CN106148376B - 一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，包括如下步骤：1)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因进行无痕点突变：对无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的LT I基因上的TCT突变成AAA，使其对应编码的63号位的丝氨酸(S)突变成赖氨酸(K)；2)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因的敲除：在步骤1)的基础上，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因，从而达到致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的目的。使用本发明方法构建的致弱菌粘附性强、体内定植时间长、接种后能防止致病菌株的感染，可用于K88ac⁺ETEC引起的大肠杆菌病的生物预防。

Description

一种K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法与应用

技术领域

本发明涉及一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法与应用，属于生物工程和动物疫病防控领域。

背景技术

仔猪大肠杆菌病又称仔猪黄白痢，有数据表明，每年有约50％的仔猪死亡与产肠毒素大肠杆菌(Enterotoxingenic Escherichia coli,ETEC)。仔猪黄痢一般发生于产后1周内的仔猪，尤其在产后3-5日内高发，患病仔猪表现为拉黄白色或黄色水样粪便，不及时治疗，死亡率高达70％以上，甚至100％；仔猪白痢多发于10-30日龄仔猪，病猪主要变现为拉白色或灰白色稀便，发病率可达65％左右。该病除了造成仔猪死亡外，还会影响仔猪的生长发育、降低饲料报酬，给养殖单位造成很大的经济损失。其中表达K88菌毛(又称F4菌毛)的ETEC 是引起该病的重要病原菌之一。根据K88菌毛的抗原性不同，可将其分为K88ab、K88ac和 K88ad三个血清型抗原变种，而猪K88ac⁺ETEC血清型在我国乃至世界范围内都是引起仔猪黄白痢的优势血清型。致病过程中，K88菌毛粘附到小肠壁上，使细菌得以定居繁殖，同时菌体分泌肠毒素，导致水和电解质流向肠腔，造成机体腹泻。

对仔猪黄白痢的防治方法主要为疫苗接种、生物学预防和药物治疗：1.疫苗接种：目前预防仔猪的黄白痢的疫苗主要有全菌灭活疫苗、粘附素(菌毛)疫苗、肠毒素疫苗以及基因工程疫苗等。这些疫苗能有效降低临床发病率，但是由于全菌灭活疫苗的细胞壁中含有脂多糖(LPS)，可能会对接种动物造成一定的副作用，如：轻微发热、接种后母猪不食、接种部位有炎症反应等；此外，粘附素疫苗、肠毒素疫苗以及基因工程疫苗的制备过程复杂、价格偏高；2.生物学预防：方定一,董国雄(1978，1979)曾从仔猪肠道内分离到一株大肠杆菌——NY-10，该细菌是一种非致病性大肠杆菌，能有效排斥肠道内的致病性大肠杆菌，临床试验表明，NY-10能在24小时内完成肠道的定植，并占压倒性优势，持续时间为7天，口服后能有效防止防治仔猪泻痢的发生，提高仔猪的存活率(方定一,董国雄.用无病原性Ny—10 株大肠杆菌生物学防制仔猪黄痢的研究.江苏农业科技,1978,5(13):55-58.方定一,董国雄.用口饲NY—10株埃希氏大肠杆菌预防仔猪黄痢的研究.畜牧兽医学报,1979, 10(2):79-84.)，但该菌株研究背景不甚清楚，究竟是何种类型的肠毒素、菌体内有没有抗生素抗性基因均不明确，且该菌无菌毛粘附性差，体内定植时间不长，现临床几乎不再使用； 3.药物治疗：理论上讲，抗生素是一种有效治疗细菌性疾病的药物，但由于临床上抗生素的长期乱用、滥用，以及饲料中将抗生素作为添加剂或保健药物，导致大肠杆菌耐药性日趋严重，有研究显示，仔猪黄白痢的大肠杆菌对四环素、氨苄青霉素、阿莫西林、强力霉素、复方新诺明、甲氧苄啶、头孢拉定、环丙沙星等常用抗生素的耐药性达86％以上，并且一株细菌有多重耐药谱，这些现状导致临床抗生素治疗效果不佳。

大肠杆菌感染仔猪时，通过菌毛的粘附作用，将细菌定植到小肠上皮细胞上，这是发生感染的第一步，研究表明，热敏感型肠毒素(LT)对菌毛的粘附有辅助作用(E MBerberov, Y Zhou,D H Francis,et al.Relative importance of heat-labileenterotoxin in the causation of severe diarrheal disease in the gnotobioticpiglet model by a strain of enterotoxigenic Escherichia coli that producesmultiple enterotoxins.Infect Immun.2004,72(7):3914-24.)。

发明内容

本发明的目的在于提供一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱菌株构建方法及其应用。使用该方法构建的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌直接致弱菌株粘附性强、体内定植时间长、接种后能防止野毒菌株的感染，可用于K88ac⁺ETEC引起的大肠杆菌病的生物预防。本发明的基本原理是：在热敏感型肠毒素(LT)对菌毛的粘附有辅助作用、且菌毛粘附作用是大肠杆菌感染仔猪的第一步的理论基础上，利用生物工程技术，在一株无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌基础上，对其LT I基因进行点突变，使其毒力丧失，但保持其抗原性；再进一部敲除了ST II毒力基因，形成新的K88ac⁺致弱株，以有效阻止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的定居繁殖，防止大肠杆菌病的发生。

为了达到以上的目的，本发明的技术方案如下：

本发明提供了一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，包括如下步骤：

1)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因进行无痕点突变：可选用Red同源重组技术，将无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的LT I基因上的TCT突变成AAA，使其对应编码的63号位的丝氨酸(S)突变成赖氨酸(K)，使得LT I的毒力丧失；

2)对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因的敲除：在步骤1)的基础上，可选用Red同源重组技术，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因，从而达到致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的目的；更进一步地，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因时，替代一段大小为34bp的dif位点，作为以后辨别该致弱株的标记。

可选地，上述构建方法中所述的无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌为表达 K88ac菌毛，并产肠毒素的大肠杆菌野生株K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

可选地，上述K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，具体包括如下步骤：

第一步：利用Red同源重组无痕点突变技术，对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌YZ1205肠毒素基因进行无痕点突变，使其LT I基因上的TCT突变成AAA，使其对应编码的63号位的丝氨酸(S)突变成赖氨酸(K)，并得到重组菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)；

可选地，此步可以分为以下几个具体操作步骤：

(1)以质粒pSG76-CS为模板，使用引物P1、P2和P3，利用重叠PCR方法扩增DNA片段；其中，所述的引物P1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的引物P2具有如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，所述的引物P3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

(2)以步骤(1)中所获得的PCR产物为模板，使用分别具有SEQ ID NO.4和SEQ IDNO.5 所示的核苷酸序列的引物P4和P5继续扩增后，提纯回收；

(3)利用Red同源重组技术，使用步骤(2)中所得的DNA片段，对K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌YZ1205肠毒素基因进行无痕点突变，使其LT I基因上的TCT突变成AAA，使其对应编码的63号位的丝氨酸(S)突变成赖氨酸(K)，并得到重组菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)；

第二步：以K88ac⁺ETEC(YZ1205)为模板，以具有SEQ ID NO.6的引物P6和具有SEQID NO.7的引物P7，以及具有SEQ ID NO.8的引物P8和具有SEQ ID NO.9的引物P9，分别扩增DNA片段后，提纯回收；

第三步：将第二步中所获得的PCR扩增产物，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和Sma Ⅰ、HindⅢ，按顺序分别插入pUC18载体(大连宝生物公司)中相应的酶切位点；再将供筛选用抗性基因DNA片段(优选地，大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif DNA片段)插入SmaⅠ酶切位点，构建重组质粒；

第四步：以第三步中所构建的重组质粒为模板，使用分别具有SEQ ID NO.10和SEQID NO.11所示的核苷酸序列的引物P10和P11继续扩增后，提纯回收；

第五步：利用Red同源重组技术，基于第一步中所得的重组菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)，使用第四步中所纯化的PCR产物，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因，达到致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的目的。在第三步使用的供筛选用抗性基因DNA片段为大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif DNA片段的优选情况下，可以将插入的庆大霉素抗性基因删除，留下一段大小为34bp的dif位点，作为致弱株鉴定标记。

本发明还提供了上述产肠毒素大肠杆菌致弱株构建方法在防止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌感染方面的应用。

本发明的技术方案达到了如下的有益效果：

1)本发明通过基因工程的方法构建致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的方法，主要是采取了直接在无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌内进行LT I基因点突变以及STⅡ基因敲除方法，有别于常规的大肠杆菌内转化表达编码特定菌毛的质粒，避免在无抗生素存在时质粒易于丢失情形发生；

2)根据本发明的方法制备而得的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株，LT I基因点突变后 63位丝氨酸变为赖氨酸，STⅡ基因缺失，K88ac菌毛表达不受影响、粘附性强，但毒力大大降低，同时该菌株不带有常见的抗生素抗性基因(这点在前期样品采集时已验证，见具体实施例1)，使用时不影响抗生素对其他细菌性疾病的治疗，且体内定植时间长；

3)本发明通过基因工程的方法构建致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌，并在小鼠体内进行了验证，能够有效防止野毒株的感染，突破常规的疫苗接种预防、抗生素治疗等大肠杆菌病防控方法；

3)本发明提供的致弱K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌来源于感染的仔猪，因此也可为仔猪 K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌感染的预防提供一种有效生物预防方法。中国猪饲养量巨大，发生黄痢的仔猪数量众多，利用基因工程方法构建的K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株能有效预防K88ac+产肠毒素大肠杆菌引起的仔猪黄痢，这对于减少抗生素的使用有重要的意义，有很好的应用前景，可带来巨大的经济效益。

附图说明

图1是LT(S63K)基因点突变测序结果。

图2是STⅡ基因敲除测序分析结果。

图3是兔体肠毒素检测结果。

图4是K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ生长特性比较。

图5是间接免疫荧光(IFA)结果；其中，1.K88ac+ETEC(YZ1205)，2.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，3.DH5α。

图6是小鼠回肠粘附试验结果；其中，1.DH5α，2.K88ac+ETEC(YZ1205)，3.K88ac+ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，4.PBS。

图7是PCR结果；其中，M：DNA分子量标准DL2000，1-23：攻毒第1-23d PCR检测结果，24：第24d PCR检测结果。

具体实施方式

为了阐明本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。

生物材料来源：

K88ac⁺ETEC(YZ1205)：本实验分离保存；

大肠杆菌(E.coli)DH5α感受态细胞：购于宝生物工程(大连)有限公司(Cat No，9057)；

pUC18载体：购于宝生物工程(大连)有限公司(Cat No，3218)；

质粒pSG76-CS、pSTKST：由沈阳农业大学生物科学技术学院张立军教授惠赠[胡逢雪, 丁锐,崔震海,于金龙,刘丽霏,敖永华,张立军.大肠杆菌基因无痕敲除技术及策略[J],生物技术通讯,2013,4(24):552-556]。

大肠杆菌基因删除试剂盒：购于江苏锐阳生物科技有限公司；

抗K88ac菌毛单克隆抗体：由扬州大学兽医学院微生物教研室制备并保存；

Goat Anti-Mouse IgG H&L(Alexa

488)：购于Abcam公司(Cat No，ab150113)；

8w龄的Balb/c小鼠购于扬州大学比较医学中心。

实施例1

本实施例1中，采用发生黄痢仔猪小肠道内分离的一株大肠杆菌，构建K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株。具体包括以下步骤：

1.K88ac⁺ETEC分离：

用麦康凯培养基从江苏某猪场初次发生仔猪黄痢5日龄猪小肠道内分离的一株大肠杆菌。经检测，该大肠杆菌能表达K88ac菌毛，具有LT I和STⅡ肠毒素基因，未检测到常见的毒力岛基因，不能在含有氨苄青霉素、四环素、庆大霉素、卡那霉素、链霉素、头孢噻嗪、诺氟沙星、红霉素、强力霉素等抗生素的琼脂平板上生长。命名为K88ac⁺ETEC(YZ1205)。

2.K88ac+产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建：

(1)LT基因点突变：

根据GenBank发表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，设计合成下列引物 P1-P5。所述的引物P1-P5的核苷酸序列如下：

P1:5’-gaggaacacaaaccggctttgtcagatatgatgacggatatgtttccactaaacttagtttgagaagtg ctcac-3’(SEQ ID NO.1)；

P2:5’-cgagctcggtacccggggatccgctagggataacagggtaatgtcctgctaagtgagcacttctcaaac taagTTTag-3’(SEQ ID NO.2)；

P3:5’–gaatatcctgataatatagactgtcctgctaagtgagcacttctcaaactaagattaccctgttatcc ctatagcggccgcaaaaattaaaaatgaag-3’(SEQ ID NO.3)；

P4：5'-gaggaacacaaaccggctttg-3’(SEQ ID NO.4)；

P5：5'-gaatatcctgataatatagactg-3’(SEQ ID NO.5)。

以质粒pSG76-CS为模板，利用重叠PCR方法扩增DNA片段。其中，在引物P1、P2和P3的作用下扩增发生点突变的部分LT I基因以及插入其内部、来源于质粒pSG76-CS的I-Sec1位点之间的DNA序列，该扩增片段带有同源左右臂，用于后面的Red重组。

重叠PCR方法中，PCR反应体系为：质粒pSG76-CS(50ng/μL)1μL、引物P1、P2和 P3(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec 后，68℃退火、延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃。扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

随后，以上述PCR产物为模板，再用引物P4、P5扩增完整的上述基因。PCR反应体系为： PCR产物(5ng/μL)1μL、引物P4和P5(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，54℃退火5sec；72℃延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃。扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳，回收大小约1390bp大小的DNA片段。

将大肠杆菌基因删除试剂盒中的质粒pKD46转化K88ac⁺ETEC，并将携带质粒的K88ac⁺ ETEC(YZ1205)用0.4％L-阿拉伯糖诱导后，制备成电转化感受态细胞，取5μL P3、P4扩增产物(约500μg)加入制备的80μL感受态细胞中，混匀后冰上静置1min，转移到冰预冷的1mm电击杯中进行电转化，转化条件为1800V，250Ω，25μF，1mm，电击后迅速加入800μL SOB培养基混匀，将电击杯中菌液转移到1.5m L EP管中，37℃180rpm振荡培养2-3h，涂布于含25mg/mL氯霉素(Cm)的LB平板上，30℃培养箱中倒置培养18h后，挑取长出的菌落用引物P4、P5进行PCR鉴定。鉴定为阳性的重组菌接种至含Cm的LB固体培养基中 42℃继续培养18h，将长出的菌落转接种于含0.1mg/mL氨苄青霉素(Amp)的LB平板和不含任何抗生素的LB的平板，37℃培养18h后，Amp平板上未长出菌落而LB平板上长出菌落，表明pKD46质粒丢失成功。

将上述丢失pKD46质粒的重组菌制备成感受态细胞，转化质粒pSTKST，并在含50mg/mL卡那霉素(Kan)的LB平板培养，转接种长出的菌落至含Kan的LB的液体培养基中，30℃， 180rpm振荡培养3-5h后，向培养基中加入氯四环素(CTc)使其终浓度为30μg/mL，继续培养24-36h，诱导I-Sec1酶表达，切开突变基因组两端的I-Sec1识别位点，再通过大肠杆菌自身的修复机制，发生二次重组；将诱导后的菌液稀释后，吸取50μL涂布于含Kan的LB平板上，30℃培养24h后，长出的单菌落，用引物P4、P5进行PCR鉴定，并将PCR产物克隆进 pMD18T载体(大连宝生物公司)，进行序列测定。结果表明(图1)，第63位丝氨酸(TCT) 变为赖氨酸(AAA)，所获得的细菌命名为K88ac⁺ETEC LT(S63K)。将上述制备的重组菌接种 LB固体培养基，42℃继续培养18h，将长出的菌落转接种于含Kan的LB平板和不含任何抗生素的LB的平板，37℃培养18h后，Kan平板上未长出菌落而LB平板上长出菌落，表明pSTKST 质粒丢失成功。

(2)STⅡ基因敲除：

根据GenBank发表的pUMNK88Ent序列(Access NO.CP002732.1)，设计合成下列引物：其中引物P6、P7用于扩增同源左臂；引物P8、P9用于扩增同源右臂；引物P10、P11用于扩增来自于构建的重组载体中的同源左臂、dif-Gm-dif片段、同源右臂DNA片段；引物P12、P13用于鉴定大肠杆菌中STⅡ基因是否被敲除。所述的引物P6-P13的核苷酸序列如下：

P6:5’-ctgaattccgctgcattattgattttaggac-3’(SEQ ID NO.6)；

P7：5’-cgcccgggcacctcaaccttattgctataag-3’(SEQ ID NO.7)；

P8：5’-cgcccgggtatatttatcaatagcattcagcacc-3’(SEQ ID NO.8)；

P9：5’-gcgaagcttccggatgatctctaaatatgaat-3’(SEQ ID NO.9)；

P10：5’-catataaaagcccactgg-3’(SEQ ID NO.10)；

P11：5’-ctttttatgaaaaattatttttg-3’(SEQ ID NO.11)；

P12：5’-attgttgacatgaacagc-3’(SEQ ID NO.12)；

P13：5’-gcgatctccttcgttagg-3’(SEQ ID NO.13)。

将K88ac⁺ETEC(YZ1205)接种LB液体培养基，37℃过夜培养后，取1μL菌液作为模板，以引物P6、P7和P8、P9分别扩增大小为378bp和356bp的DNA片段。

其中，PCR反应体系为：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，68℃退火、延伸1min，共进行30循环，温度降至16℃。

扩增后，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物，并分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和Sma Ⅰ、HindⅢ，按顺序分别插入pUC18载体(大连宝生物公司)中相应的酶切位点；构建的重组质粒用SmaⅠ酶切后，与大肠杆菌基因删除试剂盒中的dif-Gm-dif片段进行连接，转化大肠杆菌感受态细胞DH5α，构建重组质粒。以引物P10、P11扩增大小为1300bp的DNA片段。

其中，反应体系为：菌液1μL、引物(25μM)各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、5x buffer 10μL、PrimSTAR HS DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。PCR程序为：98℃变性10sec后，68℃退火、延伸2min，共进行30循环，温度降至16℃，1％琼脂糖凝胶电泳回收PCR产物。

将大肠杆菌基因删除试剂盒中的质粒pKD46转化K88ac⁺ETEC LT(S63K)，L-阿拉伯糖诱导后，制备成电转化感受态细胞，将上述P10、P11引物扩增的DNA片段电转化感受态细胞，电转化条件同上。转化后的细菌培养2h，涂布含59.3mg/mL庆大霉素(Gm)和0.1mg/mLAmp 的LB固体培养基，30℃培养18h，长出的菌落用引物P12、P13进行PCR鉴定，阳性菌落能扩增出大小约1834bp大小的DNA片段，阴性菌落扩增出的DNA片段大小为1.34bp。将鉴定出的阳性菌在LB固体培养基上37℃培养36h后，分别接种含Gm和Amp的LB固体培养基和无抗生素的LB固体培养基，37℃培养，筛选只能在无抗生素LB固体培养基上生长的重组菌，此时的细菌利用自身Xer酶切除了Gm抗性基因，并用引物P12、P13进行PCR鉴定，PCR产物进行序列测定(图2)，结果编码STⅡ的核苷酸被成功敲除，替代了两个SmaI限制性内切酶酶切位点(379-384,419-424)和一个dif位点(385-418)；再用前面的方法，提高培养温度，丢失质粒pKD46。构建的细菌命名为K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ。

实施例2

本实施例2中，对实施例1中构建的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的生物学特性进行了检测，具体如下：

1)肠毒素检测

配制改良的产毒培养基CAYE培养基：胰蛋白胨10g、酵母3g、氯化钠1.25g、磷酸氢二钾5.7g、微量盐混合溶液0.5mL(5.0％硫酸镁、0.5％氯化锰、0.5％三氯化铁溶于0.001M硫酸溶液中)依次溶于灭菌蒸馏水中，使总量成500mL。用10M氢氧化钠调pH到8.5，121℃高压灭菌15min，放4℃冰箱备用，使用前以无菌方法加入葡糖至0.25％。

分别将K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ和DH5α接种于改良的CAYE 液体培养基，37℃过夜培养，第二天1:100转接种50mL改良的CAYE培养基中，37℃培养72h，加多粘菌素B 66μl(40000单位/ml)，37℃作用0.5h，4000-5000rpm 4℃离心30min，取上清，用0.45μm的滤膜过滤除菌。

将2-3kg的健康家兔，手术前饥饿48h，麻醉后以无菌术切开腹壁，自回盲口开始，沿向心方向用4号手术缝线结扎回肠，注射段约5cm，间隔段约1cm，共4段。第一段注射除菌的CAYE培养基，第二段注射无菌DH5α培养上清，第三段注射无菌K88ac⁺ETEC(YZ1205) 培养上清，第四段注射无菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ培养上清，每段注射1mL。注射完毕后缝合切口，禁食，术后6h给予少量饮水。12h后取出结扎肠断，测定各肠段的积液体积和肠段的长度。计算液体积与肠段长度比值，并重复实验一次，取平均值。结果注射K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ、DH5α无菌培养上清以及CAYE培养基的肠段积液体积与肠段长度比值均小于等于0.9，而注射K88ac⁺ETEC(YZ1205)无菌培养上清的肠段积液体积与肠段长度比值为1.27(图3)，这表明K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ的肠毒素基因突变和敲除后确实不能造成大量水和电解质流入肠腔而导致腹泻的发生。

2)生长特性比较

将K88ac⁺ETEC(YZ1205)和K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ分别划线于麦康凯培养基上， 37℃培养12h。挑取单菌落接种于LB液体培养基中培养，37℃，220rpm摇床中培养12h。取 24支盛有LB培养基的试管，野生株与减毒株各12管。分别标注培养时间为0、1.5、3、4、6、8、10、12、14、16、20、24h，用移液枪按1:100比例转接种到标记好的试管中，测定 OD600，调整各管细菌浓度，保每管OD值均相同，37℃220rpm培养。分别在0、1.5、3、4、 6、8、10、12、14、16、20、24h，取出菌液，以未接种的LB培养基为空白对照，OD600 测定比浊度，并进行多次重复实验，最终绘制出生长曲线。由图4可知，细菌培养前10h， K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ生长略慢于野生的K88ac⁺ETEC(YZ1205)，生长至10h时，两者繁殖的细菌总数基本相等，10h后由于菌液的浓度过高，超出分光光度计测定范围，而无法进行测定，表明肠毒素基因的突变、敲除对细菌最终繁殖数量影响不大。

3)小鼠小肠黏附试验

在LB平板上复苏K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ和DH5α，挑取单个菌落接种于TSB液体培养基中，37℃220rpm过夜培养，离心收集菌体，用无菌的37℃0.01moL/L PBS(pH7.6)洗涤3遍后，用抗K88ac菌毛的单克隆抗体进行免疫荧光实验，检测菌毛是否表达，结果显示(图5)，K88ac ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ菌能正常表达具有粘附作用的K88ac菌毛。调整细菌浓度至OD600＝1.0备用。

将8w龄大小的清洁级Balb/c小鼠颈椎脱臼处死后，采集小鼠的回肠，切割成大小3mm 长的肠段，剪开肠管，无菌的37℃0.01moL/L PBS(pH7.6)中洗涤3遍，浸泡到上述1mL菌液及无菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)中，37℃孵育1h后，刮取回肠粘膜，涂布载玻片，美兰染色后显微镜下观察细菌，结果(图6)K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔST Ⅱ菌液浸泡的肠粘膜刮取液中可观察到菌体，而DH5α菌液和PBS液浸泡的肠粘膜刮取液中无可见的菌体，表明在菌毛的作用下，大肠杆菌能粘附到小鼠的回肠粘膜表面，同时也证明Balb/c小鼠是一种良好的K88ac菌毛粘附实验动物模型。

4)减毒株对小鼠免疫保护作用及在小鼠体内定植时间

为了避免过多的小鼠肠道内杂菌干扰，在进行动物实验前用抗生素清理肠道内的其他杂菌，而K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ都不带有抗性基因，在实验前，在上述两种细菌中转化了带氨苄青霉素抗性基因的pUC18质粒。

在含Amp的LB平板上复苏K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ，挑取单个细菌接种于含Amp的TSB液体培养基，37℃过夜培养至OD600为2.0，用无菌的0.01moL/LPBS(pH7.6)洗涤3遍，根据预实验的结果，调整细菌浓度至10⁹cfu/400μL，用于小鼠灌胃接种。

饲喂8w龄的Balb/c小鼠含氨苄青霉素(5g/L)的无菌水，水里添加同时6.7％的果糖，以促进饮水，清除肠道内的其他菌群；48h后，灌胃前12h，小鼠禁食；灌胃前4h，将饮水换为无果糖但添加抗生素的无菌水；灌胃前3h，给小鼠腹腔注射西咪替丁(50mg/kg)，以减少胃酸分泌。将小鼠分成4组，第一组5只，第二组5只，第三组35只，第四组5只；第一、二、四组每只小鼠分别灌胃400μL携带pUC18质粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)、K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ菌液，以及无菌的0.01moL/L PBS(pH7.6)；第三组每只小鼠灌胃400μL，在接种K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ后24h、48h、72h、96h、120h、144h、168h，任取5只再次灌胃400μL携带pUC18质粒的K88ac⁺ETEC(YZ1205)。接种后观察和记录各组小鼠的发病、死亡情况，对死亡的小鼠进行解剖观察肠道的病变；同时每天收集第二组小鼠的粪便，两倍体积的无菌0.01moL/L PBS(pH7.6)溶解后，转接种含Amp的TSB液体培养基，37℃过夜培养，用针对LT I的具有如下核苷酸序列的特异引物PCR检测K88ac+ETEC LT(S63K)ΔST Ⅱ在肠道内的定植时间：

P14：5’TAGAGACCGGTATTACAGAAATCTGA3’(SEQ ID NO.14)；

P15：5’TCATCCCGAATTCTGTTATATATGTC3’(SEQ ID NO.15)；

其反应体系为：菌液1μL、引物P14、P15各1μL、dNTP(10mM/each，大连宝生物公司)2μL、10x buffer 5μL、rTaq DNA聚合酶(大连宝生物公司)0.5μL，去离子水补至50μL。 PCR程序为：94℃预变性5min后，94℃变性30sec、54℃退火30sec、72℃延伸1min，共进行30循环，72℃再充分延伸10min，温度降至16℃，1％琼脂糖凝胶电泳。

结果第二组以及空白对照第四组所有小鼠精神状态良好，无任何临床症状；第一组接种 4h后，小鼠出现精神萎靡，反应迟钝，不愿走动，禁食进水较少，蜷缩成一团，被毛竖立，出现颤抖等临床症状，部分小鼠尿色变深、腹泻，12-24h内死亡4只，最终存活1只，剖检死亡小鼠，可见肠道鼓气、有较多积液，肠系膜水肿，腹腔内有浆液性渗出；第三组分别在不同时间段攻毒，144h后攻毒以及之前不同时间段攻毒的小鼠精神状态良好，无任何临床症状，168h后攻毒的5只小鼠，其中4只精神状态良好，无任何临床症状，1只8h后出现精神萎靡，被毛竖立，蜷缩成一团症状，但第二天又恢复正常。这表明减毒的K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ可在24h内完成对小肠的占位，并在随后的6-7天内起着良好的生物屏障作用，能有效阻止K88ac⁺ETEC(YZ1205)的粘附，由K88ac⁺ETEC引起的仔猪黄痢一般高发生时间为出生后的3-5天，ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ可以预防该阶段K88ac⁺ETEC引起的仔猪黄痢。 PCR检测结果显示，减毒的K88ac⁺ETEC LT(S63K)ΔSTⅡ在小鼠体内定植的时间能维持23d (图7)。这表明构建的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌能有效防止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌野毒株的感染。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，本发明要求保护范围由所附的权利要求书、说明书及其等效物界定。

Claims (2)

1.一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：

a)以质粒pSG76-CS为模板，使用引物P1、P2和P3，利用重叠PCR方法扩增DNA片段；其中，所述的引物P1具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，所述的引物P2具有如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，所述的引物P3具有如SEQ ID NO.3所示的核苷酸序列；

b)以步骤a)中所获得的PCR产物为模板，使用分别具有SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列的引物P4和P5继续扩增后，提纯回收；

c)利用Red同源重组技术，使用步骤b)中所得的DNA片段，对所述无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌肠毒素基因进行无痕点突变，使其LT I基因上的TCT突变成AAA，使其对应编码的63号位的丝氨酸(S)突变成赖氨酸(K)，并得到重组菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)；

d)以所述无抗生素抗性基因的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌为模板，以具有SEQ ID NO.6的引物P6和具有SEQ ID NO.7的引物P7，以及具有SEQ ID NO.8的引物P8和具有SEQ ID NO.9的引物P9，分别扩增DNA片段后，提纯回收；

e)将步骤d)中所获得的PCR扩增产物，分别用限制性内切酶EcoRⅠ、SmaⅠ和SmaⅠ、HindⅢ，按顺序分别插入pUC18载体相应的酶切位点；再将大肠杆菌基因删除试剂盒中的含有庆大霉素抗性基因的dif-Gm-dif DNA片段插入SmaⅠ酶切位点，构建重组质粒；

f)以步骤e)中所构建的重组质粒为模板，使用分别具有SEQ ID NO.10和SEQ ID NO.11所示的核苷酸序列的引物P10和P11继续扩增后，提纯回收；

g)利用Red同源重组技术，基于步骤c)中所得的重组菌K88ac⁺ETEC LT(S63K)，使用步骤f)中所纯化的PCR产物，敲除K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌的STⅡ基因；并将插入的庆大霉素抗性基因删除，留下一段大小为34bp的dif位点。

2.根据如权利要求1所述的一种K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株的构建方法所制备而得的K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌致弱株在制备基于生物学预防的方式防止K88ac⁺产肠毒素大肠杆菌感染方面的药物的应用。

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