子α诱导蛋白3））的表达。
另外，以OLL2768株刺激BIE细胞48小时后，以PBS清洗三次板孔，对以5×107个/ml的ETEC刺激3、6、12小时后的抑制因子的表达也进行了解析。
从BIE细胞提取总RNA及合成cDNA采用与例1（c）相同的方法实施，对基于实时定量RT-PCR法的牛细胞因子mRNA的测定采用与例1（d）相同的测定方法。
结果如图2及图3所示。图2是表示基于OLL2768株刺激的各细胞因子的表达量的图表，其显示通过以OLL2768株刺激BIE细胞48小时，Tollip及BCL3的表达增强。另外，图3是表示以OLL2768株刺激48小时后，进一步给予ETEC刺激时的各细胞因子表达量的变化的图表。其显示通过进一步以ETEC刺激6小时，Tollip的表达增强。并且可以确认BCL3的表达也有上升的倾向。
通过这些结果，能够筛选出作为免疫生物的候补菌株（OLL2768株），其能够缓解使用BIE细胞时基于ETEC的炎症应答。并且能够推测其活性表达结构为基于Toll样受体信号抑制因子的表达增强，抑制NF-kB转录活性。
例3：猪肠道上皮（PIE）细胞中的抗炎症性活性评价
使用PIE细胞，采用与例1相同的方法评价抗炎症性活性。即，在12孔板中以3×104个/孔接种PIE细胞，在37℃、5%CO2条件下培养3日。以100MOI向培养基对照及ETEC对照以外的孔中各添加500μl各供试乳酸菌，在37℃、5%CO2条件下培养48小时。以PBS清洗12孔板，向各孔中添加500μl的DMEM培养基（10%FCS、1%SP）后，向培养基对照区以外的孔中接种ETEC（987P株）死菌体至5.0×107个/孔（100MOI），刺激PIE细胞12小时。刺激后向各孔中添加500μl的TRIzol，通过移液管回收细胞溶解液。提取总RNA，通过实时PCR法算出各试剂中的IL-6、IL-8及MCP-1的mRNA表达量，用该值除以各试样中的β-肌动蛋白的mRNA表达量，以ETEC对照为100时的相对表达量进行评价。以Student’st检验解析相对于ETEC对照的2组间的统计学显著性差异。
在OLL2768、TL2937、MEP221102、MEP221104、MEP221111、MEP221113、MEP221115这7种菌株中，观察到了IL-6的显著性抑制。并观察到了这些菌株在MCP-1的表达中也有一定程度的抑制活性，IL-8的表达与其他供试乳酸菌相比有低的倾向。其中，在TL-2937株中，相对于阳性对照，观察到了60%以上的IL-6抑制活性，同时考虑例1的结果，认为其是其他有益的免疫生物候补菌株。
例4：猪肠道上皮细胞中的抗病毒性炎症活性评价
（a）PIE细胞的制备及刺激
向涂有Ⅰ型胶原蛋白涂层的24孔板中每孔添加500μl浓度为1×104个/ml的细胞，在37℃、5%CO2条件下培养3日。进行PIE细胞的培养基更换后，以各100MOI刺激表1所示的免疫生物候补菌株，在37℃、5%CO2条件下培养0~48小时。在基于乳酸菌的预刺激后，以PBS清洗三次，以光学显微镜确认孔内未残留供试乳酸菌。接着以添加有聚肌胞苷酸（polyI:C)的DMEM（在添加有10%FCS、1%青霉素-链霉素的DMEM中添加聚肌胞苷酸，将其浓度稀释至12.5μg/ml）置换各孔中的培养基，培养12小时。作为对照设定非刺激的孔及仅以聚肌胞苷酸刺激的孔。
（b）：抗病毒性及抗炎症活性的评价
从培养的PIE细胞中提取出mRNA，合成cDNA。与例1（d）相同，通过实时PCR法，解析作为抗病毒性指标的Ⅰ型干扰素的IFN-β、作为抗炎性指标的MCP-1的表达诱导。即，将cDNA作为模板，使用制作的引物进行表达解析。细胞因子基因的表达解析，通过ABIPRISM7300实时PCR系统（应用生物系统公司）进行。标准曲线是从作为梯度稀释质粒并进行分析的结果得到的曲线中，由指数函数的增幅区域的任意荧光值的Ct（阈值循环）计算得到的标准直线。由各样本中的Ct和标准直线，算出各条件下分开的样本中细胞因子的mRNA表达量。求出同一样本的β-肌动蛋白的表达量，将各表达量的值标准化，比较聚肌胞苷酸（Poly（I:C））为100时的相对表达强度。以Student’st检验解析相对于聚肌胞苷酸（Poly（I:C））对照的2组间的统计学显著性差异。
对PIE细胞进行聚肌胞苷酸刺激时，在IFN-β及MCP-1中，在基因水平上可以观察到随时间经过的表达变化。尤其，可以确认刺激12小时后IFN-β表达的显著减少及MCP-1的表达增加，因此将这两种细胞因子作为免疫参数，将聚肌胞苷酸刺激12小时后，定为最佳评价时间。使用本评价体系，以免疫生物候补菌株预刺激PIE细胞时，通过12小时的预刺激，作为诱导IFN-β的表达增强的菌株，可以得到MEP221106、MEP221108，通过48小时刺激，TL2937表现出比较强的趋势（图5）。另外，通过12小时的预刺激，在MEP221101、MEP221102、MEP221114、MEP221115、MEP221117五种菌株中，以及通过24小时刺激，在MEP221101、MEP221102、MEP221103、OLL2768、MEP221104、MEP221105、MEP221106、MEP221108、MEP221109、MEP221110、MEP221111、MEP221112、MEP221114、MEP221115、TL2937、MEP221117的16种菌株中确认了MCP-1的显著性表达抑制（图6）。由以上结果可知，通过使用PIE细胞的体外评价体系，可期待以抗病毒性细胞因子的增强及病毒性炎症的抑制为指标筛选和评价免疫生物。
例5：针对生产率或免疫能力的饲料中抗菌剂的效果
共20头供试的猪（雌性），在2周龄时用LWD系统导入，分成4区每区5头，给予市售代乳品驯养至3周龄。4周龄以后的饲料为含有适合成长阶段的离乳用饲料，基础成分不同的四种饲料，以加入抗菌剂的饲料为100%，与不含抗菌剂的基础成分相同的饲料0%相混合，从而设定50%投入抗菌剂的饲料和25%的共四个饲料条件的四个区，分别使其随意饱食（表2及表3）。
表2抗菌剂以外的基础饲料成分
TDN：可消化养分总量
表3试验区与混合比例
区 头数 加入抗菌剂(％) 无抗菌剂(％)
1 5 0 100
2 5 25 75
3 5 50 50
4 5 100 0
每两周进行一次体重测量、采集鼻涕以及采血，从部分采集的血液迅速分离血浆，与鼻涕一同全部在-80℃下冷冻保存至分析时。血浆用于测定代谢成分（总蛋白质、葡萄糖、总胆固醇、硝态氮、三酰甘油（triacylglycerol）、钙）及C反应性蛋白质（CPR）浓度，分别评价全血中刚采集后的总白血球数、粒细胞数对淋巴细胞数的比、巨噬细胞活性、抗体产生能力及补体第2经路活性。并且，从各区采集新鲜的粪便。分别使用鼻涕进行支原体感染检查，使用粪便进行病原性大肠杆菌（k88及k99）的感染检查。体重达115kg时出栏，屠杀肢解后，考察屠体成绩。
结果如图7~9及表4所示。可知与是否添加抗菌剂无关，至8周龄前对病原性大肠杆菌的感染较弱，从13周龄至15周龄期间，有强的感染性。17周龄以后，抗菌剂添加比例高的感染弱，低的发生强感染（图7）。13周龄以后，100%抗菌剂的第4区，血浆中CRP浓度在正常范围内（图8）。在代谢成分浓度方面，未发现周龄和区间之间有大的差异。在13周龄以后的免疫能力评价中，尤其在粒细胞数对淋巴细胞数的比中，添加了抗菌剂的区显著降低（P＜0.05）（图9）。可以确认鼻涕中的支原体感染，与是否添加抗菌剂无关。即使对于任一屠体成绩，在出栏日龄的效果方面也未看到显著性。在出栏时体重及屠体重量上，在区间未发现显著性差异，另一方面，背脂肪厚度在添加了抗菌剂的一方显著薄（P＜0.05）（表4）。
表4出栏时体重、屠体重量及背脂肪厚度的平均值
a，b：不同符号间具有显著性差异(P＜0.05)
例6：炎症抑制剂对于生产率或免疫能力的效果
共40头供试的猪（雌性或阉割的雄性），在3周龄时以LWD系统导入，分成8区每区5头，给予市售代乳品驯养至4周龄。36日龄以后的饲料为含有适合成长阶段的离乳用饲料，基础成分不同的三种饲料（表1），分别制备3种100%加入抗菌剂的饲料、3种0%不含抗菌剂的基础成分相同的饲料，共计六种饲料使其任意饱食。并且，从3周龄至15周龄，作为抗菌剂的替代物，用其他容器与培养液同时给予2种免疫生物乳酸菌（L1：詹氏乳杆菌TL2937，L2：植物乳杆菌MEP221118）（表5）。培养液中的菌数为3×108cfu/g。给予量为每日每头3g/体重kg。培养液为以酶分解处理的乳清。对8个区的给予方式如表5所示。
样本采集全部与例5相同。研究项目为从例5中除去抗体产生能力评价，另外在检测的病原性大肠杆菌的种类中增加ETEC987P。出栏及屠体成绩调查采用与例5相同的方法。
表5试验区与饲料给予
区 头数 加入抗菌剂(％) 无抗菌剂(％) 抗菌剂代替物
1 5 × ○ 无添加
2 5 × ○ 仅为培养基
3 5 × ○ L1
4 5 × ○ L2
5 5 ○ × 无添加
6 5 ○ × 仅为培养基
7 5 ○ × L1
8 5 ○ × L2
结果如图10~14所示，4周龄至8周龄期间，与是否添加抗菌剂无关，虽然有强弱，但是可以确认对病原性大肠杆菌的感染。尤其在无抗菌剂添加的L1给予区，13周龄至15周龄之间，对病原性大肠杆菌的感染消失。另一方面，在抗菌剂添加区，可以确认虽然有强弱，但可确认至15周龄发生感染（图10）。血浆中CRP浓度，从13周龄至15周龄中，与无菌体添加的对照区相比，在无抗菌剂添加的L1给予区在正常范围内显著低（P＜0.05），另外即使添加抗菌剂，L1给予区在正常范围内有低的趋势（图11）。作为免疫能力评价，尤其13周龄至15周龄的补体第2经路活性在无抗菌剂添加的L1给予区显著最高（P＜0.05）（图12）。关于体重，在无抗菌剂添加的L1给予区，增重显著最佳，22周龄时已经平均达到115kg（P＜0.05），另外，同周龄时，L1、L2及培养基给予区，与无给予区相比，有增大的趋势（图13）。另一方面，屠体重量在抗菌剂无添加区内、抗菌剂添加区内各自均未见显著性差异，两者相比较，抗菌剂添加区具有平均小的趋势（图14）。
从例5及例6的结果可知，8周龄前维持母传抗体的效果，对病原性大肠杆菌的感染弱。但是，从13周龄至15周龄与是否添加抗菌剂无关有强的感染，然后抗菌剂添加比例高的具有变低的趋势，因此，推测存在不能期待抗菌剂对病原性大肠杆菌的效果的时期。另外抗菌剂添加比例高者，血浆中CRP浓度低，由于其在正常的范围内，因此可知其显著抑制炎症应答。并且，通过添加抗菌剂，粒细胞数对淋巴细胞数的比降低，因此通过抗菌剂的效果，可抑制病原性大肠杆菌的进入，结果将自然免疫系统应答保持在正常状态。
从免疫生物乳酸菌的给予实验结果可知，与给予无关，8周龄前为或强或弱的感染状态，但是在无抗菌剂的环境下的L1给予，对13周龄至15周龄的病原性大肠杆菌感染强抑制。另外，通过给予无抗菌剂添加的L1，血浆中的CRP浓度显著低，抑制在正常范围内，补体第2经路活性的显著升高，因此L1抑制病原性大肠杆菌感染，可以期待免疫激活及抑制炎症应答的效果。并且，无抗菌剂添加的L1给予区的体重，在22周龄时已经达到适合出栏的115kg，相对于标准提早2周完成。另外，屠体重量与其他区相比无差异，因此生产率得到得了提高。
综上可知，作为维持生产率的抗菌剂的替代物，免疫生物乳酸菌L1不仅抑制病原性大肠杆菌感染，可期待免疫激活作用，而且对基于提高体重早期出栏的生产率提高做出了贡献。
工业实用性
通过本发明，可以筛选能够抑制肠道炎症性免疫应答的优益的免疫生物，并且，通过本发明的方法筛选的菌株OLL2768株及TL2937株，是优良的免疫生物，可期待用作抗菌剂替代品的应用性。

Claims (4)

1.保藏号为FERMBP-11272的詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)TL2937菌株在制备炎症抑制剂组合物中的应用。
2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述炎症抑制剂组合物用于预防及/或处置肠道内炎症性疾患。
3.保藏号为FERMBP-11272的詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)TL2937菌株在制备抑制炎症的食品组合物中的应用。
4.保藏号为FERMBP-11272的詹氏乳杆菌(Lactobacillusjensenii)TL2937菌株在制备抑制炎症的饲料组合物中的应用。
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